กิจกรรมกระตุ้นภูมิคุ้มกันของพอลิแซ็กคาไรด์ที่สกัดได้จากน้ำจาก Cistanche Deserticola เป็นสารเสริมของพืชในหลอดทดลอง

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:ali.ma@wecistanche.com

Ailian Zhang, Xiumei Yang, Quanxiao Li, Yu Yang, กันจ้าว, Bin Wang, Daocheng Wu

1 Xinjiang Key Lab of Biological Resources and Genetic Engineering, College of Life Science and Technology, มหาวิทยาลัยซินเจียง, อุรุมชี, ซินเจียง, จีน,

2 ห้องปฏิบัติการหลักของไวรัสวิทยาโมเลกุลทางการแพทย์, โรงเรียนวิทยาศาสตร์การแพทย์ขั้นพื้นฐาน, วิทยาลัยการแพทย์เซี่ยงไฮ้, มหาวิทยาลัยฟู่ตัน, เซี่ยงไฮ้, จีน,

3 College of LifeScience and Technology, Xi'an Jiaotong University, Xian, Shanxi, China

เชิงนามธรรม

วัคซีนเสริมที่ปลอดภัยและมีประสิทธิภาพมีความสำคัญในวัคซีนสมัยใหม่ ภาษาจีนต่างๆโพลีแซคคาไรด์สมุนไพรสามารถกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันCistanche deserticola(ซีดี) เป็นสมุนไพรจีนโบราณและเป็นยาเสริม ที่นี่เรายืนยันว่าพอลิแซ็กคาไรด์ที่สกัดด้วยน้ำของ CD (WPCD) สามารถปรับการตอบสนองของภูมิคุ้มกัน ในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา WPCD ส่งเสริมการเจริญเติบโตและการทำงานของเซลล์เดนไดรต์ที่ได้จากไขกระดูก (BM-DCs) อย่างมีนัยสำคัญผ่านการควบคุมระดับการแสดงออกของ MHC -II, CD86, CD80 และ CD40, การงอกขยายของทีเซลล์แบบอัลโลเจนิก และผลผลิตของ IL-12และ TNF- ผ่านทางรีเซพเตอร์ที่คล้ายโทรล 4 (TLR4) ตามที่ระบุโดยการทดลองในหลอดทดลอง นอกจากนี้ยังพบกิจกรรมกระตุ้นภูมิคุ้มกันในหนูด้วย WPCD ปรับปรุงไทเทอร์ของ IgG, IgG1 และ IgG2a อย่างมีประสิทธิภาพ และปรับปรุงการเพิ่มจำนวนของเซลล์ T และ B อย่างเห็นได้ชัด การผลิต IFN- และ IL-4 ใน CD4 บวก T เซลล์ และระดับการแสดงออกของ IFN- ใน CD8 บวกทีเซลล์ได้ดีกว่าสารส้ม นอกจากนี้ WPCD ยังสามารถควบคุมระดับการแสดงออกของ CD40 และ CD80 บน DCs ในม้ามได้อย่างชัดเจนและลดความถี่ Treg การศึกษาชี้ให้เห็นว่าพอลิแซ็กคาไรด์ของ Cistanche deserticola เป็นวัคซีนเสริมที่ปลอดภัยและมีประสิทธิภาพสำหรับการกระตุ้นภูมิคุ้มกันของร่างกายและภูมิคุ้มกันของเซลล์โดยการกระตุ้น DCs ผ่านเส้นทางการส่งสัญญาณ TLR4

คลิกเพื่อดูผลิตภัณฑ์ต้นกำเนิดของ Cistanche

บทนำ

วัคซีนมีความสำคัญต่อการควบคุมหรือป้องกันโรค วัคซีนที่สร้างขึ้นใหม่และกำลังพัฒนาเป็นวัคซีนรีคอมบิแนนท์ที่บริสุทธิ์สูงแอนติเจนด้วยความปลอดภัยที่สูงขึ้น แต่แอนติเจนที่บริสุทธิ์ไม่สามารถกระตุ้นได้อย่างน่าพอใจภูมิคุ้มกันเมื่อเทียบกับการเตรียมเชื้อก่อโรคที่ลดทอนหรือปิดใช้งาน ด้วยความช่วยเหลือของสารเสริม วัคซีนสามารถกระตุ้นให้เกิดการดื้อยาได้ภูมิคุ้มกัน[1,2]. สารเสริมที่ทรงประสิทธิภาพใหม่มีความกังวลอย่างกว้างขวางทั้งในด้านการพัฒนาวัคซีนและสุขภาพของมนุษย์ จนถึงปัจจุบันมีการระบุ adjuvants ต่าง ๆ และศึกษาอย่างกว้างขวาง สารเสริมเหล่านี้ทำให้วัคซีนมีข้อดีหลายประการ รวมถึงการลดจำนวนแอนติเจนที่ต้องการ ลดจำนวนการสร้างภูมิคุ้มกันที่จำเป็นสำหรับการตอบสนองภูมิคุ้มกันตามปกติ และกระตุ้นให้เกิดความรวดเร็ว กว้างขึ้น และแข็งแรงขึ้นภูมิคุ้มกัน[3–5]. แม้ว่าสารเสริมที่มีศักยภาพจำนวนมากได้รับการพัฒนา เช่น lipopolysaccharide (LPS) และ Freund's Complete adjuvant (FCA) พวกมันไม่ได้ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายเนื่องจากความเป็นพิษของพวกมัน ดังนั้น สารเสริมเพียงไม่กี่ชนิด เช่น สารส้ม ที่ได้รับอนุญาตให้ใช้ทางคลินิก [6] โดยรวมแล้ว ควรพัฒนาสารเสริมที่มีประสิทธิภาพและปลอดภัยยิ่งขึ้นเพื่อส่งเสริมวัคซีนป้องกันและรักษาโรคที่ดีขึ้นจากโรคติดเชื้อและไม่ติดเชื้อ

