Krüppel-like Factor 6 การสูญเสีย BCAA Catabolism ทำให้เกิดการบาดเจ็บที่ไตในหนูและมนุษย์

edmund.chen@wecistanche.com

เมแทบอลิซึมของเซลล์เปลี่ยนแปลงในไตproximal tubule (PT) เซลล์มีบทบาทสำคัญในระยะเฉียบพลันไตบาดเจ็บ (อากิ). ปัจจัยการถอดรหัส Krüppel-like factor 6 (KLF6) เกิดขึ้นอย่างรวดเร็วและแข็งแกร่งในช่วงต้น PT หลังจาก AKI เราพบว่าการล้มลง Klf6 เฉพาะ PT (Klf6PTKD) นั้นป้องกัน AKI และไตพังผืดในหนู การวิเคราะห์หาลำดับเบสของ RNA และ chromatin immunoprecipitation ที่รวมกันแสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของยีนที่เข้ารหัสเอนไซม์ catabolic ของกรดอะมิโนสายโซ่กิ่ง (BCAA) ถูกเก็บรักษาไว้ในหนูเมาส์ Klf6PTKD โดย KLF6 ครอบครองบริเวณโปรโมเตอร์ของยีนเหล่านี้ ตรงกันข้าม การแสดงออกที่มากเกินไปของ KLF6 ที่เหนี่ยวนำได้ยับยั้งการแสดงออกของยีน BCAA และทำให้รุนแรงขึ้นไตบาดเจ็บและพังผืดในหนู ในหลอดทดลอง เซลล์ที่ได้รับบาดเจ็บซึ่งแสดงออก KLF6 มากเกินไป มีการลดลงที่คล้ายกันในการแสดงออกของยีน BCAA catabolic และไม่สามารถใช้ BCAA ได้ นอกจากนี้ การล้มลงของ BCKDHB ซึ่งเข้ารหัสหนึ่งหน่วยย่อยของเอ็นไซม์จำกัดอัตราในแคแทบอลิซึมของ BCAA ส่งผลให้การผลิต ATP ลดลง ในขณะที่การรักษาด้วย BCAA catabolism Enhancer BT2 เพิ่มการเผาผลาญ การวิเคราะห์การทำงานของไตการแสดงออกของยีน KLF6 และ BCAA ในภาวะเรื้อรังของมนุษย์โรคไตผู้ป่วยมีความสัมพันธ์ผกผันอย่างมีนัยสำคัญระหว่าง KLF6 และทั้งสองการทำงานของไต และการแสดงออกของ BCAA ดังนั้น การกำหนดเป้าหมาย KLF6-การปราบปรามของ BCAA catabolism ที่เป็นสื่อกลางอาจเป็นเป้าหมายหลักในการรักษาใน AKI และไตพังผืด

CISTANCHE จะปรับปรุงไต/ความล้มเหลวของไต

เรื้อรังโรคไต(CKD) ทำให้เกิดการเจ็บป่วยและการตายอย่างมีนัยสำคัญ และมีความชุกในประชากรผู้ใหญ่ในสหรัฐอเมริกา ∼15 เปอร์เซ็นต์ CKD อาจเกิดจากการชกแบบเฉียบพลันซ้ำแล้วซ้ำเล่าไตบาดเจ็บ(AKI) อันเนื่องมาจากการดูหมิ่นสิ่งแวดล้อมหรือเป็นพิษหรือเป็นผลรองจากโรคอื่นหรือการรักษา ในกรณีส่วนใหญ่ ท่อใกล้เคียง (PT) เป็นตำแหน่งหลักของความเสียหายใน AKI เนื่องจากกิจกรรมการเผาผลาญที่สูงของเซลล์ PT ทำให้พวกเขาอ่อนแอต่อการบาดเจ็บจากการขาดเลือด และบทบาทในการขับยาและสารพิษต้องไหลย้อน ตัวแทนผ่านเซลล์ PT (1) ตัวแทนประเภทหนึ่งคือเคมีบำบัดที่สร้างความเสียหายต่อ DNA ซึ่งสะสมในเซลล์ PT ทำให้เกิดการสูญเสีย AKI และ nephron หลังจากได้รับบาดเจ็บ เซลล์ PT จะแยกความแตกต่างและหลั่งปัจจัยที่ละลายได้ เช่น สมาชิกครอบครัว Wnt และ Hedgehog และไซโตไคน์ (1-4) เซลล์ PT ที่แยกความแตกต่างที่รอดชีวิตสามารถกลับเข้าสู่วัฏจักรเซลล์อีกครั้งและเพิ่มจำนวนขึ้นเพื่อซ่อมแซม PT ที่ได้รับบาดเจ็บ ตามด้วยการเปลี่ยนแปลงซ้ำไปยังเซลล์ PT ที่ทำงานได้อย่างสมบูรณ์ (2) อย่างไรก็ตาม เซลล์ที่ได้รับการหยุดวงจรของเซลล์ที่จุดตรวจ G2/M อาจไม่ฟื้นตัว นำไปสู่การฝ่อและการควบคุมสัญญาณ profibrotic ที่เพิ่มขึ้น (5) กระตุ้นการเกิดพังผืดโดยการกระตุ้นการสร้างความแตกต่างของไฟโบรบลาสต์ที่อาศัยอยู่กับไมโอไฟโบรบลาสต์ที่หลั่งโปรตีนเมทริกซ์นอกเซลล์ และ คัดเลือกเซลล์ภูมิคุ้มกัน เช่น มาโครฟาจและทีเซลล์ (1)

คำสำคัญ:ไต; อาการบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลัน หลอดใกล้เคียง; ปัจจัยการถอดความ กรดอะมิโนสายโซ่กิ่ง

นอกจากการกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณที่ทำให้เกิดโรคแล้ว เซลล์ PT ที่ได้รับบาดเจ็บยังแสดงให้เห็นการเผาผลาญของเซลล์ที่เปลี่ยนแปลงไปอย่างมากอีกด้วย เซลล์ PT ที่ไม่ได้รับบาดเจ็บต้องอาศัยกรดไขมันไมโตคอนเดรีย - ออกซิเดชัน วัฏจักรกรดไตรคาร์บอกซิลิก (TCA) และออกซิเดชันฟอสโฟรีเลชันอย่างมากสำหรับการผลิตเอทีพี อย่างไรก็ตาม ในการตั้งค่าของการบาดเจ็บ กรดไขมัน - การเกิดออกซิเดชันจะถูกระงับ โดยมีการชดเชยระดับเล็กน้อยของ glycolysis เท่านั้น ทำให้ระดับ ATP โดยรวมลดลงใน PT (6) ที่ได้รับบาดเจ็บ นอกจากนี้ การยับยั้งกรดไขมัน - ออกซิเดชัน ในหลอดทดลอง ทำให้เกิดความแตกต่างและการตายของเซลล์เยื่อบุผิวท่อและในร่างกายแย่ลงไตบาดเจ็บหลังการรักษากรดโฟลิก (6). ที่น่าสนใจคือ การเพิ่มการควบคุมของกรดไขมันไมโตคอนเดรีย - ออกซิเดชันหรือออกซิเดชันของกรดไขมันเปอร์อกซิโซม (FAO) สามารถป้องกันได้ไตบาดเจ็บ(6, 7) แนะนำว่าการรักษาระดับเมแทบอลิซึมของเซลล์อาจเป็นเป้าหมายในการรักษาโรคใน AKI การศึกษา transcriptomic ในการตรวจชิ้นเนื้อไตด้วย CKD ของมนุษย์และหลังการบาดเจ็บจากการกลับของเลือดขาดเลือด (IRI) ในหนูทดลองแสดงให้เห็นการเผาผลาญของกรดไขมันที่ผิดปกติเช่นเดียวกับการเผาผลาญของกรดอะมิโน (6, 8) ถึงแม้ว่าบทบาทของ PT ของกรดไขมัน - ออกซิเดชันได้รับการอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ใน AKI แล้ว แต่บทบาทของการเผาผลาญกรดอะมิโน PT ใน AKI ยังคงต้องศึกษาต่อไป นอกจากนี้ กลไกของการบาดเจ็บของ PT ที่อธิบายจนถึงปัจจุบันส่วนใหญ่ได้รับการสำรวจโดยใช้แบบจำลองเมาส์ที่มีการแสดงออกมากเกินไปและการแสดงออกที่มากเกินไปของโมเลกุลการส่งสัญญาณส่วนบุคคล แต่กลไกโดยที่เส้นทางทั่วโลก ทั้งไฟโบรติก/การอักเสบและเมตาบอลิซึม และการสลับระหว่างการฟื้นตัวตามปกติและการฝ่อ ถูกควบคุมใน AKI ที่มีลักษณะไม่ดี

