ความเข้มข้นต่ำของพาราควอตทำให้เกิดการกระตุ้นก่อนเวลาของไคเนส 1/2 ที่ควบคุมสัญญาณนอกเซลล์, โปรตีนไคเนสบีและเส้นทางไคเนส 1/2 ของเทอร์มินัล N-Jun: บทบาทของไคเนสไคเนส N-เทอร์มินัล C-จุนในการตายของเซลล์ที่เหนี่ยวนำให้เกิดพาราควอต

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

Mireia Niso-Santano, Jose´ M. Mora´n, Lourdes Garcı´a-Rubio, Ana Go´mez-Martı´n, Rosa A. Gonza´lez-Polo, Germa´n Soler,§ and Jose´ M. Fuentes

เชิงนามธรรม:

พาราควอตคือสารกำจัดวัชพืชที่มีความเสี่ยงที่จะทำให้เกิดโรคพาร์กินสันเนื่องจากแสดงให้เห็นความเป็นพิษต่อระบบประสาทและโครงสร้างที่คล้ายคลึงกันอย่างมากกับ 1-เมทิล-4-ฟีนิลไพริดิเนียม (MPP plus ) ซึ่งเป็นสารพิษที่รู้จักกันดีว่าเป็นสาเหตุของอาการทางคลินิกที่คล้ายคลึงกัน ถึงโรคพาร์กินสัน(พีดี). อย่างไรก็ตาม ในปัจจุบันไม่ค่อยมีใครรู้จักเกี่ยวกับเส้นทางการส่งสัญญาณที่กระตุ้นโดยพาราควอตในระบบเซลล์ใดๆ ในการศึกษานี้ เราได้ตรวจสอบผลของพาราควอตต่อไคเนสที่ควบคุมสัญญาณภายนอกเซลล์ 1 และ 2 (ERK1/2), c-Jun N-terminal kinase (JNK) และการกระตุ้นโปรตีนไคเนส B (PKB) ในเซลล์ E18 พาราควอตที่มีความเข้มข้นต่ำกระตุ้นการเพิ่มขึ้นในช่วงต้นของฟอสโฟรีเลชั่น ERK1/2, JNK1/2 และ PKB phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K) inhibitors wortmannin และ LY 294002 (2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H{{ ฟอสฟาติดิลลิโนซิทอล 19}}benzopyran-4-หนึ่ง) ยับยั้งการเพิ่มขึ้นของ PKB phosphorylation ที่เกิดจากพาราควอตในช่วงต้น นอกจากนี้ การเพิ่มขึ้นของพาราควอตในระยะเริ่มต้นในการกระตุ้น ERK1/2 มีความไวต่อโปรตีนไคเนสไคเนส 1 (MEK1) ที่กระตุ้นการทำงานของไมโทเจน PD 98059(2#-อะมิโน-3#-เมทอกซีฟลาโวน) ในขณะที่การตอบสนองของ JNK1/2 คือ ถูกขัดขวางโดยตัวยับยั้ง JNK1/2 SP 600125 (แอนทรา[1-9-cd]ไพราซอล-6(2H)-one) การปรับสภาพด้วย wortmannin, LY 294002 หรือ PD 98059 ไม่ส่งผลต่อการตายของเซลล์พาราควอตในเซลล์ E18 ในทางตรงกันข้าม SP 600125 ลดการตายของเซลล์ที่เกิดจากพาราควอตในเซลล์ E18 ลงอย่างมีนัยสำคัญ โดยสรุป เราได้แสดงให้เห็นว่าพาราควอตที่มีความเข้มข้นต่ำกระตุ้นการเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วใน ERK1/2, JNK1/2 และ PKB phosphorylation ในเซลล์ E18 นอกจากนี้ ข้อมูลที่นำเสนอแนะนำว่าการยับยั้งวิถี JNK1/2 ปกป้องเซลล์ E18 จากการตายของเซลล์ที่เหนี่ยวนำโดยพาราควอต และสนับสนุนข้อเท็จจริงที่ว่าการยับยั้งการกระตุ้น JNK1/2 ในระยะเริ่มต้นสามารถก่อให้เกิดกลยุทธ์ที่เป็นไปได้ในการรักษา PD คำสำคัญ: พาราควอต; ความเข้มข้นต่ำ เจเอ็นเค; การตายของเซลล์ พาร์กินสัน