ความปลอดภัยเป็นปัจจัยพิจารณาที่สำคัญในการพัฒนาสารเสริม ส่วนประกอบสมุนไพรจีนประกอบด้วยสารอาหารและสารออกฤทธิ์ที่สำคัญ เช่น สารประกอบฟีนอลและโพลีแซ็กคาไรด์ ซึ่งสามารถทำหน้าที่เป็นสารกระตุ้นภูมิคุ้มกันที่มีประสิทธิภาพ [7–9] ในหมู่พวกเขา โพลีแซ็กคาไรด์จากสมุนไพรจีนโบราณได้รับการศึกษาอย่างกว้างขวางเนื่องจากกิจกรรมกระตุ้นภูมิคุ้มกันและความเป็นพิษต่ำ ตัวอย่างเช่น อินนูลินเป็นสารเสริมภูมิคุ้มกันโดยไม่มีความเป็นพิษของสารเสริมอื่นๆ เช่น FCA AdvaxTM delta inulin adjuvant ยังประสบความสำเร็จในการเพิ่มภูมิคุ้มกันของวัคซีน [10,11] Astragalus หรือที่เรียกว่า Huangqi ในภาษาจีนและ Radix Astragali ในภาษาละติน มีการกระจายอย่างกว้างขวางทั่วโลก โพลีแซ็กคาไรด์เป็นหนึ่งในส่วนผสมหลักที่ทำหน้าที่กระตุ้นภูมิคุ้มกัน การศึกษาทดลองได้แสดงให้เห็นว่า Astragalus polysaccharide มีผล immunomodulatory ที่แข็งแกร่งทั้งในหลอดทดลองและในร่างกาย [12, 13] Lycium barbarum polysaccharides เป็นสารเสริมวัคซีนยังแสดงให้เห็นการปรับปรุงที่ดีและมีผลกระตุ้น [14, 15] การศึกษาเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าพอลิแซ็กคาไรด์สมุนไพรจีนเป็นตัวเลือกที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการพัฒนาแบบเสริม

Cistanche Deserticola YC Ma(ซีดี "Rou Cong Rong" ในภาษาจีน) เป็นสมุนไพรจีนโบราณที่มีคุณค่าและมักถูกมองว่าเป็น "โสมแห่งทะเลทราย" เนื่องจากมีฤทธิ์เป็นยาชูกำลังที่เหนือชั้น มีการกระจายในพื้นที่แห้งแล้งหรือกึ่งแห้งแล้งในซินเจียง ในประเทศจีนมีการใช้ก้านเนื้อแห้งเป็นยาชูกำลังมาหลายร้อยปี [16, 17] หลายปีที่ผ่านมา ซีดีต้มถูกใช้เป็นยาชูกำลังเพื่อรักษาความบกพร่องที่เกิดจากการทำงานมากเกินไป ซึ่งบ่งชี้ว่าปลอดภัยสำหรับการบริหารช่องปาก พืชชนิดนี้มีความกังวลอย่างกว้างขวางเนื่องจากมีหน้าที่ทางยาในวงกว้าง การศึกษาพฤกษเคมีและเภสัชวิทยาเมื่อเร็ว ๆ นี้แสดงให้เห็นว่าพอลิแซ็กคาไรด์เป็นส่วนประกอบหลักที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพและมีผลทางชีวภาพต่างๆ รวมถึงฤทธิ์กระตุ้นภูมิคุ้มกัน ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ และฤทธิ์ต้านการอักเสบ (18-21] อย่างไรก็ตาม แทบไม่มีรายงานเกี่ยวกับกิจกรรมการเสริมสร้างภูมิคุ้มกันของพอลิแซ็กคาไรด์ที่สกัดด้วยน้ำจาก C. deserticola ในซินเจียง

