ฤทธิ์กระตุ้นภูมิคุ้มกันของโพลีแซ็กคาไรด์ที่สกัดน้ำได้จาก Cistanche Deserticola เป็นตัวเสริมของพืช ในหลอดทดลอง และ ใน Vivo

การแนะนำ

วัคซีนมีความสำคัญในการควบคุมหรือป้องกันโรค วัคซีนที่สร้างขึ้นใหม่และพัฒนาอยู่ในปัจจุบันเป็นแอนติเจนชนิดรีคอมบิแนนท์ที่มีความบริสุทธิ์สูงและมีความปลอดภัยสูงกว่า แต่แอนติเจนที่บริสุทธิ์ไม่สามารถกระตุ้นการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันที่น่าพอใจได้ เมื่อเทียบกับการเตรียมเชื้อก่อโรคแบบลดทอนหรือปิดใช้งาน ด้วยความช่วยเหลือของสารเสริม วัคซีนสามารถกระตุ้นให้เกิดการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันแบบถาวร [1,2- สารเสริมที่ทรงพลังชนิดใหม่มีความกังวลอย่างกว้างขวางในวัคซีนทั้งสองชนิดการพัฒนาและสุขภาพของมนุษย์ จนถึงปัจจุบัน มีการระบุและศึกษาสารเสริมหลายชนิดแล้ว สารเสริมเหล่านี้ช่วยให้วัคซีนมีข้อดีหลายประการ รวมถึงการลดปริมาณแอนติเจนที่ต้องการ ลดจำนวนการสร้างภูมิคุ้มกันที่จำเป็นสำหรับการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันตามปกติ และกระตุ้นให้เกิดการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันที่รวดเร็ว กว้างขึ้น และแข็งแกร่งยิ่งขึ้น [3–5- แม้ว่าสารเสริมที่มีศักยภาพหลายชนิดได้รับการพัฒนา เช่น ไลโปโพลีแซ็กคาไรด์ (LPS) และสารเสริมชนิดสมบูรณ์ของฟรอยด์ (FCA) แต่ก็ไม่ได้มีการใช้กันอย่างแพร่หลายเนื่องจากความเป็นพิษ ดังนั้น มีสารเสริมเพียงไม่กี่ชนิด เช่น Alum เท่านั้นที่ได้รับอนุญาตให้ใช้ทางคลินิก [6- โดยรวมแล้ว ควรพัฒนาสารเสริมที่มีประสิทธิภาพและปลอดภัยยิ่งขึ้นเพื่อส่งเสริมวัคซีนป้องกันและรักษาโรคที่ดีขึ้นสำหรับโรคติดเชื้อและไม่ติดเชื้อ

ถังเก็บน้ำธรรมชาติ TUBULOSA เพื่อเพิ่มภูมิคุ้มกัน PHGS75% ECH 30% ACT 12%

ความปลอดภัยเป็นปัจจัยสำคัญในการพิจารณาในการพัฒนาสารเสริม ส่วนประกอบของสมุนไพรจีนประกอบด้วยสารอาหารและสารประกอบออกฤทธิ์ที่สำคัญ เช่น สารประกอบฟีนอลและโพลีแซ็กคาไรด์ ซึ่งสามารถทำหน้าที่เป็นสารกระตุ้นภูมิคุ้มกันอันทรงพลัง [7–9] ในบรรดาโพลีแซ็กคาไรด์จากสมุนไพรจีนโบราณได้รับการสำรวจอย่างกว้างขวาง เนื่องจากมีฤทธิ์กระตุ้นภูมิคุ้มกันและความเป็นพิษต่ำ ตัวอย่างเช่น อินนูลินเป็นสารเสริมภูมิคุ้มกันที่ไม่มีความเป็นพิษของสารเสริมอื่นๆ เช่น FCA นอกจากนี้ AdvaxTM delta inulin adjuvant ยังช่วยเพิ่มภูมิคุ้มกันของวัคซีนได้สำเร็จอีกด้วย [10,11] Astragalus หรือที่รู้จักกันในชื่อ Huangqi ในภาษาจีน และ Radix Astragali ในภาษาละติน แพร่หลายไปทั่วโลก โพลีแซ็กคาไรด์เป็นหนึ่งในส่วนผสมออกฤทธิ์หลักที่รับผิดชอบในการทำงานของระบบภูมิคุ้มกัน การศึกษาเชิงทดลองแสดงให้เห็นว่า Astragalus polysaccharide มีฤทธิ์กระตุ้นภูมิคุ้มกันที่รุนแรงทั้งภายนอกร่างกายและในร่างกาย [12, 13] Lycium barbarum polysaccharides เป็นสารเสริมวัคซีนยังแสดงให้เห็นการปรับปรุงที่ดีและผลการกระตุ้น [14, 15] การศึกษาเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าโพลีแซ็กคาไรด์จากสมุนไพรจีนเป็นตัวเลือกที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการพัฒนาแบบเสริม

ซิสตานเช่ เดซินิโคลาYC Ma (CD, "Rou Cong Rong" ในภาษาจีน) เป็นสมุนไพรจีนโบราณที่มีคุณค่า และมักถูกมองว่าเป็น "โสมแห่งทะเลทราย" เนื่องจากมีฤทธิ์บำรุงที่เหนือกว่า มีการกระจายพันธุ์ในเขตแห้งแล้งหรือกึ่งแห้งแล้งในซินเจียง ในประเทศจีน ก้านเนื้อแห้งถูกนำมาใช้เป็นอาหารบำรุงกำลังมาหลายร้อยปีแล้ว [16, 17] เป็นเวลาหลายปีมาแล้วที่ซีดีต้มถูกใช้เป็นอาหารบำรุงกำลังเพื่อรักษาความบกพร่องที่เกิดจากความเครียดมากเกินไป ซึ่งบ่งบอกว่าปลอดภัยสำหรับการบริหารช่องปาก พืชชนิดนี้ได้รับการพิจารณาอย่างกว้างขวางเนื่องจากมีสรรพคุณทางยาอย่างกว้างขวาง การศึกษาด้านพฤกษเคมีและเภสัชวิทยาล่าสุดแสดงให้เห็นว่าโพลีแซ็กคาไรด์เป็นส่วนประกอบหลักที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพและมีผลกระทบทางชีวภาพต่างๆ รวมถึงฤทธิ์กระตุ้นภูมิคุ้มกัน ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ และฤทธิ์ต้านการอักเสบ[18–21]. อย่างไรก็ตาม ไม่ค่อยมีรายงานกิจกรรมการเสริมภูมิคุ้มกันของโพลีแซ็กคาไรด์ที่สกัดน้ำได้จาก C. Deserticola ในซินเจียง

