การรบกวนของฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์จาก Cistanche Tubulosa ด้วยการทดสอบ MTT

1. บทนำ

พืชปรสิตCistanche tubulosa(เชรงค์) อาร์. ไวท์ (Oronchaceaeครอบครัว) แพร่หลายในประเทศแอฟริกาเหนือ อาหรับ และเอเชีย [1] มีต้นกำเนิดมาจากค. ทูบูโลซาและค. เดสสิโคลามีความสำคัญในการแพทย์แผนจีน โดยมีการใช้รักษาอาการอ่อนแอ เป็นหมัน โรคปวดเอว และท้องผูกเนื่องจากลำไส้เฉื่อย [2] นอกจากนี้สารสกัดเอธานอลจากค. ทูบูโลซาได้รับการแสดงให้เห็นว่ามีผลในการป้องกันภาวะขาดออกซิเจนในสมองในหนูอย่างมีนัยสำคัญ [3]

เซลล์บุผนังหลอดเลือดมีบทบาทสำคัญในการเกิดโรคของความดันโลหิตสูงในปอดที่เป็นพิษ เซลล์บุผนังหลอดเลือด EA.hy926 มีความคล้ายคลึงกับเซลล์บุผนังหลอดเลือดปฐมภูมิอย่างมาก ในระหว่างการศึกษาฤทธิ์ต้านภาวะขาดออกซิเจนของสารสกัดเอทานอล C. tubulosa ต่อเซลล์บุผนังหลอดเลือด EA.hy926 เราสังเกตเห็นว่า 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl){{7 }},5-การทดสอบไดฟีนิลเตตระโซเลียม โบรไมด์ (MTT) ซึ่งมักใช้เพื่อประเมินความมีชีวิตของเซลล์ในการศึกษาความเป็นพิษต่อเซลล์และกิจกรรมทางเซลล์ ทำให้เกิดผลลัพธ์ที่ขัดแย้งกันโดยการแสดงความมีชีวิตของเซลล์ EA.hy926 ที่เพิ่มขึ้นหลังการรักษา

การประเมินความมีชีวิตของเซลล์อย่างแม่นยำถือเป็นสิ่งสำคัญในการระบุผลกระทบที่อาจเกิดขึ้นต่อเซลล์หรือฤทธิ์ป้องกันเซลล์ของตัวยา ดังนั้นเราจึงตรวจสอบว่าส่วนประกอบใดที่มีอยู่ในสารสกัดเอทานอลของ C. tubulosa ที่อาจรับผิดชอบต่อผลลัพธ์ที่ขัดแย้งกันที่สังเกตได้จากการทดสอบ MTT เราแยกสองหลักออกฟีนิลธานอยด์ไกลโคไซด์ (PhGs)จากสารสกัดเอธานอล C. tubulosaเอคินาโคไซด์ (ต่อจากนี้ไปเป็นสารประกอบ 1) และแอกทีโอไซด์ (ต่อจากนี้ไปเป็นสารประกอบ 2)- เราพิจารณาผลกระทบที่มีต่อความมีชีวิตของเซลล์ EA.hy926 โดยใช้วิธีการที่หลากหลาย นอกจากนี้ เพื่อชี้แจงเพิ่มเติมว่าองค์ประกอบทดแทนของสารประกอบ 1 และ 2 ใดที่อาจรับผิดชอบต่อผลลัพธ์ที่ขัดแย้งกัน เราได้ทดสอบอะไกลโคน กรดคาเฟอีน (ต่อไปนี้คือสารประกอบ 3) และ 3,4-ไดไฮดรอกซิลฟีนิลเอธานอล (ต่อไปนี้คือสารประกอบ 4) บน EA ความมีชีวิตของเซลล์ .hy926 โดยใช้วิธีการเดียวกัน

ถังเก็บน้ำธรรมชาติ TUBULOSA สำหรับการยับยั้งการตายของเซลล์ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2. ผลลัพธ์และการสนทนา