เป็นที่ทราบกันดีว่า DCs เป็นเซลล์ที่สร้างแอนติเจน (APC) ที่สำคัญซึ่งให้สัญญาณที่จำเป็นสำหรับการเริ่มต้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันและการปรับเซลล์โดยกำเนิดและเซลล์ที่ปรับตัวได้ สารเสริมบางชนิดที่ปรับปรุงการดูดซึมแอนติเจนโดย DC สามารถเพิ่มโมเลกุลกระตุ้นร่วมหรือ MHC และเพิ่มภูมิคุ้มกัน เมื่อ DCs สุกเต็มที่ จะมีการผลิตโมเลกุลและไซโตไคน์ที่กระตุ้นร่วมกันมากขึ้น และ DCs แสดงฟีโนไทป์ที่แตกต่างกัน [22, 23]

ในการศึกษานี้ ก่อนอื่นเราใช้ประโยชน์จากว่า WPCD สามารถส่งเสริมการเปิดใช้งาน DC ผ่านเส้นทางการส่งสัญญาณ TLR4 ในร่างกายได้หรือไม่ เนื่องจาก DCs เป็นตัวเชื่อมระหว่างการตอบสนองของภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติและแบบปรับตัว เราจึงตั้งสมมติฐานว่าการกระตุ้น DC ที่กระตุ้นโดย WPCD จะส่งผลต่อผลลัพธ์ของภูมิคุ้มกันแบบปรับตัว เราตรวจสอบการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันจำเพาะต่อโอวัลบูมิน (OVA) ในหนูที่ได้รับการรักษาด้วย WPCD ซึ่งรวมถึงไทเทอร์ของคลาสย่อย IgG, IgG1 และ IgG2a การเพิ่มจำนวน T- และ B และการผลิตไซโตไคน์ เราตรวจสอบว่าการรักษา WPCD จะเพิ่มกิจกรรมของเซลล์ DCs และ Treg ในม้ามของหนูเหล่านี้หรือไม่ การค้นพบของเราพิสูจน์ให้เห็นถึงศักยภาพในการกระตุ้นภูมิคุ้มกันของพอลิแซ็กคาไรด์ตามธรรมชาติจาก C. deserticola และขยายขอบเขตการใช้งาน

วัสดุและวิธีการ

สัตว์

หนูเพศเมีย C57BL/6, BALB/c หรือ ICR อายุแปดถึงสิบสัปดาห์ถูกซื้อมาจากโรงพยาบาลแห่งแรกของมหาวิทยาลัยการแพทย์ซินเจียง (อุรุมชี ซินเจียง ประเทศจีน) หนูถูกเลี้ยงภายใต้สภาวะปลอดเชื้อโรคตามแนวทางของคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ (ACUC) ของมหาวิทยาลัยซินเจียงเพื่อสุขภาพและความเป็นอยู่ของสัตว์ ขั้นตอนการทดลองกับสัตว์ได้รับการอนุมัติจาก AUCC ของมหาวิทยาลัยซินเจียง

การสกัดสารสกัดน้ำ

C. deserticola เป็นโรงงานในจังหวัดซินเจียงในประเทศจีน พอลิแซ็กคาไรด์ดิบได้มาจากการสกัดด้วยน้ำและการตกตะกอนของเอทานอล โดยสังเขป C. deserticola แห้ง 100 กรัมถูกบดเป็นผงแล้วกรอง ผงถูกรีฟลักซ์ด้วยปิโตรเลียมอีเทอร์ที่อุณหภูมิห้องซ้ำแล้วซ้ำเล่า จากนั้นจึงรีฟลักซ์ด้วยเอทานอลปราศจากน้ำเป็นเวลา 1 ชั่วโมงเพื่อขจัดส่วนผสมที่มีสีและไขมัน สกัดสารตกค้างด้วยน้ำเดือดสามครั้ง และสารสกัดถูกรวมเข้าด้วยกัน หมุนเหวี่ยงที่ 4000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 10 นาที และไหลย้อนที่ 60˚C เป็นเวลา 4 ชั่วโมง เอทานอล 95 เปอร์เซ็นต์ปริมาตรสี่เท่าถูกเติมลงในสารละลายเพื่อตกตะกอนโพลีแซคคาไรด์ที่ยังไม่ผ่านกระบวนการ พอลิแซ็กคาไรด์แบบหยาบถูกละลายอีกครั้งในน้ำกลั่นและบำบัดด้วยรีเอเจนต์ที่โหดเหี้ยมเพื่อกำจัดโปรตีน สารสกัดถูกละลายใน PBS และฆ่าเชื้อผ่านตัวกรอง 0.22-μm ในที่สุด ปริมาณน้ำตาลทั้งหมดของ WPCD เท่ากับ 59.58 เปอร์เซ็นต์ ตามที่ระบุโดยการวิเคราะห์กรดฟีนอล–ซัลฟิวริก [24]

