ในการบริหาร Vivo ของ Consortia แบคทีเรียในลำไส้จำลองเมตาโบไทป์ของ Urolithin A และ B ในแบบจำลองหนูที่ไม่ได้ผลิต urolithin

เป็นเวลาหลายทศวรรษแล้วที่การบริโภคกรดเอลลาจิแทนนิน (ETs) และกรดแอนเดลลาจิก (EA) มีความเกี่ยวข้องกับผลกระทบทางชีวภาพมากมาย รวมถึงสารต้านอนุมูลอิสระ ต้านมะเร็ง ต้านการอักเสบ ต้านเชื้อแบคทีเรีย และต้านการจำลองแบบของเชื้อ HIV1 อย่างไรก็ตาม การดูดซึมและการดูดซึมของ ET และ EA มีสภาพแย่มาก การศึกษาก่อนหน้านี้ในมนุษย์พบว่าการขับถ่ายของ EA และ EA-O-glucuronide ทางปัสสาวะน้อยกว่า 1% ของการบริโภค2,3อย่างไรก็ตาม แม้ว่าการดูดซึม ET และ EA จะต่ำ พวกมันยังถูกเผาผลาญต่อไปโดยจุลินทรีย์ในลำไส้ใหญ่ไปเป็น urolithins (Uros) ซึ่งรับผิดชอบอย่างน้อยบางส่วนต่อผลประโยชน์ของ ET- และ (หรือ) อาหารที่อุดมด้วย EA1,4

คลิกเพื่อระบาย

ขั้นแรก EA ถูกปล่อยออกมาผ่านการไฮโดรไลซิสของพันธะเอสเทอร์ของ ET โดยเอนไซม์ที่เรียกว่า ellagitannase.5 EA ผ่านการย่อยสลายเพิ่มเติม ทำให้เกิด 6H-dibenzo[b,d]pyran-6-อนุพันธ์ชนิดหนึ่งที่เรียกว่า Uros ปฏิกิริยาต่อเนื่องกันนี้เริ่มต้นด้วยการแตกวงแหวนแลคโตนโดยเอนไซม์แลคโตเนส ส่งผลให้เกิดกรดลูอิก ซึ่งจากนั้นจะถูกดีคาร์บอกซิเลตเป็นเพนตะไฮดรอกซี-อูโร (Uro-M5) ดีไฮดรอกซิเลชันติดต่อกันจะแปลงเป็นเตตระไฮดรอกซี-ยูรอส (Uro-D, Uro-E และ Uro-M6) และไตรไฮดรอกซี-Uros (Uro-C, UroM7 และ Uro-G) เพื่อให้ได้ไดไฮดรอกซี-Uros (Uro-A และisoUro-A) และโมโนไฮดรอกซี-Uro (Uro-B) ในที่สุด ซึ่งชนิดหลังนี้จะถูกตรวจพบโดยทั่วไป เมื่อ isoUro-A ถูกสร้างขึ้นด้วย1

รูปแบบการเผาผลาญ Uro ที่มีความหลากหลายที่ตรวจพบในมนุษย์หลังจากรับประทานอาหารที่อุดมด้วย ET บ่งบอกถึงความแตกต่างระหว่างบุคคลในจุลินทรีย์ในลำไส้ใหญ่ที่รับผิดชอบต่อการย่อยสลาย ET ปฏิสัมพันธ์ที่เป็นไปได้มากมายระหว่างแบคทีเรียในลำไส้ใหญ่และสิ่งมีชีวิตที่เป็นโฮสต์สามารถอธิบายชะตากรรมการเผาผลาญที่แตกต่างกันของอาหาร (โพลี )ฟีนอล.6,9 ปฏิสัมพันธ์สองทางระหว่างจุลินทรีย์ในลำไส้และ (โพลี)ฟีนอลทำให้ชุมชนวิทยาศาสตร์จัดกลุ่มประชากรตามฟีโนไทป์ของเมแทบอลิซึม (ประเภทโลหะ) เพื่ออธิบายความแตกต่างในผลกระทบของโพลีฟีนอล10,11 โดยเฉพาะอย่างยิ่งตามเมแทบอลิซึมของ ET และ EA แต่ละบุคคลสามารถแบ่งชั้นเป็น Urometabotypes (UMs) ที่เกี่ยวข้องกับองค์ประกอบและการทำงานของไมโครไบโอมในลำไส้7,8,12

