ในการออกแบบซิลิโกของวัคซีนเปปไทด์หลายหน่วยย่อยโพลีวาเลนต์ที่ใช้ประโยชน์จากภูมิคุ้มกันข้ามกับโรคลิชมาเนียในอวัยวะภายในและผิวหนังของมนุษย์: แนวทางที่ใช้ภูมิคุ้มกันวิทยา

เชิงนามธรรม

บริบทของโรคลิชมาเนียคือกลุ่มของโรคติดเชื้อที่มีพาหะนำโรค เกิดจากลิชมาเนียที่ทำให้เกิดโรคมากกว่า 20 สายพันธุ์ ซึ่งมีถิ่นกำเนิดในประเทศเขตร้อนและกึ่งเขตร้อนหลายประเทศ การเกิดขึ้นของสายพันธุ์ที่ดื้อยา ผลข้างเคียงที่ไม่พึงประสงค์ของยาต้านลิชมาเนีย และการไม่มีกลยุทธ์การฉีดวัคซีนป้องกันเป็นภัยคุกคามต่อประชากรที่มีความอ่อนไหว เมื่อเร็วๆ นี้ นักวิจัยหลายกลุ่มได้ใช้ประโยชน์จากสาขาวัคซีนย้อนกลับเพื่อพัฒนาวัคซีน โดยมุ่งเน้นที่การกระตุ้นภูมิคุ้มกันต่อโรคลิชมาเนียในอวัยวะภายในหรือทางผิวหนังเป็นหลัก

cistanche tubulosa—ต้านการอักเสบ

วิธีการงานปัจจุบันนี้เกี่ยวข้องกับการดึงลำดับโปรตีนแอนติเจนของลิชมาเนียลที่ได้รับการตรวจสอบความถูกต้องทางการทดลองจำนวน 12 ลำดับจากฐานข้อมูล UniProt ตามด้วยการทำโปรไฟล์แอนติเจนโดยใช้เซิร์ฟเวอร์ ANTIGENpro และ Vaxijen 2.0 เอพิโทปการจับ MHC สำหรับสิ่งเดียวกันถูกคาดการณ์โดยใช้ทั้งเซิร์ฟเวอร์ NetCTL 1.2 และ SYFPEITHI ในขณะที่อีพิโทปสำหรับ B เซลล์ถูกคำนวณโดยใช้เซิร์ฟเวอร์ ABCpred และ BepiPred 20 เอพิโทปที่ผ่านการคัดกรองที่มีคะแนนสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญถูกนำมาใช้เพื่อการออกแบบโครงสร้างวัคซีนด้วยตัวเชื่อมโยงและสารเสริมตามธรรมชาติที่เหมาะสม โครงสร้างทุติยภูมิและตติยภูมิของเปปไทด์สังเคราะห์ถูกกำหนดโดยฟิลด์สุ่มแบบมีเงื่อนไข โครงข่ายประสาทแบบตื้น และการจัดแนวเกลียวโปรไฟล์-โปรไฟล์ด้วยการจำลองการประกอบโครงสร้างซ้ำ ตามลำดับ แบบจำลองวัคซีน 3-D ได้รับการตรวจสอบผ่านการปรับแต่งที่ทดสอบโดย CASP10- และเว็บเซิร์ฟเวอร์ MolProbity การเชื่อมต่อระดับโมเลกุลและการจำลองการวิเคราะห์โหมดปกติหลายสเกลถูกดำเนินการเพื่อวิเคราะห์สารเชิงซ้อนของวัคซีน-TLR ที่ดีที่สุด ในที่สุด การค้นพบการจำลองภูมิคุ้มกันด้วยคอมพิวเตอร์เผยให้เห็นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของเซลล์และร่างกายที่มีแนวโน้มดี โดยเสนอว่าไคเมอริกเปปไทด์ที่ได้รับการออกแบบทางวิศวกรรมนั้นเป็นวัคซีนในวงกว้างที่มีศักยภาพในการต่อต้านโรคลิชมาเนียในอวัยวะภายในและผิวหนัง

ประโยชน์ของซิสตานช์สำหรับระบบภูมิคุ้มกันของผู้ชาย

คำสำคัญ ลิชมาเนียซิส · วัคซีนย้อนกลับ · TLR · วัคซีนหลายเอพิโทป · การจำลองแบบไดนามิกระดับโมเลกุล · การสร้างแบบจำลองที่คล้ายคลึงกัน

การแนะนำ

Leishmaniasis เป็นกลุ่มของโรคปรสิตที่เกิดจากสมาชิกหลายชนิดในสกุล Leishmania ซึ่งเป็นโปรโตซัวปรสิตในเซลล์ที่มี dimorphic [1] โรคลิชมาเนียส่งผลกระทบต่อประชากรส่วนใหญ่จากสถานะทางเศรษฐกิจและสังคมต่ำของประเทศเขตร้อนและกึ่งเขตร้อนทั่วโลก [2] เป็นโรคที่เกิดจากพาหะนำโรค และปรสิตสามารถติดต่อได้โดยการกัดแมลงวันทรายฟิลโบโตมีนตัวเมียที่ติดเชื้อ (WHO, 2019) ตามรายงานล่าสุดโดยองค์การอนามัยโลก มีผู้ป่วยใหม่ 700 ราย 000 ถึง 1 ล้านราย และมีผู้เสียชีวิตประมาณ 26,000 ถึง 65, 000 รายต่อปี (WHO, 2019) ในแอฟริกาตะวันออก การระบาดของโรคลิชมาเนียเกี่ยวกับอวัยวะภายในเกิดขึ้นบ่อยครั้ง ภูมิภาคเมดิเตอร์เรเนียนตะวันออกมีผู้ป่วยโรคลิชมาเนียที่ผิวหนังถึง 70% ทั่วโลก (WHO, 2019) ในปี 2560 มีผู้ป่วยรายใหม่ 20,792 รายจาก 22,145 ราย (94%) ที่รายงานต่อ WHO เกิดขึ้นใน 7 ประเทศ ได้แก่ บราซิล เอธิโอเปีย อินเดีย เคนยา โซมาเลีย ซูดานใต้ และซูดาน (WHO, 2017) เนื่องจากสถานการณ์ที่น่าตกใจ จึงควรเน้นย้ำมาตรการในการควบคุมและกำจัดโรคในประเทศของเรา โรคลิชมาเนียมีอาการทางคลินิกที่หลากหลาย และมีรูปแบบหลักของโรคสามรูปแบบ ได้แก่ อวัยวะภายใน (หรือที่เรียกว่าคาลา-อาซาร์และรูปแบบที่รุนแรงที่สุดของโรค) ผิวหนัง (พบบ่อยที่สุด) และเยื่อเมือก (WHO, 2019) . หลักฐานการรักษาตนเองในบางกรณีของโรคลิชมาเนียที่ผิวหนัง (CL) และผลภูมิคุ้มกันต่อการติดเชื้อซ้ำ ถือว่าขอบเขตที่เป็นไปได้ของการฉีดวัคซีนเป็นวิธีการที่เป็นไปได้ในการควบคุมโรคลิชมาเนียตลอดระยะเวลา [3] อย่างไรก็ตาม ในปัจจุบัน ยังไม่มีวัคซีนที่ได้รับใบอนุญาตสำหรับโรคลิชมาเนียในมนุษย์ แม้ว่าวัคซีนที่มีศักยภาพบางตัวจะเข้าสู่การทดลองทางคลินิกแล้ว แต่วัคซีนจำนวนมากยังอยู่ในระยะเริ่มต้นของการวิจัยและพัฒนา [4] การสร้างวัคซีนเปปไทด์เป็นงานวิจัยที่โดดเด่นและมีแนวโน้มในสาขานี้ ตรงกันข้ามกับปรสิตที่มีชีวิตทั้งหมดหรือถูกทำให้อ่อนฤทธิ์หรือวัคซีนแบบหน่วยย่อย เปปไทด์สังเคราะห์มีข้อดีหลายประการ ซึ่งรวมถึงการไม่มีวัสดุที่อาจเป็นอันตราย ลดความซับซ้อนของแอนติเจน ความเสถียรที่ดี และต้นทุนต่ำในการขยายขนาด [1, 5] การพัฒนาวัคซีนใหม่จำเป็นต้องมีข้อมูลเชิงลึกในด้านภูมิคุ้มกันวิทยา อณูชีววิทยา และวิศวกรรมเคมี ดังนั้น นักวิทยาศาสตร์ในแวดวงต่างๆ เหล่านี้จึงทำงานร่วมกันเพื่อออกแบบและผลิตวัคซีนที่ปลอดภัยและมีประสิทธิภาพ [6] วัคซีนป้องกันลิชมาเนียในอุดมคติควรสร้างภูมิคุ้มกันที่ยาวนานและมีการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่สมดุลของ TH-1 และ TH-2- [4, 7] แนวทางที่ใช้ภูมิคุ้มกันสารสนเทศในการออกแบบวัคซีนชนิดใหม่ดังกล่าวเป็นกลยุทธ์ใหม่ที่ใช้เครื่องมือคำนวณเป็นหลักในการทำนายวัคซีนเปปไทด์หลายหน่วยย่อยที่มีโครงสร้างเสถียรและสร้างภูมิคุ้มกันได้ภายในระยะเวลาอันสั้น โปรตีนที่พบว่าโดยพื้นฐานแล้วมีคุณสมบัติทางภูมิคุ้มกันที่จำเป็นสำหรับการสร้างภูมิคุ้มกันต่อโรคในการศึกษาทางภูมิคุ้มกันวิทยาก่อนหน้านี้ที่เกี่ยวข้องกับสัตว์ทดลองหรือการวิเคราะห์ซิลิโกอื่น ๆ ถือเป็นตัวเลือก epitope ที่ดีที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้ [1, 8–10] ในบรรดาโปรตีนที่อยู่ระหว่างการตรวจสอบ โปรตีน LACK (Leishmania-activated C-kinase antigen) เป็นโปรตีนที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างดีในสายพันธุ์ Leishmania และถือเป็นวัคซีนที่มีศักยภาพในการต่อต้านโรคลิชมาเนียในมนุษย์ [11] ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็นเป้าหมายสำคัญของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันในหนู BAL b/c ที่ไวต่อความรู้สึก [12] KMP-11 (โปรตีนเมมเบรนไคเนโทพลาสติด-11) มีอยู่ในโปรโตซัวไคเนโทพลาสติดทั้งหมด และยังถือเป็นตัวเลือกวัคซีนที่มีศักยภาพซึ่งแสดงให้เห็นว่าเพิ่มระดับ IL-10 ในแบบจำลองของหนู ซึ่งบ่งชี้ถึงศักยภาพในการสร้างภูมิคุ้มกันของโปรโตซัว [13]. Leishmanolysin หรือ GP63 เป็นโปรตีนโปรตีเอสบนพื้นผิวที่ได้รับการสันนิษฐานว่าเป็นปัจจัยความรุนแรงที่เกี่ยวข้องกับปฏิสัมพันธ์โดยตรงของปรสิตกับตัวรับ Macrophage ของโฮสต์ [14] โปรตีนเมมเบรน LCR1 และ GP46 ยังพบว่าเพิ่มการผลิต IFN-gamma และด้วยเหตุนี้จึงถือว่ามีประโยชน์ในการพัฒนาวัคซีนทั่วไปสำหรับการติดเชื้อ Leishmania [5, 15] โปรตีนช็อตความร้อน (HSP) เป็นโมเลกุลที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างสูงซึ่งมีภูมิคุ้มกันสูงในการกระตุ้นภูมิคุ้มกันแบบปรับตัวทั้ง MHC-I และ MHCII และคิดว่ามีบทบาทสำคัญในการพัฒนาวัคซีนต่อต้านโรคลิชมาเนียที่ติดเชื้อ [16] Leishmania hydrophilic acylated Surface Protein-B (HASP-B) แสดงออกเฉพาะในปรสิตติดเชื้อที่บ่งชี้ว่ามีบทบาทต่อความรุนแรงของปรสิต และดังนั้นจึงอาจเป็นตัวเลือกวัคซีน [17] โปรตีน Kinetoplastid parafagellar rod (PFR) ยังมีความสำคัญในการรักษาและป้องกันโรค เนื่องจากมีการกระจายเชิงวิวัฒนาการที่จำกัด มีการจัดองค์กรสูง และมีภูมิคุ้มกันสูง [18] ในทำนองเดียวกัน cysteine ​​​​โปรตีเอสและโปรตีโอฟอสโฟไกลแคนยังทำหน้าที่เป็นปัจจัยความรุนแรงที่สำคัญสำหรับปรสิตในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมและเป็นเป้าหมายยาที่น่าดึงดูดสำหรับโรคลิชมาเนีย [19–21] นอกจากนี้ ก่อนหน้านี้โปรตีนเบต้า-ทูบูลินยังมีลักษณะเป็นแอนติเจนที่กระตุ้นทีเซลล์จากลิชมาเนีย แม้ว่าจะยังไม่ได้ทดลองใช้ประสิทธิภาพในฐานะผู้สมัครรับวัคซีนก็ตาม [22] Beta-tubulin ของ L. donovani ยังถือเป็นเป้าหมายยาที่มีศักยภาพในการต่อต้านโรคลิชมาเนียในอวัยวะภายใน [23] สุดท้ายนี้ ทรานสเลชันแฟคเตอร์โปรตีน eIF5A จาก L. Brazilianiensis แสดงให้เห็นว่ากระตุ้นการป้องกันแบบต่างกันต่อโรคลิชมาเนียในสัตว์เมื่อบริหารเป็นวัคซีนร่วมกับโปรตีนรีคอมบิแนนท์อื่น เพิ่มการหลั่งของไซโตไคน์เฉพาะปรสิตในสัตว์ที่ได้รับการฉีดวัคซีน โปรตีน eIF5A ยังได้รับการอนุรักษ์ไว้ในยูคาริโอตทั้งหมด [24] ก่อนหน้านี้ Khatoon และคณะ อธิบายแนวทางที่ใช้อิมมูโนอินฟอร์มาติกในการออกแบบวัคซีนเปปไทด์หลายหน่วยย่อยเพื่อต่อต้านโรคลิชมาเนียในอวัยวะภายใน (VL) โดยการสำรวจโปรตีนที่หลั่งของ L. donovani [6] ที่นี่เราเลือกแอนติเจนของลิชมาเนียลหลายชนิดจากปรสิตสายพันธุ์ติดเชื้อต่างๆ ในเวลาเดียวกัน โปรตีนเหล่านี้ทั้งหมดได้รับการระบุแล้ว (ไม่ว่าจะจากการศึกษาในสัตว์ทดลองในหลอดทดลองหรือโดยการใช้เครื่องมือคำนวณ) เพื่อกระตุ้นการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกัน กระตุ้นภูมิคุ้มกันในการป้องกัน ลำดับโปรตีนที่เลือกเป็นของลิชมาเนียที่ทำให้เกิดโรคห้าสายพันธุ์ ได้แก่ Leishmania major, Leishmania Mexicana, Leishmania donovani, Leishmania chagasi และ Leishmania amazons โดยในจำนวนนี้ L. donovani เป็นปรสิตหลักที่ทำให้เกิดโรคลิชมาเนียในอวัยวะภายใน (VL) ในขณะที่ ส่วนอื่นๆ มีหน้าที่หลักในการทำให้เกิดโรคผิวหนัง (CL) หรือโรคลิชมาเนียทางผิวหนัง (MCL) เหตุผลที่อยู่เบื้องหลังการเลือกโปรตีนอนุรักษ์และภูมิคุ้มกันที่หลากหลายดังกล่าวในลิชมาเนียสายพันธุ์ต่างๆ คือการออกแบบวัคซีนเปปไทด์ทั่วไปที่จะให้ภูมิคุ้มกันข้ามในวงกว้างต่อโรคลิชมาเนียทั้งสองรูปแบบ (VL และ CL) ที่มักส่งผลกระทบต่อมนุษย์ .