2.1. การจำแนกสารประกอบ

โครงสร้างของสารประกอบทั้งสองแยกออกจากกันสารสกัดเอทานอล C. tubulosaถูกระบุโดยการวิเคราะห์ด้วยเรโซแนนซ์แม่เหล็กนิวเคลียร์ (NMR) และแมสสเปกโตรเมทรี (MS) ดังแสดงในรูปที่ 1 สารประกอบ 1 ถูกระบุว่าเป็นเอคินาโคไซด์โดยการเปรียบเทียบกับ NMR ที่รายงานก่อนหน้านี้ (ตารางที่ 1) และ MS (m/z 785 [M−H ]− ) ข้อมูล [4] สเปกตรัม NMR ของสารประกอบ 2 มีความคล้ายคลึงอย่างมากกับสเปกตรัมของสารประกอบ 1 ยกเว้นในกรณีที่ไม่มีหมู่ -D-กลูโคไพรานโนซิล (ตารางที่ 1) สารประกอบ 2 (m/z 623 [M−H]− ) ถูกระบุเป็นแอกทีโอไซด์[5]. ที่สำคัญ สารประกอบทั้งสองมีอะไกลโคนเหมือนกัน ซึ่งรวมถึงกรดคาเฟอิก (สารประกอบ 3) และ 3,4-ไดไฮดรอกซิลฟีนิลเอทานอล (สารประกอบ 4)

2.2. การสอบวิเคราะห์ความมีชีวิตของเซลล์

การทดสอบ MTT และ CCK{{0}} ถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์ผลของสารประกอบ 1–4 ต่อการมีชีวิตของเซลล์ EA.hy926 การสอบวิเคราะห์ MTT แสดงให้เห็นว่าความอยู่รอดของเซลล์ EA.hy926 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังการบำบัดด้วยสารประกอบ 25 และ 50 μM 1, 2 หรือ 3 (166.3% และ 174.1% สำหรับสารประกอบ 1, 205.8% และ 224.3% สำหรับสารประกอบ 2 และ 164.8% และ 189.6% สำหรับสารประกอบ 3 ตามลำดับ; p < 0.05) เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ควบคุม (รูปที่ 2A) นอกจากนี้ การตรวจสอบทางสัณฐานวิทยาของเซลล์ระบุว่าการบำบัดด้วยสารประกอบ 1, 2 หรือ 3 50 μM เพิ่มการก่อตัวของผลึกฟอร์มาซานสีม่วง ซึ่งเป็นข้อบ่งชี้โดยตรงของสัดส่วนของเซลล์ที่มีชีวิต (รูปที่ 3) ในทางกลับกัน การสอบวิเคราะห์ CCK-8 แนะนำว่าความมีชีวิตของเซลล์ลดลงอย่างมีนัยสำคัญหลังการบำบัดด้วยสารประกอบ 1, 2 หรือ 3 12.5, 25 และ 50 ไมโครโมลาร์ (75.5%, 45.1% และ 43.7% สำหรับสารประกอบ 1, 85.5% 51.8% และ 34.3% สำหรับสารประกอบ 2 และ 64.5%, 48.2% และ 36.4% สำหรับสารประกอบ 3 ตามลำดับ; p < 0.05) เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ควบคุม (รูปที่ 2B) สารประกอบ 4 ไม่ส่งผลต่อความมีชีวิตของเซลล์ในการสอบวิเคราะห์ MTT หรือ CCK-8 ความแตกต่างระหว่างผลลัพธ์ที่ได้รับจากการตรวจวิเคราะห์ทั้งสองแบบแสดงให้เห็นว่าหนึ่งในการตรวจวิเคราะห์ทั้งสองแบบอาจไม่สะท้อนผลกระทบของสารประกอบ 1 และ 2 ต่อการมีชีวิตของเซลล์ EA.hy926 ได้อย่างแม่นยำ

2.3. การประเมินการตายของเซลล์โดย Hoechst

Staining Hoechst 33342 เป็นคราบ DNA ที่สามารถซึมผ่านเซลล์ได้ ซึ่งตื่นเต้นด้วยแสงอัลตราไวโอเลต และปล่อยแสงเรืองแสงสีน้ำเงินที่ 460 ถึง 490 นาโนเมตร โครมาตินที่ควบแน่นของเซลล์อะพอพโทติกจะมีสีสว่างกว่าโครมาตินของเซลล์ปกติ [6] ในขณะที่เซลล์ควบคุมแสดงโครมาตินที่กระจายตัวสม่ำเสมอ ออร์แกเนลล์ปกติ และเยื่อหุ้มเซลล์ที่สมบูรณ์ เซลล์ที่ถูกบ่มด้วยสารประกอบ 1, 2 หรือ 3 50 ไมโครโมลาร์ เป็นเวลา 48 ชั่วโมงแสดงการติดสีโดยทั่วไปของเซลล์อะพอพโทติก (รูปที่ 4A) ในทางกลับกัน การเปิดรับเซลล์ถึง 50 ไมโครโมลาร์ของสารประกอบ 4 ไม่ได้เพิ่มจำนวนนิวเคลียสอะพอพโทซิสเมื่อเปรียบเทียบกับการบำบัดแบบควบคุม