UM ของมนุษย์สามคน (UM-A, UM-B และ UM -0) ที่เกี่ยวข้องกับโปรไฟล์การผลิต Uro ที่แตกต่างกันสามโปรไฟล์ได้รับการอธิบายไว้ในประชากรตะวันตกและตะวันออก 13–15 ในเรื่องนี้บุคคล metabotype A (UM-A) ผลิต Uros ระดับกลางหลายตัว แต่มีเพียง urolithin A (Uro-A) ซึ่งเป็น Uro หลักที่ดูดซับใน UM นี้ที่ส่วนท้ายของวิถีการสลายของจุลินทรีย์ บุคคลประเภทเมตาโบไทป์ B (UM-B) จะสร้าง Uros ระดับกลางและ Uros สุดท้าย 3 ตัว ได้แก่ urolithin B (Uro-B), urolithin A (IsoUro-A) และ Uro-A ซึ่งเป็น Uros ที่ถูกดูดซึมหลักใน UM-B ดังนั้น Uros ที่อยู่ตรงกลางสามารถออกฤทธิ์ในลำไส้เป็นหลัก ในขณะที่อันสุดท้ายอาจมีผลกระทบเฉพาะที่และเป็นระบบ6 ในทางตรงกันข้าม บุคคลที่มีโลหะประเภท 0 (UM-0) ไม่สามารถสร้าง Uros สุดท้ายเหล่านี้ได้ (เฉพาะ จนถึงขณะนี้ตรวจพบสารตั้งต้น Urolithin-M5 ซึ่งไม่ถูกดูดซึมในลำไส้)

พบความแตกต่างในโปรไฟล์ Uro ระหว่าง UM และตลอดลำไส้ใหญ่ ซึ่งแสดงให้เห็นการผลิต Uro ที่โดดเด่นในภูมิภาค distalcolon16–19 ที่น่าสังเกตคือ เปอร์เซ็นต์ UM-0 ในอาสาสมัครที่มีสุขภาพดีในสเปนและจีนอยู่ที่ประมาณ 10% และอาจสูงกว่านี้ใน ประชากรของสหรัฐอเมริกา13–15 แบคทีเรียจำพวก Gordonibacter และ Ellagibacter ได้รับการระบุว่ามีความสามารถในการเผาผลาญ EA ให้เป็น Uros บางชนิดได้20–23อย่างไรก็ตาม พบว่ามีสารตัวกลางบางชนิด (เช่น Uro-D, Uro-E, Uro- M7 และ Uro-G) และ Uros สุดท้าย (Uro-A และ Uro-B) ไม่ได้ถูกสร้างขึ้นในวัฒนธรรมบริสุทธิ์ของแบคทีเรียเหล่านี้ ซึ่งหมายความว่าแบคทีเรียอื่นๆ จำเป็นต้องสร้างชุด Uros ให้สมบูรณ์ซึ่งกำหนดค่าทั้ง UM-A และ UM-B . เมื่อเร็วๆ นี้ กลุ่มแบคทีเรียในลำไส้ที่เกี่ยวข้องกับเมแทบอลิซึมของ EA เพื่อให้ได้เมตาโบไทป์ที่สร้าง Uroprocing (UM-A และ UM-B) ในหลอดทดลอง ได้รับการระบุแล้ว24

กลุ่มแบคทีเรียที่ประกอบด้วย Gordonibacter plusEnterocloster genera และ Ellagibacter บวก Enterocloster ที่ผลิตในหลอดทดลอง คือ urolithins ที่เกี่ยวข้องกับ UM-A และ UM-B ตามลำดับ25 อย่างไรก็ตาม ความสามารถของกลุ่มแบคทีเรียเหล่านี้ในการทำซ้ำโปรไฟล์ Uro ของมนุษย์ที่เกี่ยวข้องกับ UM-A และUM-B ในร่างกาย ยังไม่ทราบ นอกจากนี้ ความปลอดภัยในการบริโภคแบคทีเรียที่สร้าง Uro เหล่านี้ในรูปแบบโปรไบโอติกชนิดใหม่ยังคงไม่แน่นอน เนื่องจากไม่เคยมีการทดสอบในสัตว์หรือมนุษย์มาก่อน ในการศึกษาปัจจุบัน กลุ่มแบคทีเรียข้างต้นได้รับการประเมินความสามารถในการตั้งรกรากในลำไส้ของหนูที่ไม่ผลิต Uro (คล้าย UM -0-) ​​และแปลงพวกมันให้กลายเป็น Uroproducer ที่เลียนแบบ UM-A และ UM-B ตามลำดับ ความปลอดภัยของกลุ่มแบคทีเรียเหล่านี้ยังได้รับการประเมินด้วย นอกจากนี้ กระบวนการที่ใช้ PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ (qPCR) ของ twonovel ยังได้รับการพัฒนาเพื่อตรวจจับและระบุปริมาณ Ellagibacter และ Enterocloster ในตัวอย่างอุจจาระ