สมุนไพร cistanche ทำอะไร—ต่อต้าน-อักเสบ

วัสดุและวิธีการ

การคัดเลือกและการดึงลำดับโปรตีนแอนติเจนของลิชมาเนีย

ลำดับกรดอะมิโนที่สมบูรณ์ของโปรตีนแอนติเจนที่จำเพาะต่อลิชมาเนีย 12 ชนิดถูกดึงมาจากฐานข้อมูล Uniprot (Universal Protein Resource) (https://www.unipr ot.org/uniprot/) ในรูปแบบ FASTA (เข้าถึงได้เมื่อวันที่ 21{{16} }3.2022) ตามที่ระบุไว้ก่อนหน้านี้ โปรตีนเหล่านี้ทั้งหมดได้รับการรายงานว่าเป็นผู้สมัครรับวัคซีนที่สร้างภูมิคุ้มกัน อนุรักษ์ไว้สูง และมีศักยภาพ ดังที่พบในการศึกษาทางภูมิคุ้มกันวิทยาก่อนหน้านี้ที่เกี่ยวข้องกับแบบจำลองสัตว์หรือการคำนวณในวิธีการทำนายซิลิโก แอนติเจนของโปรตีนที่เลือกถูกคำนวณโดยใช้เซิร์ฟเวอร์ ANTIGENpro (// scratch.proteomics.ics.uci.edu/) ที่คำนวณแอนติเจนของลำดับโปรตีนอินพุตโดยการใช้ประโยชน์จากลักษณนามสองขั้นตอนที่ใช้ SVM ที่ได้รับการตรวจสอบโดยสิบเท่า วิธีการตรวจสอบความถูกต้องข้าม [25] จากนั้นโปรตีนจะถูกวิเคราะห์ด้วยสัญญาณเปปไทด์โดยใช้เซิร์ฟเวอร์ SignalP 4.1 (SignalP—4.1— บริการ — DTU Health Tech) เพื่อแยกแยะระหว่างโปรตีนที่หลั่งแบบคลาสสิกและโปรตีนที่ไม่หลั่ง (เมมเบรน) วิธีการนี้รวมการทำนายตำแหน่งที่แตกแยกและการทำนายเปปไทด์สัญญาณ/เปปไทด์ที่ไม่ใช่สัญญาณโดยอิงจากการรวมกันของโครงข่ายประสาทเทียมหลายอัน [26] การคาดการณ์การแปลสำหรับโปรตีนทั้งหมดจะดำเนินการต่อไปโดยใช้ DeepLoc (DeepLoc—1.0—บริการ—DTU Health Tech) ซึ่งเป็นอัลกอริธึมที่ไม่มีเทมเพลตที่ใช้โครงข่ายประสาทเทียมระดับลึกเพื่อทำนายการแปลโปรตีนในระดับเซลล์ย่อยโดยใช้ข้อมูลลำดับเท่านั้น ซึ่งบรรลุความแม่นยำที่ดี [27] ลำดับโปรตีนเชิงฟังก์ชันทั้งหมดที่ได้รับจากเซิร์ฟเวอร์ SignalP 4.1 จะถูกนำไปทำนายการมีอยู่ของตัวกำหนดแอนติเจน (เอพิโทป) ที่จะรับรู้โดยตัวรับบีและทีเซลล์ สิ่งนี้ถูกทำเพื่อให้แน่ใจว่าโครงสร้างวัคซีนที่ได้รับการออกแบบประกอบด้วยทีเซลล์และอีพิโทปเซลล์บีที่มีภูมิคุ้มกันโดดเด่นเท่านั้น และดังนั้น จะสามารถขับเคลื่อนการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่มีประสิทธิผลที่เกี่ยวข้องกับวิถีทางทางร่างกายและทางเซลล์ที่มีสื่อกลางของกลไกภูมิคุ้มกัน

การทำนายอีพิโทปของ Cytotoxic T lymphocyte (CTL)

การทำนายอีพิโทปของ cytotoxic T lymphocyte (CTL) เป็นส่วนสำคัญในการออกแบบเปปไทด์ในอุดมคติ [28] เว็บเซิร์ฟเวอร์ที่เข้าถึงได้ฟรี ได้แก่ NetCTL1.2 (//www. cbs.dtu.dk/services/NetCTL) ถูกนำมาใช้เพื่อทำนาย epitopes CTL สำหรับโปรตีนที่เลือกทั้งหมด วิธีการนี้ผสมผสานการทำนายการจับเปปไทด์ MHC คลาส I, ความแตกแยกที่ปลายโปรตีโอโซมอล C และประสิทธิภาพการขนส่ง TAP [29] ซึ่งทั้งหมดนี้ถือเป็นคุณลักษณะสำคัญที่ลำดับของอีพิโทปที่จับกับ CTL ควรมี เซิร์ฟเวอร์อนุญาตให้คาดการณ์อีพิโทป CTL ที่จำกัดไว้ที่ซูเปอร์ไทป์ MHC คลาส I 12 รายการ โดยในจำนวนนี้ใช้ซูเปอร์ไทป์ A1 เท่านั้นสำหรับการศึกษาปัจจุบัน การเชื่อมโยง MHC คลาส I และความแตกแยกของโปรตีโอโซมอลดำเนินการโดยใช้โครงข่ายประสาทเทียม ประสิทธิภาพการขนส่ง TAP คาดการณ์โดยใช้เมทริกซ์น้ำหนัก [29] ลำดับที่มีคะแนนการจับที่สูงกว่าถูกพิจารณาว่าเป็นอีพิโทป CTL ที่มีศักยภาพ นอกเหนือจาก NetCTL 1.2 แล้ว ยังมีแนวทางบนเว็บเซิร์ฟเวอร์ที่เปิดเผยต่อสาธารณะอีกวิธีหนึ่ง นั่นคือ SYFPEITHI (http://www. syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm) ด้วยเช่นกัน สำหรับการทำนาย CTL epitopes จาก โปรตีนลิชมาเนียที่เลือกทั้งหมด การคาดการณ์ขึ้นอยู่กับลวดลายที่เผยแพร่ และพิจารณากรดอะมิโนในตำแหน่งพุกและตำแหน่งพุกเสริม และกรดอะมิโนที่พบบ่อยอื่นๆ [30] จากรายการประเภท MHC ที่ให้ไว้ในเซิร์ฟเวอร์นี้ HLA-A*01, HLA-A*02:01 และ HLA-A*03 ได้ถูกเลือกไว้สำหรับการทำนาย การค้นหาอีพิโทปถูกระบุสำหรับลำดับโนนาเมอร์สำหรับการเปรียบเทียบแบบสม่ำเสมอกับผลลัพธ์ที่กำหนดโดยเซิร์ฟเวอร์ NetCTL 1.2 เฉพาะอีพิโทปทั่วไปจากโปรตีนแต่ละตัว (ถ้ามี) ซึ่งได้รับการทำนายโดยทั้งเซิร์ฟเวอร์ NetCTL 1.2 และ SYFPEITHI ที่มีคะแนนที่สูงกว่าที่เข้ากันได้เท่านั้นที่ถูกเลือกสำหรับโครงสร้างวัคซีนขั้นสุดท้าย

การทำนายอีพิโทปของเฮลเปอร์ทีลิมโฟไซต์ (HTL)

Helper T lymphocytes เป็นเซลล์ภูมิคุ้มกันที่สำคัญที่สุด เนื่องจากจำเป็นสำหรับการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันแบบปรับตัวทุกประเภท การทำนายอีพิโทป HTL (ส่วนใหญ่เป็นประเภท Th-1) ดังนั้น จึงกลายเป็นองค์ประกอบสำคัญสำหรับการออกแบบวัคซีนเปปไทด์ที่มีประสิทธิผล ในการศึกษาปัจจุบัน เครื่องมือวิเคราะห์ MHC-IIbinding ในเซิร์ฟเวอร์ IEDB (ฐานและการวิเคราะห์ Immuno Epitope Datan) (http://tools.iedb.org/mhcii/) ถูกนำมาใช้เพื่อการทำนาย 15-mer HTL เอพิโทปสำหรับชุดของอัลลีลของมนุษย์สามชุด ได้แก่ HLA-DRB1*01:01, HLADRB1*01:02 และ HLA-DRB1*01:03 อัลลีล HLA ของมนุษย์ถูกเลือกเพื่อการประมาณค่าสัมพรรคภาพการจับ MHC-II ของอีพิโทปที่สมจริงยิ่งขึ้น ในขณะที่วัคซีนได้รับการออกแบบเพื่อต่อต้านโรคลิชมาเนียในมนุษย์ เอาต์พุตที่คาดการณ์ไว้จะได้รับในหน่วยของ IC50nM สำหรับไลบรารีแบบรวมและการจัดตำแหน่ง SMM ดังนั้นตัวเลขที่ต่ำกว่าบ่งบอกถึงความสัมพันธ์ที่สูงกว่า วิธีการทำนายที่แนะนำของ IEDB ถูกใช้ในแนวทางนี้โดยที่อันดับที่ถูกปรับต่ำบ่งชี้ถึงตัวจับ MHC-II ที่เหมาะสม และด้วยเหตุนี้จึงสามารถกำหนดเป็นอีพิโทป HTL ที่มีศักยภาพ

การจำแนกและการเลือกเอพิโทป HT ที่กระตุ้นไซโตไคน์

ไซโตไคน์มีความสำคัญอย่างมากต่อการทำงานที่เหมาะสมของระบบภูมิคุ้มกัน แบตเตอรี่ของไซโตไคน์ เช่น IL-2, IL-4, IL-6 และอินเตอร์เฟอรอน สามารถกระตุ้นให้เกิดการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันทั้งที่เป็นสื่อกลางของ CTL และทางร่างกาย [31] ดังนั้น อีพิโทป HTL ที่สามารถกระตุ้นการผลิตไซโตไคน์จึงเหมาะกว่าสำหรับการออกแบบวัคซีนป้องกันโรคภูมิคุ้มกัน ด้วยมุมมองนี้ เซิร์ฟเวอร์ IFNepitope (//crdd.osdd.net/raghava/ ifnepitope/) ถูกนำมาใช้เพื่อระบุตัวตนของ HTL epitopes ที่มีความสามารถในการกระตุ้นไซโตไคน์ IFNepitope เป็นเซิร์ฟเวอร์การทำนายแบบออนไลน์ที่มีจุดมุ่งหมายเพื่อทำนายเปปไทด์จากลำดับโปรตีนที่สามารถกระตุ้นแกมมา IFN ที่ปล่อยออกมาจากทีเซลล์ CD4+ เว็บเซิร์ฟเวอร์ได้รับการพัฒนาบนพื้นฐานของชุดข้อมูลที่ประกอบด้วยตัวประสาน MHC class II ที่กระตุ้นด้วยแกมมาและไม่เหนี่ยวนำ IFN [32] อีพิโทป HTL ที่ทำนายโดยเซิร์ฟเวอร์ IEDB ที่มีสัมพรรคภาพการจับ MHC-II ที่สูงกว่า (อันดับที่ถูกปรับที่ต่ำกว่า) ถูกจัดให้มีไว้เป็นข้อมูลนำเข้าเพื่อตรวจสอบความสามารถในการผลิตไซโตไคน์ของพวกมันโดยเซิร์ฟเวอร์ IFNepitope จากนั้นอีพิโทปที่ถูกระบุจึงถูกนำไปวิเคราะห์ในระดับถัดไปโดยเซิร์ฟเวอร์ IL4pred (IFNepitope(iiitd.edu.in) และโดยเซิร์ฟเวอร์ IL10Pred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/il10pred/predict3) .php) เพื่อให้แน่ใจว่าอีพิโทป HTL ที่เลือกจะกระตุ้นการคัดหลั่งของ IL-4 และ IL-10 ตามลำดับ นอกจากนี้ยังพิจารณาการอนุรักษ์ตำแหน่งของเรซิดิวกรดอะมิโนและองค์ประกอบของกรดอะมิโนของ เปปไทด์เพื่อการทำนายที่แม่นยำยิ่งขึ้น [33, 34] เอพิโทป HTL ที่มีผลผูกพันกับ MHC-II ที่คาดการณ์ว่าจะมีค่าเป็นบวกโดยเซิร์ฟเวอร์ทั้งสามเครื่องได้รับการคัดเลือกเพื่อนำมารวมไว้ในโครงสร้างวัคซีนขั้นสุดท้าย กลยุทธ์นี้ถูกนำมาใช้เพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพของวัคซีนเนื่องจากสามารถกระตุ้นได้ การตอบสนองที่รุนแรงที่เกี่ยวข้องกับไซโตไคน์หลากหลายชนิด (IFN-แกมมา, IL-4 และ IL-10) นำไปสู่การสร้างภูมิคุ้มกันที่รวดเร็วและยาวนาน

การวิเคราะห์การอนุรักษ์เอพิโทป

Epitope conservation analysis becomes essential to check whether the chosen epitope(s) is conserved across different species of Leishmania proteins. Designing a subunit vaccine consisting of conserved epitopes offers a promising scope for broad-spectrum protective immunity against leishmaniasis. Conservation analysis for each of the selected CTL and HTL epitopes was done by using the IEDB "Epitope Conservation Analysis" tool available within the IEDB portal (http://tools.iedb.org/conservancy/). This tool calculates the degree of conservation of the target epitope (e) within a set of homologous protein sequences (P) as the fraction of {p} that matched the aligned e above the chosen identity level while considering that the target epitope is sequential [35]. Firstly, the corresponding source proteins from which the CTL and HTL epitopes were finally selected were subjected to a BLAST search, for which we used the Uniprot BLAST tool (https://www.uniprot.org/blast/). From the BLAST result, the aligned protein sequences (belonging to the genus Leishmania) that showed significantly high similarity with the query sequence (>40%) were selected. Such sequences were compiled to constitute an epitope-specific dataset, and the same was provided as the input set of proteins (P) to be used for conservation analysis by the tool. Next, the sequences for selected CTL and HTL epitopes were screened individually against their respective datasets that revealed the relative conservation of the epitopes across a set of related Leishmania proteins. The threshold identity level was set at>100% (ค่าเริ่มต้น)

การออกแบบลำดับวัคซีนหลายเอพิโทป

จากการวิเคราะห์ทางอิมมูโนอินฟอร์มาติก ลำดับปฐมภูมิของวัคซีนหน่วยย่อยถูกสร้างขึ้นโดยการรวมลำดับเอพิโทป CTL และ HTL ที่เลือกไว้ เอพิโทปเหล่านี้ถูกเชื่อมโยงเข้าด้วยกันโดยตัวเชื่อมโยง AAY และ GPGPG ตามลำดับ [28, 31] มีการใส่ตัวเชื่อมโยงเพื่อแยกอีพิโทปแต่ละตัวอย่างเหมาะสมซึ่งจำเป็นต่อการทำงานที่มีประสิทธิภาพของโครงสร้างของวัคซีน [28, 36] ประการที่สอง การเติมสารเสริมที่เหมาะสมเป็นสิ่งสำคัญในวัคซีนหน่วยย่อยเพื่อเพิ่มการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน [31] การเลือกสารเสริมที่เหมาะสมเป็นสิ่งสำคัญในการออกแบบวัคซีนสำหรับการทดลองในมนุษย์ IL-12 ที่ผลิตโดยเซลล์ภูมิคุ้มกันต่างๆ มีความสำคัญในการพัฒนาภูมิคุ้มกันโดยอาศัยเซลล์เพื่อต่อต้านโรคลิชมาเนีย และศักยภาพของ IL-12 ที่เป็นสารเสริมในวัคซีนป้องกันโรคลิชมาเนียได้รับการรายงานในแบบจำลองของหนู [3, 37, 38]. IL-12 นี้ได้รับเลือกเป็นส่วนเสริมสำหรับการออกแบบวัคซีน และลำดับของสิ่งเดียวกันนี้รวมอยู่ในส่วนปลาย N ของโครงสร้างวัคซีนโดยใช้ตัวเชื่อมโยง EAAK [28, 31] ลำดับของสายอัลฟา IL-12 ของมนุษย์ถูกดึงมาจากฐานข้อมูล Uniprot (www.uniprot.org; หมายเลขทะเบียน P29459) ในที่สุด โครงสร้างวัคซีนเปปไทด์ได้รับมาโดยมีสารเสริม, ตัวเชื่อมโยง, อีพิโทป CTL และอีพิโทป HTL (ที่มีตัวเชื่อมโยง AAY และ GPGPG ภายในอีพิโทป) ในลำดับที่ย้ายจากปลาย N ไปยังปลาย C

การทำนายอีพิโทปเซลล์บีเชิงโครงสร้างและเชิงเส้น

ภูมิคุ้มกันของร่างกายเกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์และการหลั่งแอนติบอดีจำเพาะโดยเซลล์ B ที่ถูกกระตุ้น ซึ่งจำเป็นต้องมีปัจจัยกำหนดแอนติเจนที่รับรู้โดยตัวรับเซลล์ B ที่ปรากฏบนพื้นผิวของเม็ดเลือดขาวลิมโฟไซต์ วัคซีนเปปไทด์ป้องกันภูมิคุ้มกันในอุดมคติควรมีส่วนประกอบดังกล่าวเพื่อโต้ตอบและกระตุ้นเซลล์บี ดังนั้น จึงมีการใช้เซิร์ฟเวอร์สองตัว ได้แก่ ABCpred และ BepiPred 2.0 สำหรับการทำนายที่แม่นยำของอีพิโทปของเซลล์บีในลำดับปฐมภูมิของวัคซีนที่ออกแบบ เซิร์ฟเวอร์ ABCpred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/ abcpred/ABC_submission.html) เป็นแนวทางที่ใช้โครงข่ายประสาทเทียม (ANN) ซึ่งทำนายเอพิโทปของเซลล์บีในลำดับแอนติเจนที่กำหนดโดยใช้ พารามิเตอร์ความยาวคงที่ ชุดข้อมูลการฝึกที่ใช้ในวิธีนี้ประกอบด้วยบีเซลล์เอพิโทปจากฐานข้อมูลบีเซลล์เอพิโทป (BCIPEP) เซิร์ฟเวอร์สามารถทำนายเอพิโทปด้วยความแม่นยำ 65.93% โดยใช้โครงข่ายประสาทที่เกิดซ้ำ [39] ลำดับปฐมภูมิของโครงสร้างวัคซีนขั้นสุดท้ายถูกจัดเตรียมไว้เป็นอินพุตในรูปแบบธรรมดา และใช้พารามิเตอร์เริ่มต้นของเซิร์ฟเวอร์ ABCpred รวมถึงค่าเกณฑ์ที่ 0.51 ที่มีความยาวหน้าต่างเท่ากับกรดอะมิโนตกค้าง 16 ตัว ถูกนำมาใช้สำหรับ การทำนาย ในทางกลับกัน เซิร์ฟเวอร์ BepiPred 2.0 (BepiPred—2.0—บริการ—DTU Health Tech) ทำนายอีพิโทปของเซลล์ B ตามลำดับจากลำดับอินพุตโดยอัลกอริธึมฟอเรสต์แบบสุ่มที่ได้รับการฝึกบนอีพิโทปและ กรดอะมิโนที่ไม่ใช่อีพิโทปที่กำหนดจากโครงสร้างผลึกตามด้วยการทำนายแบบต่อเนื่องที่ราบรื่น [40] ลำดับปฐมภูมิของวัคซีนถูกจัดเตรียมไว้ในรูปแบบ FASTA เป็นอินพุต การใช้เซิร์ฟเวอร์ที่แตกต่างกันสองเครื่องที่ทำนายเอพิโทปของบีเซลล์โดยใช้อัลกอริธึมที่แตกต่างกันสองชุด ทำให้การทำนายสมจริงมากขึ้น ปัจจัยกำหนดแอนติเจนส่วนใหญ่ที่รับรู้โดยตัวรับบีเซลล์และแอนติบอดีนั้นไม่ต่อเนื่องกัน ซึ่งหมายความว่าพวกมันมีกรดอะมิโนตกค้างซึ่งอยู่ห่างไกลในโครงสร้างปฐมภูมิของอิมมูโนเจน แต่ถูกนำมาติดกันระหว่างการพับของโปรตีน [41] การทำนายอีพิโทปของเซลล์บีที่ไม่ต่อเนื่องดังกล่าวในโครงสร้างตติยภูมิที่ได้รับการตรวจสอบแล้วของวัคซีนดำเนินการโดยใช้เซิร์ฟเวอร์ ElliPro (//tools.iedb.org/ellip ro/) ที่รวมอยู่ในพอร์ทัล IEDB ElliPro เป็นเครื่องมือบนเว็บที่เข้าถึงได้โดยอิสระ ซึ่งใช้วิธีการของ Thronton ที่ได้รับการดัดแปลง และคำนึงถึงจุดศูนย์กลางมวลของแต่ละสารตกค้าง แทนที่จะเป็นอะตอม C การดำเนินการดังกล่าวเชื่อมโยงแต่ละอีพิโทปกับคะแนนที่กำหนดซึ่งกำหนดเป็น PI (ดัชนีส่วนที่ยื่นออก) โดยเฉลี่ยเหนือเรซิดิวของอีพิโทป อีพิโทปที่ไม่ต่อเนื่องถูกกำหนดหาตามค่า PI ที่เกี่ยวข้องและจัดกลุ่มตามระยะห่างระหว่างจุดศูนย์กลางมวล (R) ของเรซิดิว ค่า R ที่มากขึ้นมีความสัมพันธ์กับเอพิโทปที่ไม่ต่อเนื่องที่มีนัยสำคัญมากขึ้นซึ่งถูกทำนายไว้ [42] ในเวลาเดียวกัน อีพิโทปเซลล์บีเชิงเส้นในแบบจำลองโปรตีนอินพุตยังสามารถทำนายและแสดงภาพได้โดยใช้ ElliPro การตรวจหาอีพิโทปบีเซลล์ทั้งเชิงเส้นและไม่ต่อเนื่องในแบบจำลอง 3 มิติที่ได้รับการปรับปรุงของวัคซีน ช่วยให้มั่นใจได้ว่ากลยุทธ์การออกแบบวัคซีนจะประสบความสำเร็จ