สมุนไพรต้านโรคพาร์กินสัน:cistanche

การแนะนำ

โรคพาร์กินสัน (PD)เป็นความผิดปกติทางระบบประสาทที่มีลักษณะโดยการตายของเซลล์ประสาทโดปามีนใน sub-Constantia nigra ร่วมกับการรวมตัวในเซลล์ที่เรียกว่า Lewy body (Olanow and Tatton, 1999) ผู้ป่วยโรค PD เพียง 5-10 เปอร์เซ็นต์เท่านั้นที่มีรูปแบบครอบครัวของโรคนี้โดยมีรูปแบบการถ่ายทอดทางพันธุกรรมที่โดดเด่น (Gasser, 2001) ปัจจัยทางพันธุกรรมมีความสำคัญในผู้ป่วยเด็กที่เริ่มมีอาการ แต่ไม่น่าจะมีบทบาทสำคัญใน PD ประปรายทั่วไป ในทางตรงกันข้าม การศึกษาทางระบาดวิทยาระบุถึงปัจจัยแวดล้อมหลายประการที่เพิ่มความเสี่ยงในการเกิด PD(โรคพาร์กินสัน). สิ่งเหล่านี้รวมถึงยาฆ่าแมลง สารกำจัดวัชพืช สารเคมีอุตสาหกรรม เกษตรกรรม และการใช้ชีวิตในชนบท (Cory-Slechta et al.,2005; Gasser, 2001; Landrigan et al., 2005; Tanner and BenShlomo, 1999) ข้อโต้แย้งที่น่าเชื่อถือที่สุดในการสนับสนุนปัจจัยด้านสิ่งแวดล้อมใน PD เกี่ยวข้องกับการค้นพบผลกระทบทางชีววิทยาของ MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- เตตราชี-ดรอปไพริดีน) สารพิษในระบบประสาทส่วนกลางนี้ก่อให้เกิดกลุ่มอาการที่คล้ายคลึงกันทางคลินิกและทางกายวิภาคกับ PD (Kopin and Markey, 1988; Langston et al., 1983) ในแง่นี้ พาราควอตสารกำจัดวัชพืชที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย (1,1#-dimethyl-4,4#-bypiridinium) ได้รับการแนะนำว่าเป็นปัจจัยเสี่ยงโดยพิจารณาจากความคล้ายคลึงกันของโครงสร้างของ MPPþ ซึ่งเป็นเมตาโบไลต์ที่ออกฤทธิ์ของ MPTP ( Tanner and Langston, 1990) และรายงานเกี่ยวกับโรคพาร์กินสันสัมพันธ์กับการสัมผัสกับสารนี้ (Hertzman et al., 1990; Hubble et al., 1993; Jimenez-Jimenezet al., 1992; Liou et al., 1997; Wang et อัล., 1992) อย่างไรก็ตาม ในขณะที่เส้นทางการส่งสัญญาณที่เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์MPPþนั้นเป็นที่รู้จักกันดี (Halvorsen et al., 2002; Gomez-Santos et al., 2002; Gonzalez-Polo et al., 2003) ไม่ค่อยมีใครรู้จักเกี่ยวกับเส้นทางการส่งสัญญาณที่เปิดใช้งาน โดยพาราควอต (Cheng et al., 2003; Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) อย่างไรก็ตาม ไม่มีการศึกษาเกี่ยวกับเหตุการณ์ในระยะเริ่มต้นที่สังเกตได้หลังจากสัมผัสพาราควอตที่มีความเข้มข้นต่ำ

สิ่งเร้าหลายอย่าง รวมทั้ง MPPþ และพาราควอต สามารถกระตุ้นอาร์เรย์ของการส่งสัญญาณภายในเซลล์ที่สัมพันธ์กันอย่างใกล้ชิดกับทั้งการตายของเซลล์และการอยู่รอดของเซลล์ ตัวอย่างเช่น MPPþ (Gomez-Santos et al., 2002; Halvorsen et al.,2002) กระตุ้นสมาชิกของตระกูลโปรตีนไคเนสที่กระตุ้นด้วยไมโตเจน (MAPK) และโปรตีนไคเนส B (PKB) สมาชิกครอบครัว TheMAPK เปิดใช้งานโดย MPPþ หรือพาราควอตรวมถึงไคเนสที่ควบคุมสัญญาณภายนอกเซลล์ 1 และ 2 (ERK1/2), c-Jun N-terminal kinases (JNK1 และ JNK2) และ p38 MAPKs เป็นที่ยอมรับกันโดยทั่วไปว่า ERK1/2 และการเปิดใช้งาน PKB ส่งเสริมการอยู่รอดของเซลล์โดยการเปิดใช้งานเส้นทางการส่งสัญญาณการต่อต้าน apoptotic ในขณะที่การกระตุ้น JNK1/2 และ p38 MAPK เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ประสาท (Harper and LoGrasso,2001; Shin et al., 2001; Xia et al., 1995) . การกระตุ้น phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K)/PKB pathway เกี่ยวข้องกับการอยู่รอดของเซลล์ประสาท (Shin et al., 2001) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การกระตุ้นเส้นทาง JNK1/2 สามารถมีบทบาทสำคัญใน MPPþ และความเป็นพิษของพาราควอต (Cassarino et al., 2000; Halvorsen et al.,2002; Peng et al., 2004) และเป็นผลให้ในกระบวนการของเซลล์ที่ได้รับผลกระทบใน PD(โรคพาร์กินสัน).

สมุนไพร cistanche: โรคพาร์กินสัน

วัสดุและวิธีการ

สายเซลล์และการเพาะเลี้ยง

ในการศึกษานี้ใช้เซลล์ E18 ของสมองหนูที่เป็นอมตะซึ่งทำให้เป็นอมตะ เซลล์ E18 ได้มาจากการทำให้เป็นอมตะโดยธรรมชาติจากวัฒนธรรมของเยื่อหุ้มสมองของหนูในครรภ์อายุ 18-วัน และได้รับความกรุณาจาก Dr. A. Mun˜oz (Instituto de InvestigacionesBiome´dicas, CSIC, Madrid, Spain) . เซลล์ E18 เป็นตัวแทนของนิวโรบลาสต์ดั้งเดิมที่แสดง NF 68 และเนสตินมาร์กเกอร์ของเซลล์ประสาทดั้งเดิม แต่ไม่มีเครื่องหมายแอสโทรไซต์ ซึ่งเป็นโปรตีนที่เป็นกรด glial fibrillary หลังจากการเหนี่ยวนำความแตกต่างบางส่วนด้วย dibutyryl-cAMP เซลล์แสดงเครื่องหมายของเซลล์ประสาทเพิ่มเติม เช่น NF 145, NF 220 และอีโนเลสที่จำเพาะต่อเซลล์ประสาท (Mun˜oz, การสื่อสารส่วนบุคคล) เซลล์เติบโตใน F-12 ของแฮงค์ (Hyclone, Brevieres, France) และเสริมด้วย FCS 10 เปอร์เซ็นต์ (Hyclone), สเตรปโตมัยซิน (100 มก./มล.) และเพนิซิลลิน (100 U/มล.) เซลล์ถูกเพาะที่ 5 3 10 5 ในขวดเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ 75-cm2 (TPP, Trasadingen, สวิตเซอร์แลนด์) และบ่มที่ 37 C ภายใต้บรรยากาศอากาศ 5 เปอร์เซ็นต์ CO2/95 เปอร์เซ็นต์ในอากาศ วัฒนธรรมถูกส่งผ่านสัปดาห์ละครั้งโดยทริปซิไนเซชันโดยใช้สารละลายทริปซิน-EDTA (ไฮโคลน)