วัสดุและวิธีการ

สารเคมีและรีเอเจนต์

Uros ถูกสังเคราะห์ทางเคมีและทำให้บริสุทธิ์โดย VillapharmaResearch SL (Parque Tecnológico de Fuente Álamo, Murcia, สเปน) EA ถูกซื้อจาก Sigma-Aldrich (เซนต์หลุยส์, มิสซูรี, สหรัฐอเมริกา) น้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) ได้มาจาก FisherScientific (สหรัฐอเมริกา) ในขณะที่เมทานอล เอทานอล และกรดฟอร์มิกมาจาก Panreac Química (บาร์เซโลนา ประเทศสเปน) ตัวทำละลายเกรดโครมาโทกราฟี-แมสสเปกโตรเมตรีของเหลว (LC-MS) ซื้อจาก JT Baker (Deventer, เนเธอร์แลนด์) มีการใช้น้ำ UltrapureMillipore (เบดฟอร์ด, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา) ตลอดการศึกษา สารเคมีและรีเอเจนต์ทั้งหมดเป็นเกรดวิเคราะห์

การเตรียมกลุ่มแบคทีเรีย

Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213T, Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T และ Enterocloster ติด CEBASS4A9 ทั้งหมดแยกและระบุในห้องทดลองของเรา (CEBAS-CSIC ประเทศสเปน) ได้รับการปลูกฝังแบบไร้อากาศใน 5 มล.วิลกินส์ -หลอดไร้อากาศขนาดกลาง Chalgren (WAM, Oxoid) ที่ 37 องศา เป็นเวลา 48 ชั่วโมงในห้องปลอดออกซิเจน Concept 400 (BakerRuskin Technologies Ltd, Bridgend, South Wales, UK) และแขวนลอยใหม่ใน PBS ที่เสริมด้วยกลีเซอรอล 10% และ L-cysteine ​​ไฮโดรคลอไรด์ 0.05% (PanReac กีมิกา, บาร์เซโลนา, สเปน) หลังจากการฟักตัวแบบไม่ใช้ออกซิเจน สมาคมก็ถูกจัดเตรียมไว้24,25 สรุปสั้นๆ ว่า "สมาคมแบคทีเรีย A" มี G. urolithinfaciens และสายพันธุ์ E. bolteae; "กลุ่มแบคทีเรีย B" มีวัฒนธรรมของ E. isourolithinifaciens และ E. bolteae; และ "ค็อกเทลควบคุม" มี PBS ปลอดเชื้อที่มีกลีเซอรอล 10% และแอล-ซิสเทอีน ไฮโดรคลอไรด์ 0.05% ก่อนการบริหาร ค็อกเทลทั้งหมดถูกแจกจ่ายในปริมาณ 3.5 มล. และเก็บไว้ที่ -80 องศา

สัตว์ อาหาร และการออกแบบการทดลอง

ระเบียบวิธีการทดลอง (อ้างอิง 624/2020) ได้รับการอนุมัติจากรัฐบาลท้องถิ่น คณะกรรมการจริยธรรมทางชีวภาพของสภาวิจัยแห่งชาติสเปน (มาดริด สเปน) และคณะกรรมการจริยธรรมการทดลองสัตว์จากมหาวิทยาลัยมูร์เซีย (สเปน) การทดลองเป็นไปตามคำแนะนำของสหภาพยุโรปเกี่ยวกับการทดลองกับสัตว์ (คำสั่ง 2010/63/EU ของรัฐสภายุโรปและสภาว่าด้วยการคุ้มครองสัตว์ที่ใช้เพื่อวัตถุประสงค์ทางวิทยาศาสตร์) หนูวิสตาร์ (n=18; ตัวเมีย 9 ตัวและตัวผู้ 9 ตัว) น้ำหนัก 240 ± 31 กรัม ได้มาจาก Envigo (บาร์เซโลนา, สเปน) แบบจำลองหนูนี้ได้รับการคัดเลือกโดยพิจารณาจากความสามารถในการสร้าง Uros ที่สังเกตได้ในการศึกษาเบื้องต้นของเรา โดยมีการทดสอบตัวอย่างอุจจาระจากหนูแบบจำลองต่างๆ กลุ่มสามกลุ่ม (A, B และ C) ถูกสร้างขึ้นโดยการสุ่มกำหนดสัตว์ 6 ตัวต่อตัว (หนูตัวเมีย 3 ตัว และหนูตัวผู้ 3 ตัว ) ต่อกลุ่ม (รูปที่ 1)