โปรไฟล์ของแอนติเจน ภูมิแพ้ และความเป็นพิษของโครงสร้างวัคซีน

แอนติเจนเป็นเกณฑ์สำคัญสำหรับวัคซีนป้องกันภูมิคุ้มกัน เพื่อให้แน่ใจว่าโครงสร้างวัคซีนที่ได้รับการออกแบบจะกระตุ้นให้เกิดการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่ยาวนานโดยการโต้ตอบกับตัวรับเซลล์ B และ T มีการประเมินแอนติเจนของสิ่งเดียวกันโดยใช้เซิร์ฟเวอร์ ANTIGENpro และ VaxiJen 2.0 เซิร์ฟเวอร์ ANTIGENpro (http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/) แยกประเภทแอนติเจนป้องกันที่รู้จักได้อย่างถูกต้อง 82% เมื่อฝึกโดยใช้ชุดข้อมูลโปรตีนไมโครอาร์เรย์เท่านั้น ความแม่นยำของชุดข้อมูลที่รวมกันนั้นประมาณไว้ที่ 76% โดยการทดลองตรวจสอบความถูกต้องข้ามสิบเท่า ซึ่งช่วยให้สามารถจดจำเปปไทด์แอนติเจนได้ดีขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ ทำงานบนสถาปัตยกรรมสองขั้นตอน รวมถึงตัวแยกประเภทขั้นตอนที่สองที่ใช้ SVM สำหรับลำดับโปรตีนอินพุตใหม่ ความน่าจะเป็นที่คำนวณโดยตัวทำนาย SVM ระยะที่สองคือคะแนนการทำนาย ANTIGENpro สุดท้าย [25] VaxiJen20 (http://www. dog-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html) เป็นเว็บเซิร์ฟเวอร์อีกเครื่องหนึ่งที่เข้าถึงได้แบบสาธารณะ ซึ่งจะประเมินแอนติเจนของลำดับโปรตีนโดยแนวทางที่ไม่มีการจัดตำแหน่งซึ่งมีพื้นฐานมาจาก เกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงความแปรปรวนร่วมร่วมอัตโนมัติ (ACC) ของลำดับโปรตีนไปเป็นเวกเตอร์ที่สม่ำเสมอของคุณสมบัติกรดอะมิโนหลัก และช่วยให้การจำแนกประเภทแอนติเจนขึ้นอยู่กับคุณสมบัติทางเคมีกายภาพต่างๆ ของโปรตีนเท่านั้น โดยไม่อ้างอิงถึงการจัดลำดับ [43] ประการที่สอง เพื่อขจัดความเป็นไปได้ใดๆ ที่โครงสร้างของวัคซีนอาจกระตุ้นให้เกิดการตอบสนองต่อการแพ้ในแต่ละบุคคล จึงมีการใช้เซิร์ฟเวอร์ AlgPred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/algpr ed/submission.html) เพื่อ กำหนดความเป็นภูมิแพ้ เครื่องมือเซิร์ฟเวอร์นำเสนอแนวทางที่หลากหลาย รวมถึงการแมปของ IgE เอพิโทป, โมทีฟ MEME/MAST, วิธี SVM ที่อิงตามองค์ประกอบของไดเปปไทด์ และ BLAST ARP ซึ่งทั้งหมดนี้ถูกนำมาใช้เพื่อการทำนายที่แม่นยำ เกณฑ์กำหนดไว้ที่ 0.4 (ค่าเริ่มต้น) เพื่อความแม่นยำในการทำนายที่สูงขึ้น นอกจากนี้ AllerTop v.2.{{20}} (https://www. dog-pharmfac.net/AllerTOP/index.html) ซึ่งเป็นเครื่องมือบนเว็บเซิร์ฟเวอร์ที่เข้าถึงได้โดยอิสระก็ถูกนำมาใช้เช่นกัน เพื่อยืนยันลักษณะที่ไม่ทำให้เกิดอาการแพ้ของโครงสร้างวัคซีน วิธีการนี้ขึ้นอยู่กับการเปลี่ยนแปลงความแปรปรวนร่วมอัตโนมัติ (ACC) ของลำดับโปรตีนให้เป็นเวกเตอร์ที่มีความยาวเท่ากันสม่ำเสมอ มันถูกนำไปใช้กับการศึกษาความสัมพันธ์เชิงปริมาณโครงสร้าง-กิจกรรม (QSAR) ของเปปไทด์ที่มีความยาวต่างกัน และโปรตีนถูกจำแนกประเภทโดยอัลกอริธึมเพื่อนบ้าน k ใกล้ที่สุด [44] ทำนายความเป็นพิษ (ถ้ามี) โดยใช้เซิร์ฟเวอร์ ToxinPred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxicpred/prote in.php) เครื่องมือคาดการณ์นี้ทำงานโดยใช้เทคนิคการเรียนรู้ของเครื่องและวิธีการเชิงปริมาณที่ได้รับการฝึกอบรมบนชุดข้อมูลของเปปไทด์ที่เป็นพิษและไม่เป็นพิษต่างๆ ที่ได้รับจาก SwissProt และ TreEMBL [45] การทำโปรไฟล์ความเป็นพิษเป็นสิ่งสำคัญในการประเมินความปลอดภัยของวัคซีนและเปปไทด์ภูมิคุ้มกันบำบัดอื่นๆ ที่มีไว้สำหรับการทดลองในมนุษย์ การวิเคราะห์ดำเนินการโดยการเลือกวิธีการที่ใช้ SVM (TrEMBL)+motif ที่เกณฑ์ค่า E ที่ 10.0 สำหรับวิธีการที่ใช้ motif และเกณฑ์ SVM ที่ 0.1

การประเมินคุณสมบัติทางเคมีกายภาพ

การอธิบายคุณสมบัติทางกายภาพและเคมีของไคเมอริกเปปไทด์มีความสำคัญ เนื่องจากเมื่อฉีดเป็นวัคซีน ก็ควรจะสามารถกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่เหมาะสมได้ เซิร์ฟเวอร์ ProtParam ที่ใช้งานได้กับพอร์ทัล ExPASY (ระบบวิเคราะห์โปรตีนโดยผู้เชี่ยวชาญ) (https://web.expasy.org/ program/) ถูกนำมาใช้เพื่อคำนวณพารามิเตอร์เคมีกายภาพต่างๆ ของโครงสร้างวัคซีนหลักที่รวมคุณลักษณะต่างๆ เช่น น้ำหนักโมเลกุล pI ทางทฤษฎี ดัชนีความไม่แน่นอน ดัชนีอะลิฟาติก ครึ่งชีวิตในร่างกายและในหลอดทดลอง ค่าเฉลี่ยแกรนด์ของความไม่ชอบน้ำ (GRAVY) และอื่นๆ

การทำนายโครงสร้างทุติยภูมิของเปปไทด์วัคซีน

องค์ประกอบโครงสร้างรองของโครงสร้างวัคซีนที่ออกแบบถูกทำนายโดยการใช้เซิร์ฟเวอร์ PSIPRED (//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) และเซิร์ฟเวอร์คุณสมบัติ RaptorX (//raptorx.uchicago.edu/StructurePropertyPred/ ทำนาย/) ซึ่งทั้งสองอย่างนี้เป็นเซิร์ฟเวอร์วิเคราะห์โครงสร้างโปรตีนออนไลน์ที่เข้าถึงได้ฟรี ลำดับปฐมภูมิของเปปไทด์วัคซีนมีไว้เป็นข้อมูลนำเข้า PSIPRED ทำนายโครงสร้างรองของลำดับโปรตีนอินพุตโดยการใช้ประโยชน์จากโครงข่ายประสาทเทียมแบบฟีดไปข้างหน้าสองตัวที่ทำงานโดยอิงตามเมทริกซ์การให้คะแนนเฉพาะตำแหน่ง (PSSM) ที่สร้างโดย PSI-BLAST [46] โดยจะรวมการระบุลำดับที่คล้ายคลึงกับโครงสร้างวัคซีนของเราโดย PSI-BLAST ตามด้วยการสร้าง PSSM PSIPRED 3.2 และเวอร์ชันที่สูงกว่าพบว่ามีคะแนนเฉลี่ย Q3 ที่ 81.6% เมื่อประเมินโดยวิธีตรวจสอบความถูกต้องแบบสามเท่าที่เข้มงวด ซึ่งทำให้แนวทางนี้มีความแม่นยำและแม่นยำอย่างมาก เว็บเซิร์ฟเวอร์คุณสมบัติ RaptorX ใช้เทคนิคการเรียนรู้ของเครื่องล่าสุดที่เรียกว่า DeepCNF (สนามประสาทเชิงลึก) สำหรับการทำนายคุณสมบัติต่างๆ เช่น โครงสร้างรอง การเข้าถึงตัวทำละลาย และภูมิภาคที่ไม่เป็นระเบียบพร้อมกัน DeepCNF เป็นวิธีการบูรณาการที่รวมเอาทั้งฟิลด์สุ่มแบบมีเงื่อนไข (CRF) และโครงข่ายประสาทเทียมแบบตื้นที่สร้างแบบจำลองความสัมพันธ์ของโครงสร้างลำดับที่ซับซ้อนโดยสถาปัตยกรรมแบบลำดับชั้นเชิงลึก และสามารถรับความแม่นยำประมาณ 84% ของ Q3 สำหรับ 3-โครงสร้างรองของคลาส [47] .

การทำนายโครงสร้างระดับอุดมศึกษา

โครงสร้างระดับตติยภูมิของเปปไทด์วัคซีนขั้นสุดท้ายถูกทำนายโดยใช้เว็บเซิร์ฟเวอร์ออนไลน์ I-TASSER (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/) I-TASSER เป็นวิธีการสร้างแบบจำลองโครงสร้างโปรตีนแบบลำดับชั้นโดยอิงจากการจัดตำแหน่งเกลียวโปรไฟล์-โปรไฟล์ (PPA) และการจำลองการประกอบโครงสร้างแบบวนซ้ำ ตามด้วยการปรับแต่งโครงสร้างระดับอะตอม โดยทำงานในสามขั้นตอน: การระบุเทมเพลตโครงสร้าง การประกอบโครงสร้างซ้ำ และคำอธิบายประกอบฟังก์ชันตามโครงสร้าง แบบจำลองโครงสร้างที่ได้รับการจัดอันดับสูงสุดพร้อมการประมาณความแม่นยำระดับโลกและระดับท้องถิ่นจะถูกส่งกลับมาพร้อมกับคะแนน C-score และคะแนน TM ที่เป็นตัวแทน ซึ่งมีความสัมพันธ์กับคุณภาพของแบบจำลองที่คาดการณ์ไว้ โปรแกรม I-TASSER เป็นหนึ่งในวิธีที่ประสบความสำเร็จมากที่สุดซึ่งแสดงให้เห็นใน CASP สำหรับการทำนายโครงสร้างและการทำงานของโปรตีนโดยอัตโนมัติ [48, 49]

การปรับปรุงโครงสร้างตติยภูมิวัคซีน

การสร้างแบบจำลองทางคอมพิวเตอร์แบบดั้งเดิมของโครงสร้างโปรตีนเพียงอย่างเดียวไม่รับประกันความถูกต้องและความแม่นยำของแบบจำลองที่คาดการณ์ไว้ เนื่องจากกลยุทธ์การสร้างแบบจำลองดังกล่าวส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับระดับความน่าจะเป็นของอินพุต (เป้าหมาย) ด้วยโครงสร้างเทมเพลตที่มีอยู่ การปรับปรุงคุณภาพของแบบจำลองตามเทมเพลตที่เหนือกว่าความแม่นยำจึงคิดว่ามีความจำเป็น และสามารถทำได้โดยการปรับแต่งโครงสร้างโปรตีนทั้งหมด ด้วยมุมมองนี้ โมเดลสามมิติที่ส่งออกจากเซิร์ฟเวอร์ I-TASSER ที่มีคะแนน C ที่ดีที่สุดจะต้องได้รับการปรับปรุงเพิ่มเติมโดยเซิร์ฟเวอร์ GalaxyRefne (//galaxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi?type{ {4}} ปรับแต่ง) เป็นวิธีการปรับแต่งที่ผ่านการทดสอบโดย CASP10- โดยโซ่ข้างโปรตีนจะถูกสร้างขึ้นใหม่ก่อน จากนั้นจึงบรรจุใหม่โซ่ด้านข้างและการผ่อนคลายโครงสร้างโดยรวมจะดำเนินการโดยการจำลองไดนามิกของโมเลกุล สิ่งนี้นำไปสู่การปรับปรุงโครงสร้างโปรตีนเป้าหมายทั้งในระดับท้องถิ่นและระดับโลกอย่างแม่นยำ [50]

ประโยชน์ของอาหารเสริม Cistanche—ต่อต้าน-อักเสบ

การตรวจสอบความถูกต้องของโครงสร้างตติยภูมิวัคซีน

โครงสร้างระดับตติยภูมิที่ได้รับการปรับปรุงของวัคซีนจำเป็นต้องได้รับการตรวจสอบเพื่อระบุข้อผิดพลาดที่อาจเกิดขึ้นในแบบจำลอง 3 มิติที่คาดการณ์ไว้ โมเดลที่ได้รับการปรับปรุงที่ได้รับจากเซิร์ฟเวอร์ GalaxyRefne ได้รับการจัดเตรียมไว้เป็นโครงสร้างอินพุตในรูปแบบ a.pdb นอกจากนี้ พล็อตเรื่องรามจันทรันยังเป็นอีกวิธีที่มีประโยชน์มากในการแสดงภาพบริเวณไดฮีดรัลของ phi (ϕ) และ psi (ψ) ที่ได้รับอนุญาตและไม่อนุญาตอย่างกระตือรือร้นของสายโซ่ข้างกรดอะมิโนที่ถือเป็นองค์ประกอบสำคัญสำหรับการตรวจสอบความถูกต้องของโครงสร้างโปรตีน ด้วยเหตุนี้ เซิร์ฟเวอร์ MolProbity [หน้าหลัก—MolProbity (duke.edu)] จึงถูกนำมาใช้เพื่อสร้างพล็อตเรื่อง Ramachandran สำหรับแบบจำลองของวัคซีนที่กำหนดโดยอาศัยการตรวจสอบ Phenix ในรูปแบบ Python ที่ใช้ MolProbity [51] นอกจากนี้ เรายังใช้เซิร์ฟเวอร์ ERRAT [SAVESv6.0—เซิร์ฟเวอร์ตรวจสอบโครงสร้าง (UCLA.edu)] ที่วิเคราะห์สถิติของการโต้ตอบแบบไม่ผูกมัดระหว่างอะตอมต่างๆ ในแบบจำลอง และพล็อตค่าของฟังก์ชันข้อผิดพลาดเทียบกับ {{ 6}}สารตกค้างเลื่อน [52] เว็บเซิร์ฟเวอร์ ProSA (https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php) ซึ่งเป็นแพลตฟอร์มบนเว็บเชิงโต้ตอบที่ใช้โปรแกรม ProSA มาตรฐาน ถูกนำมาใช้เพื่อจุดประสงค์นี้ [53] ขั้นตอนนี้ดำเนินการเพื่อให้ได้รับการตรวจสอบโครงสร้างแบบจำลองที่ซับซ้อนและแม่นยำยิ่งขึ้น