การสร้าง DCs

BM-DC ถูกสร้างขึ้นตามวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยมีการดัดแปลงเล็กน้อย [25] DC ของไขกระดูกจากหนูเมาส์ C57BL/6 ถูกชะล้างด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อที่สมบูรณ์ของ RPMI-1640 (Gibco) ที่เสริมด้วยซีรัมของทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ (Hyclone) เซลล์ที่เก็บรวบรวมถูกแขวนลอยใหม่ในตัวกลาง RPMI-1640 ที่มี 50 ไมโครโมลาร์ -เมอร์แคปโตเอธานอล (ซิกมา, เซนต์หลุยส์, MO) และ GM-CSF ของหนู 20 ng/mL (Peprotech, Rocky Hill, NY) และบ่มที่ 37˚ C ในบรรยากาศ CO2 5 เปอร์เซ็นต์ ครึ่งหนึ่งของอาหารเลี้ยงเชื้อถูกแทนที่ด้วยอาหารสดที่มี GM-CSF ทุก ๆ 1-2 วัน เซลล์ถูกรวบรวมในวันที่ 6, บำบัดด้วยขนาดยาที่ต่างกันของ WPCD, LPS (100 นาโนกรัม/มิลลิลิตร) (ซิกมา, เซนต์หลุยส์, MO) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และจากนั้นประเมินโดยโฟลว์ไซโตเมตรี

การตรวจจับการเจริญเติบโตของ DC และการกระตุ้นทีเซลล์ในหลอดทดลอง

ผลการสุกในหลอดทดลองของ WPCD บน BM-DCs ได้รับการประเมินตามผลการวิเคราะห์ฟีโนไทป์โดย FAC ในวันที่ 7 BM–DC จาก C57BL/6 ถูกเหนี่ยวนำในการมีอยู่ของ GM-CSF และจากนั้นบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ WPCD (0.01, 0.{{11 }}2, 0.05, 0.1 และ 0.2 มก./มล.) เป็นเวลา 12 ชม. เพิ่มขึ้นสามเท่า LPS (100 นาโนกรัม/มิลลิลิตร) ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก หลังจากที่ BM-DC ถูกล้างใน PBS และ Fc Block (BD Biosciences, CA) ถูกใช้เพื่อป้องกันการจับแอนติบอดีที่ไม่จำเพาะ เซลล์ถูกย้อมสีใน PBS โดยใช้ FITC-, PE- หรือ APC-conjugatedCD40, CD11c, CD ที่เหมาะสม แอนติบอดี {24}}, CD80 และ MHC-II (BD) เป็นเวลา 20 นาทีที่ 37˚C เซลล์ที่เปื้อนถูกตรวจพบโดย FACs Calibur (BD) การวิเคราะห์ข้อมูลดำเนินการด้วยซอฟต์แวร์ FlowJo (Tree Star)

ในการทดลองการเจริญเต็มที่ของ DCS ในหลอดทดลอง สารเหนือตะกอนจากการเพาะเลี้ยงเซลล์ยังถูกรวบรวมเพื่อวิเคราะห์ IL-12 และ TNF- โดยใช้ชุดทดสอบไซโตไคน์ (เมืองโบสเตอร์ หวู่ฮั่น ประเทศจีน) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต การดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตรถูกวัดด้วยเครื่องอ่านเพลต ELISA (Bio-Rad, USA) ปริมาณไซโตไคน์ในตัวอย่างคำนวณด้วยกราฟมาตรฐานของรีคอมบิแนนท์ไซโตไคน์ตามวิธีเชิงเส้นการถดถอย

เพื่อทดสอบฤทธิ์กระตุ้น allogenic ของพวกมัน การทดลองของปฏิกิริยาลิมโฟไซต์แบบผสม (MLR) ได้ดำเนินการตามวิธีการก่อนหน้า [26] โดยการทดสอบ MTT (Sigma, St Louis, MO) โดยย่อ BM-DC จากหนูเมาส์ C57BL/6 ที่ใช้เป็นเซลล์ตัวกระตุ้นถูกนำกลับคืนในวันที่ 7 ในตัวกลาง RPMI-1640 บวกกับ GM-CSF และบำบัดด้วยความเข้มข้นต่างๆ ของ WPCD เป็นเวลา 12 ชั่วโมงที่ 37˚C เซลล์ถูกล้างและแขวนลอยใหม่ในตัวกลาง RPMI-1640 ก่อนชุบลงในจานหลุม 24-หลุม สารแขวนลอยซิงเกิลเพลโนไซต์ในฐานะเซลล์ตอบสนองถูกแยกออกจากหนูเมาส์ BALB/c BM-DC ถูกผสมกับเซลล์ม้ามตามอัตราส่วน 1:5 และ 1:10 เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงที่ 37˚C ในบรรยากาศ CO2 5 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลาสามวันในสามเท่า การบำบัดด้วย LPS ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก ต่อมาได้มีการเพิ่มวัฒนธรรมด้วย MTT 20 ไมโครลิตรสำหรับการเพาะปลูก 4- ชั่วโมงสุดท้าย การดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นการวัด (490 นาโนเมตร) และความยาวคลื่นอ้างอิง (650 นาโนเมตร) ถูกวัดสำหรับการวิเคราะห์การเพิ่มจำนวนทีเซลล์ ตัวอย่างทั้งหมดถูกวัดโดยเทียบกับตัวควบคุมพื้นหลัง