หนูแต่ละกลุ่มถูกเลี้ยงในกรงสองกรงที่แตกต่างกัน แบ่งตามเพศ ในห้องที่มีสภาพแวดล้อมที่มีการควบคุมอุณหภูมิ (22± 2 องศา) โดยมีความชื้นสัมพัทธ์ 55 ± 10% และวงจรแสง-ความมืดที่ควบคุมได้ (12 ชั่วโมง) หนูได้รับอาหาร Chow มาตรฐาน (เต็กลัด บาร์เซโลนา ประเทศสเปน) ที่มีโปรตีน (%/100 กรัมของน้ำหนักสด) 14.3% (กลูเตนข้าวโพด) คาร์โบไฮเดรต 48% (ข้าวสาลีบด ข้าวสาลีบด ข้าวโพดบด) และไขมัน 4% (น้ำมันถั่วเหลือง ) ความหนาแน่นของพลังงาน 2.9 kcal g−1 และเส้นใยดิบ 4.1% เสริมด้วยผง EA ที่มีความบริสุทธิ์มากกว่าหรือเท่ากับ 95% (3.6 มก. ต่อ 100 กรัมของอาหาร) EA ถูกผสมให้เป็นเนื้อเดียวกันกับอาหารมาตรฐานบด นำมาอัดเป็นก้อนใหม่และทำแห้งแบบแห้ง อาหารที่อุดมด้วย EA ถูกเก็บไว้ให้ห่างจากความชื้นและแสง ปริมาณ EA ที่มอบให้กับหนูที่อยู่ในอาหารอยู่ที่ประมาณ 0.72 มก. ต่อหนูต่อวัน (อาหาร EA1 ×) ปริมาณเทียบเท่าของมนุษย์คือ 41 มก. วัน−1.26 ทุกกลุ่มได้รับอาหาร EA 1 × และน้ำประปาโดยไม่จำกัดตลอดการทดลอง ( 5 สัปดาห์) เนื่องจาก EA ที่ตรวจพบในตัวอย่างอุจจาระมีค่าต่ำในช่วงสัปดาห์แรก EA พิเศษบางตัวจึงถูกเพิ่มเข้ามาในวันต่อๆ ไป ในสัปดาห์ที่ 3 ปริมาณพิเศษ 1.5 มก. EA ต่อหนูต่อวันที่ละลายในน้ำถูกบริหารให้โดยการให้ทางปากแก่สัตว์ (รวม=EA 3 × อาหาร) ซึ่งให้ไว้เพียง 1 สัปดาห์เท่านั้น ในที่สุด ในสัปดาห์ที่ 4 จะมีการเติมวอลนัท ประมาณ 5 กรัมต่อหนูต่อวัน (แหล่ง EA อื่น) ลงในอาหาร EA 1× และคงไว้จนกระทั่งสิ้นสุดการศึกษาเพื่อประเมินผลกระทบของ EA ที่ประกอบด้วยเมทริกซ์อาหารต่อความสามารถของแบคทีเรีย เพื่อผลิตยูรอส วัดน้ำหนัก อาหาร และปริมาณน้ำทุกวัน กลุ่มแบคทีเรียในลำไส้ถูกบริหารโดยทางปาก กลุ่ม A ได้รับ 500 ไมโครลิตรของแบคทีเรียค็อกเทล A, GroupB ได้รับ 500 ไมโครลิตรของแบคทีเรียค็อกเทล B และกลุ่ม C(กลุ่มควบคุม) ได้รับ PBS 500 ไมโครลิตร การให้ยาทางปากถูกดำเนินการทุก 2 วันในช่วงสองสัปดาห์แรกและทุกวันในช่วง 2 สัปดาห์ต่อมา ในสัปดาห์ที่ผ่านมา (วันที่ 28 ถึง 32) สัตว์ยังคงรับประทานอาหารแบบเดียวกันที่เสริมด้วย EA และวอลนัท แต่ไม่มีการบริหารแบคทีเรียในช่องปาก ในช่วงท้ายของการศึกษา สัตว์ต่างๆ ได้รับการสังเวยโดยใช้ห้อง CO2