การรักษาเซลล์

เซลล์ที่ไหลมารวมกัน (~ 80 เปอร์เซ็นต์ ) ในขวดเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ 75-cm2 ถูกทริปซิไนซ์และเพาะเมล็ดในจานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่ความเข้มข้น 5 3104 เซลล์/ซม2 ยี่สิบสี่ชั่วโมงต่อมา สื่อถูกสำลักและแทนที่ด้วยอาหารสดเพียงอย่างเดียวหรืออาหารที่มีความเข้มข้นของพาราควอตตามที่ระบุ ในการทดลองเพิ่มเติม ความเข้มข้นที่แตกต่างกันของสารยับยั้งไคเนส (LY 294002, wortmannin, SP 600125 และ PD(โรคพาร์กินสัน)98059, ทั้งหมดจาก Tocris, บริสตอล, สหราชอาณาจักร) ถูกเพิ่ม 30 นาทีก่อนการสัมผัสพาราควอต เนื่องจากสารยับยั้งไคเนสถูกละลายในไดเมทิลซัลฟอกไซด์ สารควบคุมถูกสร้างขึ้นด้วยความเข้มข้นสูงสุดที่ใช้ (ปริมาตร 0.2 เปอร์เซ็นต์/ปริมาตร) การเติมไดเมทิลซัลฟอกไซด์ไม่ส่งผลต่อค่าความมีชีวิตของเพลตควบคุม

การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์

ความอยู่รอดของเซลล์ถูกกำหนดหาโดยการสอบวิเคราะห์ colorimetricMTT (Mosmann, 1983) ในเซลล์ที่มีชีวิต เอนไซม์ยล ซัคซิเนต ดีไฮโดรจีเนส สามารถเผาผลาญ MTT ไปเป็นสีย้อมฟอร์มาซานที่ดูดซับแสงที่ 570 นาโนเมตร สำหรับการทดลองเหล่านี้ มีการใช้แผ่นทดสอบ 24-หลุม ในตอนท้ายของ การบำบัดแต่ละครั้ง, 100 ll ของ MTT ที่เตรียมที่ความเข้มข้น 5 มก./มล. ใน PBS ถูกเติมลงในแต่ละจาน หลังจากฟักตัว 3 ชั่วโมง ตัวกลางจะถูกเทออก และตะกอนฟอร์มาซานถูกละลายด้วยไอโซโพรพานอลที่เป็นกรด (0.04–0.1 N HCl ในไอโซโพรพานอลสัมบูรณ์) การดูดกลืนแสงของสีย้อมที่ถูกแปลงถูกวัดที่ความยาวคลื่น 570 นาโนเมตร โดยมีการลบพื้นหลังที่ 630–690 นาโนเมตร ค่าการดูดกลืนแสงของวัฒนธรรมที่ไม่ผ่านการบำบัดถูกกำหนดไว้ที่ 100 เปอร์เซ็นต์

เพื่อยืนยันผลลัพธ์ที่ได้จากการทดสอบ MTT การตายของเซลล์ยังได้รับการประเมินโดยการวัดการปลดปล่อยของเอนไซม์ cytosolic lactate dehydrogenase (LDH) ไปยังอาหารเลี้ยงเชื้อโดยใช้ชุดทดสอบสี LDH (Roche, Indianapolis, IN) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต . การรั่วไหลของ LDH ถูกกำหนดให้เป็นอัตราส่วนของการออกฤทธิ์ของ LDH ในอาหารเลี้ยงเชื้อต่อกิจกรรมทั้งหมดต่อหลุม (3100) ได้ข้อมูลเปรียบเทียบโดยใช้ทั้งสองวิธี

การเตรียมสารสกัดจากเซลล์และการวิเคราะห์ Western blot

หลังการทดลองบำบัด เซลล์ (ที่เพาะเลี้ยงในจานขนาด 60-มม.) ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS เย็นและกำจัดออกโดยการขูดออกแล้วหมุนเหวี่ยงที่ 900 3 กรัมเป็นเวลา 5 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส เซลล์ถูกสลายในบัฟเฟอร์ ประกอบด้วย 50mM HEPES, pH 7.5, 300mMNaCl, 1 เปอร์เซ็นต์ Triton X-100, 2mM EDTA, 5mM MgCl2, 25mM NaF, 1mMNa3VO4 และ Protease Inhibitor Cocktail (Sigma, St Louis, MO) เซลล์ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 13,000 3 กรัมเป็นเวลา 5 นาทีที่ 4 C ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกเก็บไว้ที่ 80 C จนกว่าการวิเคราะห์โดย Western blot วัดความเข้มข้นของโปรตีนตาม Bradford (1976) โดยใช้ BSA เป็นมาตรฐาน