การรักษาโดยตัวยับยั้ง TLR4 ในหลอดทดลอง

BM-DC ถูกบำบัดล่วงหน้าด้วย 5 ไมโครโมลาร์ TAK-242 (ตัวยับยั้งของ TLR4, Medchemexpress Inc.USA) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นจึงเพาะเลี้ยงร่วมกันด้วยความเข้มข้นต่างๆ ของ WPCD (100 และ 200 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 12 ชั่วโมง ในที่ที่มีหรือไม่มี Golgi Stop เป็นสามเท่า ในกลุ่มควบคุมเชิงบวก เพิ่ม LPS เซลล์และส่วนลอยเหนือตะกอนถูกตรวจพบโดย FAC สำหรับการวิเคราะห์เครื่องหมายพื้นผิว CD86และ CD40 และโดย ELISA สำหรับการวิเคราะห์ไซโตไคน์ TNF-a และ IL-12 ตามลำดับ

โปรโตคอลการสร้างภูมิคุ้มกัน

การทดสอบความเป็นพิษเฉียบพลัน ในการทดสอบความเป็นพิษเฉียบพลันทางปากในการศึกษานี้ ใช้หนู ICR สำหรับผู้ใหญ่ที่มีสุขภาพดี 40 ตัว หนูเมาส์ ICR ถูกอดอาหาร (อาหารแต่ห้ามดื่มน้ำข้ามคืน) ก่อนให้ยา WPCD ถูกบริหารให้ทางปากตามลำดับในปริมาณ 0, 50, 500 หรือ 5000 มก./กก. ของน้ำหนักตัวแก่สัตว์แต่ละตัวเป็นเวลา 7 วัน หนูเมาส์ที่ได้รับน้ำเกลือและหนูที่ได้รับการบำบัดด้วยสารส้มถูกรวมไว้ในกลุ่มควบคุม สัตว์ถูกสังเกตทุกวันภายใน 14 วันติดต่อกัน มีการสังเกตหนูเป็นรายบุคคลเพื่อบันทึกการตายและอาการทางคลินิก นอกจากนี้ยังมีการวัดน้ำหนักตัวและการบริโภคอาหารและน้ำตลอดการทดลอง ในวันที่ 14 ดัชนีม้ามหรือต่อมไทมัสคำนวณเป็น (น้ำหนักม้ามหรือต่อมไทมัส/น้ำหนักตัว) × 10

การตรวจหากิจกรรมกระตุ้นภูมิคุ้มกัน WPCD ในร่างกาย เพื่อตรวจสอบว่า WPCD มีฤทธิ์กระตุ้นภูมิคุ้มกันหรือไม่ ovalbumin (OVA) (Sigma) ถูกใช้เป็นแบบจำลองแอนติเจนและหนู ICR เพศเมียถูกสุ่มแยกออกเป็น 7 กลุ่ม (กลุ่มควบคุมเชิงลบ (0.9 เปอร์เซ็นต์ NaCl และ WPCD 400 ug) และกลุ่มควบคุมเชิงบวก (สารส้ม 200 ug พร้อม OVA)) หนูเมาส์ถูกฉีดเข้าใต้ผิวหนังสองครั้งด้วย OVA 10 ไมโครกรัมเพียงอย่างเดียวหรือ WPCD กับ OVA ตามขนาดยา 20, 100 หรือ 400 ไมโครกรัมโดยมีช่วงเวลา 2- สัปดาห์ เก็บตัวอย่างเลือดและม้ามหลังการฉีดวัคซีนเสริมเพื่อตรวจหา IgG titers, คลาสย่อย IgG, การเพิ่มจำนวนของเซลล์ม้ามและไซโตไคน์, เครื่องหมายพื้นผิว DCs และความถี่ Treg

การตรวจหาแอนติบอดีจำเพาะ OVA

ELISA ไทเตอร์และคลาสย่อยเฉพาะของ OVA ได้รับการตรวจสอบโดย ELISA ตามวิธีการก่อนหน้า [27] เพลต ELISA (Nunc, Thermo Fisher Scientific) ถูกเคลือบข้ามคืนแล้วปิดกั้น ตัวอย่างซีรัมถูกเจือจางตามลำดับสำหรับการวิเคราะห์ IgG titer หรือการตรวจหา IgG1 และ IgG2a (Southern Biotech, Inc.) จากนั้นเพลตถูกบ่มด้วย PBST ที่มี IgG, IgG1 และ IgG2a ของเมาส์ที่คอนจูเกตด้วย HRP เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37˚C ปฏิกิริยาคัลเลอริเมตริกได้รับการพัฒนาด้วยเตตระเมทิลเบนซิดีน (TMB) จากนั้นจึงวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตร/655 นาโนเมตร และแสดงเป็นหน่วยความหนาแน่นเชิงแสง (OD)