วิศวกรรมไดซัลไฟด์ของเปปไทด์วัคซีน

พันธะไดซัลไฟด์มีส่วนทำให้โปรตีนคงตัวโดยการลดเอนโทรปีเชิงโครงสร้างลง และยังเพิ่มพลังงานอิสระของสถานะที่เสียสภาพด้วย การนำพันธะไดซัลไฟด์ชนิดใหม่มาใช้ถือเป็นเครื่องมือทางเทคโนโลยีชีวภาพที่สำคัญในการปรับปรุงความคงตัวของความร้อนของโปรตีนที่พับตามธรรมชาติ เซิร์ฟเวอร์ไดซัลไฟด์โดย Design 2 (DbD 2) v 2.12 ถูกนำมาใช้เพื่อเพิ่มความเสถียรทางโครงสร้างโดยรวมของวัคซีนที่ออกแบบโดยการแนะนำการเชื่อมโยงไดซัลไฟด์ วิธีการนี้ใช้รูปทรงเรขาคณิตดั้งเดิมและคำนวณค่าพลังงานสำหรับไดซัลไฟด์ที่เป็นไปได้แต่ละค่า ดังนั้นจึงเป็นแนวทางในการจัดอันดับพันธะไดซัลไฟด์ที่ต้องการ พันธะไดซัลไฟด์ที่ให้ความเสถียรสูงสุดคือพันธะที่มีค่า chi3 พลังงานพันธะ และแฟกเตอร์ B สูง [54] บริเวณที่ยืดหยุ่นของเปปไทด์ถูกเลือกตามพารามิเตอร์ที่กล่าวถึงก่อนหน้านี้ และการกลายพันธุ์ที่ทำให้คงตัวที่สอดคล้องกันถูกสร้างขึ้นโดยการสร้างส่วนเชื่อมต่อไดซัลไฟด์ระหว่างคู่เรซิดิวที่เลือก

การสร้างวัคซีนเชื่อมต่อระดับโมเลกุลกับตัวรับภูมิคุ้มกัน (TLR ของมนุษย์-2, 4, 5, 8 และ TLR-9 ของเมาส์)

Toll-like receptors (TLR) เป็นคุณลักษณะสำคัญของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของเซลล์ที่จดจำรูปแบบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับเชื้อโรค (PAMPs) และทำให้เกิดการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติต่อการติดเชื้อ มีการรายงานการเปิดใช้งาน TLR-2 โดยตรงด้วยส่วนประกอบของ Leishmania ในเวลาต่อมา [55] ในการศึกษาทดลองอื่นๆ ที่เกี่ยวข้อง การขาด TLR-4 ส่งผลให้ปรสิตเติบโตเพิ่มขึ้นและการรักษารอยโรคที่ผิวหนังล่าช้าซึ่งเกิดจากการติดเชื้อ L. major ซึ่งบ่งชี้ถึงบทบาทที่เป็นไปได้ของ TLR-4 ในการกระตุ้นภูมิคุ้มกันต่อเชื้อลิชมาเนีย [56 ] ในทางกลับกัน TLR-2, 4 และ 9 พบว่าเกี่ยวข้องกับสเปกตรัมทางภูมิคุ้มกันวิทยาของ CL ที่เกิดจาก L. Brazilianiensis และ L. amazonensis [57] TLR-9 ยังได้รับการประเมินว่าเป็นผู้เล่นหลักในการกระตุ้นเซลล์เดนไดรต์ในการเกิดโรคของ VL ในมนุษย์ [58] ส่วนประกอบที่ได้มาจากลิชมาเนียบางส่วนได้รับการแสดงเพื่อกระตุ้น TLR-2, 4 และ 9 ในการศึกษาส่วนใหญ่ที่ดำเนินการในสาขานี้ การสังเกตเหล่านี้เน้นย้ำถึงความจริงที่ว่า TLR ต่างๆ เกี่ยวข้องกับการกระตุ้นภูมิคุ้มกันป้องกันลิชมาเนีย ดังนั้นการทำงานร่วมกันระหว่าง TLR และโครงสร้างวัคซีนที่ออกแบบจึงถือว่ามีความจำเป็นสำหรับการกระตุ้นภูมิคุ้มกันที่มีประสิทธิภาพต่อการติดเชื้อ Leishmania สิ่งนี้ได้รับการตรวจสอบโดยการดำเนินการเชื่อมต่อโมเลกุลของเปปไทด์วัคซีนหลายอีพิโทปิกกับ TLR ของมนุษย์-2, 4, 5, 8 และ TLR ของเมาส์-9 โดยใช้เซิร์ฟเวอร์ PatchDock [เซิร์ฟเวอร์ PatchDock (tau.ac.il )]. อัลกอริธึม PatchDock มีสามขั้นตอนหลัก ได้แก่ การแสดงรูปร่างโมเลกุล การจับคู่แพทช์พื้นผิว และการกรองและการให้คะแนน เป็นอัลกอริธึมการเชื่อมต่อโมเลกุลตามเรขาคณิตที่ทำงานโดยหลักในการเสริมรูปร่างโมเลกุลระหว่างตัวรับและลิแกนด์ แพตช์เสริมจะถูกจับคู่ และสร้างการเปลี่ยนแปลงที่เป็นตัวเลือก การแปลงแต่ละครั้งจะได้รับการจัดอันดับเพิ่มเติมโดยการกำหนดฟังก์ชันการให้คะแนนที่พิจารณาทั้งพลังงานการแยกตัวของอะตอมและเรขาคณิต ฟุต [59, 60] ในการศึกษาของเรา TLR-2 ของมนุษย์ (PDB id: 6NIG), TLR-4 (PDB id: 4G8A), TLR-5 (PDB id: 3J0A) และ TLR-8 (PDB id: 4QC0) และ TLR ของเมาส์-9 (PDB id: 3WPF) ถูกเลือกเป็นตัวรับ และไฟล์ PDB ที่แยกกันของพวกมันถูกดึงมาจาก Protein DataBank (www .rcsb.org) แบบจำลอง 3 มิติที่ได้รับการปรับปรุงของเปปไทด์วัคซีนถูกใช้เป็นลิแกนด์สำหรับการจำลองการเชื่อมต่อทั้งหมด เซิร์ฟเวอร์ PatchDock ถูกตั้งค่าเป็นพารามิเตอร์เริ่มต้น (การจัดกลุ่ม RMSD: 4.0) เราวิเคราะห์โมเดลการเชื่อมต่อที่ดีที่สุดเพิ่มเติมโดยใช้เซิร์ฟเวอร์ Cluspro ตามอัลกอริธึมการหมุนเวียนพันธะที่เป็นไปได้ และประเมินพันธะโดยใช้ซอฟต์แวร์ PyMOL [61]

การเพิ่มประสิทธิภาพของโคดอน การทำนายโครงสร้าง mRNA และการโคลนซิลิโกเพื่อการแสดงออกของโปรตีนในวัคซีน

การปรับโคดอนให้เหมาะสมนั้นจำเป็นเพื่อให้ได้การแสดงออกสูงสุดของยีนแปลกปลอมในสิ่งมีชีวิตที่เป็นโฮสต์ เมื่อการใช้โคดอนโดยโฮสต์แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญจากยีนของโฮสต์ดั้งเดิมซึ่งลำดับดั้งเดิมสำหรับโครงสร้างวัคซีนขั้นสุดท้ายได้ถูกคัดออก JCat (Java Codon Adaptation Tool) ซึ่งเผยแพร่ต่อสาธารณะที่ (//www. jcat.de/) ใช้สำหรับการแปลแบบย้อนกลับและการเพิ่มประสิทธิภาพโค้ดดอนโดยจัดเตรียมลำดับหลักของโครงสร้างวัคซีนขั้นสุดท้ายเป็นอินพุต การใช้โคดอนได้รับการปรับให้เหมาะสมกับสิ่งมีชีวิตโปรคาริโอตที่มีลำดับมากที่สุด คือ E. coli K12 [6] ตัวเลือกเพิ่มเติมสามตัวเลือกที่เครื่องมือจัดให้มีไว้ถูกเลือกเพื่อหลีกเลี่ยงตัวยุติการถอดรหัสที่ไม่ขึ้นกับโร ตำแหน่งการจับไรโบโซมโปรคาริโอต และตำแหน่งการตัดแยกข้อจำกัดที่ไม่ต้องการ ดัชนีการปรับตัวของรหัส (CAI) และเนื้อหา GC ซึ่งคำนวณโดยเครื่องมือ JCat ระบุว่าการปรับให้เหมาะสมนั้นดีเพียงใด การเพิ่มประสิทธิภาพที่ดีขึ้นช่วยให้มั่นใจได้ถึงการแสดงออกของโปรตีนวัคซีนที่สูงขึ้น นอกจากนี้ ตำแหน่งจำกัดสำหรับเอนไซม์ XhoI และ NdeI ถูกรวมเข้าไว้ในลำดับ cDNA ที่ได้รับการปรับปรุงให้เหมาะสมที่จัดทำโดยเครื่องมือ JCat เพื่ออำนวยความสะดวกในการโคลนนิ่ง ลำดับที่แก้ไข (ที่มีไซต์จำกัด) จะถูกแทรกเข้าไปในเวกเตอร์พลาสมิดของ E. coli pET 28-a(+) โดยใช้โมดูลการโคลนแบบจำกัดของเครื่องมือ SnapGene [6, 31, 62, 63] ซอฟต์แวร์ SnapGene มีอยู่บนเว็บที่ (https:// www.snapgene.com/) นอกจากนี้เรายังใช้เว็บเซิร์ฟเวอร์ mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Foldi ng-Form) สำหรับการทำนายโครงสร้างรองของ mRNA ที่เข้ารหัสโดย ยีนของไคเมอริกเปปไทด์ ลำดับที่ได้รับการปรับปรุงแบบแปลกลับที่ได้รับจากเครื่องมือ JCat นั้นถูกจัดเตรียมไว้เป็นอินพุต โปรแกรม mfold ขึ้นอยู่กับอัลกอริธึมหลักที่ทำนายพลังงานอิสระขั้นต่ำ ∆ G และพลังงานอิสระขั้นต่ำสำหรับการพับที่มีคู่เบสเฉพาะใดๆ นอกจากนี้ ยังมีการใช้ข้อจำกัดการพับต่างๆ เพื่อการทำนายพลังงานการพับที่แม่นยำ พลังงานการพับสำหรับการพับ RNA ได้รับการแก้ไขที่ 37 องศา ในขณะที่สภาวะไอออนิกคงที่ที่ [Na+]=1 M และ [Mg++]=0 [64]

การจำลองภูมิคุ้มกันด้วย C‑immsim

C-immsim (https://kraken.iac.rm.cnr.it/C-IMMSIM/index.php?page=1) เป็นเครื่องมือทำนายการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันบนเซิร์ฟเวอร์ที่ใช้คลาสแบบอิงเอเจนต์ และ การทำนายของมันขึ้นอยู่กับโครงข่ายประสาทเทียม สามารถทำนายการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันทั้งทางร่างกายและทางเซลล์ได้ C-immsim ใช้แบบจำลอง Celda Seiden, โมเดล bit-string polyclonal lattice และดัชนี Simpson เพื่อระบุลักษณะการทำนายเซลล์ที่ทำงานอยู่ เซลล์หน่วยความจำ และเซลล์ความจำ ตลอดจนอายุยืนยาวของพวกมัน ช่วยในการทำนายโปรไฟล์ไซโตไคน์ของปฏิกิริยาที่กำหนดเพื่อประเมินการตอบสนองต่อการอักเสบ [65]

ผงสกัด Cistanche

การจำลองแบบไดนามิกระดับโมเลกุล

การจำลองแบบไดนามิกระดับโมเลกุลดำเนินการเพื่อประเมินความเสถียรของคอมเพล็กซ์ที่ดีที่สุดของเรา เช่น TLR ด้วยวัคซีนที่เสนอโดยใช้ iMOD (เซิร์ฟเวอร์หน้าแรกของเซิร์ฟเวอร์ iMod (csic.es) เซิร์ฟเวอร์บนเว็บนี้ใช้การวิเคราะห์โหมดปกติที่ได้รับการปรับปรุง (NMA) สำหรับการจำแนกลักษณะของคุณสมบัติไดนามิกต่างๆ ของชีวโมเลกุล เช่น ความยืดหยุ่นและความคงตัวของโปรตีน โดยอาศัยสนามแรงภายในอะตอม ในการศึกษาปัจจุบันนี้ เราได้วิเคราะห์ความผิดปกติของสายโซ่หลัก ปัจจัย B ค่าลักษณะเฉพาะ ปัจจัยความแปรปรวนร่วม และแบบจำลองเครือข่ายยืดหยุ่น เป็นพารามิเตอร์ NMA มาตรฐานสำหรับการประเมินโปรตีนเชิงซ้อนโปรตีนที่ได้จากวิธีซิลิโก [66–69]

ผลลัพธ์

การคัดเลือกและการดึงลำดับโปรตีนแอนติเจนของลิชมาเนีย

The amino acid sequences of twelve Leishmania proteins were retrieved from the Uniprot database in FASTA format and subjected to further analysis for the purpose of designing a multi-subunit peptide vaccine against leishmaniasis. These proteins were selected based on previous studies that reported them as potential vaccine candidates as evaluated in experimental animal models or in silico prediction tools. Antigenicity analysis by the ANTIGENpro server showed all the chosen proteins as potential antigens with varying degrees of antigenicity, keeping with the information obtained from literature mining. However, ten among the twelve proteins were presented with relatively higher prediction scores (>0.51) สะท้อนถึงศักยภาพที่สูงขึ้นสำหรับการออกแบบวัคซีน (ตารางที่ 1) โปรตีนถูกจำแนกว่าเป็นสารคัดหลั่งและไม่มีสารคัดหลั่งตามการทำนายตำแหน่งการแยกเปปไทด์สัญญาณโดยเซิร์ฟเวอร์ SignalP 1.4 โปรตีนลิชมาเนีย 2 ชนิดที่เลือก ได้แก่ พบว่า L. mexicana cysteine ​​protease A (Uniprot id: P25775) และ L. amazoensis glycoprotein GP -46/M2 (Uniprot id: P21978) มีเปปไทด์สัญญาณ และด้วยเหตุนี้ จึงคาดการณ์ว่าเป็นโปรตีนหลั่ง ไม่พบแอนติเจนของ Leishmania ที่เหลือทั้ง 10 ตัวที่มีเปปไทด์ส่งสัญญาณใด ๆ ที่บ่งบอกถึงธรรมชาติที่ไม่หลั่งออกมา การวิเคราะห์การแปลทำนายว่าโปรตีนซิสเทอีนโปรตีเอส A ของ L. mexicana (Uniprot id: P25775) จะถูกแปลใน lysosome / vacuole, โปรตีน leishmanolysin C1 และ proteophosphoglycan ของ L. mexicana (Uniprot ids: P43150 และ Q9TW13 ตามลำดับ) เป็นโปรตีนเมมเบรน , ขาดแอนติเจนป้องกันของ L. donovani (Uniprot id: Q9BIJ5) ที่จะอยู่ในนิวเคลียสและภาวะช็อกความร้อน 70 ที่เกี่ยวข้องกับโปรตีน 1 ของ L. major (Uniprot id: P12076) ที่จะแปลเป็นภาษาท้องถิ่นในไมโตคอนเดรีย โปรตีนอื่น ๆ ทั้งหมดถูกทำนายว่าเป็นไซโตพลาสซึม (ตารางที่ 1) นอกจากนี้ ยังได้รับลำดับกรดอะมิโนของสายโซ่อัลฟาของ IL ของมนุษย์ -12 จากฐานข้อมูล Uniprot (Uniprot id: P29459) เพื่อใช้เป็นสารเสริมในการสร้างวัคซีนขั้นสุดท้าย

การทำนายอีพิโทปของ CTL และ HTL

จากโปรตีนทั้งหมดที่ถูกตรวจสอบ จำนวนอีพิโทป CTL ที่ไม่มีชื่อทั่วไปทั้งหมด 59 รายการถูกระบุร่วมกันโดยเซิร์ฟเวอร์ NetCTL 1.2 และ SYFPEITHI แต่ละอีพิโทป CTL ที่คาดการณ์ไว้ถูกกำหนดคะแนนเฉพาะที่คำนวณโดยเซิร์ฟเวอร์ที่เกี่ยวข้อง โมทีฟ 9-mer CTL ทั่วไปเพียง 26 โมทีฟเหล่านี้ถูกเลือกเนื่องจากคะแนนที่สูงกว่าของพวกมัน (บ่งชี้สัมพรรคภาพการจับ MHC I ที่สูงกว่า) อีพิโทป CTL ยี่สิบหกเหล่านี้ที่ระบุโดยทั่วไปโดยเซิร์ฟเวอร์ทั้งสองที่มีคะแนนที่สูงกว่าที่เข้ากันได้ถูกรวมไว้ในโครงสร้างวัคซีนขั้นสุดท้าย (ตารางเสริม S1) ในทำนองเดียวกัน เครื่องมือวิเคราะห์การจับ IEDB MHCII ทำนาย 15-อีพิโทป mer HTL จากโปรตีนที่เลือกทั้งหมดเทียบกับชุดของอัลลีล HLA ของมนุษย์สามชุด (HLA- DRB1*01:01, HLA- DRB1*01:02 และ HLADRB1* 01:03) เอพิโทป HTL ที่คาดการณ์ไว้ซึ่งมีอันดับที่ถูกปรับต่ำสุดสำหรับแต่ละอัลลีลเหล่านี้ได้รับการบันทึกไว้ดังในตารางเสริม S2 จากกลุ่มนี้ จำนวนเก้าลำดับทั้งหมดถูกเลือกบนพื้นฐานของอันดับที่ถูกปรับต่ำของพวกมัน (ตารางที่ 2) ซึ่งทำให้อีพิโทป HTL เหล่านี้เป็นตัวจับ MHC-II ที่มีศักยภาพมากที่สุดสำหรับอัลลีล HLA สามอัลลีลใดๆ HTL อีพิโทปที่ถูกเลือกถูกส่งต่อไปยังการวิเคราะห์ทางคอมพิวเตอร์เพิ่มเติมเพื่อทำนายความสามารถในการผลิตไซโตไคน์ของพวกมัน