2.4. การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมตริกของเซลล์อะพอพโทติก

การทดสอบการย้อมสีสองครั้งของ Annexin V-FITC/PI ระบุเซลล์อะพอพโทซิสโดยการจับที่มีความสัมพันธ์สูงของแอนเน็กซิน V-FITC กับฟอสฟาติดิลซีรีน ซึ่งถูกทำให้ภายนอกในเซลล์ที่อยู่ระหว่างการตายของเซลล์ [7] ในการสอบวิเคราะห์นี้ เซลล์ที่มีชีวิตไม่จับกับแอนเน็กซิน V หรือ PI และด้วยเหตุนี้จึงไม่ถูกย้อมสี (ควอแดรนท์ซ้ายล่าง) เซลล์อะพอพโทติกในระยะเริ่มแรกถูกย้อมเป็นสีเขียวโดยการจับของแอนเน็กซิน V-FITC (ควอแดรนท์ขวาล่าง) และเซลล์อะพอพโทติกตอนปลาย มีสีเขียวและสีแดงโดยการจับของ Annexin V-FITC กับฟอสฟาติดิลซีรีนและ PI กับเซลล์เนื้อตายตามลำดับ (ควอแดรนท์ขวาบน) ดังที่แสดงในรูปที่ 4B เซลล์ที่ถูกบ่มด้วยสารประกอบ 50 μM 1, 2 หรือ 3 เป็นเวลา 48 ชั่วโมง เปอร์เซ็นต์ของเซลล์อะพอพโทติกเพิ่มขึ้นจาก 3.74% (เซลล์ควบคุม) เป็น 10.32%, 12.95% และ 11.30% ตามลำดับ เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ควบคุม สารประกอบ 4 ไม่ได้เพิ่มเปอร์เซ็นต์ของเซลล์ EA.hy926 ที่เกิดจากอะพอพโทติก

สอดคล้องกับผลลัพธ์ที่ได้รับจากการสอบวิเคราะห์ CCK-8 และการย้อมสี Hoechst 33342 การสอบวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีแสดงให้เห็นว่าสารประกอบ 1, 2 และ 3 เหนี่ยวนำให้เกิดอะพอพโทซิสในเซลล์ EA.hy926 โดยรวมแล้ว การสังเกตเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการเพิ่มขึ้นของความมีชีวิตของเซลล์ EA.hy926 ที่สังเกตได้จากการทดสอบ MTT หลังการรักษาด้วยสารประกอบ 1–3 แสดงถึงผลลัพธ์ที่เป็นบวกลวง

ถังเก็บน้ำธรรมชาติ TUBULOSA เพื่อเพิ่มภูมิคุ้มกัน PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.5. การอภิปราย

ในปี พ.ศ. 2526 Mosmann ได้พัฒนาชุดตรวจไมโครเพลท MTT แบบวัดสีเพื่อตรวจวัดการเพิ่มจำนวนเซลล์และความเป็นพิษต่อเซลล์ [8] การทดสอบแบบง่ายๆ และการดัดแปลงนี้ ในปัจจุบันมีการใช้อย่างกว้างขวางในห้องปฏิบัติการชีววิทยาของเซลล์ทั่วโลก การศึกษาการแยกส่วนในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมระบุว่า NADH โคแฟกเตอร์ของไพริดีนนิวคลีโอไทด์ที่ลดลง มีหน้าที่ในการลด MTT ส่วนใหญ่ สิ่งนี้ได้รับการสนับสนุนจากการศึกษาโดยใช้ทั้งเซลล์ [9] ดังนั้นการลด MTT จึงสัมพันธ์กับเซลล์ที่ออกฤทธิ์ทางเมตาบอลิซึม และไม่เพียงแต่ควบคู่กับการหายใจแบบไมโตคอนเดรียเท่านั้น แต่ยังรวมถึงไซโตพลาสซึมและเยื่อหุ้มที่ไม่ใช่ไมโตคอนเดรีย รวมถึงช่องเอนโดโซม/ไลโซโซม และพลาสมาเมมเบรน [10] ประจุบวกสุทธิบนโมเลกุล MTT เป็นปัจจัยหลักสำหรับการดูดซึมของเซลล์ผ่านศักย์พลาสมาเมมเบรน

โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การทดสอบ MTT อาจไม่สะท้อนผลที่แท้จริงที่สารประกอบที่ทดสอบมีต่อเซลล์จำเพาะได้อย่างแม่นยำในบางครั้ง อย่างไรก็ตาม โครงสร้างทางเคมีหรือกลุ่มที่อาจก่อให้เกิดผลลัพธ์ที่ขัดแย้งกันในการทดสอบ MTT ยังไม่ได้รับการระบุ การศึกษาล่าสุดได้แสดงให้เห็นว่าการทดสอบ MTT อาจประเมินผลการต้านการเพิ่มจำนวนต่ำไปของ (−)-epigallocatechin-3-gallate ซึ่งเป็นโพลีฟีนอลที่มีมากที่สุดในชาเขียว [11] ในการศึกษาโดยใช้การทดสอบ MTT เพื่อตรวจหาความไวต่อสารเคมีของเนื้องอก สารเคมีบำบัดต้านมะเร็ง เช่น epirubicin, paclitaxel, docetaxel และ imatinib mesylate (Gleevec) แสดงให้เห็นว่าเซลล์มีชีวิตเพิ่มขึ้น [12,13] นอกจากนี้ การศึกษาหลายชิ้นรายงานว่าสารสกัดจากพืชบางชนิดและโพลีฟีนอลที่ออกฤทธิ์รีดอกซ์อาจรบกวนการทดสอบ MTT เนื่องจากสารสกัดเหล่านี้จะลดเกลือเตตราโซเลียม MTT โดยตรงในกรณีที่ไม่มีเซลล์ [14]

ความจำเป็นในการละลายผลึกฟอร์มาซาน MTT ก่อนการวิเคราะห์ด้วยสเปกโตรโฟโตเมตริกในเครื่องอ่านไมโครเพลท และลักษณะจุดสิ้นสุดโดยธรรมชาติของปฏิกิริยาจะจำกัดการใช้การทดสอบ MTT ในการใช้งานบางอย่าง สิ่งนี้นำไปสู่การพัฒนาสารอะนาล็อกเตตราโซเลียม โดยฟีนิลมอยอิตีถูกตกแต่งด้วยหมู่ซัลโฟเนตที่มีประจุลบ เช่น 2,3-บิส-(2-เมทอกซี-4-ไนโตร- 5- ซัลเฟต -5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) ซึ่งเป็นเกลือชั้นในที่มีความเป็นกรดอ่อนซึ่งเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับ MTT [16] . การปรับเปลี่ยนเหล่านี้ส่งผลให้เกิดการผลิตผลิตภัณฑ์ฟอร์มาซานที่ละลายได้ปานกลางในการเพาะเลี้ยง ซึ่งขจัดข้อกำหนดของขั้นตอนการละลายก่อนการหาปริมาณ ในทำนองเดียวกัน เนื่องจากประจุลบที่เพิ่มขึ้นบนโมเลกุลเหล่านี้ลดความสามารถในการเคลื่อนที่ผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ [17] ตัวรับอิเล็กตรอนระดับกลาง (IEA) เช่น 1-เมทอกซี-5-เมทิล ฟีนาซีน เมทิล ซัลเฟต ({{25 }}เมทอกซี PMS) เป็นสิ่งจำเป็นเพื่ออำนวยความสะดวกในการลดสีย้อมเตตราโซล หรือเพื่อเพิ่มอัตราการลดลง