เป็นที่ทราบกันดีว่า DC เป็นเซลล์ที่สร้างแอนติเจน (APC) ที่สำคัญซึ่งให้สัญญาณที่จำเป็นสำหรับการเริ่มต้นการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันและการปรับเซลล์โดยกำเนิดและเซลล์ที่ปรับตัวได้ สารเสริมบางชนิดที่ปรับปรุงการดูดซึมแอนติเจนโดย DC สามารถเพิ่มการกระตุ้นร่วมหรือโมเลกุล MHC และเพิ่มภูมิคุ้มกัน- เมื่อ DCs เจริญเติบโตเต็มที่ จะมีการสร้างโมเลกุลและไซโตไคน์ที่กระตุ้นร่วมมากขึ้น และ DC จะแสดงฟีโนไทป์ที่แตกต่างกัน [22, 23]

ในการศึกษานี้ ก่อนอื่นเราใช้ประโยชน์ว่า WPCD สามารถส่งเสริมการเปิดใช้งาน DCs ผ่านเส้นทางการส่งสัญญาณ TLR4 ใน vivo หรือไม่ เนื่องจาก DCs มีความเชื่อมโยงระหว่างการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติและการปรับตัว เราจึงตั้งสมมติฐานว่าการกระตุ้น DCs ที่ถูกกระตุ้นโดย WPCD จะส่งผลต่อผลลัพธ์ของภูมิคุ้มกันแบบปรับตัว เราตรวจสอบการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันจำเพาะต่อโอวัลบูมิน (OVA) ในหนูที่รักษาด้วย WPCD รวมถึงไทเตอร์ของคลาสย่อย IgG, IgG1 และ IgG2a, การแพร่กระจายของ T- และ B- และการผลิตไซโตไคน์ เราตรวจสอบว่าการรักษา WPCD จะเพิ่มกิจกรรมของ DC และเซลล์ Treg ในม้ามของหนูเหล่านี้หรือไม่ การค้นพบของเราพิสูจน์ให้เห็นถึงศักยภาพในการกระตุ้นภูมิคุ้มกันของโพลีแซ็กคาไรด์ธรรมชาติจาก C. Deserticola และขยายขอบเขตการใช้งาน

วัสดุและวิธีการ

สัตว์

ซื้อหนูตัวเมีย C57BL / 6, BALB / c หรือ ICR อายุแปดถึงสิบสัปดาห์จากโรงพยาบาลแห่งแรกของมหาวิทยาลัยการแพทย์ Xinjiang (Urimuqi, Xinjiang, China) หนูเหล่านี้ถูกเลี้ยงในสภาพที่ปราศจากเชื้อโรคตามแนวทางของคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ (ACUC) ของมหาวิทยาลัยซินเจียงเพื่อสุขภาพและความเป็นอยู่ที่ดีของสัตว์ ขั้นตอนการทดลองกับสัตว์ได้รับการอนุมัติจาก AUCC ของมหาวิทยาลัยซินเจียง

การสกัดสารสกัดที่เป็นน้ำ

C. Deserticola เป็นพืชในจังหวัดซินเจียงประเทศจีน ได้โพลีแซ็กคาไรด์ดิบจากการสกัดน้ำและการตกตะกอนของเอธานอล โดยสรุป C. Deserticola แห้ง 100 กรัมบดเป็นผงแล้วกรอง ผงถูกไหลย้อนด้วยปิโตรเลียมอีเทอร์ที่อุณหภูมิห้องซ้ำๆ และจากนั้นไหลย้อนด้วยเอทานอลแบบแอนไฮดรัสเป็นเวลา 1 ชั่วโมงเพื่อกำจัดส่วนผสมที่มีสีและไขมันออก สารตกค้างถูกสกัดด้วยน้ำเดือดเป็นเวลาสามครั้ง และสารสกัดถูกรวมเข้าด้วยกัน ปั่นเหวี่ยงที่ 4000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาที และไหลย้อนที่ 60°C เป็นเวลา 4 ชั่วโมง เติมเอทานอล 95% ในปริมาณสี่เท่าลงในสารละลายเพื่อตกตะกอนโพลีแซ็กคาไรด์ดิบ พอลิแซ็กคาไรด์ที่หยาบถูกละลายอีกครั้งในน้ำกลั่นและบำบัดด้วยรีเอเจนต์ Sevage เพื่อกำจัดโปรตีน สารสกัดถูกละลายใน PBS และฆ่าเชื้อผ่านตัวกรอง 0.22-μm ในที่สุด ปริมาณน้ำตาลทั้งหมดของ WPCD อยู่ที่ 59.58% ตามที่ระบุโดยการวิเคราะห์กรดฟีนอล–ซัลฟิวริก [24]

การสร้าง DC

BM-DC ถูกสร้างขึ้นตามวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ โดยมีการแก้ไขเล็กน้อย [25] DC ของไขกระดูกจากหนูเมาส์ C57BL/6 ถูกชะล้างออกด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อที่สมบูรณ์ RPMI-1640 (Gibco) ที่เสริมด้วยซีรั่มน่องของทารกในครรภ์ 10% (ไฮโคลน) เซลล์ที่เก็บรวบรวมถูกแขวนลอยอีกครั้งในตัวกลาง RPMI-1640 ที่มีเมอร์แคปโตเอทานอล 50 ไมโครโมลาร์ (ซิกมา, เซนต์หลุยส์, มิสซูรี) และ GM-CSF ของหนู 20 นาโนกรัม/มิลลิลิตร (เปโพรเทค, ร็อคกี้ฮิลล์, นิวยอร์ก) และบ่มที่ 37˚ C ในบรรยากาศ CO2 5% อาหารเลี้ยงเชื้อครึ่งหนึ่งถูกแทนที่ด้วยอาหารสดที่มี GM-CSF ทุก 1–2 วัน เซลล์ถูกรวบรวมในวันที่ 6 บำบัดด้วยขนาดยาที่แตกต่างกันของ WPCD และ LPS (100 ng/mL) (Sigma, St Louis, MO) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นประเมินโดยโฟลว์ไซโตเมทรี

การตรวจหาการเจริญเติบโตของการกระตุ้น DC และทีเซลล์ ในหลอดทดลอง

ผลการทำให้สุกเต็มที่ ภายนอกร่างกาย ของ WPCD บน BM-DC ถูกประเมินตามผลการวิเคราะห์ฟีโนไทป์โดย FAC ในวันที่ 7 BM–DC จาก C57BL/6 ถูกเหนี่ยวนำต่อหน้า GM-CSF จากนั้นทำการบำบัดด้วย WPCD ที่มีความเข้มข้นต่างกัน (0.01, 0.{{ 11}}2, 0.05, 0.1 และ 0.2 มก./มล.) เป็นเวลา 12 ชั่วโมงเป็นสามเท่า LPS (100 นาโนกรัม/มิลลิลิตร) ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก หลังจากล้าง BM-DC ใน PBS และ Fc Block (BD Biosciences, CA) ถูกใช้เพื่อป้องกันการจับแอนติบอดีแบบไม่จำเพาะ เซลล์ถูกย้อมใน PBS โดยใช้ FITC-, PE- หรือ APC-conjugated CD40, CD11c, CD{ ที่เหมาะสม แอนติบอดี {23}}, CD80 และ MHC-II (BD) เป็นเวลา 20 นาทีที่ 37°C ตรวจพบเซลล์ที่เปื้อนโดย FACs Calibur (BD) การวิเคราะห์ข้อมูลดำเนินการด้วยซอฟต์แวร์ FlowJo (Tree Star)