ปัจจัยการถอดความทำหน้าที่เป็นผู้ควบคุมหลักของกระบวนการทางชีววิทยาขั้นพื้นฐาน เนื่องจากความสามารถในการควบคุมการแสดงออกของเป้าหมายปลายน้ำหลายจุดและก่อให้เกิดการป้อนกลับแบบวนซ้ำ ใน AKI ปัจจัยการถอดความที่ศึกษามาเป็นอย่างดี เช่น FOS และสมาชิกในครอบครัว JUN นั้นได้รับการควบคุมอย่างเข้มงวด การศึกษาเมื่อเร็ว ๆ นี้เกี่ยวกับการตอบสนองระดับโมเลกุลต่อ IRI ในตัวอย่างของมนุษย์และการทำโปรไฟล์การแปล PT หลังจากการอุดตันของท่อไตข้างเดียว (UUO) ในหนูยังระบุปัจจัยการถอดรหัสด้วยนิ้วสังกะสี Krüppel-like factor 6 (KLF6) เป็นยีนตอบสนองการบาดเจ็บในระยะเริ่มแรกที่คล้ายกัน (9, 10 ). KLFs ประกอบรวมด้วยแฟกเตอร์การถอดรหัสด้วยสังกะสี-ฟิงเกอร์ที่มีโดเมนการจับดีเอ็นเอของปลาย C ที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างสูงและเทอร์มินีที่แปรผันได้ซึ่งแสดงออกอย่างกว้างขวาง ซึ่งรวมถึงในไต(11). KLF6 มีบทบาทในหลายกระบวนการ เช่น การเพิ่มจำนวนและการสร้างความแตกต่างของเซลล์ การตายของเซลล์ การตายของเซลล์ การตอบสนองต่อความเสียหายของ DNA และการทำงานของไมโตคอนเดรีย (12) และได้รับการระบุว่ามีบทบาทในตับ หัวใจ และไตการเกิดพังผืดโดยมีผลกระทบตามบริบท (13, 14) ภายในไต, KLF6 ถูกแสดงออกใน glomerular podocytes และเป็นตัวควบคุมที่สำคัญของการทำงานของไมโตคอนเดรียในการตั้งค่าของ focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) (15) นอกเหนือจากการแสดงออกของมันใน glomerular podocytes แล้ว KLF6 ยังแสดงออกอย่างแปรผันใน PT แต่บทบาทของมันในเซลล์ PT ไม่ว่าจะในการทำงานปกติหรือหลังการบาดเจ็บก็ไม่เป็นที่เข้าใจ การแสดงออกที่มากเกินไปของ KLF6 ในเซลล์ HK-2 ทำให้เกิดฟีโนไทป์ที่ไม่แตกต่างกันด้วย E-cadherin ที่ลดลงและการแสดงออกของวิเมนตินที่เพิ่มขึ้นและยังนำไปสู่การแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของโปรตีนการอักเสบของมาโครฟาจ-3 (16) นอกจากนี้ การแสดงออกของ KLF6 เพิ่มขึ้นในการตอบสนองต่อกลูโคสที่สูง และผลกระทบนี้ถูกขัดขวางโดยการทำให้ล้มลงของ TGFB1 หรือการบำบัดด้วยแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลาง TGF- 1 การบำบัดโดยตรงด้วย TGF- 1 ยังเหนี่ยวนำการแสดงออกของ KLF6 ซึ่งบ่งชี้ถึงวงจรป้อนกลับเชิงบวกที่เป็นไปได้ในเซลล์ HK-2 (16) นอกจากนี้ KLF6 ยังแสดงให้เห็นว่าถูกเหนี่ยวนำในเซลล์มะเร็ง ในหลอดทดลอง โดยขนาดยา subapoptotic ของยาเคมีบำบัดที่ทำลาย DNA ซิสพลาติน (17) เพื่อกำหนดบทบาทของ PT KLF6 ในการตอบสนองต่อความเสียหายของ DNA เราใช้กรด aristolochic I (AAI) ของสารพิษที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติ โรคไตที่เกี่ยวข้องกับ AAI มีความเกี่ยวข้องทางคลินิก (18) และความเป็นพิษของ AAI มีความเฉพาะเจาะจงสูงสำหรับ PT ดังนั้นจึงช่วยให้ศึกษาบทบาทของ PT KLF6 โดยเฉพาะในการตอบสนองต่อการบาดเจ็บของ PT นอกจากนี้ AAI ยังทำให้เกิดทั้ง AKI และการเปลี่ยนแปลงไปสู่การเกิดพังผืดในหนูได้อย่างน่าเชื่อถือ ตรงกันข้ามกับสูตรยาซิสพลาตินส่วนใหญ่ (19) AAI เข้าสู่เซลล์ PT ผ่านตัวขนส่งประจุลบอินทรีย์ basolateral (OATs) 1 ถึง 3 และมีผลทั้งต่อพันธุกรรม ผ่านการก่อตัวของ aristolactam (AL) -DNA adducts และผลกระทบต่อเซลล์ ทำให้เกิดความเสียหายต่อไมโตคอนเดรีย ซึ่งสร้างออกซิเจนชนิดปฏิกิริยา และยับยั้งปกติโดยเฉพาะ การทำงานของ PT เช่น เอนโดไซโทซิสที่อาศัยรีเซพเตอร์ (18–20) ในที่นี้ เราแสดงให้เห็นผ่านการปรับการแสดงออกของ KLF6 โดยเฉพาะใน PT ผ่านการศึกษาการได้รับฟังก์ชันและการสูญเสียหน้าที่ในหนูเมาส์ที่ KLF6-เป็นสื่อกลางในการปราบปรามของแคแทบอลิซึมของกรดอะมิโนสายโซ่กิ่ง (BCAA) มีส่วนทำให้เกิด AKI และตามมาไตพังผืด

ผลลัพธ์

การรักษา AAI เพิ่มการแสดงออกของไต PT Klf6 เนื่องจากสมาชิกหลายคนของตระกูล KLF แสดงออกในเซลล์เยื่อบุผิวในไต(21) เริ่มแรกเรารับหน้าที่ qRT-PCR สำหรับ Klfs เยื่อบุผิวเหล่านี้ในไตคอร์เทกซ์เก็บเกี่ยว 24 ชั่วโมงหลังจากขนาดยาเดียวของทอกซินจำเพาะ PT, AAI เทียบกับกระสายยา (ไดเมทิลซัลฟอกไซด์ [DMSO]) ในหนูเมาส์ C57BL/6 Klf4, Klf5 และ Klf6 ได้รับการควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่ Klf15 มีการควบคุมที่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 1A) และการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของยีนเหล่านี้เกิดขึ้นก่อนที่จะมีการเพิ่มขึ้นของ creatinine ในซีรัม (รูปที่ 1B) เพื่อตรวจสอบว่าการควบคุม Klf6 เพิ่มขึ้นชั่วคราวหรือเป็นเวลานาน เราบริหาร AAI ในการฉีดหลายครั้ง 3 ดาพาร์ทสำหรับการฉีดสองครั้งหรือ 3 สัปดาห์ (ระยะแอคทีฟ) หรือ 3 สัปดาห์ตามด้วย 3 สัปดาห์โดยไม่มี AAI (เฟสการเปลี่ยนแปลง) (รูปที่ 1C) . PT ยังคงไม่บุบสลาย 24 ชั่วโมงหลังการฉีดหนึ่งครั้ง แต่หลังจากการฉีดสองครั้ง เซลล์ PT ได้รับการตายของเซลล์ และหนูที่ได้รับการรักษาด้วย AAI หลายขนาดแสดงให้เห็นการสูญเสีย PT การอักเสบที่แทรกซึม โปรตีน

การหล่อและการพังผืดเมื่อสิ้นสุดระยะการเปลี่ยนแปลง (รูปที่ 1D) การแสดงออกของ Klf6 ยังคงเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในระยะที่ใช้งานและการเปลี่ยนแปลงรูปแบบของการบาดเจ็บ (รูปที่ 1E) ซึ่งแนะนำบทบาทของ KLF6 ตลอดระยะเฉียบพลันและการเกิดพังผืดของการบาดเจ็บ KLF6 แสดงออกในเซลล์ไต ท่อ และเซลล์อักเสบ และเพื่อตรวจสอบการมีส่วนร่วมของการแสดงออกของ Klf6 เฉพาะ PT ต่อการเพิ่มขึ้นของการแสดงออกของ Klf6 ของเยื่อหุ้มสมองไตที่สังเกตได้ เราทำการจัดลำดับ RNA (RNA-seq) ในส่วน microdissected S2 / S3 PT 24 ชั่วโมงหลังการฉีด AAI หนึ่งครั้ง ก่อนการสูญเสียเซลล์ PT Klf6 ได้รับการควบคุมอย่างสูงในระดับที่เทียบได้กับปัจจัยการถอดรหัสการตอบสนองในช่วงต้นที่รู้จักกันดีอย่าง Fos และ Jun ซึ่งบ่งชี้ว่าการเหนี่ยวนำการแสดงออกของ Klf6 messenger RNA (mRNA) ในระยะเริ่มต้นในไตถูกขับเคลื่อนโดยการแสดงออกในเซลล์ PT (รูปที่ 1F) การค้นพบนี้สอดคล้องกับข้อมูลลำดับอาร์เอ็นเอแบบเซลล์เดียว/นิวเคลียร์ที่เผยแพร่เมื่อเร็วๆ นี้ ซึ่งแสดงการควบคุมของ Klf6 ในเซลล์ PT ในหนูที่ได้รับบาดเจ็บและมนุษย์ไต(22, 23). สุดท้าย การทำเหมืองข้อมูลของอาร์เรย์นิพจน์จากการศึกษาหลักสูตรเวลา IRI ที่รายงานก่อนหน้านี้ (8) ยืนยันการเหนี่ยวนำในช่วงต้นของการแสดงออกของ KLF6 ภายใน 2 ชั่วโมงของ AKI เช่นเดียวกับ Fos และ Jun (รูปที่ 1G) ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า Klf6 เป็นยีนตอบสนองต่อการบาดเจ็บที่เหนี่ยวนำได้ในระยะแรกหลังการรักษาด้วย AAI สารพิษจำเพาะ PT และหลัง IRI และยังคงเพิ่มสูงขึ้นแม้จะหยุด AAI

การสูญเสีย KLF6 เฉพาะ PT ช่วยลดอาการบาดเจ็บที่ไตในขั้นตอนการใช้งานและการเปลี่ยนแปลงหลังการรักษา AAIเพื่อตรวจสอบการมีส่วนร่วมของ KLF6 เฉพาะ PT ต่อการบาดเจ็บที่เกิดจาก AAI เราได้สร้างหนูที่มีการล้มลงเฉพาะ PT ของ Klf6 (Klf6PTKD) โดยการข้ามหนู Klf6fl/fl (24) กับหนู Pepck-Cre (25) หนูเมาส์ Klf6PTKD มีชีวิตและเจริญพันธุ์ โดยมีการล้มลงอย่างมีนัยสำคัญของการแสดงออกของโปรตีน KLF6 จำเพาะ PT แต่ไม่มีการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของ Klf6 mRNA ในตับ เมื่อเปรียบเทียบกับหนูเมาส์ Klf6fl/fl (ภาคผนวก SI, รูปที่ S1 A–C) ไม่มีความแตกต่างที่ชัดเจนในไตเนื้อเยื่อวิทยาหรือการทำงานระหว่างหนู Klf6fl/fl และ Klf6PTKD ที่อายุ 24 สัปดาห์ (ภาคผนวก SI, รูปที่ S1 D และ E) และระดับการแสดงออกของ OAT 1 ถึง 3 (Slc22a6, Slc22a7 และ Slc22a8) เส้นทางของรายการ AAI PT ไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ (ภาคผนวก SI, รูปที่ S1F)