ตารางที่ 1 แอนติเจนเปปไทด์ที่มีศักยภาพ 12 ชนิดจากลิชมาเนียสายพันธุ์ต่างๆ ได้ถูกนำไปใช้ในการสร้างวัคซีน และเลือกตามคะแนนแอนติเจนที่สูงตามที่เซิร์ฟเวอร์ ANTIGENpro คาดการณ์ไว้

การคัดกรองเอพิโทป HTL ที่มีความสามารถในการกระตุ้นไซโตไคน์

เอพิโทป HTL ที่เลือกทั้งหมดเก้าตัว (ตารางที่ 2) ได้รับการประเมินสำหรับความสามารถของพวกมันในการผลิตอินเตอร์เฟอรอนโดยการใช้เซิร์ฟเวอร์ IFNepitope เซิร์ฟเวอร์คาดการณ์ (IFN- เทียบกับ nonIFN โดยใช้ SVM และการวิเคราะห์แบบลูกผสมที่ใช้ Motif) เพียงสามเปปไทด์ดังกล่าว เช่น FRRLYKTLGQLVYKK จากโปรตีนพาราฟาเจลลาร์ร็อด 2C ของ L. major, DNGAYLGMEPSSVAA จากโปรตีโอฟอสโฟไกลแคนของ L. mexicana และ RLHFFMMGFAPLTSR จากสายโซ่ tubulin beta ของ L. mexicana เป็น "บวก" โดยมีคะแนนน้อยกว่า 1.0 (ตารางที่ 3) เพปไทด์ทั้งสามชนิดนี้ได้รับการตรวจสอบเพิ่มเติมสำหรับความสามารถในการผลิต IL-4 และ IL-10- โดยใช้เซิร์ฟเวอร์ IL4pred และเซิร์ฟเวอร์ IL10pred ตามลำดับ เซิร์ฟเวอร์ทั้งสองใช้ตัวแยกประเภท SVM และพิจารณาพารามิเตอร์อินพุต SVM ต่างๆ เช่น องค์ประกอบของกรดอะมิโน องค์ประกอบของไดเปปไทด์ ความชอบของกรดอะมิโน และคุณสมบัติทางเคมีกายภาพสำหรับการทำนาย [32, 33] เซิร์ฟเวอร์ที่เกี่ยวข้องคาดการณ์ว่า 15-mer IFN- - ที่สร้างเอพิโทปทั้งสามนี้เป็นตัวเหนี่ยวนำสำหรับ IL-4 และ IL-10 เช่นกัน (ตารางเสริม S3) ดังนั้น ในที่สุดอีพิโทป mer HTL ที่จับกับ MHC-II ทั้งสามนี้จึงได้รับเลือกสำหรับการสร้างวัคซีนโดยพิจารณาถึงความสามารถในการกระตุ้นการผลิตไซโตไคน์ IFN- , IL-4 และ IL{{24 }} จึงเป็นสื่อกลางในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่เพิ่มขึ้น

การวิเคราะห์การอนุรักษ์เอพิโทป

โมดูล IEDB "การอนุรักษ์ข้ามแอนติเจน" ที่มีอยู่ในเซิร์ฟเวอร์ IEDB มีประโยชน์เพื่อค้นหาระดับการอนุรักษ์ของอีพิโทป CTL และ HTL ที่เลือก ซึ่งจะรวมไว้ในโครงสร้างวัคซีนขั้นสุดท้าย แต่ละอีพิโทป CTL ยี่สิบหกตัวและอีพิโทป HTL สามตัวถูกคัดกรองแยกกันต้านชุดเฉพาะของลำดับโปรตีนที่คล้ายคลึงกันที่ได้รับโดย Uniprot BLAST ผลลัพธ์ของ BLAST แสดงให้เห็นการอนุรักษ์โปรตีนที่เลือกไว้ในลิชมาเนียสายพันธุ์ต่างๆ ในระดับสูง และในโปรโตซัวปรสิตอื่นๆ ที่เกี่ยวข้อง ซึ่งส่วนใหญ่เป็นทริปาโนโซมา พบว่าอีพิโทป HTL ทั้งหมดได้รับการอนุรักษ์อย่างสูง (100%) ทั่วทั้งชุดของโปรตีนลิชมาเนียที่เกี่ยวข้องซึ่งใช้ในการวิเคราะห์ ในขณะที่ช่วงของการอนุรักษ์สำหรับอีพิโทป CTL ที่เลือกนั้นแปรผันตั้งแต่ 0 ถึง 100% (ตารางเสริม S4) การรวมเอาอีพิโทป CTL และ HTL ที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้ในโครงสร้างวัคซีนขั้นสุดท้ายจะช่วยให้มั่นใจได้ถึงภูมิคุ้มกันข้ามในวงกว้างต่อเชื้อลิชมาเนียที่ทำให้เกิดโรคหลายชนิดที่มักติดเชื้อในมนุษย์

ตารางที่ 2 รายละเอียดของอีพิโทป HTL ที่เลือก (15 เมอร์) พร้อมด้วยโปรตีนแหล่งที่มา, อัลลีลการจับที่สอดคล้องกัน และอันดับที่ถูกปรับที่ทำนายโดยเครื่องมือการจับ IEDB MHC-II

ตารางที่ 3 เซิร์ฟเวอร์ IFNepitope คาดการณ์เอพิโทปที่เหนี่ยวนำ MHC II ที่สามารถผลิตอินเตอร์เฟอรอนได้

การสร้างลำดับวัคซีนหลายเอพิโทป

ลำดับปฐมภูมิของวัคซีนเปปไทด์หลายหน่วยย่อยถูกสร้างขึ้นโดยการรวมลำดับของอีพิโทป CTL ยี่สิบหกและอีพิโทป HTL สามตัวที่เลือกบนพื้นฐานของแอนติเจน สัมพรรคภาพการจับกับ MHC และความสามารถในการกระตุ้นไซโตไคน์ อีพิโทป CTL และ HTL แต่ละตัวถูกรวมกันโดยการใช้ตัวเชื่อมโยง AAY และ GPGPG ตามลำดับ และความยาวโดยรวมของเปปไทด์วัคซีนที่เป็นผลลัพธ์คือกรดอะมิโน 369 ตัว สายอัลฟายาวของกรดอะมิโน 219 ตัวของ IL-12 ของมนุษย์ (Uniprot id: P29459) แบบเสริมถูกเติมไปยังปลาย N ของเพปไทด์ที่ออกแบบโดยตัวเชื่อมโยง EAAK การเพิ่ม IL-12 เป็นสารเสริมตามธรรมชาติควรจะเพิ่มประสิทธิภาพของวัคซีนโดยการเร่งการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกัน ดังที่ได้รับการตรวจสอบแล้วในการศึกษาในสัตว์ทดลอง [3, 37] นอกจากนี้ ยังมีการเพิ่มแท็ก 6XHis ลงในเทอร์มินัล C ของเปปไทด์เพื่ออำนวยความสะดวกในการระบุและการทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีนหลังจากการผลิตโดยเทคโนโลยีรีคอมบิแนนท์ DNA หลังจากการเติมตัวเชื่อมโยง ตัวเสริม และแท็กฮิสทิดีน พบว่าความยาวของเปปไทด์วัคซีนขั้นสุดท้ายมีกรดอะมิโนตกค้าง 598 ตัว (รูปที่ 1)

การทำนายอีพิโทปบีเซลล์เชิงเส้น ต่อเนื่อง และไม่ต่อเนื่อง

การมีอยู่ของปัจจัยกำหนดแอนติเจนในลำดับหลักของวัคซีนที่ออกแบบนั้นถูกระบุโดยการใช้เซิร์ฟเวอร์ที่แตกต่างกันสองเครื่อง ได้แก่ ABCpred และ BepiPred 2.0 เพื่อการทำนายที่มีประสิทธิภาพมากขึ้น เซิร์ฟเวอร์ ABCpred ทำนายอีพิโทปของเซลล์ B โดยใช้โครงข่ายประสาทที่เกิดซ้ำที่ได้รับการฝึก และแสดงลำดับของตัวเลือกเป็น 16- เมอร์เปปไทด์ที่จัดอันดับตามคะแนนการจับของพวกมัน (ตารางเสริม S5) คะแนนของเปปไทด์ที่สูงกว่าหมายถึงความน่าจะเป็นที่สูงขึ้นในการเป็นอีพิโทป พบว่าเปปไทด์วัคซีนที่ได้รับการออกแบบมี 16- เมอร์เปปไทด์ที่ไม่ทับซ้อนกันเจ็ดตัว โดยมีคะแนนที่คาดการณ์ไว้ที่ 0.90 และสูงกว่าที่ค่าเกณฑ์เริ่มต้นที่ 0.51 สะท้อนถึงศักยภาพที่สูงมากในการจับตัวและกระตุ้นเซลล์บี เซิร์ฟเวอร์อีกเครื่องหนึ่งคือ BepiPred 2.0 ทำนายความน่าจะเป็นของเรซิดิวกรดอะมิโนแต่ละตัวในลำดับอินพุตที่จะเป็นส่วนหนึ่งของอีพิโทปของเซลล์ B และแสดงภาพเอาต์พุตเป็นภาพประกอบที่มีการไล่ระดับสีส้มซึ่งระบุระดับของ ความน่าจะเป็น เรซิดิวที่คาดการณ์ไว้ซึ่งเป็นของอีพิโทปของเซลล์บีถูกทำเครื่องหมายเป็น "E" ผู้เสิร์ฟระบุเรซิดิวจำนวนมากให้เป็นเอพิโทปของเซลล์บีเชิงเส้นที่มีความน่าจะเป็นสูงภายในระยะเรซิดิวที่ตำแหน่ง 380–53{{20}} ของเพปไทด์ (รูปที่ 2) เมื่อ ขีดจำกัดของอีพิโทปถูกตั้งค่าไว้ที่ 0.5 (ค่าเริ่มต้น) ดังนั้น การระบุปัจจัยกำหนดแอนติเจนสำหรับตัวรับบีเซลล์โดยเซิร์ฟเวอร์อิสระสองตัวทำให้ข้อเท็จจริงที่ว่าเปปไทด์เมื่อบริหารเป็นวัคซีน จะสามารถกระตุ้นการผลิตแอนติบอดีโดยเซลล์บีเพื่อปกป้องบุคคลจากการติดเชื้อลิชมาเนีย ชุด Ellipro (มีอยู่ภายในพอร์ทัล IEDB) ทำนายการตกค้างของกรดอะมิโนทั้งหมด 323 ตัวที่อยู่ในเอพิโทปของเซลล์ B ที่ไม่ต่อเนื่องแปดตัวในโครงสร้างตติยภูมิที่ได้รับการปรับปรุงแล้วของวัคซีนเปปไทด์ โดยมีคะแนนตั้งแต่ 0.509 ถึง 0.802 ในบรรดาสิ่งเหล่านั้น อีพิโทปเชิงโครงสร้างที่ใหญ่ที่สุดมีเรซิดิวของกรดอะมิโน 107 ตัวด้วยคะแนนที่ทำนายไว้ที่ 0.772 พารามิเตอร์เริ่มต้นของเซิร์ฟเวอร์ถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์ Ellipro ยังทำนาย epitopes เซลล์ B เชิงเส้นสิบสองอันโดยมีจำนวนตกค้างทั้งหมด 324 รายการภายในช่วงคะแนน 0.535–0.885 (ตารางเสริม S6 และรูปภาพเสริม M1)

โปรไฟล์แอนติเจน ภูมิแพ้ และความเป็นพิษของโครงสร้างวัคซีน

แอนติเจนของลำดับวัคซีนขั้นสุดท้าย (ที่มีสารเสริม) ได้รับการประเมินโดยเซิร์ฟเวอร์ ANTIGENpro และ VaxiJen 2.0 เซิร์ฟเวอร์ ANTIGENpro ทำนายเหมือนกันว่าเป็นแอนติเจนที่น่าจะเป็นไปได้ด้วยคะแนนแอนติเจนที่ 0.745396 เซิร์ฟเวอร์ VaxiJen 2.0 ประเมินวัคซีนเปปไทด์ว่าเป็นแอนติเจนที่เป็นไปได้ด้วยคะแนน 0.5325 ที่เกณฑ์เริ่มต้นที่ {{10}}.5 เมื่อสิ่งมีชีวิตเป้าหมาย ได้รับเลือกให้เป็นปรสิต (ตารางที่ 4) อย่างไรก็ตาม เมื่อลำดับวัคซีนดั้งเดิมที่ไม่มีสารเสริมได้รับการวิเคราะห์โดย VaxiJen 2.0 ก็คาดการณ์ได้เช่นกันว่าเป็นแอนติเจนที่น่าจะเป็นไปได้ด้วยคะแนน 0.5768 ในแบบจำลองปรสิต คะแนนการทำนาย ANTIGENpro สำหรับลำดับดั้งเดิมคือ 0.714582 ดังนั้น ทั้งลำดับวัคซีนที่สร้างขึ้น (ที่มีและไม่มีสารเสริม) จึงพบว่ามีแอนติเจนในธรรมชาติ ซึ่งสนับสนุนความจริงที่ว่าส่วนประกอบเปปไทด์ของวัคซีนนั้นเป็นแอนติเจนด้วยตัวมันเอง แม้ว่าจะไม่มีสารเสริมเสริมก็ตาม (ตารางที่ 4) ในส่วนที่เกี่ยวข้องกับสารก่อภูมิแพ้ AlgPred พบว่าลำดับวัคซีนขั้นสุดท้ายไม่มีสารก่อภูมิแพ้ โดยมีคะแนนที่คาดการณ์ไว้ที่ 0.4018 ที่เกณฑ์เริ่มต้นที่ 0.4 นอกจากนี้ ไม่พบลำดับโปรตีนที่มีอีพิโทป IgE ที่ได้รับการพิสูจน์จากการทดลอง และไม่พบผลลัพธ์ของ BLAST สำหรับเปปไทด์ที่เป็นตัวแทนสารก่อภูมิแพ้ (ARP) ซึ่งบ่งชี้ถึงลักษณะที่ไม่ก่อให้เกิดภูมิแพ้ของวัคซีน เซิร์ฟเวอร์ AllerTOP v.2.0 ยังกำหนดโปรตีนว่าน่าจะไม่ใช่สารก่อภูมิแพ้ การวิเคราะห์ความเป็นพิษโดยเซิร์ฟเวอร์ ToxinPred คาดการณ์ว่าเปปไทด์จะไม่เป็นพิษเมื่อใช้วิธีการแบบอิง SVM (TrEMBL)+motif ถูกนำมาใช้ที่เกณฑ์ SVM ที่ 0.1 และค่าตัดค่า E สำหรับแบบพื้นฐาน motif ถูกตั้งค่าไว้ที่ 10.0 ดังนั้น ลำดับวัคซีนที่สร้างขึ้นจึงถูกคาดการณ์ว่าเป็นแอนติเจนที่เป็นไปได้ ไม่ก่อให้เกิดภูมิแพ้ และไม่เป็นพิษ ซึ่งทั้งหมดนี้ถือเป็นเกณฑ์ที่สำคัญสำหรับวัคซีนเปปไทด์หลายหน่วยย่อยในอุดมคติ

รูปที่ 1 แผนผังของวัคซีนเปปไทด์หลายเอพิโทปที่ออกแบบมาซึ่งมีลำดับกรดอะมิโนทั้งหมด 598 ลำดับซึ่งเป็นตัวแทนของโครงสร้างวัคซีนที่เป็นไปได้ด้วยสารเสริมธรรมชาติที่ปลาย N (สีเขียว) เชื่อมโยงกับ EAAK (สีม่วง) กับ 26 CTL (สีส้ม) โดยใช้ตัวเชื่อมโยง AAY (สีน้ำเงิน) และ 3HTL (สีเหลือง) เชื่อมต่อกับตัวเชื่อมโยง GPGPG (สีแดง) ลงท้ายด้วย 6-ป้ายของเขาที่สถานี C เพื่อวัตถุประสงค์ในการทำให้บริสุทธิ์

รูปที่ 2 บีเซลล์เอพิโทปทำนายโดยเซิร์ฟเวอร์ Bepipred 2.0 การยืดตัวที่จุดที่ต่างกันตั้งแต่ 1 ถึง 590 ลำดับกรดอะมิโนถูกทำนายด้วยอีพิโทปที่เป็นไปได้ที่สูงกว่าระดับขีดจำกัดเริ่มต้น บรรทัดแรกที่ทำเครื่องหมายเป็น E แสดงตำแหน่งของอีพิโทปที่คาดการณ์ไว้