การตรวจหาการเพิ่มจำนวนเซลล์ม้ามและไซโตไคน์

การเพิ่มจำนวนเซลล์ม้ามถูกกำหนดหาโดยการสอบวิเคราะห์ MTT ในวันที่ 21 หลังการฉีดวัคซีนครั้งแรก เซลล์ม้ามถูกระงับเพียงตัวเดียว เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในตัวกลาง RPMI-1640 ในเพลต96-หลุมตามความเข้มข้นของ 1×106 เซลล์/หลุมในสามเท่า วัฒนธรรมถูกกระตุ้นด้วย OVA (ความเข้มข้นสุดท้าย 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร), ConA (ความเข้มข้นสุดท้าย 5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) (ซิกมา, เซนต์หลุยส์, MO) และ LPS (ความเข้มข้นสุดท้าย 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 48 ชั่วโมงที่ 37˚C . เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 48 ชั่วโมงและ 20 ไมโครลิตร (5 มก./มล.) ของ MTT (Sigma, St Louis, MO) ถูกเติมลงในแต่ละหลุมและบ่มเป็นเวลาอีก 4 ชั่วโมง หลังจากเติม DMSO 50 ไมโครลิตรลงในแต่ละหลุมเพื่อหยุดการพัฒนาสี (Sigma) เพลตจะถูกอ่านที่ 570 นาโนเมตรโดยเครื่องอ่านเพลท microtiter (Bio-Rad, CA, USA) การเพิ่มจำนวนเซลล์ม้ามแสดงเป็นดัชนีการกระตุ้น (SI) ซึ่งเป็นอัตราส่วน OD570 นาโนเมตรของหลุมที่ถูกกระตุ้นต่อหลุมที่ไม่ถูกกระตุ้น

ผลลัพธ์ของ IL-4 และ IFN- ในทีเซลล์ถูกวัดโดยการย้อมสีไซโตไคน์ภายในเซลล์ตามโปรโตคอลที่เผยแพร่ที่มีการดัดแปลงเล็กน้อย [27, 28] สารแขวนลอยม้ามเดี่ยวถูกเตรียมในวันที่ 21 หลังการฉีดวัคซีนครั้งแรก หลังจากการสลายเซลล์เม็ดเลือดแดง ม้ามโต (2×106 เซลล์/มล.) ถูกบ่มด้วย OVA (10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) สำหรับการกระตุ้น 4-ชม. และโกลจิสต็อป (BD) ถูกเติมเป็นเวลา 12 ชั่วโมงในการฟักตัว, PMA เป็น การควบคุมในเชิงบวก เซลล์ถูกรวบรวม, ล้างด้วย PBS, ย้อมด้วย CD4-FITC/CD8-FITC, และตรึงและซึมผ่านด้วย Cyto fix/Cytoperm kit (BD) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต การย้อมสีไซโตไคน์ภายในเซลล์ถูกดำเนินการด้วยความเข้มข้นที่เหมาะสมของแอนติบอดี IL-4-PE หรือ IFN- -APC ที่ 4˚C เป็นเวลา 20 นาที FACs ตรวจพบเซลล์สี การวิเคราะห์ข้อมูลดำเนินการใน FlowJo

การประเมินการเจริญเติบโตของ DCs และเซลล์ Treg ในม้าม

สำหรับการวิเคราะห์การเจริญเต็มที่ของ DCs จากเซลล์ม้ามในหนูเมาส์ การย้อมสีที่ผิวเซลล์ถูกดำเนินการด้วยแอนติบอดี CD11c-PE, CD40-FITC และ CD80-APC ในวันที่ 3 หลังการฉีดวัคซีนครั้งแรก ได้รับสารแขวนลอยม้ามเดี่ยว (1 × 106 เซลล์/มล.) และเซลล์ถูกย้อมสีสองครั้ง ความเข้มของหลอดฟลูออเรสเซนต์วัดโดย FAC Calibur และข้อมูลที่วัดได้จะถูกวิเคราะห์โดย FlowJo

เพื่อสังเกตว่า WPCD สามารถลดความถี่ของ CD4 บวก CD25 บวก Foxp3 บวก Treg ได้หรือไม่ สารแขวนลอยม้ามเดี่ยวถูกเตรียมในวันที่ 7 หลังการฉีดวัคซีนครั้งที่สอง ม้ามโต (2×106 เซลล์/มล.) ถูกย้อมสีที่ผิวเซลล์ด้วย CD4-แอนติบอดี APC ที่ตามด้วยการย้อมสีนิวเคลียสไซโทไคน์ด้วย CD25-FITC และ Foxp3-PE แอนติบอดีที่เหมาะสมด้วย ชุดควบคุม T-cell ของเมาส์ (eBios ciences) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ความถี่ของ CD4 บวก CD25 บวก Foxp3 บวก Treg เซลล์ถูกทดสอบบน FAC การวิเคราะห์ข้อมูลดำเนินการใน FlowJo

การวิเคราะห์ทางสถิติ

การวิเคราะห์ทางเดียวของการทดสอบความแปรปรวน (ANOVA) (การทดสอบการเปรียบเทียบหลายรายการของ Tukey) ได้ดำเนินการเพื่อวิเคราะห์ความแตกต่างระหว่างกลุ่มทดลองหลายกลุ่ม ค่าทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ±SD พี< 0.05="" is="" believed="" to="" be="" statistically="" significant.="" the="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" prism="" 5.0="">