หนูกลุ่มควบคุม (Klf6fl/fl) และหนู Klf6PTKD ถูกบำบัดด้วยกระสายยา (DMSO) หรือ AAI 3 มก./กก. ในช่องท้องทุกๆ 3 วันเป็นเวลา 3 สัปดาห์และทำการุณยฆาต 3 วันหลังการฉีด AAI ครั้งสุดท้ายเพื่อประเมินระยะแอคทีฟของการบาดเจ็บหรือ 3 สัปดาห์หลัง การฉีด AAI ครั้งสุดท้ายเพื่อประเมินระยะการเปลี่ยนแปลงของการบาดเจ็บ (รูปที่ 1C) หนู Klf6fl/fl และ Klf6PTKD มีปริมาณ AL-DNA adducts ใกล้เคียงกันทั้งหลังการฉีดครั้งเดียวและเมื่อสิ้นสุดระยะใช้งานและการเปลี่ยนแปลง (ภาคผนวก SI รูปที่ S1 G และ H) บ่งชี้ว่าการดูดซึม PT ที่คล้ายกันของ AAI และการซ่อมแซม AL -DNA adducts ในหนู Klf6fl/fl และ Klf6PTKD ขณะทำการฉีด หนูที่ได้รับ AAI จะลดน้ำหนักเมื่อเทียบกับผู้ที่ได้รับ DMSO โดยลดลง ∼18 เปอร์เซ็นต์จากค่าพื้นฐานที่ใกล้เคียงกันในหนูทดลองทั้ง Klf6fl/fl และ Klf6PTKD ที่การฉีด AAI ครั้งสุดท้าย ตามด้วยน้ำหนักตัวที่เท่ากันกลับคืนมา ( ภาคผนวก SI, รูปที่ S2A)ไตน้ำหนักที่สัมพันธ์กับน้ำหนักตัวเริ่มต้น (วันที่ 0) มีความคล้ายคลึงกันระหว่างหนูเมาส์ Klf6fl/fl ที่บำบัดด้วย DMSO และ AAI และหนู Klf6PTKD ที่ส่วนท้ายของเฟสที่แอ็คทีฟ (ภาคผนวก SI, รูปที่ S2B) ในขั้นตอนการปรับปรุงไตจากหนูเมาส์ Klf6fl/fl ที่บำบัดด้วย AAI มีน้ำหนักน้อยกว่าหนูที่ได้รับการรักษาด้วย DMSO อย่างมีนัยสำคัญ แต่ในหนูเมาส์ Klf6PTKD ที่บำบัดด้วย AAIไตน้ำหนักถูกเก็บรักษาไว้ (ภาคผนวก SI, รูปที่ S2B)การทำงานของไตถูกประเมินโดยการวัดความเข้มข้นของครีเอตินีนในซีรัม (รูปที่ 2A) และความเข้มข้นของยูเรียไนโตรเจน (รูปที่ 2B) ทั้งความเข้มข้นของครีเอตินินในซีรัมและยูเรียไนโตรเจนเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในหนูที่ได้รับ AAI เทียบกับ DMSO; อย่างไรก็ตาม ระดับความสูงนั้นน้อยกว่าอย่างมีนัยสำคัญในหนูเมาส์ Klf6PTKD เมื่อเปรียบเทียบกับหนูเมาส์ Klf6fl/fl (รูปที่ 2 A และ B) การวิเคราะห์เชิงตรรกะเชิงฮิสโตโดยใช้ฮีมาทอกซิลินและอีโอซินและการย้อมสีชิฟฟ์ที่เป็นกรดเป็นระยะแสดงให้เห็นว่าทั้งหนู Klf6fl/fl และ Klf6PTKD ที่บำบัดด้วย AAI มีการหลั่งของท่อที่มีเยื่อหุ้มชั้นใต้ดินที่เหลืออยู่ การแทรกซึมของการอักเสบที่มีการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นอย่างเด่นชัดใน

เปลือกนอกและโปรตีนหลายชนิดหล่อหลอมทั้งในคอร์เทกซ์และไขกระดูก (รูปที่ 2 C และ D) อย่างไรก็ตาม ลักษณะเฉพาะเหล่านี้มีความรุนแรงน้อยกว่าในหนูเมาส์ Klf6PTKD เมื่อเปรียบเทียบกับหนูเมาส์ Klf6fl/fl โดยคงสภาพของ tubules และการแทรกซึมของการอักเสบที่มีขนาดเล็กลง การวิเคราะห์พื้นที่ PT ไม่ได้รับการดำเนินการโดยใช้การย้อมสีเลคตินของดอกบัวเรืองแสงเพื่อระบุเส้นขอบแปรง PT ที่ไม่บุบสลายในเซลล์ PT ที่มีความแตกต่างอย่างสมบูรณ์และการเรืองแสงของภูมิคุ้มกันสำหรับไซโตเคราติน-20 (KRT-20) เพื่อระบุ PT ที่ได้รับบาดเจ็บ (8) เมื่อเทียบกับหนูที่ได้รับการรักษาด้วย DMSO ทั้งหนู Klf6fl/fl และ Klf6PTKD ที่ได้รับการรักษาด้วย AAI มีการสูญเสีย PT ที่โตเต็มที่อย่างมีนัยสำคัญ ดังที่แสดงโดยการสูญเสียการย้อมสีของ Lotus lectin และการเหนี่ยวนำการแสดงออกของ KRT-20 ซึ่งบ่งชี้ถึงความเสียหายของ PT ทั้งใน เฟสที่ใช้งานและการเปลี่ยนแปลง (รูปที่ 2E และ SI ภาคผนวก, รูปที่ S2C) หนูเมาส์ Klf6PTKD ที่บำบัดด้วย AAI มีการรักษา PT ที่โตเต็มที่อย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับหนูเมาส์ Klf6fl/fl พร้อมกับการเหนี่ยวนำ KRT- 20 ในระดับที่ใกล้เคียงกันทั้งในระยะใช้งานและระยะการเปลี่ยนแปลง การย้อมสี Trichrome ของขั้นตอนการปรับปรุงใหม่ไตแสดงการสะสมของวัสดุไฟโบรติกในหนูเมาส์ Klf6fl/fl โดยมีการเกิดพังผืดที่น้อยลงอย่างมีนัยสำคัญในหนูเมาส์ Klf6PTKD (รูปที่ 2F การย้อมสีน้ำเงิน ภาคผนวก SI ตาราง S1) การสะสมของคอลลาเจนองค์ประกอบไฟโบรติกเมทริกซ์ I ที่ตรวจพบโดยใช้อิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ (รูปที่ 2G และ SI ภาคผนวก รูปที่ S2D) แสดงให้เห็นว่าคอลลาเจน I เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในหนู Klf6fl/fl ที่มี AAI แต่ไม่พบในหนู Klf6PTKD ที่มี AAI เมื่อเทียบกับ DMSO ใน เฟสที่ใช้งาน ในระยะการเปลี่ยนแปลง คอลลาเจน I เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในหนู Klf6fl/fl และ Klf6PTKD ที่มี AAI โดยมีพื้นที่เปอร์เซ็นต์ที่ต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญในหนู Klf6PTKD ที่มี AAI เมื่อเทียบกับหนู Klf6fl/fl ที่มี AAI เซลล์ที่มีการอักเสบของคั่นระหว่างหน้าประกอบด้วย CD68 บวกมาโครฟาจและ GR-1 บวกกับมัยอีลอยด์โมโนไซต์มีอยู่ใน Klf6fl/fl

และหนูเมาส์ Klf6PTKD ที่บำบัดด้วย AAI แต่มีปริมาณมากน้อยกว่าอย่างมีนัยสำคัญในหนูเมาส์ Klf6PTKD ทั้งในเฟสที่ออกฤทธิ์และระยะการเปลี่ยนแปลง (รูปที่ 2H) ดังนั้น การสูญเสีย KLF6 ที่จำเพาะต่อ PT จะช่วยป้องกันการบาดเจ็บ พังผืด และการอักเสบที่เกิดจาก PT ที่เกิดจาก AAI แม้ว่าจะมีแอดดักต์ AL-DNA ในปริมาณที่ใกล้เคียงกันเมื่อเปรียบเทียบกับหนูควบคุมที่ได้รับการรักษาด้วย AAI การสูญเสีย KLF6 เฉพาะ PT ช่วยลดสัญญาณการอักเสบและรักษาการเผาผลาญของเซลล์หลังการรักษาด้วย AAI เราพยายามทำความเข้าใจกลไกที่การสูญเสีย PT KLF6 ป้องกันการบาดเจ็บ ดังนั้นเราจึงดำเนินการ RNA-seq ของไตcortex in Klf6fl/fl and Klf6PTKD mice treated with DMSO or AAI in the active phase or remodeling phase. Significantly differentially expressed genes were defined as having a >1.5- หรือ<0.67-fold change="" and="" false="" discovery="" rate="" of=""><0.05 in="" any="" given="" pairwise="" genotype="" or="" treatment="" comparison.="" a="" combined="" total="" of="" 7,673="" genes="" were="" found="" to="" be="" differentially="" expressed="" as="" a="" result="" of="" all="" the="" pairwise="" comparisons,="" and="" hierarchical="" clustering="" showed="" these="" to="" group="" into="" two="" main="" clusters:="" genes="" that="" were="" induced="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" and="" genes="" that="" were="" suppressed="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3a="" and="" dataset="" s1).="" unbiased="" analysis="" of="" transcriptional="" effects="" of="" aai="" treatment="" in="" klf6fl/fl="" mice="" by="" undertaking="" pathway="" enrichment="" analysis="" showed="" that="" the="" most="" significantly="" upregulated="" pathways="" were="" predominantly="" inflammatory="" and="" ecm/="" cell="" adhesion="" pathways="" (e.g.,="" cytokine/chemokine="" signaling)="" and="" integrin/focal="" adhesion="" pathways,="" respectively="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b="" and="" c).="" markers="" of="" cellular="" senescence,="" including="" components="" of="" the="" senescence-associated="" secretory="" phenotype,="" were="" also="" upregulated="" after="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3d),="" but="" the="" overall="" pathway="" was="" not="" differentially="" expressed="" between="" klf6fl/fl="" and="" klf6ptkd="" mice.="" in="" general,="" these="" pathways="" were="" less="" significantly="" up-regulated="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase.="" the="" most="" significantly="" down-regulated="" pathways="" after="" aai="" were="" metabolic="" pathways,="" including="" fatty="" acid–="" and="" amino="" acid–related="" pathways;="" these="" pathways="" were="" similarly="" or="" slightly="" less="" significantly="" decreased="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b,="" e,="" and="" f).="" similar="" to="" other="" studies,="" genes="" encoding="" enzymes="" involved="" in="" anerobic="" glycolysis="" were="" up-regulated="" after="" aai="" (26,="" 27)="" (si="" appendix,="" fig.="">