เมื่อเร็วๆ นี้ เกลือเตตราโซเลียมที่ละลายน้ำได้รุ่นใหม่ได้รับการพัฒนา โดยมี WST-1 เป็นต้นแบบ [18] WST-1 ซึ่งเป็นเกลือภายในที่มีไดซัลโฟเนตที่มีประจุลบซึ่งมีกากไอโอดีน มีความเสถียรมากกว่า XTT และ MTS เมื่อมี 1-methoxy PMS ซึ่งเป็นข้อบังคับของ IEA สิ่งนี้นำไปสู่การทำการตลาดของ WST-1/1-methoxy PMS ในฐานะชุดการเพิ่มจำนวนเซลล์รีเอเจนต์เดี่ยวที่สะดวก เกลือเตตราโซเลียมอื่นๆ อีกหลายตัวในซีรีส์ WST ได้รับการพัฒนาขึ้น ซึ่งเกลือที่มีประโยชน์มากที่สุดอาจเป็น WST-8 [19] ดูเหมือนว่า WST-8 จะมีคุณสมบัติการลดระดับเซลล์ที่คล้ายกันอย่างมากกับ WST-1 และกำลังทำการตลาดอย่างเป็นอิสระในฐานะการทดสอบ CCK-8 WST-8 เป็นเซลล์ที่ไม่สามารถซึมผ่านได้ และด้วยเหตุนี้จึงถูกรีดิวซ์ภายนอกเซลล์โดยการขนส่งอิเล็กตรอนจาก NADH ภายในเซลล์ไปยัง WST-8 ข้ามพลาสมาเมมเบรนที่มีสื่อกลางโดย 1-methoxy PMS แม้ว่าทั้ง MTT และ WST-8/{1-การลด PMS ของเมทอกซีจะถูกขับเคลื่อนโดย NADH ในเซลล์ แต่แหล่งที่มาของ NADH ดูเหมือนจะแตกต่างกันในสองวิธีนี้ การลด PMS ของเมทอกซีของ WST-8/1-นั้นขึ้นอยู่กับกระสวยมาเลต/แอสปาร์เตตที่เชื่อมโยงวงจรกรดไตรคาร์บอกซิลิกของไมโตคอนเดรีย-NADH กับช่องว่างนอกไมโตคอนเดรีย [20]

ในการทดลองเบื้องต้น เรายืนยันว่าสารประกอบ 1, 2, 3 และ 4 ไม่สามารถลดเกลือเตตราโซเลียม MTT ได้โดยตรง (ไม่แสดงไว้) ในการศึกษานี้ อิทธิพลโดยตรงของสารประกอบกับรีเอเจนต์ถูกกำจัดออกไปโดยการล้างไมโครเพลทด้วยน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) อย่างระมัดระวัง ก่อนที่จะเติมสารละลาย MTT หรือ CCK-8 ตามที่ระบุไว้ในระเบียบการของผู้ผลิต อย่างไรก็ตามผลลัพธ์ที่ได้โดยใช้ทั้งสองวิธียังคงขัดแย้งกัน (รูปที่ 2) ตามที่คาดไว้ การฟักตัวของเซลล์ด้วยสารประกอบ 1, 2 และ 3 เพิ่มการลดลงของเกลือเตตราโซเลียมให้เป็นฟอร์มาซานสีม่วง เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 3) แสดงให้เห็นว่าเพียงการลดเกลือเตตราโซเลียมเมื่อมีสารประกอบเฉพาะ ไม่เพียงพอที่จะตัดสินความสามารถของสารประกอบในการรบกวนการสอบวิเคราะห์ MTT

เพื่อตรวจสอบว่าสารประกอบ 1, 2, 3 และ 4 สามารถกระตุ้นการตายของเซลล์ในเซลล์ EA.hy926 ได้หรือไม่ มีการประเมินการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาของเซลล์ และการทำให้ภายนอกของฟอสฟาติดิลซีรีนเกิดขึ้น อย่างต่อเนื่องกับการลดลงของความอยู่รอดของเซลล์ที่สังเกตได้จากการทดสอบ CCK-8 ผลลัพธ์ของการย้อมสี Hoechst และการวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีโดยใช้แอนเนกซิน V-FITC/PI เสนอแนะว่าการยับยั้งการเจริญเติบโตที่สังเกตได้หลังการบำบัดสารประกอบ 1, 2 และ 3 เนื่องจากอย่างน้อยในบางส่วนเกิดจากการตายของเซลล์ EA.hy926 ผลลัพธ์ของเรายังสนับสนุนแนวคิดที่ว่าหมู่คาเฟอีนที่มีอยู่ในสารประกอบ 1 และ 2 มีส่วนรับผิดชอบต่อผลลัพธ์ที่ขัดแย้งกันที่ได้รับจากการทดสอบ MTT