ปริมาณโปรตีนที่เท่ากัน (10 LG ต่อสภาวะ) ได้รับการแก้ไขในอิเล็กโตรโฟรีซิสเจล SDS 12 เปอร์เซ็นต์ และถ่ายโอนไปยังเยื่อ PVDF ตามวิธีการดัดแปลงบางส่วนทั่วไป (Fuentes et al., 2000) โดยสังเขป โปรตีนถูกถ่ายโอน (250 mA เป็นเวลา 60 นาที) ไปยังเยื่อ PVDF โดยใช้อุปกรณ์ Mini Trans-Blot Cell (Bio-Rad, Hercules, CA) ขั้นตอนการตรวจภูมิคุ้มกันรวมถึงการถ่ายโอนและการปิดกั้นของเมมเบรน (60 นาทีที่อุณหภูมิห้อง) ด้วย TTBS (10mM Tris/HCl, pH 7.5, 150mM NaCl และ 0.2 เปอร์เซ็นต์ Tween-20) ที่มีนมแห้งที่ไม่มีไขมัน 10 เปอร์เซ็นต์ จากนั้นจึงบ่มเมมเบรนเป็นเวลา 60 นาทีที่อุณหภูมิห้องด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิพอลิโคลนของกระต่าย (ทั้งหมดมาจาก Cell Signalling, Beverly, MA, เจือจาง 1:1000) ใน TTBS þ นมแห้งไม่มีไขมัน 10 เปอร์เซ็นต์ หรือ BSA 5 เปอร์เซ็นต์ หลังจากการล้าง (เป็นเวลาสอง 5-นาทีที่มี TTBS) เยื่อหุ้มถูกบ่ม (60 นาทีที่อุณหภูมิห้อง) ด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิต้านกระต่ายที่ควบคู่กับเปอร์ออกซิเดส (1:5000 ใน TTBS ที่มีนมแห้งที่ไม่มีไขมัน 10 เปอร์เซ็นต์) หลังจากการล้าง (สำหรับช่วงเวลาสอง 5-นาทีและหนึ่งช่วงเวลา 10-นาที) การตรวจหาแอนติบอดีที่ถูกผูกไว้ถูกมองเห็นได้โดยการใช้เคมีเรืองแสงโดยใช้รีเอเจนต์ ECL-plus (Amersham Biosciences, Orsay, France) และวิเคราะห์โดยปริมาณ ซอฟต์แวร์เดียว (Bio-Rad) ปริมาณแอคตินถูกวิเคราะห์ในฐานะกลุ่มควบคุมโดยใช้โพลีโคลนอลแอนติบอดีของกระต่าย (จากซิกมา) เจือจาง 1:2500 ใน TTBS ด้วยนมแห้งที่ไม่มีไขมัน 10 เปอร์เซ็นต์)

การวิเคราะห์ทางสถิติ.

การทดลองแต่ละครั้งทำซ้ำอย่างน้อยสามครั้งโดยมีความสัมพันธ์ที่น่าพอใจระหว่างผลลัพธ์ของการทดลองแต่ละครั้ง ข้อมูลที่แสดงเป็นข้อมูลของการทดลองที่เป็นตัวแทน แต่ละกลุ่มมีอาหารวัฒนธรรมเฉลี่ยสามถึงสี่จาน ข้อมูลทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ±SEM วิเคราะห์ผลลัพธ์โดย ANOVA ค่า p ที่น้อยกว่า 0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญ

โรคต่อต้านพาร์กินสัน:สารสกัดจาก Cistanche

ผลลัพธ์

พิษต่อเซลล์ของพาราควอตในเซลล์ E18

ตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ (Cappelletti et al., 1998; Chun et al.,2001; Gonzalez-Polo et al., 2004) เซลล์หลายสายพันธุ์มีความไวต่อคุณสมบัติที่เป็นพิษของพาราควอต การสัมผัสกับพาราควอตทำให้ความสามารถในการมีชีวิตของเซลล์ลดลงโดยขึ้นอยู่กับขนาดยา (รูปที่ 1) ในการศึกษานี้ เซลล์ E18 ที่ได้รับการรักษาด้วยพาราควอต 25lM เป็นเวลา 24 ชั่วโมง แสดงให้เห็นถึงการสูญเสียความมีชีวิตของเซลล์ 50 เปอร์เซ็นต์ ความมีชีวิตของเซลล์ถูกประเมินโดยการวัดการเปลี่ยนแปลงเป็น MTT ไปเป็นสีย้อมฟอร์มาซานที่ดูดซับแสงที่ 570 นาโนเมตร การทดสอบนี้ใช้อย่างกว้างขวางเพื่อตรวจสอบการตายของเซลล์ในหลายเซลล์ รวมถึงเซลล์ E18 (Donaire et al., 2005; Garcia-Roman et al.,2001) และการดูหมิ่นต่างๆ รวมถึงพาราควอต (Chun et al.,2001; Gonzalez -Polo et al., 2004).

การกระตุ้นด้วยพาราควอตของ ERK1/2 ในเซลล์ E18

การเพิ่มขึ้นของการกระตุ้น ERK1/2 ในเซลล์ E18 ที่บำบัดด้วยพาราควอตถูกเฝ้าติดตามโดย Western blotting โดยใช้แอนติบอดี ERK1/2 (Thr202/Tyr204) ที่มีฟอสโฟสเปซิฟิก การแสดงออกของเซลล์ E18neuroblasts ที่มีพาราควอต 25lM ทำให้เกิดสถานะฟอสโฟรีเลชั่น (Thr202/Tyr204) ที่เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดของ ERK1/2 (44/42 kDa) (รูปที่ 2A) การเพิ่มขึ้นของฟอสโฟรีเลชันสูงสุดเกิดขึ้นหลังจากผ่านไป 5 นาที หลังจากนั้นระดับฟอสโฟรีเลชันจะค่อยๆ ลดลงจนใกล้ระดับพื้นฐาน นอกจากนี้ การเพิ่มขึ้นของ ERK1/2 ฟอสโฟรีเลชั่นที่เหนี่ยวนำโดยพาราควอตไม่ขึ้นกับความเข้มข้น (รูปที่ 2B) การปรับสภาพด้วยตัวยับยั้ง MEK1, PD(โรคพาร์กินสัน)98059 (50lM; Dudley et al., 1995)ยับยั้งการเพิ่มขึ้นของ ERK1/2phosphorylation ที่เกิดจากพาราควอตอย่างสมบูรณ์ (รูปที่ 3)