ผลลัพธ์

WPCD ส่งเสริมการเจริญเติบโตและการทำงานของ BM-DC ในหลอดทดลอง

ภูมิคุ้มกันแบบปรับได้ถูกกำหนดโดยการกระตุ้นของ DC รวมถึงประเภทของโมเลกุลที่กระตุ้นร่วมและไซโตไคน์ [29, 30] ในขั้นต้น เราตรวจสอบว่า WPCD สามารถส่งเสริมการแสดงออกของโมเลกุลที่กระตุ้นร่วมกันได้หรือไม่ ตามปริมาณการใช้ที่ต่างกันของ WPCD, BM-DC จาก C57BL/6 ถูกบริหารให้ ระดับการแสดงออกของ CD11c, CD86, CD80, CD40 และ MHC-II ในเซลล์ถูกวิเคราะห์ (รูปที่ 1) เซลล์ที่ปิดล้อมด้วย SSC และ FSC แสดงให้เห็นว่าการบำบัดด้วยขนาดยาที่ต่างกันของ WPCD ไม่เปลี่ยนแปลงสัณฐานวิทยาของ BM-DC (ไม่แสดงข้อมูล) ระดับการแสดงออกของ CD86, CD80 และ CD40 ถูกควบคุมอย่างมีนัยสำคัญในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยาเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มที่ไม่บำบัดและไปถึงที่ราบสูงภายใต้ขนาดยา 20 ug/mL ของ WPCD แต่ความแตกต่างคือ ไม่มีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่ม LPS (รูปที่ 1A–1C) ระดับการแสดงออกของ MHC-II เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญจนถึงค่าสูงสุดของมันภายใต้ขนาดยา 50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (รูปที่ 1D) ผลการวิเคราะห์ของมาร์คเกอร์ที่พื้นผิวเซลล์แสดงให้เห็นว่า DC ที่บำบัดด้วย LPS หรือ WPCD แสดงระดับการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของ CD86, CD80, CD40 และ MHC-II และการเจริญเต็มที่ของฟีโนไทป์ที่ส่งเสริม

สารเสริมบางชนิดสามารถเพิ่มโมเลกุลที่กระตุ้นร่วมกันบน DC หรือกระตุ้นการหลั่งของไซโตไคน์โดยตรง IL-12 และ TNF- เป็นไซโตไคน์ที่สำคัญสำหรับกระตุ้นการตอบสนองของภูมิคุ้มกัน Th1 เราวิเคราะห์ผลผลิตของไซโตไคน์ใน BM–DCs ตามการบำบัดด้วย WPCD หลังจาก BM– DCs ได้รับการบำบัดด้วยเนื้อหาที่แตกต่างกันของ WPCD เป็นเวลา 12 ชั่วโมง สารเหนือตะกอนจะถูกรวบรวมเพื่อตรวจหาเนื้อหาของ IL-12 และ TNF- ด้วยชุดเครื่องมือ ELISA WPCD สามารถเพิ่มการผลิตของ IL-12 ขึ้นกับขนาดยา (รูปที่ 2A) และ TNF- (รูปที่ 2B) ผลการวิจัยพบว่า WPCD สามารถกระตุ้นการเจริญเติบโตของฟังก์ชัน DCs

ในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน จำเป็นต้องเปิดใช้งาน DCs ตามหน้าที่ จากนั้น ระดับที่สูงขึ้นของการเพิ่มจำนวนของแอลโลเจนิกทีเซลล์ถูกเหนี่ยวนำโดย DC ที่เจริญเต็มที่ ดังนั้น MLR จึงตรวจสอบการตอบสนองการทำงานของ DC ต่อ WPCD ความสามารถ allostimulatory ของ DC ที่เหนี่ยวนำโดย WPCD ซึ่งคล้ายกับ LPS ถูกทำให้เพิ่มขึ้นอย่างมากในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยาที่อัตราส่วนที่ระบุ (รูปที่ 2C และ 2D) ผลลัพธ์ระบุว่า WPCD ปรับปรุงการนำเสนอแอนติเจนและการตอบสนองของ T-cell ที่เหมาะสมที่สุดโดย MLR ในหลอดทดลอง