เพื่อตรวจสอบเส้นทางที่อาจควบคุมโดยตรงและโดยอ้อมโดย KLF6 เราได้วิเคราะห์ยีนที่แสดงความแตกต่างเพิ่มเติมโดยจำแนกตามการมีอยู่และตำแหน่งของไซต์การจับ KLF6 โดยใช้ข้อมูล KLF6 chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-Seq) จากสารานุกรมของโครงการ DNA Elements . ยีนคลาส 2 ถูกกำหนดให้มีตำแหน่งการจับ KLF6 อย่างน้อย 1 ตำแหน่งภายใน ±1 kb ของตำแหน่งเริ่มต้นการถอดรหัส (TSS) ยีนคลาส 1 ซึ่งมีตำแหน่งการจับ KLF6 อย่างน้อย 1 ตำแหน่งระหว่าง ±1 ถึง 10 kb ของ TSS และยีนคลาส 0 ที่ไม่มีตำแหน่งการจับ KLF6 ภายใน ±10 kb ของ TSS มียีน 538 ยีนที่ถูกควบคุมในหนูเมาส์ Klf6fl/fl และควบคุมลดลงอย่างมีนัยสำคัญในหนู Klf6PTKD เทียบกับหนู Klf6fl/fl ในระยะแอคทีฟ การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าทางเดินของยีน 538 ยีนเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ (เช่น TYROBP, phagosome และมาโครฟาจ) ที่เกี่ยวข้องและการยึดเกาะของเซลล์ (เช่น อินทีกริน การยึดเกาะโฟกัส) - วิถีที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันได้รับการเสริมสมรรถนะอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 3A) การจำแนกยีนตามตำแหน่งการจับของ KLF6 แสดงให้เห็นว่า DEG ส่วนใหญ่ (428/538) ไม่มีตำแหน่งในการจับ KLF6 (คลาส 0) และการวิเคราะห์การเพิ่มสมรรถนะของยีนคลาส 2 (72) และยีนคลาส 0 แยกจากกัน แสดงให้เห็นว่าความสำคัญของวิถีเหล่านี้ได้รับแรงผลักดันอย่างมากจากยีนคลาส 0 ซึ่งบ่งชี้ว่าการแสดงออกที่ต่ำกว่าของยีนเหล่านี้ในหนูเมาส์ Klf6PTKD มีแนวโน้มว่าจะเป็นผลทางอ้อมของการบาดเจ็บ PT ที่น้อยลงอันเป็นผลมาจากการล้มลงของ Klf6 จำเพาะของ PT (รูปที่ 3A)

CISTANCHE จะปรับปรุงการทำงานของไต/ไต

มียีน 388 ยีนที่ถูกควบคุมในหนูเมาส์ Klf6fl/fl และเก็บรักษาไว้อย่างมีนัยสำคัญ (ควบคุมขึ้น) ในหนู Klf6PTKD เทียบกับหนู Klf6fl/fl การวิเคราะห์การเสริมสมรรถนะของทางเดินแสดงให้เห็นว่ายีนเหล่านี้เป็นตัวแทนของวิถีเมแทบอลิซึม โดยมีเมแทบอลิซึมของกรดอะมิโนและเมแทบอลิซึมของกรดไขมันโดดเด่น (รูปที่ 3B และ SI ภาคผนวก รูปที่ S4) การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าของยีนคลาส 2 (1{{10}}3) และยีนคลาส 0 (246) แสดงให้เห็นว่าแม้จะมีเพียง ∼25 เปอร์เซ็นต์ของยีนที่มีตำแหน่งจับ KLF6 ภายใน ±1 kb ของ TSS ( คลาส 2) ชุดย่อยของยีนนี้เป็นตัวขับเคลื่อนสำหรับค่า P ที่มีนัยสำคัญอย่างมากของวิถีเหล่านี้ เส้นทางการเผาผลาญของกรดอะมิโนจำเพาะ (Val, Leu และ Ile [BCAA] และ Gly, Ser และ Thr) มีความสำคัญเท่าเทียมกันเมื่อวิเคราะห์ยีนคลาส 2 เท่านั้น ซึ่งบ่งชี้ถึงการควบคุมโดยตรงที่เป็นไปได้ของวิถีเหล่านี้โดย KLF6 (รูปที่ 3B) . ในทางตรงกันข้าม วิถีเมแทบอลิซึมของกรดไขมันและเส้นทางการส่งสัญญาณ PPAR ส่วนใหญ่ขับเคลื่อนโดยยีนคลาส 0 ซึ่งชี้ให้เห็นถึงการรักษาทางอ้อมของวิถีเหล่านี้อันเป็นผลมาจากการล้มลงของ Klf6 เฉพาะ PT การวิเคราะห์การเสริมสมรรถนะชุดยีนสำหรับวิถีเมแทบอลิซึมของ Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ที่เฉพาะเจาะจง (การสลายตัวของกรดไขมัน เมแทบอลิซึมของกรดอะมิโน วัฏจักร TCA และไกลโคไลซิส) โดยใช้ยีนควบคุมที่แตกต่างกันทั้งหมดยืนยันว่าสิ่งเหล่านี้ได้รับการควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ (คงไว้) ใน Klf6PTKD เทียบกับหนูเมาส์ Klf6fl/fl (รูปที่ 3C)

การเหนี่ยวนำของ KLF6 กำเริบอาการบาดเจ็บที่ไตและยับยั้ง BCAA Catabolic Genes Post-AAI Treatment ในการตรวจสอบว่าการแสดงออกที่มากเกินไปของ KLF6 จะมีผลตรงกันข้ามหรือไม่ เราใช้ระบบ "tet-on" เพื่อสร้างแบบจำลองเมาส์ที่มีการแสดงออกที่เหนี่ยวนำให้เกิดด็อกซีไซคลิน (DOX) ของ KLF6 ของมนุษย์ (hKLF6OE; CAG-rtTA ดัดแปลงพันธุกรรมคู่,TRE-hKLF6 หนู) (ภาคผนวก SI, รูปที่ S5A) หนู hKLF6OE มีการชักนำให้เกิดการแสดงออกของ hKLF6 ที่แข็งแกร่งหลังจากการเสริมอาหารด้วย DOX เป็นเวลา 7 วัน โดยไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในการแสดงออกของ Klf6 ของเมาส์ (ภาคผนวก SI, รูปที่ S5B) และไตไม่แสดงการบาดเจ็บทางเนื้อเยื่อหรือการสูญเสียการทำงานของไตหลังการรักษาด้วย DOX อย่างต่อเนื่องเป็นเวลา 15 สัปดาห์ (ภาคผนวก SI, รูปที่ S5 C และ D) เปรียบเทียบกับหนูควบคุม (TRE-hKLF6 ที่มีการรักษา DOX) อย่างไรก็ตาม เพื่อกระตุ้นว่าการเหนี่ยวนำของ hKLF6 ใน PT ทำให้ AKI และ . รุนแรงขึ้นหรือไม่ไตการเกิดพังผืด, hKLF6OE และหนูควบคุมได้รับการรักษาด้วยขนาดยาที่ต่ำกว่า 1 มก./กก. AAI หรือ DMSO ทุกๆ 3 วันเป็นเวลา 2 สัปดาห์ที่ตามด้วยนาเซียเซียหลังจาก 3 วันต่อไป (ระยะแอคทีฟ) หรืออีก 2 สัปดาห์ต่อไป (เฟสการเปลี่ยนแปลง) (ภาคผนวก SI, รูปที่ . S6A). หนูควบคุมและหนู hKLF6OE ที่ได้รับ AAI สูญเสียน้ำหนักตัวในปริมาณที่ใกล้เคียงกัน (ภาคผนวก SI, รูปที่ S6B) และไตน้ำหนักเท่ากันทุกกลุ่ม (ภาคผนวก SI, รูปที่ S6C) หนู hKLF6OE มีครีเอตินีนและยูเรียไนโตรเจนในซีรัมเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับหนูควบคุมหลังการรักษาด้วย AAI ในระยะแอคทีฟ (รูปที่ 4 A และ B) สิ่งนี้มาพร้อมกับการสูญเสีย PT ที่โตเต็มที่ซึ่งมีสัดส่วนของ KRT-20–positive PT ที่สูงขึ้น ซึ่งรุนแรงขึ้นในหนูเมาส์ hKLF6OE ทั้งสองจุดเวลา (รูปที่ 4 C–E และ SI ภาคผนวก รูปที่ S6D) และเพิ่มขึ้น การเกิดพังผืดในทั้งสองเฟส (รูปที่ 4F และ SI Appendix, รูปที่ S6E) การวิเคราะห์ qRT-PCR ของยีนที่เข้ารหัสเอนไซม์ในวิถีการเผาผลาญของ BCAA แสดงให้เห็นการปราบปรามของยีน BCAA หลังการรักษาด้วย AAI ในหนูควบคุมและหนู hKLF6OE โดยมีการปราบปรามเพิ่มเติมในหนูเมาส์ hKLF6OE เมื่อเทียบกับหนูควบคุม (รูปที่ 4G) นอกจากนี้ การแสดงออกของยีน BCAA หลายตัวยังลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (Hibch) หรือมีแนวโน้มไปสู่การแสดงออกที่ต่ำกว่าใน hKLF6OE เมื่อเทียบกับหนูควบคุมแม้จะไม่มีการบำบัดด้วย AAI (ที่บำบัดด้วย DMSO) (รูปที่ 4G) ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการเหนี่ยวนำของ hKLF6 ในหนูที่โตเต็มวัยทำให้ไตมีความอ่อนไหวต่อ AKI และเกิดพังผืดในที่สุดด้วยความผิดปกติของยีนที่เข้ารหัส BCAA catabolism อย่างมีนัยสำคัญ

