การวิเคราะห์เมตาดาต้าระบุ DNA Methylation ที่เกี่ยวข้องกับการทำงานของไตและความเสียหาย

edmund.chen@wecistanche.com

เรื้อรังโรคไตเป็นภาระด้านสาธารณสุขที่สำคัญ อัตราส่วนอัลบูมินต่อครีเอตินีนในปัสสาวะสูงเป็นตัวชี้วัดไตเสียหาย,และใช้ในการวินิจฉัยและระยะเรื้อรังโรคไต. เพื่อขยายความรู้เกี่ยวกับกลไกการกำกับดูแลที่เกี่ยวข้องกับการทำงานของไตและโรค เราได้ทำการศึกษาความสัมพันธ์ของกลุ่มอีพิจีโนมในเลือดสำหรับอัตราการกรองไตโดยประมาณ (n=33,605) และอัตราส่วนอัลบูมินต่อครีเอตินีนในปัสสาวะ (n=15,068) และตรวจพบ 69 และตำแหน่ง CpG เจ็ดตำแหน่งที่ DNA methylation สัมพันธ์กับลักษณะที่เกี่ยวข้อง การค้นพบส่วนใหญ่เหล่านี้แสดงความสัมพันธ์ที่สอดคล้องกันกับผลลัพธ์ทางคลินิกตามลำดับของโรคเรื้อรังโรคไตและอัลบูมินูเรียเพิ่มขึ้นในระดับปานกลาง ความสัมพันธ์ของ DNA methylation กับการทำงานของไตเช่น CpGs ที่ JAZF1, PELI1 และ CHD2 ได้รับการตรวจสอบในเนื้อเยื่อไต. เมทิลเลชั่นที่ PHRF1, LDB2, CSRNP1 และ IRF5 บ่งชี้ถึงผลกระทบที่เป็นสาเหตุการทำงานของไต. การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าเผยให้เห็นเส้นทางที่เกี่ยวข้องกับการห้ามเลือดและการย้ายเซลล์เม็ดเลือดสำหรับอัตราการกรองไตโดยประมาณ และการกระตุ้นเซลล์ภูมิคุ้มกันและการตอบสนองต่อ CpG ที่เกี่ยวข้องกับอัตราส่วนอัลบูมินต่อครีเอตินินในปัสสาวะ

คำสำคัญ:โรคไต ความเสียหายของไต; การทำงานของไต เนื้อเยื่อไต โครงสร้างไต

เรื้อรังโรคไต(CKD) เป็นภาระด้านสาธารณสุขที่สำคัญ โดยส่งผลกระทบมากกว่า 10 เปอร์เซ็นต์ของผู้ใหญ่ทั่วโลก และมากกว่า 40 เปอร์เซ็นต์ของผู้ที่มีอายุ 70 ​​ปีขึ้นไป1,2 โรคไตวายเรื้อรังเป็นสาเหตุสำคัญของการเสียชีวิตทั่วโลก3 และเป็นสาเหตุหลักที่ทำให้เกิดโรคหลอดเลือดหัวใจและการตาย2,4,5 CKD หมายถึงการมีอยู่อย่างต่อเนื่องของความผิดปกติของไตโครงสร้างหรือหน้าที่ ดิการทำงานของไตการวัดที่ใช้กันมากที่สุดคืออัตราการกรองไต ซึ่งมักจะประมาณจากความเข้มข้นของครีเอตินีนในซีรัม (eGFR) และอัตราส่วนอัลบูมินต่อครีเอตินีนในปัสสาวะ (UACR)6 UACR ที่สูงขึ้นเป็นตัววัดของไตเสียหายใช้ในการวินิจฉัยและระยะ CKD7 และมีความเกี่ยวข้องกับโรคเบาหวานและความดันโลหิตสูงโรคไต8. แม้ UACR ที่ยกระดับปานกลางก็เป็นปัจจัยเสี่ยงต่อโรคหลอดเลือดหัวใจ โดยไม่ขึ้นกับโรคอื่นๆการทำงานของไต markers such as eGFR9. Familial aggregation studies of CKD and eGFR revealed a substantial heritable component of up to 54%9–11. Only a small part of this heritability is attributed to classical monogenic diseases. Rather, CKD susceptibility is influenced by DNA sequence variants in many genes, environmental factors, and their interactions. Genome-wide association studies (GWAS) have successfully identified common variants at >400 ตำแหน่งทางพันธุกรรมที่เกี่ยวข้องกับการทำงานของไต10,12,13. ตัวแปรดัชนีที่ตำแหน่งที่เกี่ยวข้องกับ eGFR ที่รู้จักจะอธิบายความแปรปรวนของ eGFR12 โดยประมาณ 8.9 เปอร์เซ็นต์การวิเคราะห์เมตา GWAS ล่าสุดของ eGFR ที่รวมบริเวณโครมาตินแบบเปิดเข้ากับชุดของ single nucleotide polymorphisms (SNPs)10 ชุดเล็กๆ ผลจากการศึกษานี้สนับสนุนความสำคัญของการควบคุมการถอดรหัสที่เปลี่ยนแปลงไปซึ่งเป็นกลไกที่เอื้อต่อ CKD เพื่อตรวจสอบ DNA methylation เกี่ยวกับการทำงานของไตได้ทำการศึกษาการเชื่อมโยงระหว่าง epigenome-wide (EWAS) ของ eGFR และ CKD แล้ว ในฐานะที่เป็นตัวควบคุมหลักของการถอดความที่สามารถประเมินในลักษณะที่ประหยัดต้นทุนและมีปริมาณงานสูง DNA methylation ได้รับการศึกษาที่ไซต์ CpG (CpGs) ด้วยความละเอียดแบบเบสเดียว ก่อนหน้านี้เราได้ดำเนินการ EWAS ซึ่งรวมถึงผู้ใหญ่ 4859 คนจากการศึกษาตามประชากรสองครั้ง และระบุไซต์ที่มีเมทิลเลตที่แตกต่างกัน 18 แห่งที่ผ่านการตรวจสอบความถูกต้องในเลือดครบส่วนที่เกี่ยวข้องกับ eGFR14 แม้ว่าการศึกษาครั้งนี้จะเปิดเผยข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับกลไกการควบคุมยีนของไตฟังก์ชัน CpG ที่เกี่ยวข้องอธิบายเพียง 1.2 เปอร์เซ็นต์ของความแปรปรวน eGFR การศึกษาก่อนหน้านี้อื่นๆ มุ่งเน้นไปที่ผู้ป่วยโรคไตเรื้อรังและ/หรือผู้ป่วยโรคเบาหวานหรือผู้ป่วยที่ติดเชื้อไวรัสภูมิคุ้มกันบกพร่องของมนุษย์ หรือถูกจำกัดด้วยขนาดตัวอย่างที่เล็ก ขาดการจำลองแบบ ขาดการปรับตัวสำหรับสารก่อกวนที่อาจเกิดขึ้น หรือการรวมกันของสิ่งนั้น 14–19 การศึกษาอื่น ๆ ที่เน้นรูปแบบ DNA methylation ของผู้ป่วยเบาหวานโรคไต(DKD) ผู้ป่วย20–22.

CISTANCHE จะปรับปรุงโรคไต/โรคไต

ที่นี่ เราดำเนินการ EWAS ของการทำงานของไตลักษณะในการระบุ CpG เพิ่มเติมที่เกี่ยวข้องกับกลไกการกำกับดูแลของยีนที่มีความสำคัญต่อ CKD เราขยาย EWAS เดิมสำหรับ eGFR และ CKD โดยเพิ่มขนาดตัวอย่างอย่างมากเป็น 33,605 คน ยิ่งไปกว่านั้น เราได้รวม UACR และอัลบูมินูเรียที่เพิ่มขึ้นในระดับปานกลาง (ไมโครอัลบูมินูเรีย) เป็นลักษณะเพิ่มเติม EWAS ดำเนินการในการศึกษาตามประชากรส่วนใหญ่ที่ปรับเพศ อายุ เบาหวาน ความดันโลหิตสูง ดัชนีมวลกาย (BMI) สถานะการสูบบุหรี่ และสัดส่วนของเซลล์เม็ดเลือดขาวที่มีมากที่สุด เราจำลองผลลัพธ์ EWAS ของเราในตัวอย่างที่แยกจากกัน เชื่อมโยงไซต์ CpG กับระดับการแสดงออกของยีนในเนื้อเยื่อต่างๆ นำการค้นพบนี้ไปใช้กับผลลัพธ์ทางคลินิก และประเมินความเป็นเหตุเป็นผลระหว่าง DNA methylation และการทำงานของไต(รูปที่ 1).

ผลลัพธ์

ศึกษาลักษณะตัวอย่าง. ในการศึกษานี้ การศึกษา 36 เรื่องซึ่งมีผู้เข้าร่วมทั้งหมด 33,605 คนมีส่วนทำให้เกิด EWAS ของ eGFR และ 15,068 ต่อ EWAS ของ UACR ลักษณะที่รวมกันของพวกเขาแสดงไว้ในตารางที่ 1 และคำอธิบายการศึกษาแต่ละรายการมีอยู่ในข้อมูลเสริม 1 และ 2

EWAS ของ eGFR และ UACRเราตรวจสอบสมาคมของไตลักษณะที่มี DNA methylation ในเลือดสูงถึง 441,870 CpGs การทับซ้อนของ CpGs ที่ครอบคลุมโดย Illumina MethylationnEPIC BeadChip และอาร์เรย์ Illumina HumanMethylation450 BeadChip ซึ่งใช้สำหรับการวัดโดยทั้งหมดยกเว้นการศึกษาเดียว (ข้อมูลเสริม 3) การศึกษาทั้งหมดดำเนินการล้างข้อมูลอาร์เรย์และใช้สคริปต์ที่พัฒนาขึ้นจากส่วนกลางเพื่อเตรียมไตค่าคุณลักษณะ ซึ่งต่อมาเกี่ยวข้องกับ DNA methylation โดยใช้แบบจำลองการถดถอยเชิงเส้นที่ปรับโควาเรียด้วยค่าเมทิลเลชันเป็นตัวแปรตามตามโปรโตคอลการศึกษาที่กำหนดไว้ล่วงหน้า (ดูวิธีการ) เราสังเกตไม่พบหรือพบอัตราเงินเฟ้อเพียงเล็กน้อยใน EWAS เฉพาะการศึกษา (eGFR หมายถึงอัตราเงินเฟ้อ=100, UACR หมายถึงอัตราเงินเฟ้อ=1.00, ข้อมูลเสริม 1 และ 2) ใน EWAS ข้ามชาติพันธุ์ที่ปรับหลายตัวแปรได้ 69 CpG มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญกับ eGFR และจำลองแบบ (รูปที่ 1A ข้อมูลเสริม 4 ดูวิธีการ) รวมถึงรายงานที่รายงานก่อนหน้านี้14 ไซต์ที่จำลองแบบแสดงให้เห็นรูปแบบที่ชัดเจนของเมทิลเลชันที่ต่ำกว่า (60 CpGs, Pbinom=2.2E-10; รูปที่ 1A)

รูปที่ 1 ผลลัพธ์ EWAS ของ eGFR และ UACR แผนผังชิคาโกของผลการศึกษาความสัมพันธ์ระหว่าง epigenome-wide (EWAS) สำหรับอัตราการกรองไตโดยประมาณ (eGFR) (A) และอัตราส่วน albumin-to-creatinine ในปัสสาวะ (UACR) (B) โดยใช้ตัวอย่างการค้นพบและการจำลองแบบรวมกัน ไซต์ถูกจัดเรียงตามตำแหน่งโครโมโซมบนแกน x โดยมีค่า –log10 P-value ของการเชื่อมโยง Wald-test ที่ให้ไว้บนแกน y CpGs มีความสัมพันธ์เชิงบวกกับลักษณะนี้ถูกพล็อตในส่วนบน ไซต์ที่มีความสัมพันธ์เชิงลบในส่วนล่าง เส้นประแนวนอนแสดงถึงระดับนัยสำคัญ (ค่า P < 1.1e-7)="" ไซต์ที่จำลองแบบนวนิยายจะมีสีส้ม="" ไซต์ที่จำลองแบบที่รู้จักเป็นสีเทอร์ควอยซ์="" และไซต์ที่เกี่ยวข้องกับลักษณะไบนารีตามลำดับเพิ่มเติม="">โรคไต[CKD]/ microalbuminuria [MA]) มีเครื่องหมายกากบาท