ในการทดลองการเจริญเติบโตของ DCs ในหลอดทดลอง ยังมีการรวบรวมส่วนลอยเหนือตะกอนของการเพาะเลี้ยงเซลล์เพื่อวิเคราะห์ IL-12 และ TNF- โดยใช้ชุดทดสอบไซโตไคน์ (โบสเตอร์ หวู่ฮั่น จีน) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต วัดการดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตรด้วยเครื่องอ่านเพลท ELISA (Bio-Rad, USA) ปริมาณไซโตไคน์ในตัวอย่างถูกคำนวณด้วยเส้นโค้งมาตรฐานของไซโตไคน์ชนิดลูกผสมตามวิธีเชิงเส้นแบบถดถอย

เพื่อทดสอบฤทธิ์กระตุ้นอัลโลเจนิก การทดลองปฏิกิริยาผสมลิมโฟไซต์ (MLR) ได้ดำเนินการตามวิธีการก่อนหน้า [26] โดยการทดสอบ MTT (Sigma, St Louis, MO) โดยสรุป BM-DC จากหนูเมาส์ C57BL/6 ที่ใช้เป็นเซลล์กระตุ้นถูกทำให้กลับคืนมาในวันที่ 7 ในตัวกลาง RPMI-1640 บวกกับ GM-CSF และบำบัดด้วยความเข้มข้นต่างๆ ของ WPCD เป็นเวลา 12 ชั่วโมงที่ 37°C เซลล์ถูกล้างและแขวนลอยอีกครั้งในตัวกลาง RPMI-1640 ก่อนที่จะชุบลงในจานหลุม 24- เซลล์ตอบสนองต่อสารแขวนลอยซิงเกิลเพลโนไซต์ถูกแยกออกจากหนูเมาส์ BALB/c BM-DC ถูกผสมกับม้ามโตตามอัตราส่วน 1:5 และ 1:10 เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงที่ 37°C ในบรรยากาศ 5% CO2 เป็นเวลาสามวันในลักษณะสามเท่า การบำบัดด้วย LPS ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก ต่อมามีการเติม MTT 20 ไมโครลิตรสำหรับการเพาะปลูก 4- ชั่วโมงสุดท้าย การดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นการวัด (490 นาโนเมตร) และความยาวคลื่นอ้างอิง (650 นาโนเมตร) ถูกวัดสำหรับการวิเคราะห์การเพิ่มจำนวนทีเซลล์ ตัวอย่างทั้งหมดถูกวัดโดยเทียบกับการควบคุมเบื้องหลัง

CISTANCHE TUBULOSA ธรรมชาติสำหรับการปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกันของคุณ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

การบำบัดด้วยสารยับยั้ง TLR4 ในหลอดทดลอง

BM-DCs ได้รับการบำบัดล่วงหน้าด้วย 5 μM TAK-242 (สารยับยั้งของ TLR4, Medchemexpress Inc. USA) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นเพาะเลี้ยงร่วมกับ WPCD ที่มีความเข้มข้นต่างๆ (100 และ 200 ug/ mL) เป็นเวลา 12 ชั่วโมง เมื่อมีหรือไม่มี Golgi Stop เป็นสามเท่า ในการควบคุมเชิงบวก LPS ถูกเพิ่ม เซลล์และส่วนลอยเหนือตะกอนถูกตรวจพบโดย FAC สำหรับการวิเคราะห์มาร์กเกอร์บนพื้นผิว CD86 และ CD40 และโดย ELISA สำหรับการวิเคราะห์ไซโตไคน์ TNF-a และ IL-12 ตามลำดับ

โปรโตคอลการสร้างภูมิคุ้มกัน

การทดสอบความเป็นพิษเฉียบพลัน

ในการทดสอบความเป็นพิษเฉียบพลันทางปากในการศึกษานี้ หนู ICR วัยผู้ใหญ่ที่มีสุขภาพดีจำนวน 40 ตัวถูกนำมาใช้ หนู ICR ถูกอดอาหาร (อาหารแต่ไม่ใช่น้ำข้ามคืน) ก่อนให้ยา WPCD ถูกบริหารให้ทางปากตามลำดับในขนาดยา 0, 50, 500 หรือ 5000 มก./กก. ของน้ำหนักตัวแก่สัตว์แต่ละตัวเป็นเวลา 7 วัน หนูที่ได้รับน้ำเกลือและสารส้มถูกรวมอยู่ในกลุ่มควบคุม สัตว์ถูกสังเกตทุกวันเป็นเวลา 14 วันติดต่อกัน หนูถูกสังเกตเป็นรายบุคคลเพื่อบันทึกการตายและอาการทางคลินิก นอกจากนี้ยังวัดน้ำหนักตัวและการบริโภคอาหารและน้ำตลอดการทดลอง ในวันที่ 14 ดัชนีม้ามหรือไทมัสถูกคำนวณเป็น (น้ำหนักม้ามหรือไธมัส/น้ำหนักตัว) × 10

การตรวจหากิจกรรมการกระตุ้นภูมิคุ้มกัน WPCD ในร่างกาย

เพื่อตรวจสอบว่า WPCD มีฤทธิ์กระตุ้นภูมิคุ้มกันหรือไม่ มีการใช้โอวัลบูมิน (OVA) (Sigma) เป็นแอนติเจนแบบจำลอง และหนู ICR ตัวเมียถูกสุ่มแยกออกเป็น 7 กลุ่ม (กลุ่มควบคุมเชิงลบ (0.9% NaCl และ WPCD 400 ไมโครกรัม) ) และกลุ่มควบคุมเชิงบวก (สารส้ม 200 ไมโครกรัมพร้อม OVA) หนูเมาส์ถูกบริหารให้ใต้ผิวหนังสองครั้งด้วย OVA 10 ไมโครกรัมเพียงอย่างเดียวหรือ WPCD ที่มี OVA ตามขนาดยา 20, 100 หรือ 400 ไมโครกรัม โดยมีช่วงห่าง 2- สัปดาห์ ได้รับตัวอย่างเลือดและม้ามหลังจากการฉีดวัคซีนกระตุ้นเพื่อตรวจหาไทเทอร์ของ IgG, คลาสย่อยของ IgG, การเพิ่มจำนวนของเซลล์ม้ามและไซโตไคน์, เครื่องหมายพื้นผิว DCs และความถี่ Treg