การเหนี่ยวนำของ KLF6 ยับยั้ง BCAA Catabolism ซึ่งเป็นสารตั้งต้นที่สำคัญสำหรับการผลิต ATP ในหลอดทดลองMitochondrial BCAA ca tabolism สามารถนำไปสู่ปฏิกิริยาออกซิเดชันฟอสโฟรีเลชั่นโดยการผลิต acetyl-CoA และ succinyl-CoA (ภาคผนวก SI, รูปที่ S4B) ในการตรวจสอบว่า KLF6 ควบคุม BCAA และเมแทบอลิซึมของเซลล์ในหลอดทดลองหรือไม่ อันดับแรก เราประเมินการแสดงออกของยีนการเผาผลาญ BCAA ในเซลล์ HK-2 ด้วยการแสดงออกที่มากเกินไปของ KLF6 (KLF6-OE) โดยมีหรือไม่มีการรักษาด้วย AAI เช่นเดียวกับในหนูเมาส์ hKLF6OE การแสดงออกของ KLF6 มากเกินไปในเซลล์ HK-2 เพียงอย่างเดียวทำให้เกิดแนวโน้มต่อการปราบปรามของยีนหลายตัวที่เข้ารหัสเอนไซม์ BCAA โดยเฉพาะอย่างยิ่ง BCKDHB การบำบัดของ KLF กลุ่มควบคุม6-Con cells ที่มี 25 μM AAI เป็นเวลา 6 ชั่วโมง ยับยั้งการแสดงออกของเอ็นไซม์หลายตัวอย่างมีนัยสำคัญ และสิ่งเหล่านี้ถูกยับยั้งเพิ่มเติมในเซลล์ KLF6- OE ที่บำบัดด้วย AAI (รูปที่ 5A) ถึง

รูปที่ 3 การสูญเสีย KLF6 ไปยับยั้งวิถีการก่อมะเร็งและรักษาเส้นทางเมตาบอลิซึมหลังการรักษาด้วย AAI (A) การจำแนกประเภทและการวิเคราะห์การเพิ่มสมรรถนะของวิถีทางของยีนที่ควบคุมในหนูเมาส์ Klf6fl/fl หลัง AAI แต่มีการควบคุมที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญน้อยกว่าในหนู Klf6PTKD หลังจาก AAI ตามคลาสของไซต์การจับ: คลาส 2 ที่มีไซต์การจับ KLF6 มากกว่าหรือเท่ากับ 1 แห่ง ±1 kb ของ TSS; คลาส 1 ที่มีไซต์การผูกมัดมากกว่าหรือเท่ากับ 1 KLF6 ที่ ±1 ถึง 10 kb จาก TSS และคลาส 0 ที่ไม่มีไซต์การผูก KLF6 ภายใน ± 10 kb จาก TSS (B) การจำแนกประเภทและการวิเคราะห์การเพิ่มสมรรถนะของวิถีของยีนที่ควบคุมในหนูเมาส์ Klf6fl/fl หลัง AAI แต่มีการควบคุมที่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (เช่น เก็บรักษาไว้) ในหนู Klf6PTKD หลัง AAI ตามคลาสไซต์ที่มีผลผูกพัน: คลาส 2 ที่มีค่ามากกว่าหรือเท่ากับ 1 ไซต์การจับ KLF6 ภายใน ±1 kb ของ TSS; คลาส 1 ที่มีไซต์การผูกมัดมากกว่าหรือเท่ากับ 1 KLF6 ที่ ±1 ถึง 10 kb จาก TSS และคลาส 0 ที่ไม่มีไซต์การโยง KLF6 ภายใน ±10 kb จาก TSS (C) แผนภาพการวิเคราะห์การเสริมสมรรถนะชุดยีนโดยใช้ยีนที่แสดงออกเชิงอนุพันธ์ทั้งหมด สำหรับการเสื่อมสลายของกรดไขมัน KEGG (FA DEGRAD), เมแทบอลิซึมของกรดอะมิโน (AA METAB) และวัฏจักร TCA (KEGG_TCA)

ตรวจสอบว่าการปราบปรามในการแสดงออกของยีน BCAA ต่อหน้า AAI ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในแคแทบอลิซึมของ BCAA หรือไม่ เราวัดความเข้มข้นของ BCAA ภายในเซลล์ หลังการรักษาด้วย AAI เซลล์ KLF6- Con cells แสดง BCAA ที่ลดลง ซึ่งสอดคล้องกับ catabolism ที่เพิ่มขึ้นของ BCAA ซึ่งอาจเป็นการชดเชยสำหรับการสูญเสีย FA oxidation (รูปที่ 5B) อย่างไรก็ตาม ผลกระทบนี้หายไปในเซลล์ KLF6-OE ซึ่งไม่มีการลดลงของ BCAA ภายในเซลล์หลังการรักษาด้วย AAI ซึ่งสอดคล้องกับความสามารถในการ catabolize BCAA (รูปที่ 5B) ที่ลดลง และสิ่งนี้สัมพันธ์กับการผลิต ATP ของไมโตคอนเดรียที่ลดลง เปรียบเทียบกับเซลล์ควบคุม KLF6-Con ที่บำบัดด้วย AAI (รูปที่ 5C)

สื่อมาตรฐานที่ใช้ในการวัดการผลิต ATP ประกอบด้วยกลูโคสที่มีความเข้มข้นสูง (กลูโคส 10 มิลลิโมลาร์, กลูตามีน 1 มิลลิโมลาร์, และไพรูเวต 2 มิลลิโมลาร์) และเพื่อตรวจสอบว่า KLF6 ที่มีการแสดงออกเพียงอย่างเดียวสามารถเปลี่ยนแปลงการใช้แหล่งพลังงานต่างๆ ได้หรือไม่ เราจึงทำการทดสอบแทน อัตราการใช้ออกซิเจน (OCR) ในตัวกลางที่จำกัดพลังงาน (ตัวกลางที่ปราศจากซีรัมที่มีกลูโคส 1 มิลลิโมลาร์ ไม่มีกลูตามีน และไม่มีไพรูเวต) KLF6-เซลล์ OE มี mito chondrial OCR ที่ลดลง (กำหนดเป็น OCR เริ่มต้นลบ OCR ที่ไม่ใช่ nonmitochondrial ที่กำหนดหลังจากให้ rotenone/antimycin A) แต่มีการชดเชยที่คล้ายกันหลังจากการปิดกั้น glycolysis ด้วย 2-deoxyglucose (2- DG) และ FAO ที่คล้ายกัน (การลด OCR หลังจากการปิดกั้น FAO ด้วย etomoxir) (รูปที่ 5 D และ E) เนื่องจากการตอบสนองของไมโต chondrial ต่อการสูญเสียไกลโคไลซิสและ OCR ที่เกิดจากการออกซิเดชันของ FA ไม่ได้เปลี่ยนแปลงในเซลล์ KLF6- OE สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าการทำงานของไมโตคอนเดรียโดยรวมไม่ได้รับผลกระทบ แต่อาจไม่สามารถใช้ BCAA เป็นแหล่ง พิจารณาการลดลงของค่า OCR ของไมโตคอนเดรียในสภาวะที่จำกัดพลังงานเหล่านี้ เพื่อตรวจสอบว่าการสูญเสียของแคแทบอลิซึมของ BCAA จะส่งผลให้การผลิต ATP ของไมโตคอนเดรียลดลงหรือไม่ เราจึงสร้างเซลล์ HK-2 ที่มีการล้มลงของ BCKDHB (ภาคผนวก SI, รูปที่ S7) BCKDHA และ BCKDHB เข้ารหัสหน่วยย่อยสองหน่วยของคีโตกรดดีไฮโดรจีเนสที่มีสายโซ่ย่อยขนาดใหญ่ (BCKDH) ซึ่งเป็นสารเชิงซ้อนที่มีโปรตีนขนาดใหญ่ ซึ่งกระตุ้นขั้นตอนแรกที่ไม่สามารถย้อนกลับได้และจำกัดอัตราใน BCAA catabolism และถูกยับยั้งโดย phosphorylation โดย BCKDH kinase (BCKDK) (28) เพื่อเปลี่ยนการควบคุม BCKDHB-SCR และเซลล์ BCKDHB-sh ที่ล้มลงไปสู่การผลิต ATP ของไมโตคอนเดรีย พวกมันถูกบ่มล่วงหน้าใน 2-DG เพื่อสกัดกั้นไกลโคไลซิสเป็นเวลา 1 ชั่วโมงก่อนทำการสอบวิเคราะห์อัตราการผลิต ATP การล้มลงของ BCKDHB ส่งผลให้การผลิต ATP ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ แสดงให้เห็นว่ามีการใช้ BCAA เพื่อสร้าง ATP ในมนุษย์ไตเซลล์ (รูปที่ 5F) ในทางกลับกัน ถึง

รูปที่ 4. หนู hKLF6OE มีอาการรุนแรงขึ้นไตบาดเจ็บด้วยการยับยั้งยีน BCAA (A และ B) ความเข้มข้นของครีเอตินีนในซีรัม (A) และยูเรียไนโตรเจน (B) ในกลุ่มควบคุมและหนูเมาส์ hKLF6OE ที่บำบัดด้วย DMSO หรือ AAI ในระยะแอคทีฟ n=4 ถึง 9 ต่อกลุ่ม; $P < 0.05,="" $$p="">< 001,="" $$$p="">< 0.0{="" {26}}1="" เทียบกับจีโนไทป์เดียวกันกับ="" dmso;="" **p="">< 0.01="" เทียบกับกลุ่มควบคุมด้วย="" aai;="" anova="" ทางเดียวพร้อมการแก้ไข="" sidak="" สำหรับการทดสอบหลายครั้ง="" (c="" และ="" d)="" ภาพทางจุลกายวิภาคที่เป็นตัวแทนของการย้อมโดยใช้คราบ="" hematoxylin="" และ="" eosin="" (c)="" และคราบกรด="" schiff="" (d)="" เป็นระยะ="" ลูกศรสีเหลือง:="" ท่อไหล;="" ลูกศรสีดำ:="" เยื่อหุ้มชั้นใต้ดินที่เหลืออยู่;="" หัวลูกศรสีเหลือง:="" โปรตีนหล่อ;="" และหัวลูกศรสีดำ:="" การอักเสบแทรกซึม="" (แท่งชั่ง="" 100="" μm.)="" (e)="" การย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์สำหรับ="" cytokeratin-20="" (krt-20)="" เป็นเครื่องหมายของ="" pt="" ที่ได้รับบาดเจ็บ="" (สีแดง)="" โดยมี="" lotus="" lectin="" (ll)="" )="" เป็นเครื่องหมายของ="" pt="" ที่ไม่ได้รับบาดเจ็บ="" (สีเขียว)="" (แท่งชั่ง,="" 250="" μm.)="" (f)="" การย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์สำหรับ="" -sma="" (สีเขียว)="" พร้อมการย้อมสีสำหรับ="" edu="" (สีม่วงแดง)="" (แท่งมาตราส่วน="" 100="" ไมโครเมตร)="" (g)="" การแสดงออกของ="" mrna="" ของ="" mrna="" ของยีน="" bcaa="" ในกลุ่มควบคุมและหนูเมาส์="" hklf6oe="" ที่บำบัดด้วย="" dmso="" หรือ="" aai="" ในระยะแอคทีฟ="" n="5" ถึง="" 9="" ต่อกลุ่ม;="" $p="">< 0.01,="" $$p="">< 0.001="" เทียบกับการควบคุมด้วย="" dmso;="" hklf6oe="" ทั้งหมดที่มี="" aai="" คือ="" p="">< 0.001="" เทียบกับ="" hklf6oe="" ที่มี="" dmso="" *p="">< 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001="" เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมที่มีการรักษาแบบเดียวกัน="" การทดสอบ="" t="" หลายครั้งด้วยการแก้ไขอัตราการค้นพบที่ผิดพลาดโดยใช้โมเดลแบบขั้นบันไดสองขั้นตอนของ="" benjamini,="" kreiger="" และ="" yekutieli="" ข้อมูลมีค่าเฉลี่ย="" ±="" sem="" โดยมี="" n="">