ในการวิเคราะห์เมตา พบว่าค่า P ต่ำสุดสำหรับการเชื่อมโยง eGFR ที่ทราบ รวมถึง cg17944885 (ZNF788,=−1.75E−04, P-value=8.7E-41), cg23597162 (JAZF1 ,=−1.48E−04, ค่า P=3.2E-24) และ cg06158227 (ZSCAN29,=−1.08E−04, ค่า P=8 .7E-20)14 ตามด้วย fifinding ใหม่ที่ cg20777437 (CDCP2,=−8.28E−05, P value=1.1E-17) CpG ที่เกี่ยวข้องกับ eGFR ที่ทำซ้ำ 69 ตัวเพียงอย่างเดียวอธิบาย 15.7 เปอร์เซ็นต์ของการเปลี่ยนแปลง eGFR ในตัวอย่างการศึกษาที่แยกจากกันของผู้เข้าร่วม 1,888 คน (ดูวิธีการ) เมื่อเพิ่ม covariates ทั้งหมด (เพศ อายุ เบาหวาน ความดันโลหิตสูง BMI การสูบบุหรี่ และสัดส่วนของเซลล์เม็ดเลือดขาว) ลงในแบบจำลองการเชื่อมโยง สัดส่วนทั้งหมดของความแปรปรวนที่อธิบายใน eGFR เพิ่มขึ้นเป็น 36.3 เปอร์เซ็นต์ โดยมีความแปรผัน 2.4 เปอร์เซ็นต์มาจาก 69 CpGs เป็นอิสระจากโควาเรียตอื่นๆ

ในการวิเคราะห์ข้ามกลุ่มชาติพันธุ์ของ UACR เจ็ด CpGs มีความสัมพันธ์และทำซ้ำอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 1B, ข้อมูลเสริม 5, ดูวิธีการ) จากผลการวิจัยพบว่า cg18181703 (SOCS3,=−2.58E−03, P-value=2.6E-13) และ cg02711608 (SLC1A5,=−1.63 E−03, ค่า P-value=9.9E-13) มีค่า P ของการเชื่อมโยงการวิเคราะห์เมตาที่เล็กที่สุด ที่หกในเจ็ด CpGs เมทิลเลชันที่ต่ำกว่าสัมพันธ์กับ UACR ที่สูงขึ้น เนื่องจากจำนวนของไซต์ที่จำลองแบบ พลังของการทดสอบทวินามจึงถูกจำกัด (6 CpGs, pbinom=0.13; รูปที่ 1B) CpG ที่จำลองแบบอธิบาย 3.9 เปอร์เซ็นต์ และแบบจำลองเต็มรูปแบบ 14.6 เปอร์เซ็นต์ของความผันแปรในระดับ UACR โดย 0.07 เปอร์เซ็นต์มาจาก CpG โดยไม่ขึ้นกับตัวแปรร่วมอื่นๆ

มีการทับซ้อนกันต่ำระหว่าง EWAS ที่จำลองแบบและตำแหน่ง GWAS ที่รายงานก่อนหน้านี้สำหรับทั้ง eGFR (ซ้อนทับกัน=10 จาก 69; ข้อมูลเสริม 4) และ UACR (ซ้อนทับกัน=1 จาก 7; ข้อมูลเสริม 5) ไม่มีการทับซ้อนกันของ CpG ที่จำลองแบบระหว่าง eGFR และ UACR ซึ่งบ่งชี้ถึงโปรไฟล์ของ DNA methylation ที่จำเพาะต่อลักษณะในเลือด แม้แต่ในความสัมพันธ์ที่มีการชี้นำ 967 และ 270 (ค่า P < 1e−05)="" ของการค้นพบแบบผสมผสานและการวิเคราะห์เมตาของตัวอย่างการจำลองสำหรับ="" egfr="" และ="" uacr="" ตามลำดับ="" มีเพียง="" 10="" ไซต์ที่คาบเกี่ยวกันระหว่างลักษณะทั้งสอง="" ผลลัพธ์โดยละเอียดจากการวิเคราะห์เมตาเหล่านี้สำหรับการเชื่อมโยงที่มีการชี้นำทั้งหมดมีอยู่ในข้อมูลเสริม="" 6="" (egfr)="" และ="" 7="">ความแตกต่างของบรรพบุรุษและความทนทานของการค้นพบ เพื่อประเมินว่าผลการเชื่อมโยงใน eGFR และ UACR อาจถูกขับเคลื่อนโดยบรรพบุรุษที่เฉพาะเจาะจงหรือไม่ เราทำการวิเคราะห์เมตาดาต้า EWAS ที่แบ่งชั้นบรรพบุรุษของตัวอย่างบรรพบุรุษยุโรป (EA) และบรรพบุรุษแอฟริกันอเมริกัน (AA) ที่มีผลลัพธ์จากการศึกษาหลายชิ้นที่มีส่วนร่วมในสองกลุ่มนี้ เชื้อชาติ การเปรียบเทียบผลการเชื่อมโยงของ CpG ที่จำลองแบบในตัวอย่างของ EA (Negar=23,671; nUACR=9806) กับตัวอย่าง AA (neGFR =

5019; nUACR = 1921) showed similar effect sizes (reGFR = 0.87, rUACR = 0.74). The effect directions of almost all replicated CpGs were concordant between the ancestries (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The only exception was the UACR association cg22304262 in SLC1A5 which, however, was not significant in AA (P-value = 0.39, Supplementary Fig. 2). This association, as well as the CpGs at JAZF1 and RPS10P7 for eGFR, showed significant heterogeneity (eGFR: P-value < 0.05/69, UACR: P-value < 0.05/7) between EA and AA association results (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The presence of common SNPs (minor allele frequency >{{0}}.05) ในหรือภายใน 50 bp ของ CpG ที่จำลองแบบ 69 ตัวได้รับการประเมินเพื่อประเมินว่าการมีอยู่ของ SNP อาจส่งผลต่อการจับโพรบหรือไม่ โพรบสี่ตัวตั้งอยู่ใกล้ SNP ทั่วไป (Supplementary Data 4; cg10960375-rs113564504; cg11544657-rs2083577; cg01817897-rs142643977; cg06930757-rs112223111) ซึ่งอย่างไรก็ตาม ไม่เชื่อมโยงกับลักษณะ GWAS ใด ๆ ตามทรัพยากร PhenoScanner V2 (เข้าถึงเมื่อ 02/12/2021, pGWAS < 5e−8="" รวมถึง="" snp="" พร็อกซีที่มี="" eur="" r²=""> 0.8)23 สิ่งนี้บ่งชี้ว่าผลลัพธ์ของ EWAS ไม่น่าจะถูกรบกวนด้วยลักษณะทั่วไปที่ทราบกันดีว่าเกี่ยวข้องกับการทำงานของไตโดยการแปรผันของลำดับดีเอ็นเอใกล้เคียง โดยทั่วไปแล้วพบว่า SNP ของโพรบ-ภายในซึ่งมีมากกว่าห้าฐานจากปลาย 3′-ปลายโพรบ พบว่ามีผลที่ตามมาเล็กน้อย24

ความสัมพันธ์กับ CKD และ microalbuminuriaจาก 69 CpG ที่เกี่ยวข้องกับ eGFR 53 ยังสัมพันธ์กับ CKD ที่แพร่หลายในการวิเคราะห์เมตาจำนวน 25,609 ราย ซึ่งรวมถึง 2376 รายที่มีทิศทางการส่งผลที่สอดคล้องกัน (ค่า P < 0="" 05/69;="" ข้อมูลเสริม="" 4,="" รูปที่="" 3a)="" ความสัมพันธ์ระหว่างผลกระทบของ="" egfr="" และ="" ckd="" สูง="" (r="−0.93;" รูปที่="" 3a)="" ในกลุ่มผู้ป่วยโรคไตวายเรื้อรัง="" 551="" ราย="" 65="" cpgs="" มีความสอดคล้องกับการวิเคราะห์เมตา="" egfr="" และทำซ้ำห้าครั้ง="" (ค่า="" p="">< 0.05/69,="" r="0.77;" รูปที่="" 4="" เสริม="" ข้อมูลเสริม="" 4="" ดูวิธีการ)="" ในกลุ่มเดียวกัน="" egfr="" ที่สัมพันธ์กับ="" cpgs="" cg18194850="" (ค่า="" p="1.6E-5)" และ="" cg07242931="" (ค่า="" p="2.3E-5)">ไตล้มเหลวหรือเฉียบพลันไตบาดเจ็บ(ข้อมูลเสริม 8 ดูวิธีการ) CpG ทั้งเจ็ดที่เกี่ยวข้องกับ UACR มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญกับ microalbuminuria ในตัวอย่าง 7279 รายรวมถึง 1186 รายที่มีทิศทางของผลเช่นเดียวกับ UACR (ค่า P < 0.05/7,="" r="" {{7}="" }.98;="" รูปที่="" 3b,="" ข้อมูลเสริม="" 5,="" รูปที่="">

ความสัมพันธ์กับการแสดงออกของยีน เพื่อให้ได้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับกลไกการทำงานที่เป็นไปได้ของ CpG ที่เกี่ยวข้องกับ eGFR และ UACR เราได้ทดสอบความสัมพันธ์ของระดับเมทิลเลชันใน DNA กับระดับ mRNA ของยีนที่เข้ารหัสใน cis ในเลือดครบส่วนและในโมโนไซต์ในเลือด (ดูวิธีการ ข้อมูลเสริม 9 ). cg17944885 ที่เกี่ยวข้องกับ eGFR ที่รู้จักบนโครโมโซม 19 ใกล้ ZNF788 นั้นสัมพันธ์กับการถอดเสียงที่เข้ารหัสโดยซิงค์ฟิงเกอร์โปรตีน 439 ที่อยู่ห่างออกไป 240 kb (ZNF439, ตารางที่ 2) นอกจากนี้ methylation ของ cg04864179 ที่ปัจจัยควบคุม interferon 5 (IRF5) สัมพันธ์กับทั้งการถอดรหัส mRNA ที่เข้ารหัสโดย IRF5 และการขนส่งในบริเวณใกล้เคียง 3 (TNPO3) (รูปที่ 5A เพิ่มเติม) จากความสัมพันธ์ของ UACR พบว่า CpGs ที่จำลองแบบทั้งสอง cg02711608 และ cg22304262 ที่แฟมิลีพาหะตัวละลาย 1 สมาชิก 5 (SLC1A5) เผยให้เห็นความสัมพันธ์ที่มีนัยสำคัญกับระดับ mRNA ของ SLC1A5 และ cg23570810 ที่โปรตีนเมมเบรนที่เหนี่ยวนำโดยอินเตอร์เฟอรอน 1 (IFITM1) พร้อมการถอดเสียงเป็น cis (ตาราง 2). ผลลัพธ์ทั้งหมดของการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนมีอยู่ในข้อมูลเสริม 9