การตรวจหาแอนติบอดีจำเพาะ OVA

ตรวจสอบไตเตอร์และคลาสย่อยของ IgG เฉพาะ OVA โดย ELISA ตามวิธีการก่อนหน้า [27] เพลต ELISA (Nunc, Thermo Fisher Scientific) ถูกเคลือบข้ามคืนแล้วจึงปิดกั้น ตัวอย่างซีรั่มถูกเจือจางตามลำดับสำหรับการวิเคราะห์ไทเทอร์ IgG หรือการตรวจหา IgG1 และ IgG2a (Southern Biotech, Inc.) จากนั้นเพลตถูกบ่มด้วย PBST ซึ่งมี IgG, IgG1 และ IgG2a ของหนูเมาส์ที่คอนจูเกตที่ถูกควบด้วย HRP เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37°C ปฏิกิริยาการวัดสีได้รับการพัฒนาด้วยเตตราเมทิลเบนซิดีน (TMB) จากนั้นวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตร/655 นาโนเมตรและแสดงเป็นหน่วยความหนาแน่นของแสง (OD)

การตรวจหาการแพร่กระจายของม้ามโตและไซโตไคน์

การเพิ่มจำนวนของเซลล์ม้ามถูกกำหนดหาโดยการสอบวิเคราะห์ MTT ในวันที่ 21 หลังจากการฉีดวัคซีนครั้งแรก ได้รับสารแขวนลอยเซลล์ม้ามเดี่ยว เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในตัวกลาง RPMI-1640 ในเพลตของหลุม 96- ตามความเข้มข้นของ 1×106 เซลล์/หลุมในสามเท่า กระตุ้นการเพาะเลี้ยงด้วย OVA (ความเข้มข้นสุดท้าย 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร), ConA (ความเข้มข้นสุดท้าย 5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) (ซิกมา, เซนต์หลุยส์, MO) และ LPS (ความเข้มข้นสุดท้าย 100 นาโนกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 48 ชั่วโมงที่ 37°C . เพาะเลี้ยงเซลล์เป็นเวลา 48 ชั่วโมงและ 20 ไมโครลิตร (5 มก./มล.) ของ MTT (ซิกมา, เซนต์หลุยส์, MO) ถูกเติมลงในแต่ละหลุมและบ่มต่ออีก 4 ชั่วโมง หลังจากเพิ่ม DMSO 50 μL ลงในแต่ละหลุมเพื่อหยุดการพัฒนาสี (Sigma) เพลตจะถูกอ่านที่ 570 นาโนเมตรโดยเครื่องอ่านเพลตไมโครไทเตอร์ (BioRad, CA, USA) การเพิ่มจำนวนของเซลล์ม้ามถูกแสดงเป็นดัชนีการกระตุ้น (SI) ซึ่งเป็นอัตราส่วน OD570 นาโนเมตรของหลุมที่ถูกกระตุ้นต่อหลุมที่ไม่ถูกกระตุ้น

ผลผลิตของ IL-4 และ IFN- ในทีเซลล์ถูกวัดโดยการย้อมสีไซโตไคน์ในเซลล์ตามเกณฑ์วิธีที่เผยแพร่พร้อมการดัดแปลงเล็กน้อย [27, 28] สารแขวนตะกอนม้ามโตเดี่ยวถูกเตรียมในวันที่ 21 หลังจากการฉีดวัคซีนครั้งแรก หลังจากการสลายเซลล์เม็ดเลือดแดง ม้ามโต (2×106 เซลล์/มิลลิลิตร) ถูกบ่มด้วย OVA (10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) สำหรับการกระตุ้น 4- ชั่วโมง และ Golgi stop (BD) ถูกเติมเป็นเวลา 12 ชั่วโมงการฟักตัว PMA เป็นผลบวก ควบคุม. เซลล์ถูกรวบรวม ล้างด้วย PBS ย้อมด้วย CD4-FITC/CD8-FITC และตรึงและทำให้ซึมผ่านด้วยชุด Cytofix/Cytoperm (BD) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต การย้อมสีไซโตไคน์ในเซลล์ถูกดำเนินการด้วยความเข้มข้นที่เหมาะสมของแอนติบอดี IL-4-PE หรือ IFN- -APC ที่ 4°C เป็นเวลา 20 นาที ตรวจพบเซลล์เปื้อนโดย FAC การวิเคราะห์ข้อมูลดำเนินการใน FlowJo

การประเมินการเจริญเติบโตของ DCs และเซลล์ Treg ในม้าม

สำหรับการวิเคราะห์การเจริญเติบโตของ DC จากม้ามโตในหนูขาวเล็ก การย้อมสีผิวเซลล์ถูกดำเนินการด้วยแอนติบอดี CD11c-PE, CD40-FITC และ CD80-APC ในวันที่ 3 หลังจากการฉีดวัคซีนครั้งแรก ได้รับสารแขวนลอยของม้ามโตเดี่ยว (1×106 เซลล์/มิลลิลิตร) และเซลล์ถูกนำไปย้อมสองครั้ง ความเข้มของฟลูออเรสเซนต์ถูกวัดโดย FACs Calibur และข้อมูลที่วัดได้ถูกวิเคราะห์โดย FlowJo

เพื่อสังเกตว่า WPCD สามารถควบคุมความถี่ของเซลล์ CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg ได้หรือไม่ สารแขวนตะกอนม้ามโตเดี่ยวถูกเตรียมในวันที่ 7 หลังจากการฉีดวัคซีนครั้งที่สอง ม้ามโต (2×106 เซลล์/มิลลิลิตร) ถูกนำไปย้อมสีที่ผิวเซลล์ด้วยแอนติบอดี CD4-APC ตามด้วยการย้อมนิวเคลียสไซโตไคน์ด้วยแอนติบอดี CD25-FITC และ Foxp3-PE ที่เหมาะสม ด้วยชุดการย้อมสีทีเซลล์ควบคุมเมาส์ (eBiosciences) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ความถี่ของ CD4+ CD25+ Foxp3+ เซลล์ Treg ได้รับการทดสอบบน FAC การวิเคราะห์ข้อมูลดำเนินการใน FlowJo

การวิเคราะห์ทางสถิติ

การทดสอบการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA) (การทดสอบการเปรียบเทียบหลายรายการของ Tukey) ดำเนินการเพื่อวิเคราะห์ความแตกต่างระหว่างกลุ่มการทดลองหลายกลุ่ม ค่าทั้งหมดจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ±SD ป< 0.05 is believed to be statistically significant. The statistical analyses were performed using Prism 5.0 software.