เช่นเดียวกับการค้นพบของเรา Rottlerin ซึ่งเป็นเครื่องเปิดช่องโพแทสเซียมสื่อกระแสไฟฟ้าขนาดใหญ่ที่มีศักยภาพ ไม่แสดงปฏิกิริยาต่อ MTT ในหลอดทดลอง อย่างไรก็ตาม มันช่วยเพิ่มการก่อตัวของผลึก formazan ภายในเซลล์อย่างมาก ซึ่งส่งผลให้เกิดความขัดแย้งอย่างเห็นได้ชัดกับการยับยั้ง Rottlerin ของ NF-κB และการเพิ่มจำนวนเซลล์ที่สังเกตได้จากการวิเคราะห์การรวมตัวของ [3 H]-thymidine เข้าไปใน DNA [21] กลไกที่ Rottlerin ปรับปรุงการลด MTT นั้นเป็นผลมาจากการแยกตัวของไมโตคอนเดรีย [22] Rottlerin มีกลุ่มทดแทนกรดซินนาโมอิล เมื่อเปรียบเทียบกับกรดซินนาโมอิล สารประกอบ 3 มีไฮดรอกซิลเรซิดิวเพิ่มเติมอีกสองตัว ซึ่งอยู่ที่ C-3 และ C-4 ดังนั้นเราจึงคาดการณ์ว่ากลไกที่สารประกอบ 1 และ 2 ทำให้เกิดผลลัพธ์ที่ขัดแย้งกันในการทดสอบ MTT อาจเกี่ยวข้องกับผลการแยกตัวของไมโตคอนเดรีย เพื่อทดสอบสมมติฐานนี้ จำเป็นต้องมีการศึกษาเปรียบเทียบระหว่างสารประกอบ 1 และ 2 และตัวแยกสารเคมี เช่น ไตรฟลูออโรคาร์บอนิลไซยาไนด์ ฟีนิลไฮดราโซน (FCCP)

 CISTANCHE TUBULOSA ธรรมชาติสำหรับการปรับปรุงการทำงานทางเพศ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3. ส่วนทดลอง

3.1. รีเอเจนต์และเคมีภัณฑ์

สารประกอบ 3 (กรดคาเฟอีน–ผง ความบริสุทธิ์=98.6%) ถูกซื้อจาก Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (เฉิงตู, จีน) สารประกอบ 4 (3,4-ไดไฮดรอกซิลฟีนิลเอทานอล–น้ำมัน ความบริสุทธิ์=98.5%) ได้มาจาก Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (เฉิงตู จีน) ได้รับ MTT และ dimethyl sulfoxide (DMSO) จาก Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) การสอบวิเคราะห์ CCK-8 ถูกซื้อจากห้องปฏิบัติการโดจิน (คุมาโมโตะ ประเทศญี่ปุ่น) Hoechst 33342 และชุดตรวจจับการตายของเซลล์ Annexin V-FITC/PI ถูกซื้อจากสถาบันเทคโนโลยีชีวภาพ Beyotime (เมืองไห่เหมิน ประเทศจีน)

3.2. วัสดุจากพืช

ค. ทูบูโลซาเก็บลำต้นจากจังหวัดยูเทียน เขตปกครองตนเองซินเจียงอุยกูร์ ประเทศจีน ตัวอย่างบัตรกำนัลถูกฝากไว้ในห้องปฏิบัติการหลักของการแพทย์ระดับสูง มหาวิทยาลัยการแพทย์ทหารแห่งที่สาม (ฉงชิ่ง ประเทศจีน) และได้รับการรับรองโดย Yi Zhang จากมหาวิทยาลัยการแพทย์แผนจีนเฉิงตู (เฉิงตู ประเทศจีน)