ผลกระทบต่อเนื้อเยื่อไตเพื่อประเมินว่าผลของเมทิลเลชั่นที่สังเกตได้ในเลือดแปลเป็น .หรือไม่เนื้อเยื่อไตเราใช้แบบจำลองการถดถอยเพื่อทดสอบการเชื่อมโยงของ CpG ที่จำลองแบบสำหรับนัยสำคัญ (อัตราการค้นพบที่ผิดพลาด (FDR) < 0.05) และการเชื่อมโยงที่สอดคล้องกับทิศทางกับ eGFR และไตพังผืดตามลำดับใน 506 microdissectedเนื้อเยื่อไตตัวอย่าง ในตัวอย่างนี้ไต- การทำเมทิลเลชั่น DNA แบบเนื้อเยื่อของ CpGs ที่เกี่ยวข้องกับ eGFR ที่จำลองแบบ cg23597162 ที่ JAZF1, cg26099045 ใกล้ PELI1 และ cg12644285 ที่ CHD2 มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญกับ eGFR โดยมีทิศทางของผลเช่นเดียวกันกับในเลือด (รูปที่ 6A, ตารางที่ 2, ข้อมูลเสริม 10) . นอกจากนี้ CpG เดียวกันที่ PELI1 และอีกหกเพิ่มเติม

ไซต์ (cg20146909 ที่ LRRC8D, cg25767870 ใกล้ FAM46C, cg16618493 ที่ ZBTB7B, cg10632966 ใกล้ RPEL1, cg01068906 ที่ NOD2 และ cg03297731 ที่ GDPD3) มีความสัมพันธ์กับการเกิดพังผืดในไตตัวอย่างเนื้อเยื่อที่มีทิศทางผลกระทบที่สอดคล้องกัน (เช่น ผกผัน) (รูปที่ 6B เพิ่มเติม ตารางที่ 2) จากไซต์ UACR ที่จำลองแบบ ระดับ DNA methylation ในไตเนื้อเยื่อของ cg00008629 ที่ PTBP3 และ cg24859433 ใกล้ IER3 สัมพันธ์กับการเกิดพังผืดและแสดงให้เห็นทิศทางของผลเดียวกัน (รูปที่ 6D เสริม, ตารางที่ 2) สอดคล้องกับการค้นพบของ EWAS ไม่พบความสัมพันธ์ที่มีนัยสำคัญของ UACRassociated CpGs กับ eGFR ในผู้บริจาคตัวอย่างไต (รูปที่ 6C เสริม ข้อมูลเสริม 10)

ผลกระทบเชิงสาเหตุระหว่าง DNA methylation และการทำงานของไตลักษณะ เพื่อประเมินว่าการทำงานของไตลักษณะที่ส่งผลกระทบเชิงสาเหตุส่งผลต่อ DNA methylation หรือในทางกลับกัน เราได้ทำการวิเคราะห์ Mendelian randomization (MR) แบบสองทิศทางแบบสองทิศทางของ CpG ที่เกี่ยวข้องอย่างมีนัยสำคัญ การวิเคราะห์ทิศทางไปข้างหน้า MR ชี้ให้เห็นว่า CpGs cg02304370 (PHRF1), cg04460609 (LDB2), cg00501876 (CSRNP1) และ cg04864179 (IRF5) ส่งผลต่อระดับ eGFR เชิงสาเหตุ (ตารางที่ 3) ค่าประมาณการถ่ายทอดทางพันธุกรรมของ CpG ทั้งสี่นี้แปรผันตามชุดข้อมูลสามชุดจากประชากรของบรรพบุรุษในยุโรป แต่มีค่าสูงกว่าค่าเฉลี่ยทางพันธุกรรมของ CpG ทั้งหมดที่ประเมินในการศึกษาทั้งสามอย่างเสมอต้นเสมอปลาย: 0.34 (eGFR CpG เชิงสาเหตุ) เทียบกับ 0.16 (อาร์เรย์ HM450K) ตาม Hannon et al.25, 0.55 เทียบกับ 0.19 สำหรับ Dongen et al.26 และ 0.51 เทียบกับ 0.19 สำหรับ McRae et al.27 ไม่มีการระบุความสัมพันธ์เชิงสาเหตุที่มีนัยสำคัญสำหรับ CpG ที่เกี่ยวข้องกับ UACR สำหรับ MR ย้อนกลับ ผลกระทบที่มีนัยสำคัญเพียงอย่างเดียวคือ eGFR ต่อ cg23597162 (JAZF1) เมื่อใช้วิธีผกผันหลัก อย่างไรก็ตาม ไม่มีการระบุ/สังเกตผลกระทบที่มีนัยสำคัญในการวิเคราะห์ความไวของ MR แบบย้อนกลับหลายครั้ง การวิเคราะห์แบบปล่อยครั้งเดียวไม่ได้แสดงข้อบ่งชี้ใดๆ ว่าผลลัพธ์ของ MR อาจถูกขับเคลื่อนโดย SNP เดียว นอกจากนี้ การยกเว้น SNPs ที่เกี่ยวข้องกับโรคเบาหวานประเภท 2 เป็นปัจจัยเสี่ยงที่สำคัญสำหรับโรคไตไม่ได้ผลการค้นพบที่แตกต่างกัน ผลลัพธ์สำหรับการวิเคราะห์ MR หลักและความไวทั้งหมดแสดงในข้อมูลเสริม 11 และ 12 และรูปที่ 7 เพิ่มเติม การวิเคราะห์ความไวสนับสนุนการค้นพบเบื้องต้นของผลลัพธ์ MR ไปข้างหน้าที่มีนัยสำคัญ (FDR < 0.05="" ดูวิธีการ)="" ด้วย="" ประมาณการผลกระทบที่สม่ำเสมอของทิศทาง="" ซึ่งบ่งชี้ถึงความสัมพันธ์เชิงสาเหตุที่อาจเกิดขึ้นจาก="" dna="" methylation="" กับ="" egfr="">

การรวมปัจจัยการถอดความ เครื่องหมายฮิสโตน และการวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าทางเดิน เราทำการวิเคราะห์ไซต์ที่มีผลผูกพันปัจจัยการถอดรหัส เครื่องหมายฮิสโตนและการวิเคราะห์การเพิ่มประสิทธิภาพของเส้นทางโดยอิงจาก 967 CpG ที่แสดงความสัมพันธ์ที่ชี้นำกับ eGFR (ค่า Pvalue < 1e−05="" ข้อมูลเสริม="" 6)="" และ="" 270="" cpg="" ที่แสดงความสัมพันธ์ที่ชี้นำกับ="" uacr="" (ค่า="" p="">< 1e-5;="" ข้อมูลเสริม="" 7)="" ในการวิเคราะห์เมตาเพื่อเพิ่มพลังทางสถิติของการวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่า="" (ดูวิธีการ)="" 14="" อันดับแรก="" เราประเมินว่า="" cpg="" ที่เกี่ยวข้องกับ="" egfr="" ถูกแมปกับไซต์ที่มีผลผูกพันของ="" 169="" ปัจจัยการถอดรหัส="" (tf)="" ตามโครมาติน="" immunoprecipitation="" ข้อมูล="" dna-sequencing="" (chip-seq)="" จากโครงการ="" encode="" ที่รวบรวมโดยฉันทามติในเซลล์ของมนุษย์="" 91="" ชนิด="" (แทร็ก="" 161="" tf)="">ไตรอยตามเนื้อเยื่อ (ดูวิธีการ) หลังจากการแก้ไขการทดสอบหลายครั้งสำหรับ 169 TFs TF แปดรายการแสดงให้เห็นการปรับปรุงที่สำคัญสำหรับ CpG ที่เกี่ยวข้องกับ eGFR (FDR < 0.05;="" รูปที่="" 4a,="" ข้อมูลเสริม="" 13)="" รวมถึง="" cebpb="" (ค่า="" p="1" 75e−06,="" cross-tissue="" track)="" และ="" ep300="" (ค่า="" p="7.49E−09," รอยขวางของเนื้อเยื่อ)="" สิ่งนี้สอดคล้องกับการค้นพบจาก="" chu="" et="" al.14="" ในกลุ่มย่อยที่มีผู้เข้าร่วม="" 4859="" คนจากผู้เข้าร่วม="" 33,605="" คนวิเคราะห์ที่นี่="" cpg="" ที่เกี่ยวข้องกับ="" uacr="" ถูกทำให้สมบูรณ์ในไซต์การจับของ="" 56="" tfs="" (รูปที่="" 4b,="" ข้อมูลเสริม="" 14)="" ที่มีการเชื่อมโยงที่แข็งแกร่งที่สุดสำหรับ="" polr2a="" (ค่า="" p="6.93E-19)," fos="" (ค่า="" p="" {{32)="" }}.28e-12)="" และ="" ep300="" (ค่า="" p="">

ไต- CpG ที่เกี่ยวข้องกับฟังก์ชันถูกทำให้สมบูรณ์ในวงกว้างสำหรับเครื่องหมายฮิสโตนหลายๆ ตัว โดยมี 82 จาก 195 ชนิดเซลล์ของเครื่องหมายฮิสโตนที่มีนัยสำคัญ (FDR q < 0.05)="" สำหรับ="" egfr="" (รูปที่="" 4c,="" ข้อมูลเสริม="" 15)="" และ="" 79="" จาก="" 195="" สำหรับ="" uacr="" (รูปที่="" 4d,="" ข้อมูลเสริม="" 16)="" การดัดแปลงฮิสโตน="" h3k4me1="" ซึ่งเป็นเครื่องหมายที่เข้มข้นที่เอนแฮนเซอร์ที่ออกฤทธิ์และไพรม์="" ถูกทำให้สมบูรณ์สำหรับเซลล์ทุกประเภทสำหรับ="" cpg="" ที่เกี่ยวข้องกับ="" uacr="" และเซลล์เกือบทั้งหมดสำหรับ="" cpg="" ที่เกี่ยวข้องกับ="" egfr="" ในขณะที่="" cpg="" ที่เกี่ยวข้องกับ="" uacr="" แสดงให้เห็นถึงการเสริมสมรรถนะสำหรับเครื่องหมายโปรโมเตอร์="" h3k4me3="" ในเซลล์="" 34="" ชนิด="">

ประเภทแสดงการเสริมสมรรถนะสำหรับไซต์ที่เกี่ยวข้องกับ eGFR ในทางกลับกัน เครื่องหมายที่เกี่ยวข้องกับยีน H3K36me3 แสดงให้เห็นการเสริมสมรรถนะที่กว้างกว่ามากสำหรับ CpG ที่เกี่ยวข้องกับ eGFR (30 ชนิดเซลล์) มากกว่า CpG ที่เกี่ยวข้องกับ UACR (ห้าชนิดเซลล์) ในทางตรงกันข้ามกับ H3K3me1/3 และ H3K36me3 ซึ่งทั้งหมดเชื่อมโยงกับยีนที่ออกฤทธิ์ (ตัวเสริม โปรโมเตอร์ที่ใช้งานอยู่ การถอดรหัสแบบแอคทีฟ) H3K9me3 และ H3K27me3 ซึ่งโดยทั่วไปเกี่ยวข้องกับเฮเทอโรโครมาติน28–31 ที่เป็นส่วนประกอบและเชิงปัญญา ไม่ได้เสริมสมรรถนะอย่างมีนัยสำคัญสำหรับ UACR- CpG ที่เกี่ยวข้องในเซลล์ประเภทใดก็ตามที่ทดสอบ (รูปที่ 4D, ข้อมูลเสริม 16) การเพิ่มคุณค่าของยีนที่เกี่ยวข้องกับการทำงานของไต- CpG ที่เกี่ยวข้องได้รับการประเมินใน Gene Ontology (GO) สารานุกรมเกียวโตของยีนและจีโนม (KEGG) และฐานข้อมูล Reactome (ดูวิธีการ) 32–35 มีการสังเกตการเสริมสมรรถนะที่สำคัญสำหรับ 27 คำ (25 GO, หนึ่ง KEGG, หนึ่ง Reactome; ข้อมูลเสริม 17, รูปที่ 5A) สำหรับ eGFR และ 91 เงื่อนไข (87 GO, สี่ Reactome; ข้อมูลเสริม 18, รูปที่ 5B) สำหรับ UACR (รูปที่) . 5B). เส้นทางที่เกี่ยวข้องกับการย้ายถิ่นเฉพาะเซลล์เม็ดเลือดขาว การแปล mRNA การแข็งตัวของเลือดและการแข็งตัวของเลือด ตลอดจนการตอบสนองของอินซูลินแสดงให้เห็นการเสริมสมรรถนะที่สำคัญสำหรับ eGFRassociated CpGs (FDR < 0.05;="" รูปที่="" 5a)="" วิถีทางที่มีค่า="" p="" การทำให้อุดมสมบูรณ์ต่ำที่สุดสำหรับตำแหน่งที่เกี่ยวข้องกับ="" uacr="" ถูกครอบงำโดยการกระตุ้นและการตอบสนองของเซลล์ภูมิคุ้มกัน="" และวิถีที่เกี่ยวข้องกับอินเตอร์เฟอรอน="" (รูปที่="" 5b)="" เส้นทางเพิ่มเติมที่ถูกทำให้สมบูรณ์นั้นรวมถึงการโยกย้ายเซลล์เม็ดเลือดขาว="" สำหรับผลลัพธ์="" egfr="" (ข้อมูลเสริม="">