การประเมินพารามิเตอร์เคมีกายภาพ

พารามิเตอร์เคมีกายภาพของโครงสร้างวัคซีนขั้นสุดท้ายคำนวณโดยเซิร์ฟเวอร์ Protparam บนพื้นฐานของกรดอะมิโนที่ตกค้างอยู่ในลำดับที่กำหนด น้ำหนักโมเลกุล (MW) ของเปปไทด์ที่ออกแบบนั้นคำนวณเป็น 65.68 kDa ซึ่งเหมาะสำหรับการกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน pI ทางทฤษฎี (จุดไอโซอิเล็กทริก) คำนวณเป็น 5.98 ซึ่งกำหนดว่าเปปไทด์มีลักษณะเป็นกรดเล็กน้อย จำนวนรวมของสารตกค้างที่มีประจุบวกและประจุลบในเปปไทด์คือ 48 และ 55 ตามลำดับ ครึ่งชีวิตคำนวณเป็น 30 ชั่วโมงในเรติคูโลไซต์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ในหลอดทดลอง มากกว่า 20 ชั่วโมงในยีสต์ และมากกว่า 10 ชั่วโมงใน E. coli ในร่างกาย การคงอยู่ของโปรตีนเป็นเวลา 30 ชั่วโมงในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม (รวมถึงมนุษย์) เพียงพอสำหรับการกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่ต้องการ เนื่องจากกลไกดังกล่าวต้องการการประมวลผลและการนำเสนอโปรตีนโดยเซลล์ภูมิคุ้มกัน ดัชนีอะลิฟาติก (ปริมาตรสัมพัทธ์ซึ่งครอบครองโดยสายโซ่อะลิฟาติกด้านข้าง) คาดว่าจะอยู่ที่ 78.34 ซึ่งบ่งชี้ว่าโปรตีนมีคุณสมบัติทนความร้อนได้ในธรรมชาติ เนื่องจากดัชนีอะลิฟาติกอาจได้รับการพิจารณาว่าเป็นปัจจัยบวกที่มีส่วนทำให้ความคงตัวต่อความร้อนของโปรตีนทรงกลมเพิ่มขึ้น ดัชนีความไม่แน่นอนคำนวณเป็น 47.10 ค่าเฉลี่ยแกรนด์ของไฮโดรพาที (GRAVY) ที่คาดการณ์ไว้ของโครงสร้างวัคซีนถูกคาดการณ์ว่าจะอยู่ที่ −0.140; ค่าลบกำหนดว่าเป็นสารที่ชอบน้ำในธรรมชาติและจะมีปฏิกิริยากับโมเลกุลของน้ำ [28, 70–72] โดยสรุป การวิเคราะห์ทางอิมมูโนอินฟอร์มาติกทำนายโครงสร้างเปปไทด์ที่ออกแบบไว้ว่าเป็นแอนติเจน ทนต่อความร้อน คงอยู่ในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม และชอบน้ำ ปัจจัยทั้งหมดเหล่านี้ส่งผลต่อประสิทธิผลของโครงสร้างในฐานะตัวเลือกวัคซีนที่เป็นไปได้

การทำนายโครงสร้างทุติยภูมิ

การทำนายโครงสร้างรองสำหรับไคเมอริกเปปไทด์ยาว 592 ที่ตกค้างโดยเซิร์ฟเวอร์ PSIPRED เผยให้เห็นการมีอยู่ของอัลฟาเฮลิกส์ 45.77%, แผ่นเบต้า 4.89% และคอยล์ 49.32% ดังที่บรรยายไว้ในรูปที่ 3 ต่อไปนี้ นอกจากนี้ โครงสร้าง RaptorX เซิร์ฟเวอร์การทำนายวิเคราะห์การเข้าถึงตัวทำละลายที่เกี่ยวข้องสำหรับเปปไทด์ โดยที่ 36% ของสารตกค้างถูกคาดการณ์ว่าจะถูกสัมผัส, 28% ถูกคาดการณ์ว่าถูกฝังตัวกลาง และ 35% ของสารตกค้างถูกคาดการณ์ว่าถูกฝังอยู่ ซึ่งบ่งชี้ว่าโปรตีนจะมีการสัมผัสที่ยุติธรรมโดยรวม ด้วยน้ำ (ตัวทำละลาย) เซิร์ฟเวอร์ RaptorX คาดการณ์ว่าสารตกค้างเพียง 32 รายการ (5% ของเปปไทด์) จะอยู่ในโดเมนที่ไม่เป็นระเบียบของโปรตีน

การทำนายโครงสร้างระดับอุดมศึกษา

I-TASSER web server was utilized for the prediction of the 3-D structure of the designed vaccine. The server predicted five models for the said peptide on the basis of multiple threading alignments using ten different templates, among which the template with PDB id 7e2cl showed the best alignment with an TM score of 0.931 and an RMSD value of 2.75. The top-ranked model exhibiting the highest confidence score (C-score) of−1.11 and an estimated RMSD of 10.3±4.6 Å (Fig. 4a) was selected for further refinement. A higher C-score indicates a higher level of confidence with which the server predicts the tertiary structure of the target protein based on the predictions obtained from modeling simulations [46, 66]. The C-score has a strong correlation with the overall quality of the tertiary structure, and it has been used widely for quantitative estimation of the RMSD and TM scores of predicted models in comparison with the native models; further, the estimated TM score of the chosen model was found to be 0.58±0.14 which is another strong indicator of good modeling strategy since a TM score of>0.5 หมายถึงรุ่นที่มีการพับที่ถูกต้อง คะแนน TM เป็นพารามิเตอร์อิสระที่มีความยาวเป็นลำดับสำหรับการวัดความคล้ายคลึงกันทางโครงสร้างของแบบจำลองที่คาดการณ์ไว้กับโปรตีนที่เหมือนกันอื่นๆ ในตระกูลพับ SCOP/CATH เดียวกัน [47]

ตารางที่ 4 ผลลัพธ์แอนติเจนที่คำนวณจากเซิร์ฟเวอร์ ANTIGENpro และเซิร์ฟเวอร์ Vaxijen2.0 ที่มีและไม่มีแอนติเจน

รูปที่ 3 การทำนายโครงสร้างทุติยภูมิต่อลำดับวัคซีนเชิงเส้นโดยเซิร์ฟเวอร์ PSIPRED

รูปที่ 4 การทำนายและการปรับแต่งโครงสร้างระดับตติยภูมิ 3-การสร้างแบบจำลอง D ของโครงสร้างวัคซีนตามที่ทำนายโดยเซิร์ฟเวอร์ I-TASSER b การปรับแต่งโมเดล 3- D แบบดิบโดยเซิร์ฟเวอร์ GalaxyRefne

การปรับแต่งและการตรวจสอบความถูกต้องของแบบจำลอง 3 มิติของวัคซีน

แบบจำลองระดับตติยภูมิ "ดิบ" สำหรับวัคซีนเปปไทด์ได้รับการปรับปรุงตามลำดับย่อยโดยการประมวลผลผ่านเซิร์ฟเวอร์ GalaxyReone GalaxyRefne ให้ผลลัพธ์ 5 โมเดล โดยในจำนวนนั้นพบว่าโมเดล 1 ดีที่สุดหลังจากการประเมินและการเปรียบเทียบพารามิเตอร์ที่เกี่ยวข้อง เช่น GDT-HA (0.8826) RMSD (0.608); โมลโพรบิตี้ (2.398); คะแนนการปะทะ (21.1); โรตาเมอร์ที่ไม่ดี (0.6); และภาคโปรดพระราม (88.8) พร้อมด้วยโมเดลที่เหลือ (รูปที่ 4b) พล็อตเรื่องรามจันทรันที่สร้างขึ้นโดยเซิร์ฟเวอร์ MolProbity แสดงให้เห็นว่าแบบจำลอง 3-D ที่ได้รับการปรับปรุงแล้วมีเรซิดิว 88.8% ในภูมิภาคที่ต้องการ, 98.6% เรซิดิวในภูมิภาคที่อนุญาต และมีเพียง 0.013% ค่าผิดปกติเท่านั้น ในทางตรงกันข้าม แบบจำลองน้ำมันดิบเริ่มแรกพบว่ามีสารตกค้าง 77.1%, 94.2% และ 0.057% ในภูมิภาคที่ได้รับการสนับสนุน ได้รับอนุญาต และผิดปกติ ตามลำดับ ผลลัพธ์เหล่านี้สรุปได้ชัดเจนว่าคุณภาพของแบบจำลองระดับอุดมศึกษาที่ได้รับการปรับปรุงได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญ เซิร์ฟเวอร์ ERRATA ยังถูกนำไปใช้เพื่อตรวจสอบความถูกต้องเพิ่มเติมของโมเดลที่ได้รับการปรับปรุง เซิร์ฟเวอร์ ERRATA วิเคราะห์แบบจำลองด้วยปัจจัยด้านคุณภาพโดยรวมที่ 43.542 ซึ่งจริงๆ แล้วแสดงถึงเปอร์เซ็นต์ของแบบจำลองโปรตีนอินพุตซึ่งต่ำกว่าขีดจำกัดการปฏิเสธ 95% ดังนั้นเราจึงประสบความสำเร็จในการได้รับโครงสร้างระดับตติยภูมิที่ได้รับการปรับปรุงและตรวจสอบแล้วสำหรับโครงสร้างของวัคซีน โครงสร้างตติยภูมิที่ได้รับการปรับปรุงของวัคซีน พร้อมด้วยแปลงที่ได้รับจากเซิร์ฟเวอร์ MolProbity และเซิร์ฟเวอร์ ERRAT แสดงในรูปที่ 5 เว็บเซิร์ฟเวอร์ ProSA แสดงคะแนน Z ที่ 1.08 (รูปภาพเสริม M2) ซึ่งค่าลบ ค่าบ่งชี้ว่าแบบจำลองอยู่นอกช่วงคะแนนของโปรตีนที่คล้ายกันซึ่งมีขนาดใกล้เคียงกันซึ่งมีโครงสร้างถูกกำหนดโดยการเลี้ยวเบนของรังสีเอกซ์หรือโดย NMR [51]

วิศวกรรมไดซัลไฟด์ของเปปไทด์วัคซีน

เซิร์ฟเวอร์ไดซัลไฟด์โดยการออกแบบ 2.12 ส่งคืนเรซิดิวกรดอะมิโน 45 คู่ซึ่งเป็นตำแหน่งที่เป็นไปได้สำหรับการสร้างพันธะไดซัลไฟด์ เราได้ระบุคู่สารตกค้างที่สำคัญที่สุดสี่คู่ที่อาจอยู่ในบริเวณลูปที่ยืดหยุ่นของโปรตีนวัคซีนโดยพิจารณาจากพลังงานพันธะสูงและค่า Chi3 (ตารางเสริม S7) สารตกค้างเหล่านี้ THR58-PHE61 (chi3:+126.18), LEU216-ALA234 (chi3:+125.92), THR323-GLU359 (chi3 :+121.54) และ TYR472-ARG504 (chi3: + 125.75) ถูกแทนที่ด้วยซิสเทอีนในแบบจำลองตติยภูมิที่ได้รับการปรับปรุงแล้วของโปรตีนวัคซีนขั้นสุดท้าย ซึ่งจะช่วยปรับปรุงเสถียรภาพทางความร้อน ของเปปไทด์ (รูปที่ 6) อย่างไรก็ตาม ความแม่นยำของแฟกเตอร์ B นั้นจำกัดอยู่ที่การลดทอนของการกระเจิงของนิวตรอนหรือรังสีเอกซ์โดยการเคลื่อนที่ด้วยความร้อนของโมเลกุลในผลึกโปรตีน ดังนั้นเราจึงเลือกพลังงานพันธะสูงและค่า Chi3 อย่างเข้มงวดเหนือปัจจัย B สำหรับโมเดลวัคซีนกลั่นที่ใช้คอมพิวเตอร์ช่วย [73, 74]

การวิเคราะห์ปฏิกิริยาระหว่างการเชื่อมต่อของเปปไทด์วัคซีนกับ TLR

อันตรกิริยาของไคเมอริกเปปไทด์กับตัวรับภูมิคุ้มกัน (TLR ของมนุษย์{{0}}, 4, 5, 8 และ TLR ของเมาส์-9) ได้รับการศึกษาโดยดำเนินการวิเคราะห์การเชื่อมต่อโดยใช้เซิร์ฟเวอร์ PatchDock ซึ่งมีการเชื่อมโยง ประเมินความสัมพันธ์ของวัคซีน (ลิแกนด์) กับ TLR (ตัวรับ) ต่างๆ ได้รับการประเมิน มีการพิจารณาโมเดลสิบอันดับแรกที่สร้างโดย PatchDock สำหรับการเชื่อมต่อแต่ละครั้ง โดยเลือกโมเดลที่มีอันดับดีที่สุดและมีคะแนนการเชื่อมต่อสูงสุดสำหรับแต่ละกรณี คะแนนแสดงถึงรูปร่างและการกุศลเสริมไฟฟ้าสถิตระหว่างตัวรับและลิแกนด์ การเสริมกันที่ดีที่สุดพบในกรณีของ TLR ของมนุษย์-2 (PDB id: 6NIG) ด้วยคะแนน 18,714 พื้นที่ผิว 3963.10 และพลังงานสัมผัสของอะตอม (ACE) 217.99 (รูปที่ 7a) . วัคซีนยังแสดงการจับที่มีประสิทธิภาพกับ TLR-5 (PDB id: 3J0A) และ TLR-9 (PDB id: 3WPF) ด้วยคะแนนการเชื่อมต่อที่ 18,258; พื้นที่ผิว 2879.80 และ ACE ที่ 666.94 และคะแนนการเชื่อมต่อ 18,164; และพื้นที่ผิว 4,090.70 และ ACE เท่ากับ 495.74 ตามลำดับ การเทียบชิดกับ TLR อื่นๆ แสดงสัมพรรคภาพในการจับที่อ่อนกว่าดังสะท้อนโดยคะแนนการเทียบชิดที่ต่ำกว่าที่สร้างโดย PatchDock, 16,708 สำหรับ TLR-4 (PDB id: 4G8A) และ 17,800 สำหรับ TLR-8 (PDB id: 4QC0) ดังนั้น โครงสร้างวัคซีนของเราจึงสามารถจับกับตัวรับภูมิคุ้มกันที่แตกต่างกันซึ่งมีสัมพรรคภาพในการจับที่แตกต่างกัน สิ่งนี้จะเป็นที่ต้องการอย่างมากสำหรับวัคซีนที่มีประสิทธิภาพในแง่ของการกระตุ้นภูมิคุ้มกันที่เหมาะสมและสูงขึ้นเพื่อป้องกันการติดเชื้อลิชมาเนีย นอกจากนี้ เครื่องมือเว็บ FireDock ยังถูกนำมาใช้ในการปรับแต่งและการให้คะแนนใหม่ของคอมเพล็กซ์วัคซีนที่ดีที่สุด (TLR{42}} วัคซีนคอมเพล็กซ์) ซึ่งได้รับการปรับแต่งแบบเดียวกันด้วยพลังงานทั่วโลกขั้นต่ำที่ −19.01, สมาคม Van Der Waals (−25.74), การสัมผัสของอะตอม พลังงาน (−0.03) และพลังงานอิสระที่มีผลผูกพัน (−24.26) ผลลัพธ์เหล่านี้ยืนยันความจริงที่ว่าเปปไทด์ของวัคซีนมีปฏิกิริยาอย่างมีประสิทธิภาพสูงสุดกับ TLR ของมนุษย์-2 และด้วยเหตุนี้ จึงก่อให้เกิดสารเชิงซ้อนที่มีความเสถียรพอสมควรซึ่งอาจกระตุ้นให้เกิดการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่ชัดเจนต่อปรสิตลิชมาเนีย นอกจากนี้ เรายังตรวจสอบการเชื่อมต่อระหว่าง TLR-2 กับวัคซีนเพิ่มเติม การใช้เว็บเซิร์ฟเวอร์ Cluspro โมเดลอันดับต้น ๆ (รูปที่ 7b) จะถูกเลือกตาม FFT และ CAPRI แบบหมุน 5D (การประเมินที่สำคัญของการโต้ตอบที่คาดการณ์ไว้) ด้วยคะแนนถ่วงน้ำหนักที่สมดุล − 1192.5 ซึ่งมีขนาดคลัสเตอร์ใหญ่ที่สุดที่ 42 สมาชิก ตารางที่ 5 ประกอบด้วยรายการเรซิดิวของกรดอะมิโนที่ทำปฏิกิริยากัน 10 รายการจากรูปที่ 7b ซึ่งก่อตัวเป็นสารเชิงซ้อนของรีเซพเตอร์-ลิแกนด์ที่เสถียร

รูปที่ 5 โครงเรื่องรามจันทรันสำหรับโมเดล GalaxyRefne b เซิร์ฟเวอร์ ERRAT คาดการณ์การประเมินคุณภาพของโครงสร้างโปรตีน

รูปที่ 6 ไดซัลไฟด์ตามการออกแบบ 2.0 ทำนายการเกิดพันธะไดซัลไฟด์ที่เป็นไปได้สี่รูปแบบ (แสดงด้วยลูกศร) เพื่อปรับปรุงเสถียรภาพทางความร้อนของโครงสร้างวัคซีนขั้นสุดท้าย