ผลลัพธ์ WPCD ส่งเสริมการเจริญเติบโตและการทำงานของ BM-DC ในหลอดทดลอง

ภูมิคุ้มกันแบบปรับตัวถูกกำหนดโดยการกระตุ้นของ DC รวมถึงประเภทของโมเลกุลกระตุ้นร่วมและไซโตไคน์ [29, 30] เริ่มแรกเราตรวจสอบว่า WPCD สามารถส่งเสริมการแสดงออกของโมเลกุลกระตุ้นร่วมได้หรือไม่ ตามขนาดยาที่แตกต่างกันของ WPCD, BM-DC

จาก C57BL/6 ถูกบริหารให้ ระดับการแสดงออกของ CD11c, CD86, CD80, CD40 และ MHC-II ในเซลล์ได้รับการวิเคราะห์ (รูปที่ 1) เซลล์ที่ถูกควบคุมด้วย SSC และ FSC แสดงให้เห็นว่าการรักษาด้วย WPCD ในขนาดที่แตกต่างกันไม่ได้เปลี่ยนสัณฐานวิทยาของ BM-DCs (ไม่แสดงข้อมูล) ระดับการแสดงออกของ CD86, CD80 และ CD40 ถูกควบคุมเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยาเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มที่ไม่ได้รับการบำบัดและไปถึงระดับสูงสุดภายใต้ขนาดยา 20 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรของ WPCD แต่ความแตกต่างคือ ไม่สำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม LPS (รูปที่ 1A–1C) ระดับการแสดงออกของ MHC-II เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญจนถึงค่าสูงสุดของมันภายใต้ขนาดยาที่ 50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (รูปที่ 1D) ผลการวิเคราะห์ของเครื่องหมายที่พื้นผิวเซลล์แสดงให้เห็นว่า DC ที่บำบัดด้วย LPS หรือ WPCD แสดงระดับการแสดงออกของ CD86, CD80, CD40 และ MHC-II เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ และส่งเสริมการเจริญเต็มที่ของฟีโนไทป์

สารเสริมบางชนิดสามารถเพิ่มโมเลกุลกระตุ้นร่วมบน DC หรือกระตุ้นการหลั่งของไซโตไคน์โดยตรง IL-12 และ TNF- เป็นไซโตไคน์หลักสำหรับการกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของ Th1 เราวิเคราะห์ผลผลิตของไซโตไคน์ใน BM – DCs จากการรักษา WPCD หลังจากที่ BM–DC ได้รับการบำบัดด้วยเนื้อหาต่างๆ ของ WPCD เป็นเวลา 12 ชั่วโมง ส่วนเหนือตะกอนจะถูกรวบรวมเพื่อตรวจจับเนื้อหาของ IL-12 และ TNF- ด้วยชุดอุปกรณ์ ELISA WPCD สามารถเพิ่มการผลิต IL-12 (รูปที่ 2A) และ TNF- (รูปที่ 2B) ขึ้นกับขนาดยา ผลการวิจัยแสดงให้เห็นว่า WPCD สามารถกระตุ้นให้เกิดการทำงานของ DC ได้เต็มที่

ในการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกัน จำเป็นต้องเปิดใช้งาน DCs ตามหน้าที่ จากนั้นระดับที่สูงขึ้นของการแพร่กระจายของ T-cell allogeneic นั้นเกิดขึ้นจาก DC ที่โตเต็มที่ ดังนั้นการตอบสนองการทำงานของ DC ต่อ WPCD จึงถูกตรวจสอบโดย MLR ความสามารถ allostimulatory ของ DC ที่เกิดจาก WPCD ซึ่งคล้ายกับ LPS ได้รับการปรับปรุงอย่างมากในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยาที่อัตราส่วนที่ระบุ (รูปที่ 2C และ 2D) ผลลัพธ์บ่งชี้ว่า WPCD ปรับปรุงการนำเสนอแอนติเจนและการตอบสนองของทีเซลล์ให้เหมาะสมโดย MLR ในหลอดทดลอง

WPCD ส่งเสริมการเจริญเติบโตของ DCs ผ่านเส้นทาง TLR4

มันสามารถอนุมานได้จากผลลัพธ์ข้างต้นที่ว่า BM-DC ที่ถูกกระตุ้นโดย WPCD ระบุการแสดงออกของโมเลกุลบนพื้นผิว DC ที่คล้ายกันกับ LPS (ลิแกนด์ TLR4) ดังนั้นเราจึงตั้งสมมติฐานว่า BM-DC ถูกเปิดใช้งานโดย WPCD ผ่านเส้นทาง TLR4 หลังจากที่ BM-DC ถูกเตรียมล่วงหน้าด้วย TAK-242 (ตัวยับยั้ง TLR4) และเพาะเลี้ยงร่วมกับ WPCD และ LPS เป็นเวลา 12 ชั่วโมง การแสดงออกของ CD40, CD86, TNF-a หรือ IL{{12 }} ถูกตรวจพบโดย FAC หรือ ELISA ดังที่แสดงในรูปที่ 3A และ 3B การบำบัดด้วย TAK-242 ส่งผลให้เกิดการแสดงออกของ CD40 และ CD86 ที่มีการควบคุมลดลงอย่างมีนัยสำคัญซึ่งชักนำโดย LPS หรือ WPCD และการผลิตไซโตไคน์ของ IL-12 หรือ TNF-a ก็ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเช่นกัน (รูปที่ 3C และ 3D) ผลลัพธ์บ่งชี้ว่า WPCD สามารถกระตุ้นการเจริญเติบโตของ DC ผ่านทางวิถี TLR4

WPCD ช่วยเพิ่มภูมิคุ้มกันของร่างกายและเซลล์

สำหรับการเปรียบเทียบ เราประเมินผลกระทบของ WPCD ต่อการกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกายในหนูที่ได้รับวัคซีน OVA ก่อนฉีดวัคซีนและในวันที่ 14, 21

35 และ 49 หลังจากการฉีดวัคซีนครั้งแรก มีการเก็บเลือดเพื่อตรวจหา IgG titer และ IgG subclasses Serum โดย ELISA การตอบสนองของแอนติบอดี IgG ต่อ OVA เพิ่มขึ้นตามการเพิ่มขึ้นของขนาดยาของการบริหารให้ WPCD (100 และ 400 ไมโครกรัม) ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา (รูปที่ 4) ความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดคือ 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรของ WPCD และเพิ่มการตอบสนองของ IgG สองเท่าเมื่อเปรียบเทียบกับ OVA เพียงอย่างเดียวในวันที่ 21, 35 และ 49 (รูปที่ 4A) การเพิ่มขึ้นอย่างมากในระดับ IgG1 และ IgG2a แอนติบอดีที่จำเพาะต่อ OVA ที่ต่ำกว่า 20 และ 100 ไมโครกรัมของการบริหารให้ WPCD ได้รับการเปรียบเทียบกับกลุ่ม OVA ในซีรั่มในวันที่ 35 (รูปที่ 4B) ในขณะเดียวกัน สารส้มส่งเสริมเฉพาะระดับการแสดงออกของแอนติบอดี IgG และ IgG1 ที่จำเพาะต่อ OVA ในหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกัน WPCD เพียงอย่างเดียวไม่กระตุ้นแอนติบอดีจำเพาะ OVA ผลลัพธ์ข้างต้นบ่งชี้ว่า WPCD สร้างไทเทอร์แอนติบอดีที่สูงกว่าและการตอบสนองของ Th1/Th2 ที่สมดุลมากกว่าสารส้ม