การกระตุ้นด้วยพาราควอตของ PKB ในเซลล์ E18

การกระตุ้น PKB ในเซลล์ E18 ถูกตรวจพบโดย Western blotting โดยใช้แอนติบอดีจำเพาะฟอสโฟ (Ser473) การกระตุ้นเซลล์ E18 ที่มีพาราควอต 25lM ทำให้เกิดการเพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดใน PKB phosphorylation (รูปที่ 4A) การเพิ่มขึ้นนี้เกิดขึ้นหลังจากผ่านไป 20 นาที ซึ่งเทียบได้กับระดับฟอสโฟรีเลชั่น ERK1/2 หลังจากที่ระดับฟอสโฟรีเลชั่นลดลงอย่างช้าๆ จนถึงระดับพื้นฐานที่ใกล้เคียง (รูปที่ 4A) นอกจากนี้ การเพิ่มขึ้นของ PKB ฟอสโฟรีเลชันที่อาศัยพาราควอตขึ้นอยู่กับความเข้มข้นโดยมีค่าพาราควอตสูงสุดที่ 25lM (รูปที่ 4A) เนื่องจากต้องใช้ PI-3K สำหรับการกระตุ้น PKB บทบาทของ PI-3K ในการกระตุ้น PKB ที่เกิดจากพาราควอตในเซลล์ E18 จึงถูกสำรวจโดยใช้ PI-3K inhibitors wortmannin และ ลี 294002

การเพิ่มขึ้นของ PKB ฟอสโฟรีเลชันที่มีสื่อกลางด้วยพาราควอตถูกขัดขวางโดยสมบูรณ์หลังจากการปรับสภาพ (30 นาที) ของ E18cells ด้วยเวิร์ตมันน์ 100 นาโนโมลาร์และ 30lM LY 294002 (รูปที่ 5) การสังเกตเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าวิถีทางที่ขึ้นกับ PI-3K-dependent ไกล่เกลี่ยการเพิ่มขึ้นของ PKB phosphorylation ที่เกิดจากพาราควอตในเซลล์ E18

การกระตุ้นด้วยพาราควอตของ JNK1/2 ในเซลล์ E18

การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าพาราควอตกระตุ้นเซลล์ประสาท JNK1 / 2in (Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) และเซลล์ที่ไม่ใช่เซลล์ (Bennet et al., 2001; Cheng et al., 2003) อย่างไรก็ตาม ความเข้มข้นที่ใช้นั้นสูงกว่าที่ใช้ในงานนี้มาก นอกจากนี้ เวลาที่เลือกเพื่อแสดงภาพการเปิดใช้งาน JNK1/2 ก็นานขึ้นเช่นกัน การกระตุ้น JNK1/2 ในเซลล์ E18 ตรวจพบโดย Western blotting โดยใช้แอนติบอดี JNK (Thr183/Tyr185) ที่มีฟอสโฟสเปซิฟิก การกระตุ้นเซลล์ E18 ที่มีพาราควอต 25lM ทำให้เกิดฟอสโฟรีเลชัน JNK (46/54 kDa) ที่ทำเครื่องหมายไว้และเพิ่มขึ้นในช่วงต้น (รูปที่ 6A) การเพิ่มขึ้นเหล่านี้มีค่าสูงสุดหลังจาก 5 นาทีหลังจากที่ระดับฟอสโฟรีเลชั่นลดลงจนถึงระดับพื้นฐาน (รูปที่ 6A) อย่างไรก็ตาม การเพิ่มขึ้นของสารพาราควอตในฟอสโฟรีเลชัน JNK1/2 ไม่ขึ้นกับความเข้มข้น (รูปที่ 6B) การเพิ่มขึ้นของพาราควอตในฟอสโฟรีเลชั่น JNK1/2 มีความไวต่อตัวยับยั้ง JNK1/2 SP 600125 (10lM; รูปที่ 7; Bennett et al.,2001) ในที่สุด พาราควอต (25lM) ไม่ได้กระตุ้นการเพิ่มขึ้นที่วัดได้ในฟอสโฟรีเลชั่น p38 MAPK ในเซลล์ E18 ในการทดลองในช่วงเวลาเดียวกัน (ไม่แสดงข้อมูล) การทดลองเหล่านี้ดำเนินการโดยใช้แอนติบอดีที่มีฟอสโฟสเปซิฟิก p38 MAPK(Thr180/Tyr182)