การเพิ่มประสิทธิภาพโคดอนและการโคลนซิลิโกเพื่อการแสดงออกของโปรตีนวัคซีน

ในความพยายามที่จะเอาชนะปัญหาอคติของโคดอน เครื่องมือ JCat ถูกนำมาใช้เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพโคดอนที่ส่งคืนลำดับกรดอะมิโนอินพุตของเปปไทด์วัคซีนในรูปแบบของลำดับ cDNA ที่แปลแบบย้อนกลับโดยมีค่า CAI ที่ปรับให้เหมาะสมที่ 1 ค่านี้อยู่ ภายในช่วงค่า CAI ที่ยอมรับที่ 0.8–1.0 [28] ทำให้มั่นใจได้ถึงอัตราการแสดงออกของยีนในสิ่งมีชีวิตที่เป็นโฮสต์ E. coli K12 ที่สูง ยิ่งค่าของ CAI สูง อัตราการแสดงออกของยีนต่างประเทศก็จะยิ่งดีขึ้นเท่านั้น นอกจากนี้ พบว่าเนื้อหา GC ของลำดับที่ได้รับการปรับปรุงคือ 51.85% ซึ่งบ่งชี้ถึงการปรับให้เหมาะสมของโคดอนที่ดี เพื่อการแสดงออกของยีนที่ดีขึ้น จำเป็นต้องมีเนื้อหา GC 35–70% [63] ตำแหน่งจำกัดสำหรับเอนไซม์ XhoI และ NdeI ถูกสร้างขึ้นที่ปลาย 5/ และ 3/ ของลำดับ ตามด้วยการแทรกลำดับที่ถูกแก้ไขเข้าไปในเวกเตอร์ pET28 a(+) ส่วนแทรกที่ถูกโคลนซึ่งแสดงด้วยสีแดง อยู่ระหว่างไซต์ข้อจำกัดที่ระบุในเวกเตอร์ นอกจากนี้ ฮิสทิดีนตกค้าง 6 ชนิดยังอยู่ที่ปลายทั้งสองของลำดับการโคลนเพื่ออำนวยความสะดวกในกระบวนการทำให้บริสุทธิ์หลังจากการผลิตโปรตีนวัคซีนรีคอมบิแนนท์ [6, 31] ขนาดของโครงสร้างพลาสมิดเวกเตอร์สุดท้ายที่มีส่วนของยีนที่แทรกอยู่คือประมาณ 7 kb (รูปที่ 8) เว็บเซิร์ฟเวอร์ mfold ทำนายโครงสร้างการพับของ mRNA จำนวนห้าสิบรูปแบบ โดยเลือกโครงสร้างบนสุดเนื่องจากคะแนนพลังงานต่ำที่สุด (ΔG=−492.50) โครงสร้างแบบพับเฉพาะนี้คาดการณ์ว่าจะมีวงรอบภายนอกเดี่ยวและสี่กองที่มีพลังงานอิสระขั้นต่ำซึ่งบ่งบอกถึงความเสถียรของโครงสร้าง ห่วงประกอบด้วยฐานเกลียวเดี่ยว 21 อันและเกลียวปิด 2 อัน ดอทพล็อตพลังงานคำนวณพลังงานที่เหมาะสม (δG) ให้เป็น 494.4 กิโลแคลอรี/โมล จุดสีที่แตกต่างกันในฟิลด์อ้างอิงถึงระดับพลังงานที่แตกต่างกันของคู่เบสเฉพาะที่มีอยู่ใน mRNA โดยพิจารณาจาก δG ที่คำนวณโดยเซิร์ฟเวอร์ [64] จากโครงเรื่อง พลังงานอิสระของคู่ฐานส่วนใหญ่อยู่ภายใน -487.5<δg <="−485.8" kcal/mol="" range="" (supplementary="" image="" m3).="" conclusively,="" a="" thermodynamically="" favored="" and="" energetically="" stable="" secondary="" structure="" of="" the="" mrna="" was="" predicted="" (supplementary="" image="" m4).="" all="" the="" folding="" constraints="" were="" set="" at="" their="" default="" values,="" and="" the="" rna="" was="" considered="" to="" be="" linear="" in="">

ตารางที่ 5 PyMOL สร้างกรดอะมิโนที่ตกค้างจากตัวรับและลิแกนด์สิบตัวจากรูปที่ 7b และตัวเลขใน () ระบุตำแหน่งตามลำดับของกรดอะมิโนในตัวรับและลิแกนด์

การจำลองภูมิคุ้มกัน

ในการจำลองภูมิคุ้มกันซิลิโกโดยใช้เว็บเซิร์ฟเวอร์ C-immsim ทำนายจำนวนแอนติเจนสูงถึง 6.9× 105 /มล. ภายใน 2 วันนับจากการฉีดยาครั้งแรก และระดับแอนติเจนลดลงเหลือ 0 ในวันที่สี่เป็นต้นไป การเพิ่มขึ้นของจำนวนแอนติเจนนี้สัมพันธ์กับการเพิ่มขึ้นอย่างน่าทึ่งในความเข้มข้นของทั้งระดับ IgM IgG และระดับ IgM เพียงอย่างเดียวในช่วงระยะเวลาการติดเชื้อระยะแรก และถึงระดับสูงสุดประมาณภายใน 12 วันของรอบการติดเชื้อในระดับที่กำหนดเอง ชนิดย่อยอื่นๆ ของระดับ IgG1+IgG2 และ IgG1 เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดอันเป็นผลมาจากการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันทุติยภูมิ (รูปที่ 9a) โปรไฟล์ของไซโตไคน์แสดงตัวกลางการอักเสบ เช่น INF ถึงระดับสูงถึง 4×106 ng/ml ในวันที่ 12 ในขณะที่ระดับไซโตไคน์อื่นๆ ยังคงค่อนข้างต่ำ (รูปที่ 9b) การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยเซลล์เป็นสื่อกลางที่แนะนำโดยการมีอยู่ของ T lymphocytes ที่เป็นพิษต่อเซลล์ที่ออกฤทธิ์และพักอยู่เพิ่มขึ้นหลังจาก 2-3 วันหลังจากการฉีดครั้งแรก และการมีอยู่ของ T cell ผู้ช่วยหน่วยความจำที่ขยายตัวก็โดดเด่นเช่นกัน (รูปที่ 9c และ d) ประชากรเซลล์ B ทั้งหมดยังเพิ่มขึ้นภายใน 2–3 วัน พร้อมกับการสร้างเซลล์หน่วยความจำ B หลังจาก 1 สัปดาห์ของการบริหารขนาดยาหลัก (รูปที่ 9e)

รูปที่ 8 ระบบการแสดงออกของวัคซีนลิชมาเนียโดยใช้เวกเตอร์ pET28 a(+) บริเวณสีแดงบ่งชี้ถึงลำดับกรดนิวคลีอิกของวัคซีนที่ขนาบข้างด้วยตำแหน่งจำกัด NdeI และ XhoI

การตีความการจำลองไดนามิกของโมเลกุล

คะแนนการเชื่อมต่อที่ดีที่สุดที่ได้รับจากคอมเพล็กซ์วัคซีน TLR2- ได้รับการวิเคราะห์เพิ่มเติมโดยการจำลองไดนามิกของโมเลกุลที่ได้รับความช่วยเหลือจาก NMA ความสามารถในการเปลี่ยนรูปของโซ่หลักแสดงด้วยบานพับที่สูง (รูปที่ 10a) ซึ่งหมายถึงความสามารถในการเปลี่ยนรูปสูง ปัจจัย B (รูปที่ 10b) คำนวณโดย NMA ซึ่งแสดงถึงความยืดหยุ่นของโปรตีนตามพารามิเตอร์การกระจัดของอะตอม [73] ค่าลักษณะเฉพาะ (รูปที่ 10c) อธิบายเกี่ยวกับพลังงานที่ต้องการเพื่อทำให้โครงสร้างผิดรูป คอมเพล็กซ์วัคซีน TLR-2 แสดงค่าลักษณะเฉพาะประมาณ 7.778× 10−7 ความแปรปรวน (รูปที่ 10d) มีความสัมพันธ์แบบผกผันกับค่าลักษณะเฉพาะ เมทริกซ์ความแปรปรวนร่วม (รูปที่ 10e) แสดงให้เห็นว่าคู่ของสารตกค้างมีความสัมพันธ์กัน (สีแดง) ไม่สัมพันธ์กัน (สีขาว) หรือต่อต้านความสัมพันธ์ (สีน้ำเงิน) แบบจำลองเครือข่ายแบบยืดหยุ่น (รูปที่ 10f) คำนวณสปริงระหว่างคู่อะตอมที่สอดคล้องกัน จุดในกราฟที่แสดงด้วยการไล่ระดับสีบ่งบอกถึงความแข็งแกร่งหรือความยืดหยุ่นของสปริง และสีเข้มกว่าสะท้อนถึงสปริงที่แข็งกว่า ดังนั้นผลลัพธ์ของการจำลองแบบไดนามิกระดับโมเลกุลชี้ให้เห็นว่าวัคซีนเปปไทด์ที่เรานำเสนอมีความเสถียร

การอภิปราย

โรคลิชมาเนียถือเป็นหนึ่งในโรคเขตร้อนที่ถูกละเลยมากที่สุด ซึ่งส่งผลกระทบต่อผู้คนที่อาศัยอยู่ในพื้นที่ยากจนของประเทศกำลังพัฒนา รวมถึงอินเดียเป็นหลักด้วย [2] ตามรายงานของ WHO อินเดียเป็นโรคเฉพาะถิ่นสำหรับโรคทั้งสองรูปแบบ ได้แก่ CL และ VL CL เกิดจาก L. tropica และ L. major เกิดขึ้นในรัฐทางตะวันตกเฉียงเหนือของอินเดีย ปัญจาบ และราชสถานเป็นจุดโฟกัส (https://www.who.int/leishmaniasis/ภาระ/Leishmaniasis_อินเดีย/en/ ). นอกจากนี้ ด้วยการแพร่ระบาดของไวรัสเอชไอวี (Human Immunodeficiency Virus: HIV) ที่เพิ่มขึ้นทั่วโลก โรคลิชมาเนียจึงกลายเป็นเชื้อก่อโรคฉวยโอกาสที่กลับมาปรากฏอีกครั้งในผู้ป่วยโรคเอดส์ ทำให้สถานการณ์เลวร้ายยิ่งขึ้น [22, 38] ในการศึกษาปัจจุบัน เรามุ่งเป้าที่จะออกแบบวัคซีนทั่วไปชนิดโพลีวาเลนต์ใหม่สำหรับโรคลิชมาเนีย ที่อาจให้การป้องกันที่ต่างกันจากปรสิตที่ทำให้เกิดโรคทั่วไป เราเลือกโปรตีนเฉพาะของ Leishmania สิบสองชนิดซึ่งครอบคลุมสายพันธุ์ที่ทำให้เกิดโรคห้าสายพันธุ์ของปรสิตที่ทำให้เกิดการติดเชื้อ VL และ CL ในมนุษย์ โปรตีนเหล่านี้ได้รับการประเมินแล้วว่ามีบทบาทต่อความรุนแรงและภูมิคุ้มกัน รวมทั้งศักยภาพของโปรตีนเหล่านี้ในฐานะตัวเลือกวัคซีนในการศึกษาทางภูมิคุ้มกันต่างๆ[1, 8–10, 75] ดังนั้น โครงสร้างวัคซีนที่ออกแบบในซิลิโกโดยการรวมโปรตีนภูมิคุ้มกันที่มีคุณสมบัติเฉพาะอย่างดีและได้รับการอนุรักษ์ไว้สูงจากลิชมาเนียสายพันธุ์ที่ทำให้เกิดโรคที่แตกต่างกัน อาจจัดให้มีภูมิคุ้มกันข้ามกับโรคลิชมาเนียของมนุษย์ทุกรูปแบบ (โดยหลักคือ VL และ CL) และด้วยเหตุนี้ จึงสามารถใช้สำหรับ โปรแกรมการฉีดวัคซีนทั่วไปเพื่อป้องกันการติดเชื้อลิชมาเนียในมนุษย์ โปรตีนที่เลือกถูกคัดกรองเบื้องต้นสำหรับการมีอยู่ของอีพิโทป CTL และ HTL ที่เป็นไปได้ การตรวจหาเอพิโทปของทีเซลล์มีความสำคัญเนื่องจากทีเซลล์สามารถจดจำแอนติเจนได้เฉพาะเมื่อถูกประมวลผลโดยวิถีทางภายนอกหรือจากภายนอก ที่ถูกทำให้เกิดซ้อนด้วยโมเลกุล MHC คลาส I หรือ MHC คลาส II และต่อมาถูกนำเสนอต่อรีเซพเตอร์ของทีเซลล์โดยเซลล์ที่สร้างแอนติเจน ( APC) MHC-I มีความจำเพาะต่อ CD8+CTL ในขณะที่ MHC-II ผูกกับ CD4+HTL receptor โดยเฉพาะ การบ่งชี้สำหรับอีพิโทป CTL ถูกดำเนินการอย่างเข้มงวดโดยการจ้างเซิร์ฟเวอร์อิสระสองตัวพร้อมกัน เฉพาะอีพิโทปเหล่านั้นที่ทำนายโดยทั้งสองเซิร์ฟเวอร์ที่มีสัมพรรคภาพการจับ MHC สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญเท่านั้นที่ถูกรวมไว้ในเปปไทด์ของวัคซีนในที่สุด เอพิโทป HTL ที่ระบุได้รับการประเมินเพิ่มเติมสำหรับความสามารถในการกระตุ้นไซโตไคน์ของพวกมันโดยการใช้ประโยชน์จากเว็บเซิร์ฟเวอร์สามตัว สารที่สามารถกระตุ้นการผลิตไซโตไคน์ที่หลากหลาย ได้แก่ IFN- , IL{{20}} และ IL-10 ได้รับการคัดเลือกสำหรับการออกแบบวัคซีนไคเมอริกเปปไทด์เพื่อให้แน่ใจว่า มันจะกระตุ้นการผลิตไซโตไคน์ที่จำเพาะต่อปรสิตเหล่านี้ทั้งหมดในโฮสต์ สิ่งนี้มีความสำคัญสูงสุดเนื่องจาก Kedzierski และเพื่อนร่วมงานได้เสนอว่าการหลั่งของ IL-10 มีความสำคัญเท่ากับการหลั่งของ IFN- เพื่อตรวจสอบว่าวัคซีนสามารถกระตุ้นการตอบสนองของภูมิคุ้มกันในการป้องกันได้หรือไม่ และภูมิคุ้มกันที่เหมาะสมจะไม่เกิดขึ้นหาก IL ระดับ -10 ไม่ได้ยกระดับตามสัดส่วน [8, 75] อีพิโทป CTL และ HTL เฉพาะตัวถูกหลอมต่อไปโดยการใช้ตัวเชื่อมโยง AAY และ GPGPG เพื่อสร้างไคเมอริกเปปไทด์ ก่อนหน้านี้ตัวเชื่อมโยง AAY และ GPGPG ได้รับการรายงานว่ามีประโยชน์สำหรับการออกแบบวัคซีนหลาย epitope เนื่องจากพวกมันทำให้เกิดการสร้างภูมิคุ้มกันทางแยกน้อยที่สุด และอำนวยความสะดวกในการประมวลผลและการนำเสนอ epitopes ที่เลือกโดย MHC-II [6, 28, 71] สายอัลฟาเสริมของ IL-12 ของมนุษย์ถูกเชื่อมโยงกับปลาย N ของเปปไทด์ที่เป็นผลลัพธ์ผ่านทางตัวเชื่อมโยง EAAK IL-12 ได้รับเลือกให้เป็นสารเสริมเนื่องจากเป็นหนึ่งในสารเสริมที่มีประสิทธิภาพมากที่สุดสำหรับวัคซีนลิชมาเนียในสัตว์ทดลอง ตามที่บันทึกไว้ในการศึกษาด้านภูมิคุ้มกันวิทยาครั้งก่อนๆ [3, 37, 71] เนื่องจากวัคซีนมีไว้สำหรับการบริหารของมนุษย์ การนำ IL-12 ของมนุษย์มาใช้เป็นสารเสริมตามธรรมชาติแทนการใช้ TLR agonist สังเคราะห์ใดๆ คาดว่าจะช่วยเพิ่มภูมิคุ้มกันโดยไม่ก่อให้เกิดผลข้างเคียงที่ไม่พึงประสงค์ บทบาทของ IL-12 ในฐานะสารเสริมทั่วไปสำหรับวัคซีนยังได้รับการเน้นย้ำเนื่องจากศักยภาพของมันในการเพิ่มประสิทธิภาพการตอบสนองของแอนติบอดีทั้งโปรตีนและโพลีแซ็กคาไรด์ของวัคซีน และกระตุ้นการอักเสบเฉพาะที่เพียงพอซึ่งทำให้มีการหลั่งของ IgG ซึ่งนำไปสู่การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่สูงขึ้น [72] มีการเพิ่ม EAAK linker เพื่อให้ได้อัตราการแสดงออกที่สูงขึ้น และเพื่อส่งเสริมการทำงานทางชีวภาพของฟิวชันเปปไทด์โดยการจำกัดปฏิสัมพันธ์ระหว่างโดเมนของวัคซีน [76, 77] การวิเคราะห์ทางภูมิคุ้มกันแสดงให้เห็นว่าโครงสร้างวัคซีนของเรามีเอพิโทปเซลล์บีเชิงเส้นจำนวนมากซึ่งเป็นที่ต้องการอย่างมากสำหรับวัคซีนที่ผลิตขึ้นเพื่อใช้ในการป้องกันภูมิคุ้มกัน เราใช้เครื่องมือสองอย่างที่แตกต่างกันเพื่อการคาดการณ์ที่แม่นยำยิ่งขึ้น เซิร์ฟเวอร์ทั้งสองทำนายเอพิโทปของบีเซลล์ที่เพียงพอในลำดับวัคซีน วัคซีนที่ออกแบบนี้คาดการณ์ว่าไม่มีสารก่อภูมิแพ้ ไม่เป็นพิษ และมีภูมิคุ้มกันเพียงพอที่จะกระตุ้นปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันที่เหมาะสม การวิเคราะห์ทางเคมีกายภาพในเวลาต่อมาพบว่าเปปไทด์ของวัคซีนมีความเป็นกรดเล็กน้อย (pI 5.98) โดยมีดัชนีอะลิฟาติกสูงกว่ามาก (78.34) ซึ่งบ่งบอกถึงธรรมชาติที่ทนความร้อนได้ ค่า GRAVY เป็นลบ (−0.14) บ่งชี้ว่าเปปไทด์เป็นแบบที่ชอบน้ำ ซึ่งมีส่วนช่วยเสริมศักยภาพของเปปไทด์ในฐานะวัคซีน องค์ประกอบโครงสร้างรองของวัคซีนถูกกำหนดโดยเซิร์ฟเวอร์ PSIPRED v 4.0 ซึ่งเป็นหนึ่งในวิธีการคำนวณที่แม่นยำที่สุดและใช้กันอย่างแพร่หลายที่สุดสำหรับการทำนายโครงสร้างรองของโปรตีน นอกจากนี้ โครงสร้าง 3 มิติสำหรับเปปไทด์ที่ออกแบบยังได้รับการคาดการณ์โดยใช้เซิร์ฟเวอร์ I-TASSER ที่ให้ข้อมูลโดยละเอียดเกี่ยวกับพิกัดของสารตกค้างที่สำคัญของโปรตีน ซึ่งมีความสำคัญยิ่งในการศึกษาพลวัต ฤทธิ์ทางชีวภาพ และปฏิสัมพันธ์ของวัคซีน กับลิแกนด์อื่นๆ โครงสร้างตติยภูมิเริ่มต้นได้รับการปรับปรุงและตรวจสอบโดยใช้เครื่องมือตรวจสอบโครงสร้างโปรตีนเพื่อค้นหาและแก้ไขข้อผิดพลาดที่อาจเกิดขึ้นในสายด้านข้างหรือกระดูกสันหลังของแบบจำลองที่คาดการณ์ไว้ การวิเคราะห์พล็อตเรื่องรามจันทรันแสดงให้เห็นว่ามากกว่า 90% ของสิ่งตกค้างของแบบจำลองที่ได้รับการปรับปรุงนั้นอยู่ภายในขอบเขตที่อนุญาต โดยมีเปอร์เซ็นต์ของค่าผิดปกติเพียงเล็กน้อย ในขณะที่เซิร์ฟเวอร์ ERRAT แสดงปัจจัยด้านคุณภาพที่ 43.542 ซึ่งล้วนเกี่ยวข้องกับคุณภาพของแบบจำลองที่น่าพึงพอใจ พบว่าแบบจำลอง 3 มิติที่ได้รับการตรวจสอบความถูกต้องมีจำนวนอีพิโทปของบีเซลล์ที่มีโครงสร้างเพียงพอโดยเซิร์ฟเวอร์ ElliPro ซึ่งแสดงเป็นนัยว่าโมเดลอาจสร้างการตอบสนองของบีเซลล์ที่ต้องการและกระตุ้นการผลิตแอนติบอดีจำเพาะในเจ้าบ้าน การกระตุ้นบีเซลล์ยังมีความสำคัญต่อความจำทางภูมิคุ้มกันและรับผิดชอบต่อภูมิคุ้มกันที่ยาวนานในผู้ที่ได้รับการฉีดวัคซีน ปฏิกิริยาระหว่างวัคซีนกับตัวรับภูมิคุ้มกัน (TLR) ได้รับการประเมินโดยทำการวิเคราะห์การเชื่อมต่อด้วย พบว่าวัคซีนเปปไทด์มีสัมพรรคภาพสูงที่สุดสำหรับ TLR-2 รองลงมาคือ TLR-5 แม้ว่าจะสามารถจับกับ TLR อื่นๆ ได้ในระดับที่น้อยกว่าก็ตาม การโต้ตอบกับ TLR เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการกระตุ้นภูมิคุ้มกันในการป้องกัน เนื่องจากการศึกษาก่อนหน้านี้เกี่ยวกับแบบจำลองสัตว์บันทึกไว้ว่า Leishmania สายพันธุ์ต่าง ๆ หรือส่วนประกอบแอนติเจนของพวกมันมีปฏิกิริยากับ TLR ต่าง ๆ ที่นำไปสู่การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่รุนแรงในโฮสต์ที่ถูกท้าทาย เพื่อให้เป็นไปตามข้อกำหนดสำหรับการแสดงออกที่น่าพอใจของโปรตีนวัคซีนรีคอมบิแนนท์ในระบบโฮสต์ของ E. coli (K12) การปรับโคดอนให้เหมาะสมได้ดำเนินการโดยการใช้เครื่องมือ JCat ที่ปรับเนื้อหา CAI และ GC ของลำดับ ทำให้เหมาะสำหรับการแสดงออกใน อี. โคไล ในการโคลนซิลิโกยังดำเนินการโดยใช้เวกเตอร์การแสดงออกที่มีพลาสมิดเป็นพื้นฐาน pET28a(+) เพื่อแสดงความเป็นไปได้ของลำดับสำหรับการโคลนและการแสดงออกมากเกินไปเพื่อให้ได้การผลิตโปรตีนวัคซีนชนิดรีคอมบิแนนท์ที่เพิ่มขึ้น การทำนายโครงสร้างรองของ mRNA ที่เข้ารหัสโดยลำดับยีนไคเมอริกถูกสร้างขึ้นเพื่อแสดงความเสถียรของโครงสร้างพับของ mRNA ซึ่งจะส่งผลต่อกระบวนการแปลที่มีประสิทธิภาพในโฮสต์ของแบคทีเรีย การกลายพันธุ์ที่ทำให้เสถียรถูกสร้างขึ้นโดยการเพิ่มการเชื่อมโยงไดซัลไฟด์ใหม่ในโปรตีนวัคซีน เนื่องจากมันจะมีส่วนทำให้โปรตีนพื้นเมืองมีความแข็งแรง ทำให้คล้อยตามสำหรับการสำรวจทางชีวเคมี ภูมิคุ้มกัน และเทคโนโลยีชีวภาพเพิ่มเติม