ขั้นตอนการสุ่มตัวอย่าง

ตัวอย่างอุจจาระถูกเก็บในระหว่างการศึกษาเพื่อการวิเคราะห์ Uro โดย UPLC-ESI-QTOF-MS/MS และจุลินทรีย์ในลำไส้โดยลำดับยีน 16S rRNA และ qPCR เลือดถูกสกัดที่จุดเวลาที่ต่างกัน (เส้นพื้นฐาน, วันที่ 28 และจุดสิ้นสุดของการศึกษา) สำหรับการวิเคราะห์ทางโลหิตวิทยาและทางชีวเคมีในซีรัม ตัวอย่างเลือดได้รับจากหลอดเลือดดำส่วนท้าย (ประมาณ 500 ไมโครลิตร) และเก็บในหลอดที่มีเฮปารินที่เส้นฐานและวันที่ 28 และ 32 (รูปที่ 1) การแยกพลาสมาดำเนินการทันทีโดยการปั่นแยกที่ 3,000 กรัม เป็นเวลา 10 นาทีที่ 4 องศา และแช่แข็งที่ - 80 องศาจนกระทั่งหาตัวแปรซีโรชีวเคมีต่อไป ตับ ไต และม้ามถูกรวบรวม ชั่งน้ำหนัก และตรวจสอบเพื่อตรวจหาความแตกต่างทางสัณฐานวิทยา ณ การสังเวย

การออกแบบและการเพิ่มประสิทธิภาพของไพรเมอร์และโพรบสำหรับการหาปริมาณของ Ellagibacter และ Enterocloster โดย qPCR

ลำดับของยีน 16S rRNA ของ Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T และ E. bolted CEBAS S4A9 ได้มาจากฐานข้อมูล GenBank (ฐานข้อมูล EMBL) ลำดับดังกล่าวสอดคล้องกับการสร้างแบคทีเรียแบบปิดสายวิวัฒนาการโดยใช้ซอฟต์แวร์การวิเคราะห์พันธุศาสตร์วิวัฒนาการระดับโมเลกุล (MEGA 11) และตรวจสอบบริเวณที่ได้รับการอนุรักษ์และลำดับตัวแปรเพื่อออกแบบไพรเมอร์และโพรบเพื่อตรวจจับและวัดปริมาณ Ellagibacter และ Enterocloster (ตารางที่ 1) ไพรเมอร์แซนด์โพรบได้รับการออกแบบและตรวจสอบความถูกต้องด้วยเครื่องมือ Primer Quest และ Oligo Analyzer ตามลำดับ (Integrated DNATechnologies, Inc., เบลเยียม) โพรบ TaqMan มีป้ายกำกับอยู่ที่ 5′ และ 3′ ลงท้ายด้วย6-หมู่คาร์บอกซี-ฟลูออเรสซีน (6FAM) และเครื่องดับแบล็คเบอร์รี่ (BBQ) ตามลำดับ qPCR ดำเนินการโดยใช้ระบบการตรวจจับลำดับ ABI 7500 ความเข้มข้นสุดท้ายของไพรเมอร์และโพรบแต่ละตัวคือ 300 และ 375 นาโนโมลาร์สำหรับเอลลาจิแบคเตอร์ และ 200 และ 500 นาโนโมลาร์สำหรับเอนเทอโรคลอสเตอร์ โปรโตคอล qPCR แบบธรรมดาถูกดำเนินการเพื่อการขยาย DNA ของ Ellagibacter และเอนเทอโรคลอสเตอร์ ตามลำดับ โปรไฟล์การไล่ระดับสำหรับการขยายด้วยเอลลากิแบคทีเรียคือ 1 รอบที่ 95 องศาเป็นเวลา 5 นาที ตามด้วย 45 รอบที่ 95 องศาเป็นเวลา 15 วินาที, 50 องศาเป็นเวลา 40 วินาที และ 72 องศาเป็นเวลา 31 วินาที สุดท้าย เพิ่ม 1 รอบที่ 72 องศาเป็นเวลา 5 นาที . โปรไฟล์การไล่ระดับสำหรับการขยายเอนเทอโรคลอสเตอร์คือ 1 รอบที่ 95 องศาเป็นเวลา 5 นาที ตามด้วย 40 รอบที่ 95 องศาเป็นเวลา 15 วินาที, 65 องศาเป็นเวลา 40 วินาที และ 72 องศาเป็นเวลา 31 วินาที สุดท้าย เพิ่ม 1 รอบที่ 72 องศาเป็นเวลา 5 นาที