การวัดความมีชีวิตของเซลล์หลังการบำบัดเซลล์ E18 ด้วยสารยับยั้งพาราควอตและไคเนส

จากการแสดงให้เห็นว่าพาราควอตสร้างการกระตุ้น ERK1/2, PKB และ JNK1/2 ก่อนกำหนดในทุกกรณีในเซลล์ E18 เราจึงได้กำหนดบทบาทของการกระตุ้นอย่างรวดเร็วของวิถีไคเนสเหล่านี้ในการตายของเซลล์ที่เกิดจากพาราควอตที่มีความเข้มข้นต่ำโดยใช้คุณสมบัติทางเภสัชวิทยา สารยับยั้ง ดังแสดงในรูปที่ 1 การสัมผัสเซลล์ E18 กับพาราควอต 25lM ทำให้เกิดการลดลงอย่างมีนัยสำคัญในความมีชีวิตของเซลล์ (ประมาณ 50 เปอร์เซ็นต์) เพื่อตรวจสอบบทบาทของ ERK1/2, PKB และ JNK1/2 ในการตายของเซลล์ที่เกิดจากพาราควอต เซลล์ E18 ถูกบ่มล่วงหน้าเป็นเวลา 30 นาทีด้วยสารยับยั้งไคเนสต่อไปนี้: PD(โรคพาร์กินสัน)98059 (50lM; MEK1/2inhibitor), LY 294002 (30lM; PI{6}}K inhibitor), wortmannin(100nM; PI-3K inhibitor) และ SP 600125 (10lM; JNK1/2 inhibitor) ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 8 (และถูกสรุปไว้ในตารางที่ 1) เวิร์ตมันนิน, LY 294002 และ PD 98059 ไม่มีผลอย่างมีนัยสำคัญต่อการสูญเสียความมีชีวิตของเซลล์ที่เกิดจากพาราควอต 25lM

อภิปรายผล

เมื่อเร็ว ๆ นี้ การศึกษาต่างๆ ได้เพิ่มความสนใจในความเป็นไปได้ที่ neurotoxins ในสิ่งแวดล้อม เช่น ยาฆ่าแมลง อาจเกี่ยวข้องกับการพัฒนาของ nongenetic PD(โรคพาร์กินสัน)(Cory Slechta et al., 2005; Landrigan et al., 2005; Norris et al., 2004; Ritz and Yu, 2000; Sherer et al., 2001) PQ เป็นหนึ่งในสารกำจัดวัชพืชที่เป็นไปได้ที่เกี่ยวข้องกับ PD เนื่องจากมีโครงสร้างทางเคมีที่คล้ายคลึงกันกับ MPPþ และความสัมพันธ์ที่แข็งแกร่งระหว่างอุบัติการณ์ของโรคกับปริมาณของ PQused (Lanska, 1997; Liou et al., 1997; Ritz and ยู, 2000). อย่างไรก็ตาม กลไกของความเป็นพิษของเส้นประสาทที่เกิดขึ้นจากการได้รับพาราควอตในระดับต่ำนั้นยังไม่ได้รับการพิจารณา ไม่ว่าในกรณีใด ผลงานก่อนหน้านี้ไม่สนใจในกระบวนการเริ่มต้นที่พิสูจน์ได้หลังจากแสดงพาราควอต การค้นพบที่สำคัญของการศึกษาครั้งนี้คือ เราได้แสดงให้เห็นว่าเซลล์ E18neuroblast ที่สัมผัสกับพาราควอทราพิดที่มีความเข้มข้นต่ำช่วยเพิ่มฟอสโฟรีเลชั่นที่ถูกกระตุ้นของวิถีการส่งสัญญาณต้านอะพอพโทซิสโดยทั่วไป PI-3K/PKB และ MEK ERK และโปรไบโอติกโดยทั่วไป JNK1/ 2 แผนที่ ในทางตรงกันข้าม พาราควอตไม่ได้กระตุ้นการเพิ่มขึ้นของเวลาหรือความเข้มข้นที่วัดได้ใน p38 MAPK phosphorylation ตามที่ระบุไว้ข้างต้น เราใช้พาราควอตความเข้มข้นต่ำ ความเกี่ยวข้องของข้อเท็จจริงที่ว่าพาราควอตสามารถเข้าสู่สมองได้หรือไม่เพราะเป็นโมเลกุลที่มีประจุได้รับการถกเถียงกัน อย่างไรก็ตาม การค้นพบล่าสุด (Shimizu et al., 2001) เปิดเผยว่าพาราควอตสามารถใช้ปั๊มกรดอะมิโนที่เป็นกลางเพื่อเข้าสู่สมองได้ ผลการวิจัยที่นำเสนอในงานนี้ระบุว่าจำเป็นต้องมีพาราควอตที่มีความเข้มข้นต่ำในเซลล์เพื่อกระตุ้นเส้นทางสัญญาณต่างๆ อย่างรวดเร็ว รวมทั้ง NK ซึ่งเกี่ยวข้องกับกระบวนการตายของเซลล์ การกระตุ้นการทำงานในช่วงแรกเหล่านี้เนื่องจากพาราควอตความเข้มข้นต่ำถูกเสนอเป็นครั้งแรกในงานปัจจุบัน