รูปที่ 9 การจำลองภูมิคุ้มกันบนเซิร์ฟเวอร์ C-immsim ก การสร้างแอนติเจนทั้งหมดและการสร้างแอนติบอดีตามลำดับ ข ประวัติการผลิตไซโตไคน์ การสร้างทีเซลล์ตัวช่วยใน c และ d และจำนวนทีลิมโฟไซต์ที่เป็นพิษต่อเซลล์ทั้งหมด (ที่ออกฤทธิ์และพักอยู่) การตอบสนองของเซลล์ e บีหลังการให้วัคซีน

รูปที่ 10 การจำลองไดนามิกเชิงโมเลกุล a ความสามารถในการเปลี่ยนรูปของสายโซ่หลักที่ระบุโดยบานพับ b NMA สร้างปัจจัย B ที่แสดงความเสถียรของโปรตีน c ค่าลักษณะเฉพาะเพื่อทำให้โครงสร้างของด็อกกิ้งคอมเพล็กซ์เปลี่ยนรูป d บุคคล (สีม่วง) % ของความแปรปรวนและสะสม (สีเขียว) ของโครงสร้าง e เมทริกซ์ความแปรปรวนร่วมมีความสัมพันธ์กัน (สีแดง) ไม่สัมพันธ์กัน (สีขาว) หรือต่อต้านความสัมพันธ์ (สีน้ำเงิน) ระหว่างคู่ของอะตอม แบบจำลองเครือข่ายยืดหยุ่น f แสดงสปริงที่เชื่อมต่อกันระหว่างคู่ของอะตอม สีเทาเข้มหมายถึงสปริงที่แข็ง และในทางกลับกัน

คุณประโยชน์อาหารเสริม cistanche - เพิ่มภูมิคุ้มกัน

คลิกที่นี่เพื่อดูผลิตภัณฑ์ Cistanche Enhance Immunity

【สอบถามเพิ่มเติม】 อีเมล:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

บทสรุป

ในงานปัจจุบัน เราได้ใช้ประโยชน์จากวิธีการฉีดวัคซีนแบบย้อนกลับสำหรับการออกแบบ in silico ของวัคซีนเปปไทด์หลายหน่วยย่อยแบบหลายวาเลนต์เพื่อต่อต้านโรคลิชมาเนียของมนุษย์ (ทั้งอวัยวะภายในและผิวหนัง) ที่อาจสามารถให้การป้องกันที่แตกต่างกันจากปรสิตลิชมาเนียทั่วไปที่ติดเชื้อในมนุษย์ และ จึงถือได้ว่าเป็นสเปกตรัมกว้างในธรรมชาติ วิธีเดียวกันนี้สามารถนำไปใช้กับโปรแกรมการฉีดวัคซีนทั่วไปเพื่อควบคุมและกำจัดโรคให้เป็นกลยุทธ์เสริมควบคู่ไปกับสารเคมีบำบัดที่มีอยู่ในปัจจุบัน นอกจากนี้ เราได้ใช้ IL-12 เป็นตัวเสริมตามธรรมชาติแทนเปปไทด์สังเคราะห์ที่ไม่ได้ทำให้มีลักษณะของมนุษย์ การใช้ IL-12 เป็นสารเสริมจะช่วยเพิ่มภูมิคุ้มกันของวัคซีนโดยไม่ก่อให้เกิดผลข้างเคียงที่ไม่พึงประสงค์ใดๆ ต่อร่างกายของโฮสต์ โดยมีเงื่อนไขว่าเปปไทด์ของวัคซีนประกอบด้วยเปปไทด์หลายชนิดที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างดีและอาจสร้างภูมิคุ้มกันได้ซึ่งได้จากลิชมาเนียที่ทำให้เกิดโรค 5 สายพันธุ์ จะเป็นประโยชน์ในการกระตุ้นให้เกิดภูมิคุ้มกันข้ามในผู้ที่ได้รับวัคซีน ดังนั้นจึงมีข้อได้เปรียบในการรักษาและป้องกันโรคด้วย การวิเคราะห์ทางอิมมูโนอินฟอร์มาติกที่เข้มงวดต่างๆ โดยใช้เครื่องมือคำนวณหลายอย่างพบว่าวัคซีนที่นำเสนอมีภูมิคุ้มกันบกพร่อง มีความเสถียรและสามารถทำซ้ำได้เป็นโปรตีนรีคอมบิแนนท์และปลอดภัยสำหรับการทดลองในมนุษย์ อย่างไรก็ตาม การตรวจสอบการทดลองยังคงต้องดำเนินการเพื่อรับประกันการกระตุ้นภูมิคุ้มกันที่เหมาะสมและการป้องกันที่ยาวนาน และขจัดความเป็นพิษ

อ้างอิง

1. เดอ-บริโต อาร์ซีเอฟ, คาร์โดโซ่ เจเอ็มโอ, รีส เลส, วิเอรา เจเอฟ, มาเธียส ฟาส, โรแอตต์ บีเอ็ม, อาจูอาร์-โซอาเรส RDDO, รุยซ์ เจซี, เรเซนเด DM และคณะ (2561) วัคซีนเปปไทด์สำหรับโรคลิชมาเนีย. อิมมูนอลด้านหน้า 9:1043

2. Okwor I, Uzonna J (2016) ภาระทางสังคมและเศรษฐกิจของโรคลิชมาเนียในมนุษย์ ฉันคือ J Trop Med Hyg 94(3):489–493. https://doi. org/10.4269/ajtmh.15-0408

3. Mutiso JM, Macharia JC, Gicheru MMJ (2010) ความละเอียดชีวการแพทย์ 24(1):16–25. https://doi.org/10.1016/S1674-8301(10)60004-8

4. Gillespie PM, Beaumier CM, Strych U, Hayward T, Hotez PJ, Bottazzi ME (2016) สถานะของการวิจัยวัคซีนและการพัฒนาวัคซีนสำหรับโรคลิชมาเนีย วัคซีน 34(26):2992–2995. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2015.12.071

5. Joshi S, Rawat K, Yadav NK, Kumar V (2014) Siddiqi MI และ Dube A (2014) Visceral leishmaniasis: ความก้าวหน้าในการพัฒนาวัคซีนผ่านแนวทางคลาสสิกและโมเลกุล อิมมูนอลด้านหน้า 5:380. https://doi.org/10.3389/fmmu.2014.00380

6. Khatoon N, Pandey RK, Prajapati VK (2017) การสำรวจโปรตีนที่หลั่งของ Leishmania เพื่อออกแบบวัคซีนหน่วยย่อยหลาย epitope ของเซลล์ B และ T โดยใช้วิธีการทางอิมมูโนอินฟอร์เมติกส์ ตัวแทนวิทยาศาสตร์ 7:8285

7. Goto Y, Bhatia A, Raman VS, Liang H, Mohammad R, Picone AF, Vidal SEZ, Vedvick TS et al (2011) KSAC ซึ่งเป็นวัคซีนตัวเลือกโพลีโปรตีนตัวแรกที่กำหนดสำหรับโรคลิชมาเนียในอวัยวะภายใน วัคซีนคลินิกอิมมูนอล 18(7):1118–1124 https://doi.org/10.1128/CVI. 05024-11

8. Kedzierski L (2010) วัคซีนโรคลิชมาเนีย: วันนี้เราอยู่ที่ไหน? เจโกลบติดเชื้อ Dis 2(2):177–185. https://doi.org/10.4103/0974- 777X.62881

9. Nagill R, Kaur S (2011) ผู้สมัครรับวัคซีนสำหรับโรคลิชมาเนีย: การทบทวน อินท์ อิมมูโนฟาร์มาคอล 11(10):1464–1488. https://doi.org/ 10.1016/j.intimp.2011.05.008

10. Coler RN, Reed SG (2005) วัคซีนป้องกันลิชมาเนียรุ่นที่สอง เทรนด์พาราซิทอล 21(5):244–249

11. Fernández L, Carrillo E, Sánchez-Sampedro L, Sanchez C, Ibarra Meneses AV, Jimenez MA, Almeida VDA, Esteban M et al (2018) Antigenicity ของแอนติเจน c-kinase ที่กระตุ้นด้วย Leishmania (LACK) ในโมโนนิวเคลียร์ในเลือดของมนุษย์ เซลล์และผลการป้องกันของการฉีดวัคซีนไพรม์บูสต์ด้วย pcI-neo-LACK บวกกับไวรัสวัคซีนที่แสดงออกถึง LACK ที่ถูกลดทอนในหนูแฮมสเตอร์ อิมมูนอลด้านหน้า 9:843. https://doi.org/10.3389/fmmu.2018.00843

12. Kelly BL, Stetson DB, Locksley RM (2003) จำเป็นต้องมีแอนติเจน LACK ที่สำคัญของ Leishmania สำหรับการกำจัดปรสิตของสัตว์มีกระดูกสันหลังอย่างมีประสิทธิภาพ เจประสบการณ์แพทย์ 198(11):1689–1698. https://doi.org/10.1084/jem.20031 162

13. De Mendonça SC, Cysne-Finkelstein L, Matos DC (2015) โปรตีนเมมเบรน Kinetoplastid-11 ในฐานะตัวเลือกวัคซีนและปัจจัยความรุนแรงในลิชมาเนีย อิมมูนอลด้านหน้า 6:524. https://doi.org/ 10.3389/fmmu.2015.00524

14 Joshi PB, Kelly BL, Kamhawi S, Sacks DL, McMaster WR (2002) การลบยีนแบบกำหนดเป้าหมายใน Leishmania major ระบุว่า leishmanolysin (GP63) เป็นปัจจัยที่ก่อให้เกิดความรุนแรง โมลไบโอเคมพาราซิทอล 120(1):33–40. https://doi.org/10.1016/s0166-6851(01)00432-7

15. McMahon-Pratt D, Rodriguez D, Rodriguez JR, Zhang Y, Manson K, Bergman C, Rivas L, Rodriguez JL et al (1993) ไวรัส Recombinant vaccinia ที่แสดง GP46/M-2 ป้องกันการติดเชื้อ Leishmania ติดเชื้อภูมิคุ้มกัน 61(8):3351–3359

16. Holakuyee M, Mahdavi M, Zuhair MH, Abolhasani M (2012) โปรตีนช็อตความร้อนที่อุดมด้วย promastigotes ของ Leishmania สำคัญที่กระตุ้นการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกัน Th2 ในหนู BALB/c อิหร่านไบโอเมด J 16(4):209–217. https://doi.org/10.6091/ibj.1098.2012

17. MacLean L, Price H, O'Toole P (2016) สำรวจเส้นทางการส่งออกโปรตีนผิว B (HASPB) ของ Leishmania hydrophilic acylated โดยวิธีถ่ายภาพเซลล์ที่มีชีวิต วิธีการ โมล ไบโอล 1459:191–203. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-3804-9_13

18. Maharana BR, Tewari AK, Singh V (2015) ภาพรวมเกี่ยวกับแท่งพาราฟาเจลลาร์แบบ kinetoplastid เจ Parasit Dis 39(4):589–595. https:// doi.org/10.1007/s12639-014-0422-x

19 Mahmoudzadeh NH, McKerrow JH (2004) Leishmania tropica: โปรตีเอสซิสเทอีนมีความจำเป็นต่อการเจริญเติบโตและการก่อโรค เอ็กซ์พีพาราซิทอล 106(3–4):158–163. https://doi.org/10.1016/j.exppara. 2004.03.005

20 Mundodi V, Kucknoor AS, Gedamu L (2005) บทบาทของ Leishmania (Leishmania) chagasi amastigote cysteine ​​protease ในการอยู่รอดของปรสิต travellular: การศึกษาโดยการหยุดชะงักของยีนและการยับยั้ง mRNA ของ antisense BMC โมล บิออล 6:3. https://doi.org/10.1186/ 1471-2199-6-3

21. Rogers ME (2012) บทบาทของ leishmania proteo phosphoglycans ในการแพร่กระจายของแมลงวันทรายและการติดเชื้อของโฮสต์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ไมโครไบโอลด้านหน้า 3:223. https://doi.org/10.3389/fmicb.2012.00223

22. Bhowmick S, Ali N (2009) การจำแนกแอนติเจนของ Leishmania donovani ใหม่ที่ช่วยกำหนดความสัมพันธ์ของการป้องกันโดยใช้วัคซีนเป็นสื่อกลางในโรคลิชมาเนียในอวัยวะภายใน โปรดหนึ่ง 4(6):e5820. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005820

23. Assis TM, Mancini DT, Ramalho TC, da Cunha EFF (2014) ในการศึกษาซิลิโกของ Leishmania donovani - tubulin และสารยับยั้ง เจเคม. https://doi.org/10.1155/2014/492579