การแพร่กระจายของ Splenocyte เป็นอีกตัวบ่งชี้หนึ่งของภูมิคุ้มกันของเซลล์ ConA กระตุ้นทีเซลล์ และ LPS กระตุ้นการเพิ่มจำนวนบีเซลล์ ในวันที่ 21 หลังการฉีดวัคซีนครั้งแรก ได้รับสารแขวนลอยของเซลล์ม้ามเดี่ยวและกระตุ้นตามลำดับด้วยเปปไทด์ OVA (10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร), OVA323-339 (10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร), ConA (5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) และ LPS ( 5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 48 ชม. จากนั้นวัดการแพร่กระจายของทีเซลล์โดยวิธี MTT WPCD สามารถส่งเสริมการเพิ่มจำนวนเซลล์ม้ามของ OVA, Con A-mitogen และ LPS mitogen อย่างมีนัยสำคัญในหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกันด้วย OVA และ WPCD (รูปที่ 5) และความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดของ WPCD คือ 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่า WPCD เป็นตัวเสริมวัคซีนในหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกัน OVA สามารถกระตุ้นการกระตุ้นการทำงานของ T-cells และ B cells ได้อย่างมีประสิทธิภาพมากกว่า Alum

สารเสริม WCPD ที่ทดสอบทั้งหมดที่มีสูตรผสมวัคซีน OVA สร้างภูมิคุ้มกันของร่างกายและเซลล์ที่แข็งแกร่งพอๆ กัน (รูปที่ 4 และ 5) จากข้อมูลเหล่านี้ เพื่อประเมินอิทธิพลของ WPCD ต่อการตอบสนองของเซลล์ T helper (Th) เฉพาะของ OVA เราได้วิเคราะห์การแสดงออกของไซโตไคน์เพิ่มเติมในเซลล์ T CD8+ และ CD4+ โดย Flow cytometry (รูปที่ 6) . ในวันที่ 21 หลังจากการฉีดวัคซีนครั้งแรก, ม้ามโตตัวเดียวของหนูเมาส์ถูกแยกออกและจากนั้นเพาะเลี้ยงร่วมกับ OVA (10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ผลผลิต IL-4 ในทีเซลล์ CD4+ ในกลุ่มที่บริหารด้วย 100 ไมโครกรัม OVA/WPCD สูงกว่าในกลุ่ม OVA/สารส้มและกลุ่ม OVA อย่างมีนัยสำคัญ และคล้ายคลึงกับผลลัพธ์ใน PMA (รูปที่ 6A) นอกจากนี้ ผลผลิต IFN ในทีเซลล์ CD8+ และ CD4+ ยังได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญในหนูที่บริหารด้วย OVA/WPCD (20, 100 และ 400 ไมโครกรัม) (รูปที่ 6B และ 6C) เมื่อเปรียบเทียบกับสารเสริมสารส้ม WPCD แสดงความสามารถที่ดีกว่าในการกระตุ้นการหลั่งของ IL-4 และ IFN จากทีเซลล์

การเจริญเติบโตของ DCs ที่กระตุ้นด้วย WPCD และความถี่ Treg ที่ลดลง ใน vivo DCs ได้รับการยอมรับว่าเป็น APC ที่มีศักยภาพมากที่สุดที่เกี่ยวข้องกับการเริ่มต้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันปฐมภูมิ ดังนั้นในวันที่ 3 หลังจากการฉีดวัคซีนครั้งแรก เรายังตรวจสอบผลกระทบของ WPCD ต่อ CD40 และ CD80 ต่อ DCs ในม้ามในหนู (รูปที่ 7A และ 7B) หนูในกลุ่ม 100-ug OVA/WPCD ผลิตระดับ CD40 และ CD80 บน DC ที่สูงกว่าหนูในกลุ่ม OVA/สารส้มอย่างมีนัยสำคัญ ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่า WPCD สามารถกระตุ้น DC และกระตุ้นการเจริญเติบโตของ DC ในหนูได้ เซลล์ Treg สามารถปรับสมดุลของความทนทานและการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันได้ เพื่อตรวจสอบเพิ่มเติมว่า WPCD ปรับการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันได้อย่างไร เซลล์ Treg ในม้ามในหนูถูกย้อมด้วยชุดการย้อมสีทีเซลล์ควบคุมด้วยเมาส์ ในวันที่ 21 หลังการฉีดวัคซีนครั้งแรก ความถี่ที่ลดลงของเซลล์ CD25+ Foxp3+ Treg ถูกสังเกตพบใน CD4+ ทีเซลล์ทั้งหมด (รูปที่ 7C) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม OVA และ OVA/สารส้ม กลุ่ม WPCD แสดงความถี่ Treg ที่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ

การประเมินความปลอดภัยของ WPCD ในหนูเมาส์

เพื่อประเมินความเป็นพิษเฉียบพลันเมื่อรับประทาน เราทำการทดสอบความเป็นพิษเฉียบพลัน หนูที่ได้รับยาทางปากด้วยน้ำหนักตัว 5,000 มก./กก. ไม่พบพฤติกรรมที่ผิดปกติหรือผลข้างเคียง และไม่พบการเสียชีวิตในการทดสอบประเมินความเป็นพิษ ไม่มีความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในการเพิ่มน้ำหนักตัว ดัชนีไธมัส และดัชนีม้ามถูกบันทึกไว้ในกลุ่มหนูต่างๆ ที่ได้รับ WPCD ในขนาดต่างกัน และไม่มีความแตกต่างที่มีนัยสำคัญ (ตารางที่ 1) ไม่พบการเสียชีวิตหลังจากผ่านไป 14 วัน ดังนั้นค่า LD50 ของ WPCD จึงมากกว่า 5,000 มก. ต่อน้ำหนักตัวกิโลกรัม

เพื่อทดสอบว่า WPCD มีผลเสียต่อการเจริญเติบโตของหนูหรือไม่ ก่อนและหลังการฉีดวัคซีนใต้ผิวหนังหรือไม่ น้ำหนักตัวจะถูกกำหนดตามลำดับสำหรับหนูแต่ละตัว (ตารางที่ 2) ในการสังเกตหนูครั้งต่อไป ไม่พบผลข้างเคียงหรือพฤติกรรมที่ผิดปกติ นอกจากนี้ น้ำหนักตัวของหนูที่ได้รับ WPCD และหนูที่ได้รับน้ำเกลือหรือ OVA/สารส้ม ไม่มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ ผลการสังเกตเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการบริหารให้ WPCD มีความปลอดภัย