3.3. การสกัดและการแยกวัสดุพืช

ก้าน C. tubulosa แห้งด้วยอากาศ (0.6 กก.) ถูกทำให้เป็นผงและสกัดด้วยเอทานอล 50% เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 70 องศา หลังจากกำจัดตัวทำละลายออกภายใต้ความดันที่ลดลง สารสกัดเอทานอล (212.5 กรัม) จะถูกละลายและแขวนลอยในน้ำ (2 ลิตร) และสกัดด้วย n-บิวทานอล (2 ลิตร × 3) สารสกัดเอ็น-บิวทานอล (110 กรัม) ถูกโครมาโตกราฟีบนคอลัมน์โพลีเอไมด์และชะด้วยเอธานอล/น้ำ (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50) ทำให้เกิดเศษส่วนห้าส่วน (A–E) . เศษส่วน B (65 กรัม) ถูกแยกส่วนในคอลัมน์ ODS ชะด้วยเอทานอล: น้ำ (1:9) แยกสารประกอบ 1 (3 กรัม) เศษส่วน D (10.5 กรัม) ถูกแยกส่วนในคอลัมน์ ODS ชะด้วยเอธานอล/น้ำ (1:4) แยกสารประกอบ 2 (1 ก.)

สเปกตรัม NMR ถูกบันทึกบนสเปกโตรมิเตอร์ Bruker Avance 600 ใน CD3OD โดยมี Tetramethylsilane (TMS) เป็นมาตรฐานภายใน แมสสเปกตรัมถูกดำเนินการบนแมสสเปกโตรมิเตอร์ BioTOF-Q

3.4. การเพาะเลี้ยงเซลล์

ได้เซลล์ EA.hy926 จาก American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) เพาะเลี้ยงเซลล์ในอาหารเลี้ยงเชื้อ RPMI 1640 เสริมด้วยซีรั่มของวัวของทารกในครรภ์ 10% (ปริมาตร/ปริมาตร) และเพนิซิลลิน-สเตรปโตมัยซิน 1% (ปริมาตร/ปริมาตร) ในสภาพแวดล้อมที่มีความชื้นด้วย 5% CO2 ที่ 37 องศา

3.5. ความมีชีวิตของเซลล์

ความมีชีวิตของเซลล์ได้รับการประเมินโดยใช้การสอบวิเคราะห์ MTT และ CCK{{0}} สารประกอบ 1 และ 2 และอะไกลโคน, กรดคาเฟอิก (3) และ 3,4-ไดไฮดรอกซิลฟีนิลเอธานอล (4) ของพวกมันถูกละลายใน DMSO จนถึงความเข้มข้น DMSO สุดท้าย < 0.1% (ปริมาตร/ปริมาตร) ในตัวกลางการเพาะเลี้ยง

เซลล์ EA.hy926 ถูกเพาะบนเพลตหลุม 96- ที่ 4 × 103 เซลล์/หลุม หลังจากการฟักตัวเป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์จะได้รับการบำบัดด้วยสารประกอบ 1, 2, 3 หรือ 4 6.25–50 ไมโครโมลาร์ เป็นเวลา 24 ชั่วโมง อาหารเลี้ยงเชื้อถูกนำออกและเซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วยน้ำเกลือที่มีบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) เติมส่วนลงตัว (10 ไมโครลิตร) ของสารละลาย MTT (5 มก.·มล.−1 ) ลงในแต่ละหลุมที่มีตัวกลาง 100 ไมโครลิตรและบ่มด้วยเซลล์เป็นเวลา 4 ชั่วโมง หลังจากการบ่ม ตัวกลางถูกดึงออกและส่วนลงตัวของ DMSO 150 ไมโครลิตรถูกเติมลงในแต่ละหลุมเพื่อละลายผลึกฟอร์มาซาน วัดการดูดซับที่ 490 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, USA) ความมีชีวิตของเซลล์แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของการลด MTT โดยกำหนดค่า 100% ให้กับค่าการดูดกลืนแสงของเซลล์ควบคุม การทดลองทั้งหมดดำเนินการสามครั้งและนำเสนอเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD)

การทดสอบ CCK-8 ดำเนินการตามวรรณกรรมที่มีการดัดแปลงเล็กน้อย [23] โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เซลล์ได้รับการบำบัดด้วยสารประกอบ 1, 2, 3 หรือ 4 6.25–50 μM เป็นเวลา 24 ชั่วโมงและล้างสองครั้งด้วย PBS ก่อนที่จะเติมสารละลาย CCK -8 10 μL และสื่อการเพาะเลี้ยง 100 μL หลังจากการบ่มไมโครเพลทที่ 37 องศาเป็นเวลา 2 ชั่วโมง วัดการดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท ความมีชีวิตของเซลล์ถูกแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของเซลล์ที่มีชีวิตที่สัมพันธ์กับเซลล์ควบคุม (100%) การทดลองทั้งหมดดำเนินการสามครั้งและแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SD