ความสัมพันธ์กับความสัมพันธ์ของ EWAS ที่รู้จักกับลักษณะอื่นๆ เมื่อพิจารณาจากการเสริมสมรรถนะของเส้นทางที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน ผล DNA methylation รวมถึง CpGs ใกล้กับยีนของเส้นทาง interferon และความจริงที่ว่าสถานะ DNA methylation นั้นได้รับการประเมินอย่างเด่นชัดในเม็ดเลือดขาว เราประเมินว่าการค้นพบของเราอาจได้รับแรงหนุนจากผลกระทบที่สับสนของ การตอบสนองของภูมิคุ้มกันหรือสถานะการอักเสบ ดังนั้นเราจึงทำการค้นหา CpG ที่จำลองแบบใน EWAS ขนาดใหญ่ในระดับซีรัม C-reactive protein (CRP) ที่มีความไวสูง 36 มีเพียงสอง CpGs ซึ่งสัมพันธ์กับ DNA methylation และ eGFR inเนื้อเยื่อไตcg09610644 ที่ BDH1 และ cg12644285 ที่ CHD2 อยู่ในตำแหน่งที่เกี่ยวข้องกับ CRP ดังนั้น ผลลัพธ์โดยทั่วไปที่สับสนโดยสถานะการอักเสบตามที่ CRP ประมาณการไว้จึงไม่น่าจะเป็นไปได้

บางส่วนของการทำงานของไต- CpG ที่เกี่ยวข้องที่ระบุในการศึกษานี้มีความเกี่ยวข้องกับลักษณะอื่นๆ อีกหลายอย่างตาม EWAS ที่เผยแพร่ ไซต์ eGFR ยี่สิบเอ็ดแห่งเกี่ยวข้องกับความดันโลหิต การบริโภคแอลกอฮอล์ ค่าดัชนีมวลกาย เพศ ตัวรับปัจจัยเนื้อร้ายเนื้องอกที่ละลายได้ 2 และ/หรือสถานะการสูบบุหรี่ และไซต์ UACR ห้าแห่งก่อนหน้านี้เกี่ยวข้องกับการบริโภคแอลกอฮอล์ สถานะการสูบบุหรี่ ค่าดัชนีมวลกาย ความสำเร็จทางการศึกษา -glutamyl transferase, tumor necrosis factor receptor 2, เบาหวานชนิดที่ 2 และ/หรือสารเมตาโบไลต์ในซีรัมหลายชนิด (ตารางที่ 2, ข้อมูลเสริม 19) CpG สามตัว (ตำแหน่ง UACR ทั้งหมด) สัมพันธ์กับลักษณะมากกว่าสองลักษณะ กล่าวคือ cg02711608 ใน SLC1A5 (ที่มี -glutamyl transferase, -glutamylthreonine, BMI, การบริโภคแอลกอฮอล์), cg18181703 ใน SOCS3 (ที่มีเบาหวานชนิดที่ 2, สถานะการสูบบุหรี่, BMI , ตัวรับปัจจัยเนื้อร้ายเนื้องอกที่ละลายได้ 2) และ cg24859433 ใกล้ IER3 (ที่มีสถานะการสูบบุหรี่, ความสำเร็จทางการศึกษา, 4-ไวนิลฟีนอล_ซัลเฟต) รูปที่ 5B เสริมเป็นตัวอย่าง CpG, cg26099045 ซึ่งมีความสัมพันธ์กับ eGFR และการเกิดพังผืดในเนื้อเยื่อไตในการวิเคราะห์ของเรา และยังเกี่ยวข้องกับเรื่องเพศและการสูบบุหรี่ใน EWAS ก่อนหน้า สุดท้าย cg17944885 ที่ ZNF788 ยังสัมพันธ์กับ eGFR ในกลุ่มตัวอย่างของผู้ป่วย DKD22

การอภิปราย

ใน EWAS นี้ของการทำงานของไตเราระบุและจำลองระดับ DNA methylation ในเลือดที่ 69 CpG ที่เกี่ยวข้องกับ eGFR ในจำนวนนี้ ก่อนหน้านี้ 60 ไซต์ไม่ได้รายงาน เช่นเดียวกับ CpG ทั้งเจ็ดที่ระบุร่วมกับ UACR CpG ที่เกี่ยวข้องกับ eGFR และ UACR ส่วนใหญ่มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญกับผลลัพธ์ทางคลินิก เช่น CKD และ microalbuminuria ดังนั้นจึงอาจมีโอกาสในการแบ่งกลุ่มบุคคลที่มีความเสี่ยง ความแปรปรวนของ eGFR ที่เกิดจาก 69 CpGs เหล่านี้คือ 2.4 เปอร์เซ็นต์ - สองเท่าของ EWAS14 รุ่นก่อนหน้า และเทียบได้กับความแปรปรวนที่อธิบายโดย 29 SNP ที่ค้นพบโดย GWAS ซึ่งรวมขนาดตัวอย่างที่สูงขึ้นสามเท่าสำหรับการค้นพบโลคัส37,38 นี่ชี้ให้เห็นว่าดิฟเฟอเรนเชียล DNA methylation ที่ CpG แต่ละตัวที่หาปริมาณจากเลือดอธิบายความแปรปรวนของ eGFR ได้มากกว่า SNP ทั่วไปในขนาดตัวอย่างที่กำหนด สำหรับ UACR ดูเหมือนว่าต้องใช้ขนาดตัวอย่างที่ใหญ่กว่าเมื่อเปรียบเทียบกับ eGFR เพื่อแสดงจำนวน CpG ที่เกี่ยวข้องกับลักษณะใกล้เคียงกัน เนื่องจากอัลบูมินและครีเอตินีนสำหรับการคำนวณ UACR ถูกวัดในปัสสาวะ ซึ่งต่างจากการวัดปริมาณครีเอตินีนจากซีรัมสำหรับการประมาณค่า GFR ความแตกต่างนี้ไม่ได้คาดไม่ถึง และสอดคล้องกับการสังเกตจาก GWAS ของลักษณะเหล่านี้10,13 นอกจากนี้ ความผันแปรทางพันธุกรรมดูเหมือนว่าจะส่งผลกระทบต่อการทำงานของไตลักษณะผ่านวิถีทางที่แตกต่างจากการเปลี่ยนแปลงของ DNA methylation ซึ่งได้รับการสนับสนุนโดยความเหลื่อมล้ำต่ำระหว่างไซต์ EWAS และ GWAS ที่จำลองแบบสำหรับทั้ง eGFR และ UACR

การวิเคราะห์เมตาของ EWAS นี้รวมตัวอย่างของประชากรและชาติพันธุ์ต่างๆ เราสังเกตเห็นความสัมพันธ์สูงของการประมาณผลกระทบที่ได้รับจากตัวอย่างย่อยขนาดใหญ่ของบุคคล EA ที่มีผลกระทบโดยประมาณในบุคคล AA (รูปที่ 2) แม้จะมีการรวมข้อมูลจากบุคคลจำนวนมากที่ไม่ใช่บรรพบุรุษของ EA แต่ผลลัพธ์โดยรวมของ EWAS ข้ามชาติพันธุ์อาจได้รับแรงหนุนจากข้อมูลจากบุคคลในวงศ์ตระกูล EA ซึ่งคิดเป็นร้อยละ 70 (eGFR) / 65 เปอร์เซ็นต์ (UACR) ของการศึกษาของเรา (ข้อมูลเสริม 3 และ 4) เพื่อจัดการกับข้อจำกัดนี้ การวิเคราะห์ในอนาคตด้วยสัดส่วนที่เพิ่มขึ้นของตัวอย่างที่ไม่ใช่ EA เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการประเมินที่เชื่อถือได้และมีรายละเอียดระหว่างความแตกต่างของบรรพบุรุษ ศักยภาพในการแปลข้อมูลเชิงลึกจาก EWAS ของลักษณะเชิงปริมาณในการศึกษาตามประชากรส่วนใหญ่ไปยังบุคคลที่เป็นโรคนั้นแสดงให้เห็นโดยข้อเท็จจริงที่ว่าการประมาณผลที่ 65 จาก 69 eGFR ที่เกี่ยวข้องกับ CpGs ถูกสังเกตในทิศทางเดียวกันในกลุ่มผู้ป่วยโรคไตวายเรื้อรัง 551 คน ชี้ไปที่กลไกที่ใช้ได้ในระดับ eGFR ที่หลากหลาย (รูปที่ 3) นอกจากนี้,

cg07242931 ใน MAN1C1 และ cg18194850 ใน SUCLG2 ไม่เพียงเกี่ยวข้องกับ eGFR เท่านั้น แต่ยังคาดการณ์เวลาที่จะไตล้มเหลวหรือเฉียบพลันไตบาดเจ็บ(ข้อมูลเสริม 8) หลักฐานเพิ่มเติมสำหรับการมีส่วนร่วมของ SUCLG2 ซึ่งเข้ารหัส -subunit ของการสังเคราะห์ succinyl-CoA ในโรคไตได้รับการแนะนำโดย GWAS ในผู้ป่วยเบาหวานโรคไตในชาวอเมริกันอินเดียน (SNP=rs4453858, P-value=2E−6)39. ความผันแปรทางพันธุกรรมในยีนนี้ยังสัมพันธ์กับระดับซัคซินิลคาร์นิทีนในปัสสาวะ (C4DC, SNP=rs115560420, P-value=7E-15)40 C4DC เป็นผลิตภัณฑ์เมตาบอลิซึมจากวัฏจักรกรดไตรคาร์บอกซิลิก ซึ่งกระตุ้นภายใต้การมีส่วนร่วมของการสังเคราะห์ succinyl-CoA และระดับ C4DC ในเลือดที่สูงขึ้นซึ่งสัมพันธ์กับ eGFR41 ที่ต่ำกว่า อย่างไรก็ตาม การค้นหาในผลลัพธ์ของ methylation quantitative trait loci (meQTL) ของ GoDMC (http://www.godmc.org.uk)42 ไม่ได้เปิดเผยความสัมพันธ์ที่มีนัยสำคัญของ SNP ทั้งสองนี้กับ cg18194850 ซึ่งบ่งชี้ว่าไม่มีการเชื่อมโยงโดยตรงระหว่าง SNP เหล่านี้ และเว็บไซต์ CpG