การอภิปราย

สารเสริมเป็นส่วนประกอบสำคัญในวัคซีน [31] เนื่องจากความก้าวหน้าทางจีโนมิกส์และโปรตีโอมิกส์ จึงมีการระบุโมเลกุลรีคอมบิแนนต์และวัคซีนสังเคราะห์มากขึ้นเรื่อยๆ ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีสารเสริมและสูตรผสมเพิ่มเติม สารเสริมที่มีศักยภาพบางชนิดโดยทั่วไปเกี่ยวข้องกับความเป็นพิษที่เพิ่มขึ้น ตัวอย่างเช่น FCA ดังนั้นจึงจำเป็นต้องค้นหาสูตรที่ปลอดภัยซึ่งมีส่วนประกอบที่เสริมฤทธิ์กันต่างกันไปซึ่งจะช่วยกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่ต้องการได้ในที่สุดสารโพลีแซ็กคาไรด์จากสมุนไพรจีนไม่มีพิษและไม่มีผลข้างเคียงที่มีนัยสำคัญ [32,28] จำเป็นต้องมีสารเสริมที่ปลอดภัยสำหรับวัคซีนบางชนิด

Cistanche Deserticola เป็นสมุนไพรบำรุงกำลังที่สำคัญและมีอยู่ทั่วไปในพื้นที่แห้งแล้งและทะเลทรายอันอบอุ่นทางตะวันตกเฉียงเหนือของประเทศจีน Cistanche Deserticola มีความกังวลอย่างกว้างขวางเนื่องจากฤทธิ์ทางชีวภาพ รวมถึงฤทธิ์กระตุ้นภูมิคุ้มกัน สารต้านอนุมูลอิสระ ต้านเชื้อแบคทีเรีย และฤทธิ์ต้านมะเร็ง [20,21] มีความก้าวหน้าบางประการในการจำแนกลักษณะโครงสร้างและกิจกรรมทางภูมิคุ้มกันของ Cistanche Deserticola ซึ่งเป็นตัวเลือกที่ดีสำหรับการพัฒนาสารเสริม เราประเมินผลเชิงทดลองและกลไกของ WPCD ในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย การบริหารให้ใต้ผิวหนังของ WPCD ส่งเสริมการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกายและเซลล์อย่างมีนัยสำคัญโดยการเพิ่มซีรั่มแอนติบอดีและการแพร่กระจายของลิมโฟไซต์, เพิ่มการแสดงออกของไซโตไคน์, เพิ่มการควบคุมการสุกของ DC และควบคุมความถี่ของ CD4+ CD{{5} } ฟ็อกซ์พ3+ เซลล์เทร็ก

DC เป็น APC ที่สำคัญสำหรับการเตรียมทีเซลล์ไร้เดียงสา การเปิดใช้งาน DC เป็นสิ่งสำคัญสำหรับแอดจูแวนท์ DC โดยเฉพาะ DC ที่ได้มาจากไขกระดูกของหนู มักใช้ในการประเมินสารเสริมและวัคซีน Flow cytometry สามารถแยกแยะเซลล์ที่ถูกกระตุ้นหลังจากจับแอนติเจนจากเซลล์โดยรอบ ในการวิเคราะห์ FCM ระดับการรวมตัวของสิ่งกระตุ้น

เซลล์เป็นตัวบ่งชี้ทางอ้อมในการประเมินความปลอดภัยของเครื่องกระตุ้นภูมิคุ้มกัน [3] ดังนั้นข้อมูลกิจกรรมเสริม WPCD ใน DCs ในหลอดทดลอง อาจให้ข้อมูลที่มีคุณค่าสำหรับแบบจำลองสัตว์ ตามแบบจำลอง BM-DC ระดับการแสดงออกของ MHC-II, CD86, CD80 และ CD40, การผลิตไซโตไคน์ และการเพิ่มจำนวนทีเซลล์อัลโลเจนิกถูกตรวจพบในช่วงความเข้มข้น WPCD ที่เหมาะสมที่สุด ระดับการแสดงออกของ MHC-II, CD86, CD80 และ CD40 ได้รับการควบคุมเพิ่มใน BM-DC และผลผลิตของ TNF-a และ IL-12 เพิ่มขึ้นในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา การแพร่กระจายของทีเซลล์ที่เป็นอัลโลจีนิกถูกสังเกตพบ สัณฐานวิทยาของ BM-DCs ไม่มีการเปลี่ยนแปลง ด้วยการกระตุ้นการกระตุ้น BM-DCs และการหลั่งของไซโตไคน์ที่มีการอักเสบ ในหลอดทดลอง สารเสริม WPCD อาจเพิ่มปริมาณแอนติเจนและจำนวน APC อย่างมีนัยสำคัญ และกระตุ้นเซลล์ T ให้หลั่ง IFN- ซึ่งมีส่วนช่วยในการเพิ่มประสิทธิภาพของกิจกรรมภูมิคุ้มกัน

หลากหลายโพลีแซ็กคาไรด์สมุนไพรจีนมีความสามารถในการกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันและมีความสามารถเสริมที่ดีเยี่ยมโดยการกระตุ้นการเจริญเติบโตของ DC โดยวิถี TLR4 [33,28] ดังนั้นเราจึงสันนิษฐานว่า TLR4 มีส่วนร่วมในเส้นทางการส่งสัญญาณของการเจริญเติบโตของ DCs ที่เกิดจาก WPCD ตามที่คาดไว้ การบำบัดด้วยสารยับยั้ง TLR4 ส่งผลให้ TNF-a และ IL-12 ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ นอกจากนี้ การยับยั้งเส้นทาง TLR4 ยังขัดขวางการแสดงออกของ CD40 และ CD80 บน DCs ซึ่งบ่งชี้ว่าการเจริญเติบโตของ DC ขึ้นอยู่กับ TLR4 ดังนั้นจึงเห็นได้ชัดว่า TLR4 มีส่วนร่วมในการเจริญเติบโตของ DCs ที่เกิดจาก WPCD