การสกัด DNA ของอุจจาระและการวิเคราะห์จุลินทรีย์ในลำไส้

การสกัด DNA จากตัวอย่างอุจจาระดำเนินการด้วยชุดการทำให้ DNA ของเนื้อเยื่อ NucleoSpin® (Macherey-Nagel ประเทศเยอรมนี) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตพร้อมการปรับเปลี่ยนบางอย่าง DNA ถูกวัดปริมาณด้วยฟลูออริเมทรี (Qubit3.0 – ThermoFisher Scientific™, UK) และวัดความบริสุทธิ์จากอัตราส่วนการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 260/280 nm (A260/A280) (NanoDrop-ThermoFisher Scientific™, UK ). องค์ประกอบของ Gut microbiota ถูกกำหนดโดยการเรียงลำดับขอบเขตตัวแปร V3 และ V4 ของยีน 16S rRNA ตามโปรโตคอลของ Illumina (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) ด้วยความยาวการอ่าน 2 × 300 bp paired-end run (MiSeqReagent Kit v3 ,อิลลูมินาอิงค์) การจัดลำดับเมทาเจโนมิกดำเนินการบนแพลตฟอร์ม MiSeq-Illumina (บริการจัดลำดับ FISABIO ประเทศสเปน) การประมวลผลข้อมูล การลบลำดับไคเมอริก การจัดตำแหน่งลำดับ และการจัดกลุ่มลำดับยีน 16S rRNA ได้รับการดำเนินการตามที่อธิบายไว้ที่อื่นเพื่อให้ได้การจำแนกอนุกรมวิธาน 8,27 การขยาย DNA Gordonibacter ทำได้สำเร็จในระบบ ABI 7500 qPCR ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 19,28 The Enterocloster และ Ellagibacter- ไพรเมอร์และโพรบเฉพาะที่ออกแบบในการศึกษานี้ถูกนำมาใช้ตามโปรโตคอล qPCR ที่อธิบายไว้ข้างต้น เส้นโค้งมาตรฐานจีโนม DNA ของ Gordonibacter, Enterocloster และ Ellagibacter ถูกนำมาใช้ในการหาปริมาณ ตัวอย่างอุจจาระทั้งหมดได้รับการวิเคราะห์เป็นสามเท่า

การสกัด การตรวจหา และการหาปริมาณของยูโรลิธินในตัวอย่างอุจจาระ

ตัวอย่างอุจจาระ ({{0}}.2–0.5 กรัม) ถูกสกัดในสัดส่วน 1: 10 ด้วยสารละลาย MeOH/H2O (8{{ 20}}/20) ทำให้เป็นกรดด้วย 0.1% HCl และทำให้เป็นเนื้อเดียวกันโดยการหมุนวนเป็นเวลา 2 นาทีและเขย่าที่ 1500 รอบต่อนาทีที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาทีในเครื่องทำความร้อนแบบบล็อก สารแขวนลอยถูกปั่นแยกที่ 14 000กรัม ที่ 4 องศาเป็นเวลา 10 นาที และส่วนลอยเหนือตะกอนถูกกรองผ่านตัวกรองเมมเบรน PVDF ขนาด 0.22 µm (Millipore Corp., เบดฟอร์ด, MA) และเจือจาง 3 เท่าด้วย MeOH (กรดฟอร์มิก 0.1% ) ก่อนการฉีดในระบบ UPLC-ESI-QTOF-MS ระบบ UPLC (Agilent 1290Infinity) ควบคู่กับเวลาการบินสี่เท่า (QTOF) LC/MSsystem (6550 Accurate-Mass) (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) ถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์สารเมตาบอไลต์ของอุจจาระโดยใช้วิธีการชะล้างแบบไล่ระดับตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ .29,30 โดยสรุป การแยกดำเนินการในคอลัมน์แบบย้อนกลับของ Poroshell 120 EC-C18 โดยใช้น้ำและอะซีโตไนไตรล์ ซึ่งทั้งคู่ทำให้เป็นกรดด้วยกรดฟอร์มิก 0.1% เป็นเฟสเคลื่อนที่ อัตราการไหลคือ 0.4 มิลลิลิตร นาที−1 และปริมาตรการฉีดคือ 5 ไมโครลิตร ซอฟต์แวร์การวิเคราะห์เชิงคุณภาพ MassHunter (เวอร์ชัน B.10, Agilent Technologies, Waldbronn ประเทศเยอรมนี) ใช้สำหรับการประมวลผลข้อมูล สารเมตาบอไลต์ทั้งหมดได้รับการระบุโดยการเปรียบเทียบโดยตรงกับสารมาตรฐานและยืนยันโดยมวลโมเลกุลของสารเหล่านั้น ได้รับกราฟการปรับเทียบสำหรับEA และ Uros ที่แตกต่างกันที่มีความเป็นเส้นตรงที่ดี (R2 > 0.99)