เนื่องจาก DNA methylation เป็นตัวควบคุมหลักของการแสดงออกของยีน เราจึงประเมินความสัมพันธ์ของไซต์ methylation DNA ที่เกี่ยวข้องกับลักษณะกับระดับ mRNA ของยีนใน cis ยีนที่มีระดับ mRNA สัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญกับการทำงานของไตตำแหน่งที่เกี่ยวข้องกับเมทิลเลชันของ DNA เกี่ยวข้องกับวิถีทางอินเตอร์เฟอรอน (ทั้งสำหรับ eGFR และ UACR) แม้ว่าการค้นพบนี้จะเห็นด้วยกับผลลัพธ์การเพิ่มประสิทธิภาพของเส้นทางสำหรับ UACR (รูปที่ 5B, ข้อมูลเสริม 18) จำนวนความสัมพันธ์ที่มีนัยสำคัญระหว่าง CpG ที่สัมพันธ์กับ UCR และระดับการถอดเสียงนั้นค่อนข้างต่ำ สิ่งนี้ไม่น่าแปลกใจเมื่อพิจารณาจากขนาดตัวอย่างที่ค่อนข้างเล็กของบุคคลในปี 1915 ที่มีให้สำหรับการวิเคราะห์นี้ และความครอบคลุมที่จำกัดของทรัพยากรการถอดรหัส ที่น่าสนใจ ในบรรดาการค้นพบที่สำคัญสำหรับ UACR นั้น CpG สองตัวที่ตัวพาตัวถูกละลายในแฟมิลี 1 สมาชิก 5 (SLC1A5) สัมพันธ์กับการแสดงออกของยีนที่แตกต่างกันและยังมีความดันโลหิตอีกด้วย DNA methylation ที่ SLC1A5 ซึ่งเข้ารหัสตัวขนส่งกรดอะมิโนที่เป็นกลางที่ขึ้นกับโซเดียม อาจเป็นองค์ประกอบเพิ่มเติมที่มีส่วนทำให้เกิดความสัมพันธ์ที่ทราบกันระหว่าง UACR กับความดันโลหิต

ทรานสคริปต์ที่แสดงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญไม่ได้เข้ารหัสโดยยีนที่ใกล้ที่สุดเสมอ (cg17944885 ใกล้ ZNF788) หรือไซต์ CpG มีความสัมพันธ์กับยีนหลายตัวใน cis (cg04864179 ที่ IRF5) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ความสัมพันธ์ของ DNA methylation ที่ cg04864179 กับระดับการถอดรหัส IRF5 นั้นมีความโดดเด่น เมื่อพิจารณาผลลัพธ์ MR ที่สำคัญของ CpG นี้กับ eGFR แล้ว DNA methylation ที่ IRF5 อาจส่งผลต่อ eGFR ที่เป็นสื่อกลางโดยการแสดงออกของยีน เมื่อพิจารณาการเปลี่ยนแปลงลักษณะของการเชื่อมโยงทางพันธุกรรมพื้นฐาน (ดูวิธีการ) เราสังเกตเห็นว่าการเพิ่มขึ้นของ DNA methylation ของค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานสิบส่วนส่งผลให้ eGFR สูงขึ้น 3.2 เปอร์เซ็นต์ แม้ว่าผลกระทบโดยประมาณนี้จะน้อยมาก แต่อิทธิพลเชิงสาเหตุของรูปแบบเมทิลเลชันในเซลล์เม็ดเลือดใน CKD ยังได้รับการสนับสนุนโดย MR แบบสรุปที่มีชุดข้อมูล meQTL ที่แตกต่างกันในการศึกษาเมื่อเร็วๆ นี้ โดยที่ผลเชิงสาเหตุสอดคล้องกับผลลัพธ์ของเราในเชิงทิศทาง22 พวกเขายังแสดงให้เห็นว่าผลกระทบทางพันธุกรรมของโลคัสนี้ต่อ eGFR นั้นถูกสื่อกลางโดย IRF5 methylation และการแสดงออกของยีนในเลือด นอกจากนี้ ยังแสดง colocalization ของการแสดงออกของยีน IRF5 ด้วย eGFR ทั้งในช่องท่อและไตของไตเนื้อเยื่อ43. เมื่อตีความผลเชิงสาเหตุที่สังเกตพบในการศึกษาของเรา อย่างไรก็ตาม ควรจำไว้ว่าการวิเคราะห์ MR สำหรับ CpG cg04864179 มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.05)="" ในเครื่องมือต่างๆ="" (ข้อมูลเสริม="" 11="" และรูปที่="" 7="" เพิ่มเติม="">

IRF5 เข้ารหัสสมาชิกของตระกูลปัจจัยการกำกับดูแลของอินเตอร์เฟอรอน (IRF) กลุ่มสมาชิกในครอบครัว IRF ประกอบด้วยปัจจัยการถอดรหัสที่มีบทบาทต่างกัน เช่น การปรับการทำงานของระบบภูมิคุ้มกัน การเติบโตและการเปลี่ยนแปลง ตลอดจนการควบคุมการแสดงออกของยีนสำหรับการตอบสนองต่ออินเตอร์เฟอรอนต่อการติดเชื้อไวรัส IRF5 สามารถส่งผลต่อการตอบสนองของเซลล์ภูมิคุ้มกัน การศึกษาหลายชิ้นสนับสนุนว่าการเปลี่ยนแปลงใน IRF5 methylation อาจส่งผลกระทบการทำงานของไตทางภูมิคุ้มกัน: SNPs ใน IRF5 สัมพันธ์กับ SLE โดยผ่านการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของ IRF5 ในโมโนไซต์ในเลือด 44–46 SLE เป็นโรคภูมิต้านตนเองที่โดดเด่นด้วยการกระตุ้นเส้นทาง IFN ที่อาจส่งผลต่อไตเป็นโรคไตอักเสบลูปัส47 การยับยั้ง IRF5 hyperactivation ในรูปแบบเมาส์ของ SLE ที่ได้รับการปกป้องจากการโจมตีและความรุนแรงของโรคลูปัสโรคไตอักเสบและดีขึ้นการทำงานของไตและพยาธิวิทยา48,49. แม้ว่า EWAS ของเราไม่ได้เน้นที่การศึกษาผู้ป่วยโรค SLE แต่ผลกระทบเล็กน้อยของ IRF5 methylation ต่อผลลัพธ์ที่เกี่ยวข้องกับไต ซึ่งอาศัยการแสดงออกอย่างน้อยบางส่วนและวิถี IFN ที่ตามมา อาจถูกตรวจพบว่าเป็นผลกระทบต่อ eGFR ในประชากรทั่วไป

CISTANCHE จะช่วยเพิ่มอาการปวดไต/ไต

CpG ที่เกี่ยวข้องกับ eGFR หลายตัวที่ DNA methylation ถูกหาปริมาณจากเซลล์เม็ดเลือดก็สัมพันธ์กับ eGFR และไตพังผืดเมื่อหาปริมาณเมทิลดีเอ็นเอจากไตเนื้อเยื่อ แม้ว่าขนาดตัวอย่างจะเล็กกว่ามากเมื่อเทียบกับชุดข้อมูล EWAS นี่ชี้ให้เห็นว่าอย่างน้อยบางส่วนของการค้นพบที่ได้รับจากเลือดสามารถแปลเป็นเนื้อเยื่อเป้าหมายที่จำเพาะต่อลักษณะเพิ่มเติมได้ ที่นี่เลือดและไตเป็นเนื้อเยื่อเป้าหมายเฉพาะลักษณะหลักสองอย่าง เนื่องจากการทำงานของไตเป็นการกรองเลือดเพื่อกำจัดของเสีย การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าของการทำงานของไตCpG ที่เกี่ยวข้องชี้ให้เห็นถึงบทบาทสำคัญในการควบคุมการถอดรหัส เราพบว่ามีการเพิ่มประสิทธิภาพของ H3K4me1/3 และ H3K36me3 อย่างกว้างขวาง H3K4me1 / 3 เชื่อมโยงกับไพรเมอร์และแอกทีฟเอนแฮนเซอร์ตลอดจนโปรโมเตอร์ที่ออกฤทธิ์ และ H3K36me3 มีความสัมพันธ์อย่างแน่นแฟ้นกับบริเวณที่คัดลอกมาของจีโนม50 บทบาทของการควบคุมการถอดรหัสได้รับการสนับสนุนเพิ่มเติมโดยสัญญาณเสริมสมรรถนะปัจจัยการถอดรหัสที่แข็งแกร่งที่สุดของ CpG ที่เกี่ยวข้องกับ UACR ซึ่งเป็น POLR2A ซึ่งเป็นหน่วยย่อยที่ใหญ่ที่สุดของเอนไซม์หลักที่สังเคราะห์ mRNA ในยูคาริโอต

ข้อจำกัดที่อาจเกิดขึ้นที่เกี่ยวข้องกับการวิเคราะห์ MR รวมถึงเครื่องมือที่ถูกต้องไม่สามารถใช้ได้สำหรับ CpG ทั้งหมดสำหรับ MR ไปข้างหน้า เนื่องจากเครื่องมือทั้งหมดของ CpG ได้รับการคัดเลือกจากบริเวณ cis กล่าวคือ อยู่ในบริเวณพันธุกรรมเดียวกัน จึงมีแนวโน้มว่าเครื่องมือทั้งหมดของ CpG จะใช้ได้หรือไม่ถูกต้อง ดังนั้นจึงจำกัดจำนวนวิธี MR ต่างๆ ที่สามารถนำมาใช้เพื่อทดสอบ ความทนทานของผลลัพธ์51. MR แบบย้อนกลับมีกำลังจำกัดเนื่องจากขนาดตัวอย่างเล็กที่มีอยู่สำหรับการประมาณความสัมพันธ์ของ SNP-DNA methylation การศึกษา meQTL ที่ใหญ่ขึ้น เช่น GoDMC ไม่สามารถจัดเก็บผลลัพธ์การเชื่อมโยงสำหรับ SNP ทั้งหมด (กล่าวคือ อยู่เหนือจุดตัดค่า P-value ของการเชื่อมโยงบางอย่าง) เนื่องจากเหตุผลทางเทคนิค ดังนั้นจึงไม่สามารถใช้กับ MR ย้อนกลับสองตัวอย่างได้ ดังนั้น จึงต้องตีความข้อค้นพบที่ไม่มีนัยสำคัญด้วยความระมัดระวัง นอกจากนี้ การตีความขนาดผลเชิงสาเหตุทำได้ยาก เนื่องจากความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมพื้นฐานคำนวณจากมาตราส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของระดับเมทิลดีเอ็นเอ ข้อจำกัดที่เป็นไปได้อีกประการหนึ่งของการศึกษาคือ eGFR, CKD และ UACR เป็นฟีโนไทป์ที่ประเมินจากพารามิเตอร์พื้นฐานที่แตกต่างกันและมีอิทธิพลหลายปัจจัย ดังนั้นเราจึงทำการวิเคราะห์หลายครั้งเพื่อให้แน่ใจว่าผลลัพธ์ EWAS ของเราไม่ได้ถูกขับเคลื่อนโดยปัจจัยที่เป็นที่รู้จัก ซึ่งรวมถึงโรคเบาหวานประเภท 2 ซึ่งเป็นปัจจัยที่อาจก่อให้เกิดความสัมพันธ์ระหว่าง DNAm กับการทำงานของไต. ประการแรก การเชื่อมโยง EWAS ในแต่ละกลุ่มประชากรตามรุ่นได้รับการปรับปรุงสำหรับตัวสร้างความสับสนเพื่อลบผลกระทบภายในกลุ่มประชากรตามรุ่น ประการที่สอง มีการดำเนินการ EWAS ในแต่ละกลุ่มผลิตภัณฑ์ จากนั้นจึงวิเคราะห์เมตา ซึ่งสอดคล้องกับการปรับ เช่น สำหรับความชุกของโรคเบาหวานในกลุ่มประชากรตามรุ่น สุดท้าย เราได้ตรวจสอบความสัมพันธ์ของ CpG ที่จำลองแบบของเราภายในการศึกษา EWAS เกี่ยวกับโรคเบาหวานที่เผยแพร่ จากการเชื่อมโยง CpG ที่จำลองแบบทั้งหมดของเรา มีเพียง CpG ที่เกี่ยวข้องกับ UACR cg18181703 ที่ SOCS3 เท่านั้นที่แสดงความสัมพันธ์กับโรคเบาหวานประเภท 2 CpG นี้ยังสัมพันธ์กับสถานะการสูบบุหรี่ ค่าดัชนีมวลกาย และระดับเลือดของตัวรับปัจจัยเนื้อร้ายเนื้องอกที่ละลายได้ 2 โดยคำนึงถึงว่า EWAS ของเราได้รับการปรับสถานะการสูบบุหรี่และ BMI ด้วย เราถือว่าผลของ cg18181703 ต่อ UACR อยู่ที่ อย่างน้อยบางส่วนเป็นอิสระจากโรคเบาหวานประเภท 2 ค่าดัชนีมวลกายและสถานะการสูบบุหรี่ แม้ว่าเราจะควบคุมปัจจัยที่ทราบเหล่านี้หลายประการ แต่ปัจจัยอื่นๆ เช่น covariates ที่ไม่ได้วัดก็ไม่สามารถปรับเปลี่ยนได้อย่างชัดเจนในการวิเคราะห์และอาจส่งผลต่อการค้นพบ