ถังเก็บน้ำธรรมชาติ TUBULOSA สำหรับการปรับปรุงภูมิคุ้มกัน PHGS75% ECH 30% ACT 12%

ปริมาณที่เหมาะสมของสารเสริมและสูตรวัคซีนถูกกำหนดโดยการทดลองหลายครั้ง ในการสำรวจความสัมพันธ์ของการตอบสนองต่อขนาดยาของ WPCD adjuvant และแอนติเจน OVA ในหนู เราได้เลือกขนาดยา WPCD ที่แตกต่างกันตามข้อมูลที่รายงานก่อนหน้านี้จาก BM-DCs ในหลอดทดลอง เพื่อจัดการหนู ICR ใต้ผิวหนังสองครั้ง เราพบว่า WPCD เพิ่มผลผลิตของแอนติบอดีจำเพาะ OVA อย่างมีนัยสำคัญ และกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของ Th1/Th2 ที่สมดุลด้วยการเพิ่มระดับ IgG1 และ IgG2a โดยเฉพาะอย่างยิ่งระดับ IgG2a สูงกว่าที่รักษาด้วยสารส้มในปริมาณที่เหมาะสม ดังนั้น WPCD ส่งผลให้ระดับแอนติบอดีจำเพาะสูงขึ้นและมีประสิทธิภาพสูงขึ้นด้วยการฉีดที่ลดลง

วัคซีนใหม่จำเป็นต้องกระตุ้นการตอบสนองของเซลล์ที่รุนแรง ซึ่งเกี่ยวข้องกับแอนติบอดี, เซลล์ T helper (Th) และ T lymphocytes ที่เป็นพิษต่อเซลล์ (CTL) วัคซีนรักษาโรคมีเป้าหมายเพื่อกระตุ้นการตอบสนองของทีเซลล์ให้แข็งแกร่งขึ้น สารเสริมในอุดมคติจะช่วยเพิ่มประสิทธิภาพของวัคซีนและส่งเสริมภูมิคุ้มกันแบบเซลล์โดยไม่ก่อให้เกิดพิษ [34] ในบรรดาการสังเกตในแบบจำลองหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกัน WPCD นำไปสู่การเพิ่มจำนวนของเซลล์ม้ามที่จำเพาะต่อ OVA และไม่จำเพาะเมื่อเปรียบเทียบกับสารส้ม สารเสริมบางชนิดควบคุมไซโตไคน์และระบบภูมิคุ้มกัน ตัวอย่างเช่น ซาโปนินอาจกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยอาศัยเซลล์ต่อแอนติเจนซึ่งโดยปกติจะกระตุ้นให้เกิดเฉพาะแอนติบอดีเท่านั้น เราเลือก IL-4 และ IFN- เป็นตัวบ่งชี้เพื่อประเมินระดับภูมิคุ้มกันในหนูโดยอ้อม WPCD สามารถกระตุ้นให้เกิดการหลั่ง IL-4 และ IFN- มากกว่าสารส้ม ดังนั้น การตอบสนองของทีเซลล์ตัวช่วยที่แข็งแกร่งและการหลั่งของไซโตไคน์จึงถูกสังเกตพบอันเป็นผลมาจากการฉีดวัคซีน WPCD ซึ่งบ่งชี้ว่า WPCD สามารถกระตุ้นเซลล์เม็ดเลือดขาวได้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้นเพื่อหลั่งไซโตไคน์ชนิด Th1- และไซโตไคน์ชนิด Th2- มากกว่า สารส้ม.

สารเสริมที่มีอิทธิพลต่อการนำเสนอแอนติเจนอาจส่งผลต่อกระบวนการภูมิคุ้มกันที่ซับซ้อน เซลล์ Treg สามารถปรับการตอบสนองของ Th1 และ Th2 ได้ [35] ขนาดที่เหมาะสมของ WPCD อาจส่งเสริมการเจริญเติบโตของ DCs ในหนูโดยการเพิ่มระดับการแสดงออกของ CD80 และ CD40 และขยายความสามารถของการนำเสนอแอนติเจน OVA ในการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันในระยะเริ่มต้น ผลการทดลองของการกระตุ้น DCs และความถี่ Treg แสดงให้เห็นว่า WPCD ชักนำให้เกิดการเจริญเติบโตของ DCs และลดความถี่ Treg ในม้ามในหนูเมาส์ ผลลัพธ์เหล่านี้พิสูจน์ว่า WPCD เพิ่มประสิทธิภาพของวัคซีน OVA โดยเพิ่มการกำหนดเป้าหมายของเซลล์ที่สร้างแอนติเจน และส่งเสริมการกระตุ้นการทำงานของ T-cell โดยเฉพาะ

ในการพัฒนา adjuvants เป็นการยากที่จะเลือกกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่เหมาะสมต่อการติดเชื้อที่เกี่ยวข้อง สารเสริมที่เหมาะสมควรมีผลข้างเคียงและความเป็นพิษต่ำต่อมนุษย์หรือสัตว์ ดังนั้นควรคำนึงถึงความปลอดภัยของ WPCD รวมถึงผลข้างเคียงที่เกิดขึ้นในทันทีและระยะยาว ในการศึกษานี้ เราได้สำรวจความเป็นพิษเฉียบพลันของ WPCD และผลเสียของ WPCD ต่อประสิทธิภาพการเติบโตของหนูเป็นเวลา 110 วัน ผลความเป็นพิษเฉียบพลันของ WPCD พบว่า น้ำหนักตัว ดัชนีไทมัส หรือดัชนีม้าม ไม่มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ ค่า LD50 ของ WPCD มากกว่า 5,000 มก. ต่อน้ำหนักตัวกิโลกรัม ตลอดการทดลองสังเกตหนู ไม่พบผลข้างเคียงหรือพฤติกรรมผิดปกติในหนู ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า WPCD ปลอดภัย

โดยสรุป ในการศึกษานี้ WPCD ซึ่งเป็นโพลีแซ็กคาไรด์ดิบที่สกัดจาก C. Deserticola จากซินเจียง แสดงคุณสมบัติบางอย่างของสารเสริม ตัวอย่างเช่น WPCD เพิ่มการตอบสนองทั้ง Th1 และ Th2 โดยการกระตุ้น DC, เพิ่มการตอบสนองของแอนติบอดี และปรับปรุงการผลิตไซโตไคน์ นอกจากนี้เรายังสำรวจกลไกของประสิทธิภาพ WPCD โดยการวิเคราะห์การเจริญเติบโตและการทำงานของ DCs ผ่านทางเส้นทาง TLR4 ในหลอดทดลอง ในหนูที่ได้รับการรักษาด้วย WPCD เท่านั้น ไม่พบผลข้างเคียงที่ชัดเจน ดังนั้น WPCD จึงมีฤทธิ์กระตุ้นภูมิคุ้มกันที่สูงขึ้นในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของเซลล์และร่างกาย สารเสริมเป็นส่วนผสมของสารประกอบหลายชนิด ส่วนผสมของสารสกัดหยาบหลายชนิดอาจมีผลประโยชน์มากกว่าสารสกัดจากพืชชนิดเดียว จำเป็นต้องสำรวจสารสกัด WPCD อย่างเป็นระบบ, ทดสอบประสิทธิภาพและความปลอดภัย, และอธิบายกลไกของผลกระทบ.

ถังเก็บน้ำธรรมชาติ TUBULOSA สำหรับการปรับปรุงภูมิคุ้มกัน PHGS75% ECH 30% ACT 12%