ให้ความสนใจเพียงเล็กน้อยกับการศึกษาการเปลี่ยนแปลงในระดับฟอสโฟรีเลชั่นของ PKB หรือ ERK1/2 ที่เกิดจากพาราควอต (Cheng et al., 2003; Peng et al., 2004) ไม่ว่าในกรณีใด รายงานก่อนหน้านี้ (Peng et al., 2004) ใช้พาราควอตที่มีความเข้มข้นค่อนข้างสูง (400lM) ซึ่งวัดระดับฟอสโฟรีเลชันของ ERK หลังการสัมผัส 12–18 ชั่วโมง ในช่วงเวลานี้ พวกเขาไม่ได้สังเกตการเปลี่ยนแปลงในระดับ p-ERK ในงานของเรา เราตรวจพบการทำงานในช่วงต้น (5–10 นาที) และการเปิดใช้งาน ERK1/2 ที่สำคัญ (รูปที่ 2A) การเปิดใช้งานนี้จะค่อยๆ ลดลงจนถึงระดับพื้นฐาน ในเงื่อนไขของเรา ระดับของฟอสโฟรีเลต ERK1/2 (หลังจาก 12–18 ชั่วโมง) จะเหมือนกับในตัวควบคุม ซึ่งบ่งชี้ว่าเส้นทางนี้ไม่ทำงานในเวลาเหล่านี้ (ไม่แสดงข้อมูล) ตามที่อธิบายโดย Peng et al (2004). การกระตุ้นนี้ไม่ขึ้นกับความเข้มข้น ซึ่งบ่งชี้ถึงผลลัพธ์ที่ได้รับและคงไว้ซึ่งการกระตุ้นที่มีประสิทธิภาพของ ERK ด้วยพาราควอตที่มีความเข้มข้นต่ำมาก การเปลี่ยนแปลงของระดับ PKB ที่มีฟอสโฟรีเลตยังไม่ได้รับการอธิบายหลังจากการสัมผัสพาราควอต เราแสดงในรูปที่ 4 ว่าผลลัพธ์ขึ้นอยู่กับเวลาและความเข้มข้น โดยแสดงผลสูงสุดหลังจากแสดงผลลัพธ์สูงสุด 20- นาทีด้วยพาราควอต 25lM นั่นคือการเพิ่มขึ้นของ PKB phosphorylation ที่อาศัยพาราควอตในช่วงแรกนั้นเทียบได้กับ ERK1/2 ที่สังเกตพบ ข้อมูลเหล่านี้เผยให้เห็นการเพิ่มขึ้นในช่วงต้นของการเปิดใช้งาน phosphorylation ของทั้งเส้นทางการอยู่รอดของ PKB และ ERK ไม่มีข้อมูลเกี่ยวกับการกระตุ้น PKB หรือ ERK ในระยะเริ่มต้นในการตายของเซลล์ที่เกิดจากพาราควอต อย่างไรก็ตาม การศึกษาก่อนหน้านี้ (Halvorsen et al., 2002) อธิบายถึงการเพิ่มขึ้นในช่วงต้นที่คล้ายกันในทั้งสองวิถีในเซลล์ neuroblastoma SH-SY5Y ที่สัมผัสกับMPPþ ในกรณีนี้ ระดับฟอสโฟรีเลชันจะไม่สลายตัวไปถึงระดับฐาน ข้อมูลเหล่านี้มีความน่าสนใจเป็นพิเศษเนื่องจากโครงสร้างที่คล้ายคลึงกันก่อนหน้านี้ระหว่างพาราควอตและMPPþ ซึ่งบ่งชี้ถึงการเริ่มต้นที่แตกต่างกันของกลไกเซลลูลาร์ที่เกี่ยวข้องกับผลกระทบของทั้งสองโมเลกุล

มีการให้ความสนใจมากขึ้นกับบทบาทของ JNK1/2pathway ในการไกล่เกลี่ยสัญญาณที่เอื้อต่อการตายของเซลล์ที่เกิดจากพาราควอต ในการศึกษานี้ เราได้แสดงให้เห็นว่าพาราควอตที่มีความเข้มข้นต่ำ (25lM) กระตุ้นการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในฟอสโฟรีเลต JNK1/2 (รูปที่ 6) ดังที่เกิดขึ้นใน PKBor ERK1/2 การเปิดใช้งานนี้ขึ้นอยู่กับเวลาโดยเริ่มจากจุดเริ่มต้น (5 นาที) และกลับสู่ระดับพื้นฐานอย่างช้าๆ ผลงานก่อนหน้านี้ (Cheng et al., 2003; Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) แสดงการเปิดใช้งาน JNK1/2pathway ในช่วงปลาย (12–18 ชั่วโมง) ในทุกกรณีด้วยพาราควอตที่มีความเข้มข้นค่อนข้างสูง (จาก 400lM [Peng et al., 2004] ถึง 800lM [Chunet al., 2001]) ในสภาวะของเรา ระดับฟอสโฟรีเลชั่นของJNK1/2 ณ เวลาที่ระบุนั้นเทียบได้กับกลุ่มควบคุม โดยรวม ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้เป็นครั้งแรกว่าการที่เซลล์ได้รับพาราควอตที่มีความเข้มข้นต่ำมากทำให้เกิดการกระตุ้นเส้นทาง PKB, ERK1/2 และ JNK1/2 ในระยะเริ่มต้น