จำเป็นต้องมีการศึกษา EWAS เพิ่มเติมด้วยขนาดตัวอย่างที่เพิ่มขึ้นและด้วย DNA methylation ที่วัดจากเนื้อเยื่อเพิ่มเติมตลอดจนการวิเคราะห์เชิงหน้าที่ เพื่อเพิ่มพูนความรู้ของเราเกี่ยวกับกลไกการกำกับดูแลของการทำงานของไตและเพื่อปรับปรุงการทำนายและการรักษา .ในที่สุดไตโรค. สิ่งนี้เป็นจริงโดยเฉพาะสำหรับ UACR โดยพิจารณาจากจำนวนการเชื่อมโยง CpG ที่มีนัยสำคัญที่สังเกตพบได้น้อยกว่า โดยสรุป การวิเคราะห์เมตาของ EWAS ขนาดใหญ่นี้ได้ขยายจำนวน CpG ที่ทำซ้ำได้อย่างมากซึ่งเกี่ยวข้องกับ eGFR และ CKD และเผยให้เห็นความสัมพันธ์เจ็ดประการสำหรับ UACR และ microalbuminuria DNA methylation ที่ไซต์เหล่านี้อธิบายความแปรปรวนของ eGFR ส่วนใหญ่ และความแตกต่างของ methylation ที่ CpG สี่ตัวแสดงหลักฐานสำหรับความสัมพันธ์เชิงสาเหตุที่อาจเกิดขึ้นกับ eGFR ลักษณะที่ครอบคลุมของ CpG ที่จำลองแบบในผู้ป่วย CKD, inเนื้อเยื่อไตสำหรับการแสดงออกของยีนที่แตกต่างกันและสำหรับเส้นทางที่สมบูรณ์และเครื่องหมาย epigenetic ให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับการทำงานของไต-ระเบียบการถอดความที่เกี่ยวข้อง

วิธีการ

ภาพรวมเราตั้งค่าการวิเคราะห์เมตาการทำงานร่วมกันตามแบบจำลองข้อมูลแบบกระจายและขั้นตอนการควบคุมคุณภาพ เพื่อเพิ่มมาตรฐานฟีโนไทป์สูงสุดระหว่างการศึกษา แผนการวิเคราะห์และสคริปต์บรรทัดคำสั่ง (https://github.com/ generic-Freiburg/Skagen-pheno/tree/ckdgen-ewas-pheno) ได้ถูกสร้างขึ้นและจัดเตรียมไว้สำหรับการศึกษาที่เข้าร่วมทั้งหมด ( การศึกษาตามประชากรส่วนใหญ่ ข้อมูลเสริม 1 และ 2) ไฟล์สรุปที่สร้างขึ้นโดยอัตโนมัติได้รับการตรวจสอบจากส่วนกลาง เมื่อได้รับการอนุมัติฟีโนไทป์ การศึกษาได้ดำเนินการ EWAS และอัปโหลดผลลัพธ์และรวบรวมข้อมูล DNA methylation ไปยังเซิร์ฟเวอร์ส่วนกลาง การควบคุมคุณภาพ EWAS ดำเนินการด้วยสคริปต์ที่กำหนดเองเพื่อประเมินอัตราเงินเฟ้อ การควบคุมเชิงบวก การกระจายของโพรบ CpG และเปรียบเทียบการกระจายโดยรวมของขนาดผลกระทบ ข้อผิดพลาดมาตรฐาน และค่า P ระเบียบวิธีการศึกษาทั้งหมดได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมท้องถิ่นที่เกี่ยวข้อง ผู้เข้าร่วมทั้งหมดในการศึกษาทั้งหมดได้ให้ความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษร

CISTANCHE จะปรับปรุงการฟอกไต/ไต

คำจำกัดความของฟีโนไทป์ค่า Creatinine ที่ได้จากการทดสอบ Jaffé ก่อนวันที่ 2009 ถูกปรับเทียบโดยการคูณด้วย 0.9552 การศึกษาประเมิน GFR ด้วย Chronicโรคไตสมการความร่วมมือทางระบาดวิทยา (CKD-EPI)53. eGFR ได้รับ winsorized ที่ 15 และ 200 มล. ขั้นต่ำ-1 ต่อ 1.73 m2 CKD ถูกกำหนดให้เป็น eGFR ที่ต่ำกว่า 60 มล. ขั้นต่ำ-1 ต่อ 1.73 m2 ค่า UACR ที่วัดเป็นมิลลิกรัม/กรัมถูกเปลี่ยนรูปล็อกตามธรรมชาติก่อนการวิเคราะห์ทั้งหมด ไมโครอัลบูมินูเรียถูกกำหนดเป็น 1 สำหรับ UACR > 30 มก./กรัม และ 0 สำหรับค่า UACR < 10="">

การหาปริมาณ DNA methylation และการควบคุมคุณภาพสำหรับการหาปริมาณของ DNA methylation นั้น genomic DNA ถูกสกัดจากเลือดส่วนปลาย ระดับของ DNA methylation ถูกหาปริมาณโดยใช้ Infinium MethylationEPIC BeadChip array (EPIC), Illumina Infinium HumanMethylation450K BeadChip array (HM450K) หรือ Illumina Infinium HumanMethylation27 BeadChip array (HM27K) การประมวลผลข้อมูลล่วงหน้าของ DNA methylation ดำเนินการตามโปรโตคอลการศึกษาแต่ละรายการ รวมถึงการแก้ไขพื้นหลัง การทำให้เป็นมาตรฐานของควอนไทล์ การกรองโพรบ การกรองตัวอย่าง การจับคู่ SNP กับตำแหน่งโพรบควบคุม SNP การกรองค่าผิดปกติ และการแก้ไขประเภทการทดสอบ (ข้อมูลเสริม 3) ระดับเมทิลเลชันที่แต่ละไซต์ถูกแสดงและวิเคราะห์เป็น -value โพรบ CpG ทับซ้อนกับ SNP ถูกใส่หมายเหตุประกอบ การศึกษาแต่ละครั้งคำนวณค่าเฉลี่ยและส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของแต่ละไซต์ CpG และสถิติสรุปเหล่านี้ถูกเปรียบเทียบระหว่างการศึกษาสำหรับความแตกต่างอย่างเป็นระบบใน CpG และติดตามกับนักวิเคราะห์การศึกษารายบุคคล

การประเมินค่าตัวแปรร่วมDNA methylation และ covariates ถูกวัดที่การเยี่ยมชม/จุดเวลาเดียวกัน โรคเบาหวานที่แพร่หลายถูกกำหนดให้เป็นระดับน้ำตาลในเลือดขณะอดอาหาร มากกว่าหรือเท่ากับ 126 มก./ดล. ระดับน้ำตาลในเลือดที่ไม่อดอาหาร มากกว่าหรือเท่ากับ 200 มก./ดล. การรักษาโรคเบาหวาน หรือการรายงานตนเองเกี่ยวกับการวินิจฉัยโรคเบาหวาน ความดันโลหิตสูงที่แพร่หลายถูกกำหนดให้เป็นความดันโลหิตซิสโตลิกมากกว่าหรือเท่ากับ 140 มม. ปรอท ความดันโลหิตไดแอสโตลิกมากกว่าหรือเท่ากับ 90 มม. ปรอท หรือการรักษาความดันโลหิตสูง หากไม่มีการวัดความดันโลหิต ความดันโลหิตสูงถูกกำหนดโดยการรายงานด้วยตนเอง สถานะการสูบบุหรี่ในปัจจุบันถูกกำหนดโดยใช้ข้อมูลที่รายงานด้วยตนเอง ค่าดัชนีมวลกาย (กก./ตร.ม.) คำนวณโดยใช้การวัดน้ำหนักและส่วนสูงตามที่ประเมินในการศึกษาแต่ละครั้ง อายุถูกรวมเป็นค่าต่อเนื่องในแบบจำลองความสัมพันธ์ โครงสร้างประชากรในการศึกษานอกครอบครัวถูกปรับโดยองค์ประกอบหลักทางพันธุกรรม (PC) สัดส่วนของชนิดเม็ดเลือดขาวถูกประเมินโดยอาศัย DNA methylation54 ตัวแปรร่วมทางเทคนิคเพิ่มเติม ได้แก่ PCs55 โพรบควบคุม, ศูนย์การศึกษา, ชุดการประมวลผล, ID อาร์เรย์เซนทริกซ์ และตำแหน่ง Sentrix

วิธีการทางสถิติและการวิเคราะห์เมตา. เพื่อให้แน่ใจว่ามีกำลังที่เปรียบเทียบได้ระหว่างไซต์ที่วิเคราะห์ เฉพาะ CpG แบบออโตโซมที่วัดโดยทั้ง EPIC และ HM450K เท่านั้นจึงถูกรวมไว้ในการวิเคราะห์ การศึกษาแต่ละครั้งทำการวิเคราะห์การถดถอยเชิงเส้นโดยแยกตามกลุ่มบรรพบุรุษ สำหรับการประเมินความทนทานของผลลัพธ์ EWAS การวิเคราะห์จำกัดเฉพาะการศึกษาและตัวอย่างย่อยของบุคคลในวงศ์ตระกูลยุโรป ค่า DNA methylation ถูกจำลองเป็นตัวแปรตามโดยมีลักษณะเป็นค่า eGFR หรือ UACR แบบต่อเนื่องหรือค่าไบนารี CKD หรือตัวแปร microalbuminuria: DNA methylation ~ ลักษณะบวกเพศบวกอายุบวกพีซีทางพันธุกรรมบวกสัดส่วนเซลล์เม็ดเลือดขาวบวก covariates ทางเทคนิคบวกกับโรคเบาหวานและความดันโลหิตสูงบวก ค่าดัชนีมวลกายรวมกับการสูบบุหรี่ในปัจจุบัน ผู้เข้าร่วมต้องการข้อมูลที่สมบูรณ์สำหรับตัวแปรทั้งหมดและสถิติสรุปการศึกษา และรวมไว้ก็ต่อเมื่อมีผู้เข้าร่วมอย่างน้อย 50 คนสำหรับ eGFR/UACR และ 50 ราย/กลุ่มควบคุมสำหรับ CKD/microalbuminuria ตามลำดับ EWAS เฉพาะการศึกษาแต่ละรายการได้รับการปรับสำหรับอัตราเงินเฟ้อก่อนการวิเคราะห์เมตาโดยวิธี BACON หากการประมาณการเงินเฟ้อมากกว่าหรือเท่ากับหนึ่ง (รูปที่ 8)56 เสริม การศึกษาถูกแบ่งออกเป็นการค้นพบและการจำลองแบบตามลำดับเวลาของการมีส่วนร่วมในการวิเคราะห์เมตาดาต้าของ CKDGen Consortium (ข้อมูลเสริม 1 และ 2) การวิเคราะห์เมตาถ่วงน้ำหนักแบบถ่วงน้ำหนักแบบผกผันแบบคงที่ที่ดำเนินการในแพ็คเกจ R 'metafor' (เวอร์ชัน 21-0) ถูกดำเนินการสำหรับการศึกษาการค้นพบ การศึกษาการจำลองแบบ และสำหรับการประมาณผลของการค้นพบและการจำลองแบบที่เป็นผลลัพธ์ CpG ถูกแยกออกหากมีขนาดตัวอย่างน้อยกว่าครึ่งหนึ่งภายในการค้นพบหรือการจำลองแบบ หรือถ้าค่าประมาณความแตกต่างของ I2 มากกว่า 95 เปอร์เซ็นต์ การจำลองแบบที่ประสบความสำเร็จของ CpG ที่เกี่ยวข้องถูกกำหนดให้เป็นทิศทางที่สอดคล้องกันของการประเมินผลกระทบระหว่างการค้นพบ (ดิสก์ neGFR=22,347, ดิสก์ nUACR=11,458) และการจำลองแบบ (การจำลอง neGFR=11,258 , nUACR repl=3610) การวิเคราะห์เมตา, Bonferroni ปรับความสำคัญของการค้นพบ P-value (pdisc)<1.1e−7 (#cpgs="" egfr="441,870," #cpgs="" uacr="441,854)," nominal="" significance="" of="" the="" replication="" p-value="" (prepl)=""><0.05, and="" a="" combined="" discovery="" and="" replication="" p-value="" (pcomb)=""><>

การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนผลกระทบของการทำงานของไตCpG ที่เกี่ยวข้องกับลักษณะได้รับการทดสอบสำหรับความสัมพันธ์กับการแสดงออกของยีนในเลือดโดยใช้ชุดข้อมูลสองชุด: (1) ระดับ mRNA ของโมโนไซต์จากผู้เข้าร่วมการศึกษา MESA 1202 ราย และ (2) mRNA ในเลือดครบจำนวน 713 รายของ KORA F4 การศึกษา 57,58 เป็นขั้นตอนเริ่มต้น การค้นหาระดับ CpG methylation ที่มีระดับ mRNA ที่มีอยู่ในผลการเชื่อมโยงจากการศึกษา MESA ได้ดำเนินการ สำหรับการค้นหานี้ มีผลลัพธ์การเชื่อมโยงกับค่า P < 1e{{10}}="" การวิเคราะห์ได้อธิบายไว้อย่างละเอียดใน="" kennedy="" et="" al.59="" โดยย่อ="" การแสดงออกของยีนได้รับการประเมินโดยใช้="" illumina="" humanht-12="" v3.0="" และ="" v4.0="" expression="" beadchips="" และ="" dna="" methylation="" โดยอาร์เรย์="" illumina="" hm450k="" ค่านิพจน์ถูกทำให้เป็นมาตรฐานโดยใช้การเปลี่ยนแปลงที่ทำให้คงตัวของความแปรปรวน="" การถอดเสียง="" 13,933="" รายการจากอาร์เรย์="" v3.0="" และ="" v4.0="" ซึ่งแสดงออกมาเหนือระดับพื้นหลังอย่างมีนัยสำคัญ="" (ค่า="" p="" การตรวจจับ="">< 0.01)="" อย่างน้อย="" 5="" เปอร์เซ็นต์ของอาสาสมัคร="" การวิเคราะห์การเชื่อมโยงใน="" mesa="" ดำเนินการในรูปแบบผสมเชิงเส้นโดยใช้ค่าการแสดงออกของยีนที่แปลงบันทึกเป็นตัวแปรตาม="" ค่า="" dna="" methylation="" beta="" เป็นตัวแปรอิสระโดยเพิ่มอายุ="" เพศ="" เชื้อชาติ="" และศูนย์การศึกษาเป็นตัวแปรร่วมในแบบจำลอง="" การทดสอบความสัมพันธ์ครั้งที่สองได้ดำเนินการในชุดข้อมูล="" kora="" f4="" ความสัมพันธ์ของระดับเมทิลเลชันที่="" cpg="" ที่จำลองแบบด้วยระดับการแสดงออกของยีนของยีนภายในบริเวณใกล้เคียง="" ±500="" kb="" คำนวณโดยใช้ล็อก2-ระดับ="" mrna="" ที่เปลี่ยนรูปแบบที่ได้รับจากอาร์เรย์การแสดงออกของยีน="" illumina="" human="" ht-12v3="" ค่าการแสดงออกของยีนถูกถดถอยในค่า="" dna="" methylation="" beta="" ที่ปรับตามเพศและอายุ="" ก่อนการวิเคราะห์="" ปัจจัยทางเทคนิค="" เช่นเดียวกับสัดส่วนของเซลล์เม็ดเลือด="" ถูกถดถอยออกจากระดับ="" mrna="" และ="" dna="" methylation="" และส่วนที่เหลือถูกรวมไว้ในแบบจำลองการเชื่อมโยงขั้นสุดท้าย="" การตรวจสอบคำอธิบายประกอบและการควบคุมคุณภาพของโพรบการแสดงออกของยีนเป็นไปตามตารางที่ให้ไว้ใน="" schurmann="" et="" al.60="" ความสัมพันธ์การแสดงออกของยีน="" cpg="" ในเลือดที่มีอยู่ในผลลัพธ์ของ="" mesa="" และมีค่าความสัมพันธ์=""><0.05 in="" kora="" f4="" with="" consistent="" effect="" direction="" were="" considered="" as="" significant.="" all="" gene="" expression="" probes="" passed="" the="" annotation-based="" quality="" control="">

DNA methylation ในเนื้อเยื่อไตการวิเคราะห์โดยใช้ DNA methylation ในเนื้อเยื่อไตด้วย eGFR และการเกิดพังผืดถูกดำเนินการโดยใช้ข้อมูลจาก 506 microdissectedเนื้อเยื่อไตตัวอย่างโดยใช้ Illumina EPIC BeadChip ตัวอย่างเนื้อเยื่อไตถูกเก็บแยกจากกัน และแตกต่างจากตัวอย่างเลือดที่วิเคราะห์ในการวิเคราะห์เมตาของ EWAS ตัวอย่างเหล่านี้รวบรวมจากส่วนที่ไม่ได้รับผลกระทบของเนื้องอกในไตและเตรียมตามที่อธิบายไว้ก่อนปี 61 โดยสังเขป ซอฟต์แวร์ SeSAMe 62 ถูกใช้เพื่อดำเนินการก่อนประมวลผลและควบคุมคุณภาพ รวมถึงการตรวจหาตามความเข้มต่ำ การแก้ไขเลือดออกตลอดในการลบพื้นหลัง การแก้ไขอคติของสีย้อมแบบไม่เชิงเส้น ควบคุมการแปลงไบซัลไฟต์ การคำนวณค่าเบต้า และการประมาณเศษส่วนของเม็ดเลือดขาว ค่าเบต้าของ CpG ที่เกี่ยวข้องกับ eGFR และ UACR และข้อมูลทางคลินิกถูกดึงออกมาเพื่อวิเคราะห์ความสัมพันธ์ แบบจำลองการถดถอยถูกนำมาใช้เพื่อทดสอบความสัมพันธ์ของ DNA methylation betas ของ CpGs สุดท้ายเป็นตัวแปรตามที่มีระดับ eGFR และการเกิดพังผืดตามลำดับ โดยตัวแปรอิสระที่ปรับตามเพศ อายุ พีซีทางพันธุกรรม (1-5) สถานะโรคเบาหวาน ภาวะความดันโลหิตสูง , BMI, Array Sentrix ID, ตำแหน่ง Sentrix และการควบคุมการแปลงไบซัลไฟต์และเศษส่วนเม็ดเลือดขาวโดยประมาณ

การตรวจสอบเป้าหมายของโพรบ eGFR ในผู้ป่วย CKD การเชื่อมโยงของ 69 eGFR ที่เกี่ยวข้องและตรวจสอบ CpG จากประชากรทั่วไปที่มี eGFR ใน German Chronicโรคไต (GCKD) study was evaluated after correcting for the number of evaluated sites, and statistical significance was defined as Pvalue < 7.2E−4 (0.05/69). The GCKD study is a prospective observational study of patients with CKD63. Briefly, 5217 adult patients under nephrological care provided written informed consent and were enrolled from 2010 to 2012. Inclusion criteria were eGFR between 30 and 60 ml min−1 per 1.73 m2 or an eGFR of >60 ml min−1 per 1.73 m2 with UACR > 300 mg g−1 (or a urinary protein–creatinine ratio of >500 มก. ก−1). การติดตามผู้ป่วยสำหรับจุดยุติทางคลินิกยังคงดำเนินต่อไป จุดยุติการศึกษาจะถูกบันทึกอย่างต่อเนื่องในรูปแบบมาตรฐานตามจดหมายออกจากโรงพยาบาลและใบมรณะบัตร รวมถึงเหตุการณ์ที่เกี่ยวข้องกับไตเช่นเดียวกับการเสียชีวิต การออกแบบการศึกษาและประชากรการศึกษาที่คัดเลือกได้อธิบายไว้ในรายละเอียดเพิ่มเติมในสิ่งพิมพ์ก่อนหน้า63,64 การศึกษา GCKD ได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมในท้องถิ่นและจดทะเบียนในทะเบียนแห่งชาติเพื่อการศึกษาทางคลินิก (DRKS 00003971) กลุ่มย่อยของ 559 ผู้ป่วยที่เป็นโรคไตวายเรื้อรังที่เกิดจากโรคลูปัส erythematosus ระบบ, โรคไตจากเยื่อเมือก, โรคเนื้องอกในต่อมน้ำเหลืองโฟกัสหรือ polycystic autosomal-dominantโรคไตถูกเลือกสำหรับการหาปริมาณ DNA methylation และวัดโดยใช้ Infinium MethylationEPIC BeadChip array (EPIC) การเชื่อมโยงกับ eGFR ได้รับการประเมินโดยเปรียบเทียบกับการวิเคราะห์หลัก (ดูวิธีการทางสถิติและการวิเคราะห์เมตา) นอกเหนือจากการปรับสำหรับการสูบบุหรี่ซึ่งมีรหัส 0/1/2 สำหรับผู้สูบบุหรี่ที่ไม่เคย/อดีต/ปัจจุบัน เพื่อประเมินความสัมพันธ์ของ DNA methylation กับเวลาถึงไตล้มเหลวจากรายการการศึกษา ตัวแบบการถดถอยค็อกซ์ได้รับการติดตั้งสำหรับแต่ละ CpG และในทำนองเดียวกันสำหรับจุดสิ้นสุดที่รวมกันของไตล้มเหลวและเฉียบพลันอาการบาดเจ็บที่ไตนอกจากตัวทำนาย DNA methylation แล้ว แบบจำลองยังได้รับการปรับตามอายุ เพศ และชนิดย่อยของ CKD แบบจำลองการถดถอยค็อกซ์แสดงค่าประมาณสำหรับอัตราส่วนความเป็นอันตรายจำเพาะ (HR) ต่อหน้าเหตุการณ์ที่แข่งขันกัน กล่าวคือ การเสียชีวิตอื่นๆ ยกเว้นการเสียชีวิตที่เกี่ยวข้องกับไต การวิเคราะห์อันตรายแบบกระจายย่อยได้ดำเนินการเพิ่มเติมเพื่อประเมินผลกระทบทางอ้อมที่อาจเกิดขึ้นผ่านเหตุการณ์ที่แข่งขันกัน สมมติฐานความเป็นอันตรายตามสัดส่วนได้รับการประเมินจากเศษซากเชินเฟลด์ที่ปรับขนาด การประเมินแบบกราฟิกสำหรับ CpG ที่เกี่ยวข้องทั้งสองไม่พบหลักฐานการละเมิดที่สำคัญ (รูปที่ 9) เพิ่มเติม