โลหิตวิทยาและเคมีคลินิก

ตัวแปรทางโลหิตวิทยาถูกกำหนดในเลือดที่มีเฮโดยใช้เครื่องวิเคราะห์ทางโลหิตวิทยาอัตโนมัติพร้อมซอฟต์แวร์เฉพาะสำหรับตัวอย่างเลือดหนู (AVDIA 120, Siemens, Munich, Germany) ตัวแปรที่วิเคราะห์คือปริมาตรคอร์ปัสกล้ามเนื้อเฉลี่ย (MCV), ฮีโมโกลบินคอร์ปัสเฉลี่ย (MCH), ความเข้มข้นของฮีโมโกลบินคอร์ปัสเฉลี่ย (MCHC), การกระจายตัวของเม็ดเลือดแดง (RDW), ปริมาตรเกล็ดเลือดเฉลี่ย (MPV), เกล็ดเลือดคริท (PCT), ความกว้างของการกระจายของเกล็ดเลือด (PDW) ส่วนประกอบของเกล็ดเลือดเฉลี่ย (MPC) มวลเกล็ดเลือดเฉลี่ย (MPM) จำนวนเกล็ดเลือด (PLT) ปริมาณฮีโมโกลบินเรติคูโลไซต์ (CHr) และปริมาตรเม็ดเลือดเรติคูโลไซต์เฉลี่ย (MCVr) วิเคราะห์ตัวแปรทางชีวเคมีในพลาสมาแคลเซียม (Ca) และฟอสฟอรัส (P) โดยใช้เครื่องวิเคราะห์เคมีและพิษวิทยาของ Olympus AU400 (เบ็คแมนโคลเตอร์, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) ตัวแปรทางชีวเคมี ได้แก่ โปรตีนทั้งหมด (PROT), อัลบูมิน (ALBU), โกลบูลิน (GLOB), ครีเอตินีน (CREA), กลูโคส (GLUC), โคเลสเตอรอล (CHOL), ไตรกลีเซอไรด์ (TRIGL), อัลคาไลน์ฟอสฟาเตส (ALP), แกมมา-กลูตามิลทรานเปปทิเดส ( GGT), แอสพาเทต อะมิโนทรานสเฟอเรส (AST) และอะลานีน อะมิโนทรานสเฟอเรส (ALT) สุดท้าย ระดับไทรอกซีน (T4) ถูกวิเคราะห์โดยใช้ระบบ IMMULITE® 1000 อิมมูโนแอสเสย์ (ซีเมนส์)

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) ทำการวิเคราะห์ทางสถิติด้วยซอฟต์แวร์ SPSS เวอร์ชัน 270 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) และความแตกต่างด้วย p < 0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ ประเมินความเป็นปกติของข้อมูลด้วยการทดสอบ Shapiro – Wilk การเปรียบเทียบระหว่างกลุ่มการรักษาที่แตกต่างกันได้ดำเนินการโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวน (RM ANOVA) ที่วัดซ้ำด้วยการทดสอบ T3 หลังการทดสอบของ Tukey หรือ Dunnett ขึ้นอยู่กับว่าข้อมูลเป็นไปตามการแจกแจงแบบปกติหรือไม่ปกติตามลำดับ มีการสำรวจความแตกต่างระหว่างชายและหญิงโดยใช้การทดสอบแบบจับคู่ของนักเรียน หรือการทดสอบอันดับลงนามของ Wilcoxon เมื่อข้อมูลมีการกระจายแบบปกติหรือไม่ปกติตามลำดับ เอฟเฟกต์การวิเคราะห์จำแนกเชิงเส้นไคสแควร์ (LEfSe) ถูกนำมาใช้เพื่อตรวจจับลักษณะเฉพาะของแบคทีเรียที่แตกต่างกันระหว่างกลุ่ม ความสัมพันธ์แบบเพียร์สันถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์ความสัมพันธ์ที่เป็นไปได้ระหว่างตัวแปรในข้อมูลที่กระจายแบบปกติ ในขณะที่ความสัมพันธ์แบบสเปียร์แมนถูกนำมาใช้ในข้อมูลที่กระจายแบบไม่ปกติ ดำเนินการแปลงข้อมูลโดยใช้ Sigma Plot 14.5 (ซอฟต์แวร์ Systat, San Jose, CA, USA)