เพิ่มแคแทบอลิซึมของ BCAA เรารักษาเซลล์ HK-2 ด้วย BT2 ซึ่งยับยั้ง BCKDK ซึ่งขัดขวางการยับยั้งฟอสโฟรีเลชันของ BCKDH ภายใต้สภาวะที่จำกัดพลังงาน การรักษาด้วย BT2 เพิ่ม OCR ในเซลล์ที่บำบัดด้วย DMSO ซึ่งคงอยู่หลังจากการยับยั้งไกลโคไลซิสและไม่ได้เกิดจากการเปลี่ยนแปลงของ FAO หรือ OCR ที่ไม่ใช่ไมโตคอนเดรีย (รูปที่ 5 G และ H) การค้นพบนี้บ่งชี้ว่าการปราบปรามของ BCAA ที่เป็นสื่อกลางของ KLF6- ช่วยลดการผลิต ATP ของไมโตคอนเดรีย ซึ่งอาจทำให้อาการบาดเจ็บของ PT รุนแรงขึ้นในการตั้งค่าของความเครียดของเซลล์ ซึ่งมีสภาวะจำกัดพลังงานในทำนองเดียวกันเนื่องจาก FAO ถูกทำลาย

การแสดงออกของยีน BCAA ลดลงในหนูและมนุษย์ที่หลากหลายอาการบาดเจ็บที่ไต. เพื่อตรวจสอบว่าการสูญเสียการแสดงออกของยีน BCAA เกิดขึ้นก่อนการสูญเสีย PT และเพิ่มระดับครีเอตินีนในการบาดเจ็บที่เกิดจาก AAI หรือไม่ เราใช้ qRT-PCR ในหนูทดลอง C57BL/6 ที่ได้รับ AAI ครั้งเดียวและทำการุณยฆาตหลังจาก 24 ชั่วโมง Bckdhb, Hibch และ Mccc2 ได้รับการควบคุมดาวน์อย่างมีนัยสำคัญแล้ว ณ จุดเวลานี้ โดยยีนอื่นๆ (เช่น Acadm) แสดงแนวโน้มที่แข็งแกร่งต่อการควบคุมระดับล่าง (รูปที่ 6A) เพื่อศึกษาการแสดงออกของยีน BCAA ในหนูตัวอื่นไตบาดเจ็บแบบจำลอง เราใช้ qRT-PCR ในหนูเมาส์ที่บำบัดด้วยซิสพลาติน (รูปที่ 6B) หรืออยู่ภายใต้ UUO (รูปที่ 6C) ในทั้งสองรุ่น การแสดงออกของ Klf6 ได้รับการควบคุมอย่างเข้มงวดเมื่อเทียบกับยานพาหนะ/การควบคุม ในหนูที่ได้รับการรักษาด้วยซิสพลาติน ยีน BCAA หลายตัวที่ทดสอบได้รับการควบคุมที่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ โดยมีแนวโน้มไปสู่การควบคุมยีนอื่นๆ ที่ลดลง (รูปที่ 6B) ในหนูทดลองที่อยู่ภายใต้ UUO ยีนทั้งหมดที่ทดสอบได้รับการควบคุมอย่างมีนัยสำคัญที่ทั้ง 3 และ 7 วันหลัง UUO (รูปที่ 6C) ซึ่งบ่งชี้ว่าการควบคุมยีน BCAA ที่ลดลงเกิดขึ้นก่อนหลังได้รับบาดเจ็บ

รูปที่ 5 การแสดงออกมากเกินไปของ KLF6 ยับยั้งการแสดงออกของยีน BCAA การผลิต ATP และการใช้ BCAA ในหลอดทดลอง (A) การแสดงออกของยีนเมแทบอลิซึมของ KLF6 และ BCAA ในเซลล์ HK-2 ซึ่งแสดงออกการควบคุม (Con) หรือพลาสมิดที่แสดงออกมากเกินไปของ KLF6 อย่างคงตัว บำบัดด้วย DMSO หรือ AAI n=4 ต่อกลุ่ม; *P < 0.05,="" **p="">< {{10}}.01,="" ***p="">< 0.{="" {21}}01="" เทียบกับ="" con="" aai;="" $p="">< 0.{{3{{40}}}}}5,="" $$p="">< 0.01,="" $$$p="">< 0.001="" เทียบกับบรรทัดเซลล์เดียวกันกับ="" ดีเอ็มเอสโอ;="" การวิเคราะห์ความแปรปรวนสองทางพร้อมการแก้ไขของ="" tukey="" สำหรับการทดสอบหลายครั้ง="" (b)="" การหาปริมาณ="" bcaa="" ทั้งหมดในเซลล์="" con="" และ="" oe="" ที่บำบัดด้วย="" dmso="" หรือ="" aai="" n="6" ต่อกลุ่ม;="" $p="">< 0.05="" เทียบกับ="" con="" dmso;="" anova="" ทางเดียวพร้อมการแก้ไขของ="" sidak="" สำหรับการทดสอบหลายครั้ง="" (c)="" เปอร์เซ็นต์การเปลี่ยนแปลงของอัตราการผลิต="" atp="" ของไมโตคอนเดรียในเซลล์="" con="" และ="" oe="" ที่บำบัดด้วย="" aai="" เทียบกับ="" dmso="" n="27" ถึง="" 30="" ต่อกลุ่ม;="" *p="">< 0.05,="" ***p="">< 0.001="" เทียบกับ="" dmso,="" $p="">< 0.05="" เทียบกับ="" con="" aai;="" anova="" ทางเดียวพร้อมการแก้ไขของ="" sidak="" สำหรับการทดสอบหลายครั้ง="" (d)="" การวัด="" ocr="" สำหรับเซลล์="" con="" และ="" oe="" ในสื่อที่ถูกจำกัด="" โดยที่บ่งชี้,="" 2-dg,="" อีโตม็อกเซอร์="" (eto)="" และการรวมกันของโรทีโนน/แอนติมัยซิน="" a="" (เน่า)="" ถูกเติม="" n="16" ต่อกลุ่ม="" (e)="" การหาปริมาณของ="" basal="" mitochondrial="" ocr="" (เริ่ม="" ocr="" ลบ="" post-rot="" ocr),="" nonmitochondrial="" ocr="" (หลังการเน่า)="" และการเปลี่ยนแปลงใน="" ocr="" หลังจากเพิ่ม="" 2-dg="" (การชดเชย="" mitochondrial="" หลังจาก="" 2-dg)="" และอีโตม็อกเซอร์="" (fao)="" n="16" ต่อกลุ่ม;="" **p="">< 0.01="" เทียบกับ="" con;="" การวิเคราะห์ความแปรปรวนสองทางพร้อมการแก้ไขของ="" tukey="" สำหรับการทดสอบหลายครั้ง="" (f)="" อัตราการผลิต="" atp="" ของไมโตคอนเดรียในเซลล์="" bckdhb-scr="" และ="" bckdhb-sh="" n="14" ต่อกลุ่ม;="" **p="">< 0.05,="" การทดสอบแบบ="" unpaired="" t="" (g)="" การวัด="" ocr="" ในเซลล์="" hk-2="" ในตัวกลางที่ถูกจำกัดในกรณีที่ไม่มีอยู่หรือมี="" bt2="" โดยที่ระบุ="" เพิ่ม="" 2-dg,="" eto="" และ="" rot="" (h)="" การหาปริมาณของ="" basal="" mitochondrial="" ocr,="" nonmitochondrial="" ocr="" และการเปลี่ยนแปลงใน="" ocr="" หลังจากเพิ่ม="" 2-dg="" และ="" etomoxir="" ใน="" hk-2="" เซลล์ในกรณีที่ไม่มีหรือมี="" bt2="" n="8" ต่อกลุ่ม;="" *p="">< 0.05="" เทียบกับไม่มี="" bt2;="" การวิเคราะห์ความแปรปรวนสองทางพร้อมการแก้ไขของ="" tukey="" สำหรับการทดสอบหลายครั้ง="" ข้อมูลมีค่าเฉลี่ย="" ±="" sem="" โดยมี="" n="">