แผนผังการเชื่อมโยงระดับภูมิภาคและคำอธิบายประกอบ แปลงสำหรับรูปที่ 5 เสริมถูกสร้างขึ้นโดยใช้แพ็คเกจ 'Gviz' 65 และ 'rtracklayer' 66 R ไซต์สูงสุด 40 แห่งภายใน 50 000 bp ต้นน้ำหรือปลายน้ำของไซต์ CpG ที่น่าสนใจรวมอยู่ในพล็อต หากช่วงเวลามีมากกว่า 40 ไซต์ พื้นที่ที่วางแผนไว้จะลดลงเหลือระยะทางของไซต์ที่ไกลที่สุด บวก 10,000 bp ส่วนยีน RefSeq อิงตามแทร็ก UCSC NCBI RefSeq ที่มีสัญลักษณ์ยีนจากแพ็คเกจ 'org.Hs.eg.db' R ส่วน CpG Islands อิงตามแทร็ก UCSC CpG Islands ส่วน Roadmap chromHMM อิงตาม แผนงาน 15- ระบุโมเดล chromHMM ของทารกในครรภ์ไตepigenome (แผนงาน Epigenome ID: E086)67 และส่วน SNP ทั่วไปอิงตาม UCSC Common SNPs(151) track68 สุดท้าย พล็อตความสัมพันธ์ของ CpG ที่ด้านล่างของรูปจะขึ้นอยู่กับข้อมูลของตัวอย่าง DNA methylation ที่ทำการศึกษา KORA F4 โดยใช้อาร์เรย์ Illumina HumanMethylation450 BeadChip โดยที่ไซต์ที่หายไปจะเป็นสีเทาอ่อน

ความแปรปรวนอธิบายได้ด้วย DNA methylationเปอร์เซ็นต์ของความแปรปรวนฟีโนไทป์ที่อธิบายโดย CpG จำลอง 69 ตัวที่เกี่ยวข้องกับ eGFR นั้นประมาณโดยใช้ข้อมูลจากผู้เข้าร่วม 1,888 คนจากการศึกษา KORA FF4 การติดตามผลเจ็ดปีของการศึกษา KORA F457,58 KORA FF4 ไม่ได้เป็นส่วนหนึ่งของการวิเคราะห์เมตาของ EWAS อย่างไรก็ตาม มีบุคคล 988 รายที่รวมอยู่ในการวิเคราะห์ความแปรปรวนที่อธิบายซึ่งทับซ้อนกับผู้เข้าร่วม KORA F4 ของ EWAS ในชุดข้อมูลนี้ ความแปรปรวนที่อธิบายโดย CpG ทั้งหมดโดยไม่ขึ้นกับตัวแปรร่วมถูกประมาณว่าเป็นความแตกต่างใน R2 ของแบบจำลองพื้นฐาน ซึ่งรวมถึง CpG และอีกรูปแบบที่ไม่มี โมเดลพื้นฐานถูกกำหนดเป็นไตลักษณะ ~เพศบวกอายุบวกสัดส่วนเม็ดเลือดขาวบวกโรคเบาหวานบวกความดันโลหิตสูงบวกดัชนีมวลกายบวกสูบบุหรี่ในปัจจุบันด้วยไตลักษณะที่แสดง eGFR และ UACR สำหรับ CpG ที่เกี่ยวข้องกับ eGFR สองรายการ (cg06008406, cg20004659) ไม่มีข้อมูลในชุดข้อมูล KORA FF4

การวิเคราะห์การสุ่ม Mendelian แบบสองทิศทางในการส่งต่อ MR โดยใช้แพ็คเกจ 'TwoSampleMR' R เราตรวจสอบผลกระทบเชิงสาเหตุที่เป็นไปได้ของ DNA methylation ที่ CpG ที่จำลองแบบบน eGFR และ UACR MR ใช้เครื่องมือทางพันธุกรรมเพื่อลดความลำเอียงอันเนื่องมาจากเหตุที่ก่อให้เกิดความสับสนและย้อนกลับ70 เครื่องมือทางพันธุกรรมสำหรับ DNA methylation (meQTL) มีให้สำหรับ 47 และห้า CpGs สำหรับ eGFR และ UACR ตามลำดับ ตามที่ GoDMC ระบุก่อนหน้านี้ในมากถึง 27,750 ราย42 ข้อมูล GWAS สรุปบรรพบุรุษของยุโรปบน eGFR10 และ UACR13 ถูกใช้เป็นข้อมูลผลลัพธ์ตามลำดับ ตัวกรองถูกนำมาใช้สำหรับการรวม meQTL (pSNP < 1e−5="" กับ="" dna="" methylation="" ในบริเวณ="" ±="" 500kb="" cis,="" การเชื่อมโยงความไม่สมดุล="" r2="">< 0.2="" ภายในขอบเขต="" 1mb,="" การกรอง="" steiger,="" maf=""> 0.05) เราทำ MR ที่ถ่วงน้ำหนักแบบผกผันเช่นเดียวกับการวิเคราะห์ความไวของ MR (โหมดง่าย โหมดแบบถ่วงน้ำหนัก ค่ามัธยฐานแบบถ่วงน้ำหนัก และ MR Egger) หรือการวิเคราะห์สามเหลี่ยมโดยประมาณค่าอัตราส่วน Wald ในกรณีที่มีเครื่องมือเพียงชิ้นเดียวต่อไซต์ CpG เท่านั้น71–73 การประมาณผลกระทบที่ได้รับจาก MR ขึ้นอยู่กับหน่วยของชุดข้อมูลพื้นฐาน และในกรณีนี้สอดคล้องกับการเปลี่ยนแปลงต่อหน่วยในส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานหนึ่งของระดับเมทิลเลชันบน eGFR ที่แปลงบันทึกตามธรรมชาติ และค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานของ UACR ที่แปลงบันทึกตามธรรมชาติ ตามลำดับ ใน MR แบบย้อนกลับ เราได้ตรวจสอบผลกระทบเชิงสาเหตุที่อาจเกิดขึ้นของการทำงานของไตลักษณะเฉพาะของ DNA methylation โดยใช้ SNPs ที่มีนัยสำคัญทั่วทั้งจีโนมจาก GWAS ข้ามชาติพันธุ์บน eGFR10 และ UACR13 เป็นเครื่องมือทางพันธุกรรมสำหรับ eGFR และ UACR ตามลำดับ เพื่อเพิ่มพลังให้กับข้อมูลผลลัพธ์ เราได้ทำการวิเคราะห์เมตา z-score ของการเชื่อมโยง SNP-CpG จากการศึกษา KORA F4 (n=1662) ​​และ FHS (n=3868) ค่าประมาณผลกระทบรวมและข้อผิดพลาดมาตรฐานของ meQTL ที่รวมอยู่ใน MR ประเมินจากขนาดตัวอย่าง ความถี่อัลลีล และ z-score74 ใช้ตัวกรองเพื่อรวม SNP (ค่า P < 5e−8="">ไตลักษณะ ค่า P ด้านเดียว < 0.05="" ที่มียูเรียไนโตรเจนในเลือดสำหรับเครื่องมือ="" egfr="" ค่า="" p-value="" ที่ต่างกันของบรรพบุรุษ="" มากกว่าหรือเท่ากับ="" 0.0="" 1,="" การกรอง="" steiger,="" maf=""> 0.05) เราทำ MR ที่ถ่วงน้ำหนักแบบผกผันกับเอฟเฟกต์สุ่มแบบทวีคูณ (เนื่องจากมีเครื่องมือจำนวนมากเพียงพอจากตำแหน่งที่แตกต่างกันต่อคุณลักษณะ) 51 และการวิเคราะห์ความไวของ MR (โหมดง่าย โหมดแบบถ่วงน้ำหนัก ค่ามัธยฐานแบบถ่วงน้ำหนัก และ MR Egger) 71–73 จากการวิเคราะห์ความไวเพิ่มเติมที่จัดการกับตัวแปร pleiotropic เราไม่รวมเครื่องมือทั้งหมด 35 ชนิดที่เกี่ยวข้องกับโรคเบาหวานประเภท 2 ใน GWAS75 ล่าสุดซึ่งรวมถึง 898,130 ราย: SNP 11 รายการที่มีค่า P-value <5e−8 กับโรคเบาหวานและอีก="" 24="" รายการ="" เครื่องมือที่อยู่ในการเชื่อมโยงที่ไม่สมดุล="" (r2=""> 0.2 ภายใน 1 Mb, แผงอ้างอิง 1000 G EUR) ที่มี SNP ที่เกี่ยวข้องกับโรคเบาหวานดังกล่าว ความไม่สมดุลของการเชื่อมโยงถูกประเมินผ่านทาง LDlink76 สำหรับ MR ย้อนกลับ การประมาณผลจะให้การเปลี่ยนแปลงต่อหน่วยใน eGFR ที่แปลงบันทึกตามธรรมชาติ และค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานของ UACR ที่เปลี่ยนรูปล็อกตามธรรมชาติ ตามลำดับ บนค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานของระดับเมทิลดีเอ็นเอ การปรับการทดสอบหลายค่า P-value ตาม Benjamini–Hochberg FDR < 0.05="" ถูกปรับใช้ต่อลักษณะของไต="" และสำหรับ="" mr="" ไปข้างหน้าและย้อนกลับแยกกัน77="" ค่า="" p="" ของความหลากหลายทางพันธุกรรมได้มาจากสถิติ="">

การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าเพื่อแจ้งผลกระทบการทำงานที่อาจเกิดขึ้นของ CpG ที่เกี่ยวข้อง เราได้ประเมินการเพิ่มประสิทธิภาพของ CpG นี้ในไซต์ของ DNase I หรือการดัดแปลงฮิสโตน (H3K4me1, H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3) ชุดยีนตามเงื่อนไข GO และเส้นทางในฐานข้อมูล KEGG และ Reactome –35. การวิเคราะห์การเสริมสมรรถนะ TFBS ถูกดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ในรายละเอียด14 โดยสังเขป การทดสอบการเพิ่มสมรรถนะได้รับการประเมินโดยใช้ eForge78 โดยใช้การเรียงสับเปลี่ยนด้วยการจับคู่สำหรับการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นของยีนและ CpG เมื่อมีการสุ่มตัวอย่าง ข้อมูลมาจากทั้งโครงการ ENCODE (125 ตัวอย่าง) หรือ Roadmap Epigenomics (299 ตัวอย่าง) ที่สร้างโดยวิธี Hotspot67,79,80 CpG ที่เกี่ยวข้องกับ eGFR และ UACR ตามลำดับที่ค่า P < 1e−05="" ในการวิเคราะห์เมตาถูกใช้เป็นอินพุต="" (ข้อมูลเสริม="" 6="" และ="" 7)="" และ="" 10000="" การสุ่มตัวอย่างการทำงาน="" ตัวกรองความใกล้เคียงที่ใช้งานอยู่="" และถือว่า="" fdr="">< 0.05="" มีนัยสำคัญ="" (ข้อมูลเสริม="" 13="" และ="" 14)="" การวิเคราะห์การเพิ่มสมรรถนะของเครื่องหมายฮิสโตนถูกดำเนินการในลักษณะคล้ายคลึงกัน="" (ข้อมูลเสริม="" 15="" และ="" 16)="" การเพิ่มคุณค่าในชุดยีนหรือวิถีทางได้รับการประเมินโดยใช้แพ็คเกจ="" methylgsa="" และ="" r="" เวอร์ชัน="" 3.6.181="" วิธีการทดสอบการเสริมสมรรถนะคือ="" methylglm="" ที่ใช้การถดถอยโลจิสติกที่ปรับจำนวนโพรบต่อยีนและพื้นหลัง="" autosomal="" ซึ่งทับซ้อนกับอาร์เรย์="" 450k="" และ="" epic="" ทดสอบชุดยีนหรือเส้นทางที่มี="" 100–500="" ยีน="" (การตั้งค่าเริ่มต้น)="" เราพิจารณาชุดยีนหรือเส้นทางที่จะเสริมสมรรถนะอย่างมีนัยสำคัญที่="" fdr="">< 0.05="" การแก้ไขสำหรับการทดสอบหลายรายการภายในแต่ละฐานข้อมูลโดยใช้วิธี="" benjamini="" และ="" hochberg="" (ข้อมูลเสริม="" 17="" และ="">