ยาสมุนไพรธรรมชาติบรรเทาอาการท้องผูก-Cistanche

Cistanche เป็นพืชสกุลกาฝากที่อยู่ในวงศ์ Orobanchaceae พืชเหล่านี้ขึ้นชื่อในด้านคุณสมบัติทางยา และมีการใช้ในการแพทย์แผนจีน (TCM) มานานหลายศตวรรษ พันธุ์ Cistanche มักพบในพื้นที่แห้งแล้งและทะเลทรายของจีน มองโกเลีย และส่วนอื่นๆ ของเอเชียกลาง พืช Cistanche มีลักษณะลำต้นที่มีเนื้อและมีสีเหลือง และมีคุณค่าสูงในด้านประโยชน์ต่อสุขภาพ ใน TCM เชื่อกันว่า Cistanche มีคุณสมบัติในการบำรุง และมักใช้ในการบำรุงไต เพิ่มความมีชีวิตชีวา และสนับสนุนการทำงานทางเพศ นอกจากนี้ยังใช้เพื่อจัดการกับความชรา ความเหนื่อยล้า และปัญหาความเป็นอยู่โดยรวม แม้ว่า Cistanche จะมีประวัติการใช้มายาวนานในการแพทย์แผนโบราณ แต่การวิจัยทางวิทยาศาสตร์เกี่ยวกับประสิทธิภาพและความปลอดภัยของยายังคงดำเนินต่อไปและจำกัด อย่างไรก็ตาม มันมีสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพหลายชนิด เช่น ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ ไอริดอยด์ ลิกแนน และโพลีแซ็กคาไรด์ ซึ่งอาจมีส่วนทำให้เกิดผลทางยาได้

เวซิสตานช์ผง cistanche, แท็บเล็ต cistanche, แคปซูล cistanche,และผลิตภัณฑ์อื่นๆได้รับการพัฒนาโดยใช้ทะเลทรายถังน้ำเป็นวัตถุดิบซึ่งล้วนมีผลดีต่อการบรรเทาอาการท้องผูก กลไกเฉพาะมีดังนี้: เชื่อกันว่า Cistanche อาจมีประโยชน์ในการบรรเทาอาการท้องผูกโดยพิจารณาจากการใช้แบบดั้งเดิมและสารประกอบบางชนิดที่มีอยู่ แม้ว่าการวิจัยทางวิทยาศาสตร์โดยเฉพาะเกี่ยวกับผลกระทบของ Cistanche ต่ออาการท้องผูกนั้นมีจำกัด แต่เชื่อกันว่ามีกลไกหลายอย่างที่อาจมีส่วนช่วยในการบรรเทาอาการท้องผูกได้ ผลยาระบาย:ซิสแทนเช่มีการใช้กันมานานในการแพทย์แผนจีนเพื่อแก้อาการท้องผูก เชื่อกันว่ามีฤทธิ์เป็นยาระบายอ่อนๆ ซึ่งสามารถช่วยส่งเสริมการเคลื่อนไหวของลำไส้และทำให้ท้องผูกได้ ผลกระทบนี้อาจเกิดจากสารประกอบต่างๆ ที่พบใน Cistanche เช่น ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์และโพลีแซ็กคาไรด์ การทำให้ลำไส้ชุ่มชื้น: จากการใช้แบบดั้งเดิม Cistanche ถือว่ามีคุณสมบัติในการให้ความชุ่มชื้น โดยเฉพาะสำหรับลำไส้ การส่งเสริมความชุ่มชื้นและการหล่อลื่นของลำไส้อาจช่วยให้เครื่องมือนิ่มลงและช่วยให้ขับผ่านได้ง่ายขึ้น ซึ่งช่วยบรรเทาอาการท้องผูกได้ ผลต้านการอักเสบ: บางครั้งอาการท้องผูกอาจเกี่ยวข้องกับการอักเสบในระบบทางเดินอาหาร Cistanche มีสารประกอบบางชนิด รวมถึงฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์และลิกแนน ซึ่งเชื่อกันว่ามีคุณสมบัติต้านการอักเสบ การลดการอักเสบในลำไส้อาจช่วยให้การเคลื่อนไหวของลำไส้สม่ำเสมอและบรรเทาอาการท้องผูกได้