ในทำนองเดียวกัน การทำเหมืองข้อมูลอาร์เรย์นิพจน์ที่รายงานก่อนหน้านี้จากช่องระหว่างเนื้อเยื่อท่อไตของผู้ป่วยโรคไตวายเรื้อรังในมนุษย์ 36 คน (ความดันโลหิตสูงและเบาหวานโรคไต) เมื่อเปรียบเทียบกับผู้ป่วยกลุ่มควบคุม (6) พบว่ายีน BCAA หลายตัวถูกควบคุมในลักษณะที่คล้ายคลึงกับหนูที่ได้รับการรักษาด้วย AAI (รูปที่ 6D) เพื่อชี้แจงความสัมพันธ์ระหว่างการทำงานของไต, การแสดงออกของ KLF6 และการแสดงออกของยีน BCAA ใน CKD ของมนุษย์ เราใช้อาร์เรย์นิพจน์ที่ตีพิมพ์จากช่อง lointerstitial ของ tubu ของผู้ป่วย 164 คนที่มีหลากหลายโรคไต (29). Ranking of patients by eGFR showed a significant inverse correlation between eGFR and KLF6 expression and a significant positive correlation between eGFR and each BCAA gene expression, with significant inverse correlations also between KLF6 and each BCAA gene expression (Fig. 6E). Indeed, even individuals with only moderate decreases in eGFR (∼45 to 60 mL/min/1.73m2) had significantly increased expression of KLF6 and decreased BCAA gene expression compared to individuals with normal eGFR (>90 มล./นาที/1.73 ม. 2) (P < 0.001="" สำหรับยีนทั้งหมด)="" แสดงให้เห็นว่าการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ในการแสดงออกของยีนอาจเกิดขึ้นตั้งแต่เนิ่นๆ="" ซึ่งสัมพันธ์กับการเปลี่ยนแปลงการทำงาน="" โดยรวมแล้ว="" ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า="" klf6-การยับยั้งยีนที่สำคัญต่อแคแทบอลิซึมของ="" bcaa="">ไตบาดเจ็บในหุ่นจำลองของไตพังผืดเช่นเดียวกับใน CKD ของมนุษย์

การอภิปราย

ในการศึกษานี้ เราแสดงให้เห็นถึงบทบาทในร่างกายของ KLF6 เฉพาะ PT ในการตั้งค่าของอาการบาดเจ็บที่ไตKLF6 ได้รับการควบคุมอย่างเข้มงวดและสม่ำเสมอในช่วงต้นของ PT เพื่อตอบสนองต่อไตบาดเจ็บแต่นี่เป็นการตอบสนองที่ไม่เหมาะสม ดังที่แสดงโดยผลการป้องกันของการสูญเสีย PT Klf6 หลังการรักษาด้วย AAI ของสารพิษที่มีความเกี่ยวข้องทางคลินิกและมีความเฉพาะเจาะจงสูงสำหรับ PT นอกจากนี้ เราแสดงให้เห็นถึงความสำคัญที่อาจเกิดขึ้นของการเผาผลาญ BCAA ที่ผิดปกติใน PT ที่ได้รับบาดเจ็บซึ่งเป็นสาเหตุที่เป็นไปได้ของ AKI และการเกิดพังผืดที่ตามมา การสูญเสีย Klf6 นำไปสู่การรักษาการแสดงออกของเอนไซม์ BCAA catabolic โดยมียีนหลายตัวที่เข้ารหัสเอ็นไซม์เหล่านี้ซึ่งมีจุดจับกับ KLF6 ในบริเวณใกล้เคียงกับ TSS ของพวกมัน ซึ่งบ่งชี้ว่า KLF6 อาจเป็นตัวยับยั้งการถอดรหัสของ BCAAcatabolism แม้ว่าสมาชิกอื่นของตระกูล KLF คือ KLF15 จะได้รับการแสดงก่อนหน้านี้เพื่อควบคุมการแสดงออกของอะมิโนทรานสเฟอเรส 2 (Bcat2) ของกล้ามเนื้อโครงร่าง (30) การควบคุมของเอ็นไซม์ BCAA อื่น ๆ ไม่ได้รายงาน เราสันนิษฐานว่า KLF6 ทำหน้าที่ระงับการแสดงออกของยีนหลายตัวที่เข้ารหัสเอนไซม์ BCAA

ใน PT ที่ไม่ได้รับบาดเจ็บ การแสดงออกของ Klf6 ต่ำและแสดงออกอย่างแปรผันในเซลล์ PT บางเซลล์ ไม่ใช่เซลล์อื่นๆ กฎระเบียบที่เพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วและแข็งแกร่งซึ่งเกิดขึ้นหลังจากการบาดเจ็บหลายประเภทแสดงให้เห็นบทบาทที่สำคัญทางสรีรวิทยาสำหรับ KLF6 ในไฟโบรบลาสต์ เมื่อเร็ว ๆ นี้ KLF6 แสดงให้เห็นว่ามีการควบคุมขึ้นเพื่อตอบสนองต่อความเครียดที่ก่อให้เกิดมะเร็งและออกซิเดชัน ซึ่งนำไปสู่ความชราภาพของเซลล์ ในขณะที่การปิดเสียงของ KLF6 ทำให้เกิดการสะสมของเครื่องหมายของความเสียหายของดีเอ็นเอและความไม่แน่นอนของจีโนม (31) ดังนั้น บทบาททางสรีรวิทยาของ KLF6 ในการบาดเจ็บอาจเป็นการชักนำให้เกิดการเสื่อมสภาพของเซลล์ ซึ่งยอมให้มีการซ่อมแซมความเสียหายของดีเอ็นเอที่อาจเป็นผลมาจากการดูหมิ่นที่เป็นพิษหรือออกซิเดชัน/ขาดเลือด อย่างไรก็ตาม ในเซลล์ PT ที่ได้รับบาดเจ็บ ผลที่สองของการควบคุม Klf6 ดูเหมือนจะเป็นการปราบปรามของแคแทบอลิซึมของ BCAA ซึ่งในเซลล์ PT โดยเฉพาะอย่างยิ่งมีแนวโน้มที่จะเป็นอันตราย ที่น่าสนใจ แม้ว่า Klf6 จำเพาะ PT บางส่วนล้มลงที่การตรวจวัดพื้นฐานในหนู Klf6PTKD แต่ก็ยังสามารถให้ผลการป้องกันที่ชัดเจนหลังจากได้รับบาดเจ็บ สิ่งนี้มีนัยสำคัญในการรักษา เนื่องจากมันแสดงให้เห็นว่าการจัดการเพียงเล็กน้อยในระดับ KLF6 หรือกิจกรรม (เช่น ผ่านการใช้ตัวยับยั้งโมเลกุลขนาดเล็ก) เท่านั้นที่สามารถแสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพในการรักษา แท้จริงแล้วปัจจัยการถอดรหัสมีแนวโน้มมากกว่ายีนตระกูลอื่น

ในจีโนมมนุษย์จะมีความไวต่อปริมาณยา (32) ในทำนองเดียวกัน ข้อจำกัดอย่างหนึ่งของแบบจำลองหนูที่มีการแสดงออกของหนูที่มีการแสดงออกมากเกินไปของ KLF6 คือการที่มันไม่ได้ถูกจำกัดเซลล์ PT และด้วยเหตุนี้ การศึกษาในอนาคตจะต้องมุ่งเน้นไปที่การใช้แบบจำลองที่เหนี่ยวนำเฉพาะเซลล์เพื่ออธิบายบทบาทที่ขึ้นกับบริบทของเซลล์ของ KLF6

ก่อนหน้านี้เราได้แสดงให้เห็นว่าการสูญเสีย Klf6 ใน glomerular podocytes นั้นเป็นอันตรายในการตั้งค่าของ FSGS เนื่องจากมีบทบาทในการกระตุ้นการถอดรหัสของการสังเคราะห์ cytochrome c oxidase 2 (Sco2) การสูญเสีย Klf6 ใน FSGS ทำให้เกิดพังผืดที่แย่ลง โดยมีการกระตุ้นทางเดิน apoptotic ที่แท้จริง (15) การสอบปากคำของชุดข้อมูล RNA-seq เซลล์เดียวที่มีอยู่แสดงให้เห็นว่าในหนูที่มีสุขภาพดีไตKlf6 แสดงออกในสัดส่วนของ podo cytes มากกว่าเซลล์ PT และในระดับที่สูงกว่ามาก (อ้างอิง 33; https:// susztaklab.com/) ดังนั้น KLF6 จึงน่าจะมีบทบาททางสรีรวิทยาที่สำคัญกว่าในพอดไซต์ปกติมากกว่าเซลล์ PT ในขณะที่สารควบคุมหลักไมโตคอนเดรียอื่นๆ ที่เป็นที่รู้จัก (เช่น Ppara) จะแสดงออกมาในเซลล์ PT มากกว่าในเซลล์โพโดไซต์ ดังนั้นการสูญเสีย Klf6 ใน podocytes จึงน่าจะมีผลเสียมากกว่าในเซลล์ PT บทบาทที่ตัดกันของ KLF6 ในเซลล์ประเภทต่างๆ ภายในไตสอดคล้องกับการค้นพบก่อนหน้านี้เกี่ยวกับผลกระทบเฉพาะเซลล์ในหัวใจและตับ ดังนั้น การล้มลงของ Klf6 ใน myocytes หัวใจในหนูทดลองลดทอนการเกิดพังผืดของหัวใจหลังจากโหลด angiotensin II มากเกินไป ซึ่งบ่งชี้ถึงบทบาทของ KLF6 ในการแพร่กระจายของพังผืด แต่การล้มลงของ Klf6 ใน myofibroblasts ของหัวใจไม่มีผลต่อการเกิดพังผืด (14) ในทางกลับกัน ในตับ การล้มลงของ Klf6 ในเซลล์ตับของหนูเมาส์ไม่มีผลต่อการเกิดพังผืดในตับหลังการบริหารให้ CCl4 แบบเรื้อรัง แต่การแสดงออกของ KLF6 ที่มากเกินไปในเซลล์ตับทำให้เกิดพังผืดที่ลดลง ซึ่งบ่งชี้ว่า KLF6 สามารถป้องกันได้ (13)