เมื่อพบว่าพาราควอตกระตุ้นการกระตุ้น PKB, ERK1/2 และ JNK1/2 ในช่วงต้นในเซลล์ E18 เราจึงตรวจสอบบทบาทของเส้นทางโปรตีนไคเนสเหล่านี้ในการตายของเซลล์ที่เกิดจากพาราควอตโดยใช้สารยับยั้งทางเภสัชวิทยาหลายชนิด ความอยู่รอดของเซลล์ถูกเฝ้าติดตามโดยการวัดการเปลี่ยนแปลงเป็น MTT ไปเป็นสีย้อมฟอร์มาซานที่ดูดซับแสงที่ 570 นาโนเมตร การทดสอบ MTT ถูกนำมาใช้เพื่อวัดการบาดเจ็บของเส้นประสาทอย่างแม่นยำหลังจากการดูถูกเหยียดหยามต่างๆ รวมถึง MPPþ หรือพาราควอต (Gonzalez Polo et al., 2003, 2004; Schmuck et al., 2002; Sheng et al.,2002; Storch et al., 2004 ) และเป็นวิธีที่ใช้มากที่สุดในการพิจารณาการตายของเซลล์ ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 8 การปรับสภาพด้วยตัวยับยั้ง JNK1/2 แบบเลือกเฟ้น SP 600125 ลดการตายของเซลล์ที่เกิดจากพาราควอตอย่างมีนัยสำคัญ ความเข้มข้นของ SP 600125 นี้ปิดกั้นการกระตุ้นด้วยพาราควอตของ JNK1/2 อย่างสมบูรณ์ (รูปที่ 7) ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการยับยั้งการกระตุ้นต้นของวิถี JNK1/2 ในระยะเริ่มต้นช่วยปกป้องเซลล์จากการตายของเซลล์ที่เกิดจากพาราควอต ข้อมูลเหล่านี้สอดคล้องกับการศึกษาก่อนหน้านี้ (Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) ซึ่งแสดงให้เห็นว่า JNK1/2 เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ประสาทที่เกิดจากพาราควอต อย่างไรก็ตาม การศึกษาเหล่านี้ใช้พาราควอตที่มีความเข้มข้นระหว่าง 15 ถึง 30 เท่ามากกว่าที่ใช้ในการศึกษานี้ เรายังแสดงให้เห็นด้วยว่าพาราควอตที่มีความเข้มข้นต่ำไม่เพียงแต่สามารถกระตุ้นได้เท่านั้น แต่ยังช่วยกระตุ้นเส้นทางนี้ในระยะเริ่มต้นอีกด้วย การป้องกันที่สังเกตได้จาก SP600125 ยังบ่งชี้ว่าวิถี JNK1/2 เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ที่เกิดจากพาราควอต นอกจากนี้ การยับยั้ง JNK1/2 ยังได้รับการออกแบบให้เป็นกลยุทธ์ในการรักษา PD(โรคพาร์กินสัน)ในหลายรุ่นทั้งในร่างกายและในหลอดทดลอง (Wang et al., 2004)

ฤทธิ์ป้องกันระบบประสาทของ cistanche

การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าทั้ง PKB และ ERKpathways เกี่ยวข้องกับการอยู่รอดของเซลล์ประสาท (Guyton et al.,1996; Shin et al., 2001) ในการศึกษานี้ เราได้แสดงให้เห็นว่าการผลิตพาราควอตที่มีความเข้มข้นต่ำและกระตุ้นทั้งวิถี PKB และ ERK ในระยะเริ่มต้น การสังเกตเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการกระตุ้น PKB และ ERK ที่เกิดจากพาราควอตอาจเกี่ยวข้องกับการปกป้องเซลล์จากการตายของเซลล์ที่เกิดจากพาราควอต ในการตรวจสอบความเป็นไปได้นี้ เราใช้ PI-3K inhibitors wortmannin และ LY 294002 ที่ไม่เกี่ยวข้องเชิงโครงสร้างและ ERK1/2inhibitor PD(โรคพาร์กินสัน)98059. สิ่งที่น่าสนใจคือ ทั้งการยับยั้ง PKB และ ERK ไม่ได้เปลี่ยนแปลงความมีชีวิตของเซลล์เมื่อมีพาราควอต ซึ่งบ่งบอกว่าในสภาวะของเรา การกระตุ้น PKB และ ERK ที่เพิ่มขึ้นนั้นไม่จำเป็นต่อการอยู่รอดในการตายของเซลล์ที่เกิดจากพาราควอตในเซลล์ E18

เป็นที่ทราบกันดีว่ากลไกของความเป็นพิษต่อระบบประสาทของพาราควอตนั้นเป็นสื่อกลางผ่านความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน (Gonzalez-Polo et al., 2004; Mollace et al., 2003) ท่ามกลางปัจจัยอื่นๆ ในแง่นี้ เมื่อเร็ว ๆ นี้ได้มีการอธิบายความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันของเซลล์อย่างรวดเร็วในเหตุการณ์ apoptotic ในช่วงต้นที่เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ที่เกิดจากพาราควอต (Gonzalez-Polo et al., 2004) เนื่องจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันกระตุ้นสมาชิกของตระกูล MAPK (เช่น ERK1/2 และ JNK1/2) และ PKB (Kamata และ Hirata, 1999) การกระตุ้น ERK1/2, JNK1/2 และ PKB ในช่วงต้นนี้สามารถนำมาประกอบกับการเกิดออกซิเดชันอย่างรวดเร็ว ความเครียดที่เกิดขึ้นหลังการแสดงพาราควอต

โดยสรุป ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นเป็นครั้งแรกว่าพาราควอตความเข้มข้นต่ำกระตุ้นการเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วและแข็งแกร่งในเซลล์ PKB, ERK1/2 และ JNK1/2 ในเซลล์ E18 นอกจากนี้ เราได้แสดงให้เห็นว่าการยับยั้งการกระตุ้นในช่วงต้นของวิถี JNK1/2 ช่วยปกป้องเซลล์ E18 จากการตายของเซลล์ที่เกิดจากพาราควอต ผลลัพธ์นี้ชี้ให้เห็นถึงการมีอยู่ของเหตุการณ์เริ่มต้นบางอย่าง (เช่นการกระตุ้น JNK1/2 อย่างรวดเร็ว) ที่มีบทบาทสำคัญในการตายของเซลล์ที่เกิดจากพาราควอตที่มีความเข้มข้นต่ำ ผลลัพธ์นี้ยังเปิดบรรทัดใหม่และน่าตื่นเต้นในการศึกษาความเป็นพิษของพาราควอตและความหมายที่เป็นไปได้ในการพัฒนา PD(โรคพาร์กินสัน).

บันทึก: Cistancheเป็นสมุนไพรจีนโบราณที่มีผลต่อเซลล์ประสาทและเซลล์สมอง cistanche เป็นที่รู้จักกันว่าโสมทะเลทรายมันเป็นการรักษาโรคทางระบบประสาทเช่นโรคพาร์กินสันจากการศึกษาทางเภสัชวิทยาสมัยใหม่