3.6. การประเมินการตายของเซลล์โดย Hoechst 33342 การย้อมสี

การเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาของอะพอพโทติกถูกสังเกตโดยการย้อมสี Hoechst 33342 โดยสรุป เซลล์ EA.hy926 ถูกเพาะบนเพลตหลุม 48- (2 × 104 เซลล์/หลุม) และบำบัดด้วยสารประกอบ 1, 2, 3 หรือ 4 50 μM เป็นเวลา 48 ชั่วโมงที่ 37 องศา ล้างสองครั้งด้วย PBS และตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% (ปริมาตร/ปริมาตร) เป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง หลังจากล้างสองครั้งด้วย PBS เซลล์จะถูกย้อมด้วย Hoechst 33342 (10 ug·mL−1 ) เป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้องและล้างสองครั้งด้วย PBS นิวเคลียสที่ย้อมสี Hoechst ถูกมองเห็นด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ (โอลิมปัส, โตเกียว, ญี่ปุ่น)

3.7. การวิเคราะห์การตายของเซลล์โดย Flow Cytometry

เซลล์อะพอพโทซิสถูกตรวจพบโดยแอนเน็กซิน V-FITC/PI การย้อมสีสองครั้งและการวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรี โดยสรุป หลังจากการบำบัดด้วยสารประกอบ 1, 2, 3 หรือ 4 50 μM เป็นเวลา 48 ชั่วโมง เซลล์จะถูกเก็บเกี่ยวและแขวนลอยใหม่ใน PBS ที่ 1 × 105 เซลล์·มล.−1 หลังจากการปั่นแยกที่ 500× กรัม เป็นเวลา 5 นาทีที่ 25 องศา, 195 ไมโครลิตรของบัฟเฟอร์การจับ V-FITC ของแอนเน็กซิน และ 5 ไมโครลิตรของบัฟเฟอร์การจับ V-FITC ของแอนเน็กซินถูกเพิ่มเข้าไป หลังจากการผสมวอร์เท็กซ์อย่างอ่อนโยน ของผสมถูกบ่มเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้องในที่มืด หลังจากการปั่นแยกที่ 500× g เป็นเวลา 5 นาทีที่ 25 องศา, บัฟเฟอร์การจับ Annexin V ที่ควบด้วย FITC 190 μL และ PI 10 μL ถูกเพิ่ม หลังจากการผสมน้ำวนอย่างอ่อนโยน ตัวอย่างถูกวิเคราะห์โดยใช้ FACSCalibur Flow Cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) ภายใน 30 นาที

3.8. การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลการทดลองทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SD ความสำคัญของความแตกต่างระหว่างตัวอย่างทดลองและการควบคุมที่เกี่ยวข้องได้รับการประเมินโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (one-way analysis of variance (ANOVA)) โดยใช้ซอฟต์แวร์ SPSS (เวอร์ชัน 11.5) กำหนดนัยสำคัญทางสถิติที่ p < 0.05

4. ข้อสรุป

ผลลัพธ์ของเราชี้ให้เห็นว่าการประเมินค่าสูงเกินไปของจำนวนเซลล์ที่มีชีวิตที่สังเกตได้ในการทดสอบ MTT สามารถปกปิดความเป็นพิษต่อเซลล์ของสารประกอบบางชนิดได้ ดังนั้น ในระหว่างกระบวนการคัดกรองยา เราขอแนะนำให้ใช้วิธีการที่หลากหลายเพื่อตรวจสอบผลกระทบของสารประกอบเฉพาะต่อการมีชีวิตของเซลล์ (เช่น การตรวจ CCK{0}} และ H-TdR 3 ครั้ง) เพื่อหลีกเลี่ยงการสร้างผลลัพธ์ที่ทำให้เข้าใจผิด

CISTANCHE TUBULOSA ธรรมชาติสำหรับส่งเสริมการหลั่งฮอร์โมนเพศชาย PHGS75% ECH 30% ACT 12%