CISTANCHE จะช่วยเพิ่มอาการปวดไต/ไต

การสูญเสีย FAO ในช่วงไตบาดเจ็บเป็นที่ทราบกันดีอยู่แล้วว่าเป็นเหตุการณ์สำคัญทางพยาธิวิทยาของไตบาดเจ็บและสามารถทำให้เกิดพังผืดได้โดยตรง ในกรณีที่ไม่มี FAO ซึ่งเป็นแหล่งพลังงานหลักสำหรับ PT ที่ไม่ได้รับบาดเจ็บ แหล่งพลังงานอื่นๆ อาจมีความสำคัญมากกว่า BCAAs มีส่วนทำให้เกิดวัฏจักร TCA ผ่านการผลิต acetyl-CoA และ succinyl-CoA การศึกษาเมื่อเร็ว ๆ นี้แสดงให้เห็นว่า BCAA ที่ติดฉลาก 13C ไม่เพียงแต่มีส่วนทำให้ตัวกลางของวงจร TCA ในไตแต่ไตมีการรวมตัวสูงสุดเป็นอันดับสี่ของ 13C ในตัวกลางวงจร TCA ของอวัยวะที่ทดสอบ หลังจากตับอ่อน กล้ามเนื้อ และเนื้อเยื่อไขมันสีขาว (34) ซึ่งบ่งชี้ว่า BCAA อาจเป็นปัจจัยสำคัญต่อวงจร TCA อย่างไรก็ตาม ความสำคัญของ BCAA catabolism ที่เอื้อต่อวงจร TCA ทั้งแบบปกติและแบบบาดเจ็บไต, ไม่เคยมีการสำรวจมาก่อน ตัวอย่างเช่น ไม่ทราบว่าการสูญเสียแคแทบอลิซึมของ PT BCAA เพียงอย่างเดียวจะทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในสภาวะสมดุลของ PT และ/หรือการซ่อมแซมหรือไม่ และการศึกษาเหล่านี้จะต้องมีการสร้างโมเดลเมาส์แบบใหม่ เช่น หนูล้มลง Bckdhb เฉพาะสำหรับ PT ในการตั้งค่าของไตการบาดเจ็บ เมื่อ FAO ถูกปราบปรามอย่างรุนแรง การปราบปรามเพิ่มเติมของ

ยีนที่เข้ารหัสเอนไซม์เมตาบอลิซึมของ BCAA อาจกีดกันเซลล์ท่อจากแหล่งพลังงานทางเลือกที่สำคัญ สิ่งสำคัญคือต้องสังเกตว่าการแสดงออกของยีน BCAA ถูกลดการควบคุมลงแล้ว 24 ชั่วโมงหลังจากการฉีดเพียงครั้งเดียว ก่อนการเปลี่ยนแปลงใดๆ ของระดับครีเอตินินในซีรัมหรือการสูญเสีย PT ซึ่งบ่งชี้ว่าการปรับลดเหล่านี้เป็นผลเฉพาะของการบาดเจ็บของ PT และไม่เชื่อมโยงกับความต้องการพลังงาน PT ที่ลดลง จาก GFR ที่ลดลงและความต้องการที่ลดลงสำหรับการดูดซึมตัวถูกละลาย วิถีทางเหล่านี้ถูกรักษาไว้ในหนูเมาส์ Klf6PTKD ซึ่งได้รับการปกป้องจากการบาดเจ็บและยับยั้งเพิ่มเติมในหนูเมาส์ hKLF6OE ซึ่งมีอาการบาดเจ็บที่เลวร้ายกว่า นอกจากนี้ เซลล์ KLF6-OE มีการผลิต ATP ของไมโตคอนเดรียลดลงหลังการรักษาด้วย AAI เมื่อเทียบกับเซลล์ KLF6-Con และในขณะที่ BCAA ภายในเซลล์ลดลงในเซลล์ KLF6-Con สอดคล้องกับแคแทบอลิซึมของพวกมัน ไม่พบการลดลงนี้ในเซลล์ KLF6-OE นอกจากนี้ การล้มลงของ BCKDHB ในเซลล์ HK-2 ยังส่งผลให้การผลิต ATP ของไมโตคอนเดรียลดลง ดังนั้น การแสดงออกที่คงไว้ของยีน BCAA ในหนูเมาส์ Klf6PTKD อาจให้การป้องกันการบาดเจ็บโดยการจัดหาตัวกลางของวงจร TCA ที่สำคัญในการตั้งค่าของการเกิดออกซิเดชันของ FA ที่ลดลงอย่างรุนแรง การศึกษาในอนาคตโดยใช้หนูที่มีการปรับเปลี่ยนทางพันธุกรรมของแคแทบอลิซึมของ BCAA และ/หรือการรักษาด้วย BT2 จะช่วยให้เราสามารถตรวจสอบไดนามิกระหว่าง BCAA catabolism กับ FAO ในไตบาดเจ็บ.

เราได้แสดงให้เห็นว่าการสูญเสียการแสดงออกของยีน BCAA ทำให้การหายใจของไมโตคอนเดรียและการผลิต ATP ลดลง และนี่เป็นกลไกหนึ่งที่การสูญเสียแคแทบอลิซึมของ BCAA อาจนำไปสู่ไตบาดเจ็บ. กลไกทางเลือกอาจเกิดจากการสะสมของ BCAA ซึ่งอาจมีผลเป็นพิษ อันที่จริงสิ่งนี้แสดงให้เห็นในการตั้งค่าของ IRI หัวใจ การสะสมของ BCAA เนื่องจากการสูญเสียแคแทบอลิซึมถูกแสดงเพื่อยับยั้งการใช้ไมโตคอนเดรีย ไพรูเวตโดยการยับยั้งไพรูเวต ดีไฮโดรจีเนสภายหลังการแปล ดังนั้นการขจัดแหล่งพลังงานของเซลล์เพิ่มเติมและทำให้อาการบาดเจ็บรุนแรงขึ้น (35) สิ่งนี้ถูกย้อนกลับโดยการเพิ่มแคแทบอลิซึมของ BCAA โดยการรักษาหนูด้วย BT2 หรือโดยการเพิ่มการเผาผลาญกลูโคสโดยการแสดงออกของ GLUT1 มากเกินไป ผลการศึกษาล่าสุดยังแสดงให้เห็นอาการกำเริบของ IRI ของหัวใจโดยการสูญเสียแคแทบอลิซึม BCAA ในหนูที่เป็นเบาหวาน สิ่งนี้มาพร้อมกับความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันที่เพิ่มขึ้นและถูกย้อนกลับอีกครั้งโดยการเปิดใช้งานแคแทบอลิซึมของ BCAA (36) BCAA และโดยเฉพาะอย่างยิ่งลิวซีนเป็นที่รู้จักกันเพื่อกระตุ้นเป้าหมายของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมของการส่งสัญญาณของราพามัยซิน (mTOR) เชิงซ้อน 1 (mTORC1) ในรูปแบบเมาส์ของ polycysticโรคไต,โดยที่เซลล์รอบๆ ซีสต์มีการกระตุ้น mTOR

การส่งสัญญาณ การเสริมด้วย BCAA กระตุ้นการส่งสัญญาณ mTORC1 เพิ่มเติม ซึ่งนำไปสู่การเพิ่มจำนวนที่เพิ่มขึ้น (37) โปรไฟล์ Transcriptional ของมะเร็งตับเผยให้เห็นการแสดงออกของยีน BCAA ที่ลดลง ซึ่งนำไปสู่การสะสมของ BCAA ในเนื้อเยื่อเนื้องอก สิ่งนี้เกี่ยวข้องกับการส่งสัญญาณและการเพิ่มจำนวน mTORC1 ที่เพิ่มขึ้น ซึ่งลดลงโดยการจำกัด BCAA หรือการบำบัดด้วย BT2 และทำให้รุนแรงขึ้นในหนูที่ได้รับอาหาร BCAA สูง (38) จำเป็นต้องมีการส่งสัญญาณ mTORC1 สำหรับฟังก์ชัน PT และการศึกษาโดยใช้สารยับยั้ง mTOR ในไตบาดเจ็บได้แสดงผลที่ขัดแย้งกัน ซึ่งน่าจะเกิดจากรูปแบบการให้ยาที่แตกต่างกัน ระยะเวลาในการรักษา และรูปแบบการบาดเจ็บ (39–42) การส่งสัญญาณ mTORC1 นำไปสู่การตอบสนองของเซลล์จำนวนมาก รวมถึงการเติบโตของเซลล์และการเพิ่มจำนวน การสังเคราะห์ไขมัน การสังเคราะห์ไมโตคอนเดรีย และการปราบปรามของ autophagy (43) มีแนวโน้มว่าการเปิดใช้งานการส่งสัญญาณ mTORC1 น้อยเกินไปหรือมากเกินไปอาจเป็นผลเสียและจำเป็นต้องมีความสมดุลเพื่อการทำงานของเซลล์ที่ถูกต้อง ตัวอย่างเช่น การกระตุ้นมากเกินไปของสัญญาณ mTORC1 ในการบาดเจ็บของ PT อาจนำไปสู่การปราบปราม autophagy ที่เป็นอันตราย ซึ่งจำเป็นสำหรับการกำจัดไมโตคอนเดรียที่เสียหาย และได้รับการแสดงว่ามีความสำคัญสำหรับการกู้คืนหลังจาก PTบาดเจ็บ (39, 42, 44, 45) ดังนั้น การสะสมของลิวซีนอาจส่งผลเสียต่อไตบาดเจ็บโดยการเปิดใช้งานการส่งสัญญาณ mTORC1 มากเกินไปและการปราบปรามของ autophagy โดยสรุป เราได้แสดงให้เห็นว่าการขึ้นระเบียบที่แข็งแกร่งของ Klf6 ที่เกิดขึ้นในไตบาดเจ็บเป็นอันตรายซึ่งการสูญเสีย Klf6 เฉพาะ PT ที่รักษาการแสดงออกของยีน BCAA และลดทอน AKI และการเกิดพังผืดในที่สุด ในทางกลับกัน การเหนี่ยวนำของ KLF6 ในหนูทดลองยับยั้งการแสดงออกของยีน BCAA และทำให้เกิดไตอ่อนแอต่ออาการบาดเจ็บที่ไตนอกจากนี้ ยีนที่เข้ารหัสเอ็นไซม์ BCAA หลายตัวมีจุดจับกับ KLF6 ซึ่งบ่งชี้ว่า KLF6 อาจเป็นตัวควบคุมการถอดรหัสของแคแทบอลิซึมของ BCAA การลดการควบคุมของแคแทบอลิซึมของ BCAA ในหลอดทดลอง โดยการแสดงออกของ KLF6 ที่มากเกินไป และการรักษาด้วย AAI หรือโดยการล้มลงของ BCKDHB นำเพื่อลดการผลิต ATP ของไมโตคอนเดรีย เรียกรวมกันว่าข้อมูลแนะนำว่าการรักษาเป้าหมายการรักษาของการสลายตัวของ BCAA อาจให้ mitochondrial ทางเลือกแหล่งพลังงานในการตั้งค่าของไตบาดเจ็บซึ่ง FAOจะลดลง