WPCD ส่งเสริมการเจริญเติบโตของ DCs ผ่านเส้นทาง TLR4

มันสามารถอนุมานได้จากผลลัพธ์ข้างต้นที่ว่า BM-DC ที่ถูกกระตุ้นโดย WPCD บ่งชี้การแสดงออกของโมเลกุลพื้นผิว DCs ที่คล้ายคลึงกันกับ LPS (ลิแกนด์ TLR4) ดังนั้นเราจึงตั้งสมมติฐานว่า BM-DC ถูกเปิดใช้งานโดย WPCD ผ่านทางเส้นทาง TLR4 หลังจากที่ BM-DC ถูกปรับสภาพด้วย TAK-242 (ตัวยับยั้ง TLR4) และเพาะเลี้ยงร่วมกับ WPCD และ LPS เป็นเวลา 12 ชั่วโมง การแสดงออกของ CD40, CD86, TNF-a หรือ IL{{12 }} ตรวจพบโดย FAC หรือ ELISA ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 3A และ 3B การบำบัด TAK-242 ส่งผลให้เกิดการแสดงออกที่มีการควบคุมลดลงอย่างมีนัยสำคัญของ CD40 และ CD86 ที่เหนี่ยวนำโดย LPS หรือ WPCD และการผลิตไซโตไคน์ของ IL-12 หรือ TNF-a ยังลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 3C และ 3D) ผลการวิจัยพบว่า WPCD สามารถกระตุ้นการสุกของกระแสตรงผ่านวิถี TLR4

WPCD เพิ่มภูมิคุ้มกันทางร่างกายและเซลล์

เพื่อวัตถุประสงค์ในการเปรียบเทียบ เราประเมินผลของ WPCD ต่อการกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกายในหนูที่ได้รับวัคซีน OVA ก่อนการฉีดวัคซีนและในวันที่ 14, 21,35 และ 49 หลังการฉีดวัคซีนครั้งแรก ELISA รวบรวมเลือดเพื่อตรวจหา IgG titer และ IgG subclasses serum โดย ELISA การตอบสนองของแอนติบอดี IgG ต่อ OVA เพิ่มขึ้นตามการเพิ่มขึ้นของขนาดยาของการบริหารให้ WPCD (100 และ 400 ไมโครกรัม) ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา (รูปที่ 4) ความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดคือ 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรของ WPCD และเพิ่มการตอบสนองของ IgG สองเท่าเมื่อเทียบกับ OVA เพียงอย่างเดียวในวันที่ 21, 35 และ 49 (รูปที่ 4A) การเพิ่มขึ้นอย่างมากในระดับแอนติบอดี IgG1 และ IgG2a ที่จำเพาะต่อ OVA ที่ต่ำกว่า 20 และ 100 ไมโครกรัมของการบริหารให้ WPCD ได้รับเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม OVA ในซีรัมในวันที่ 35 (รูปที่ 4B) ในขณะเดียวกัน สารส้มส่งเสริมเฉพาะระดับการแสดงออกของแอนติบอดี IgG และ IgG1 จำเพาะต่อ OVA ในหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกัน WPCD เพียงอย่างเดียวไม่กระตุ้นแอนติบอดีจำเพาะ OVA ผลลัพธ์ข้างต้นบ่งชี้อย่างชัดเจนว่า WPCD สร้างระดับแอนติบอดีที่สูงขึ้นและการตอบสนอง Th1/Th2 ที่สมดุลมากกว่าสารส้ม

การเพิ่มจำนวนของเซลล์ม้ามเป็นตัวบ่งชี้ภูมิคุ้มกันของเซลล์อีกตัวหนึ่ง ConA กระตุ้น T-cells และ LPS กระตุ้นการงอกของ B-cell ในวันที่ 21 หลังการฉีดวัคซีนครั้งแรก ได้รับสารแขวนลอยม้ามเดี่ยวและกระตุ้นตามลำดับด้วย OVA (10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เปปไทด์ OVA323-339 (10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ConA (5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) และ LPS (5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้นวัดการเพิ่มจำนวนของเซลล์ T โดยวิธี MTT WPCD สามารถส่งเสริมการเพิ่มจำนวนเซลล์ม้ามที่กระตุ้น OVA-antigen, Con A-mitogen และ LPS mitogen อย่างมีนัยสำคัญในหนูเมาส์ที่สร้างภูมิคุ้มกันโรคด้วย OVA และ WPCD (รูปที่ 5) และความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดของ WPCD คือ 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่า WPCD เป็นวัคซีนเสริมในหนูที่ได้รับวัคซีน OVA สามารถกระตุ้นการกระตุ้นของ T-cells และ B เซลล์ได้อย่างมีประสิทธิภาพมากกว่าสารส้ม

สารเสริม WCPD ที่ทดสอบทั้งหมดซึ่งกำหนดสูตรด้วยวัคซีน OVA สร้างภูมิคุ้มกันทางร่างกายและเซลล์ที่แข็งแรงเท่ากัน (รูปที่ 4 และ 5) บนพื้นฐานของข้อมูลเหล่านี้ เพื่อประเมินอิทธิพลของ WPCD ต่อการตอบสนองของเซลล์ T helper (Th) จำเพาะต่อ OVA เพิ่มเติม เราได้วิเคราะห์การแสดงออกของไซโตไคน์เพิ่มเติมในเซลล์ CD8 plus และ CD4 บวก T โดย Flow cytometry (รูปที่ 6) ในวันที่ 21 หลังการฉีดวัคซีนครั้งแรก เซลล์ม้ามของหนูตัวเดียวถูกแยกออกมา จากนั้นจึงเพาะเลี้ยงร่วมกับ OVA (10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) IL-4 ให้ผลผลิตใน CD4 บวกทีเซลล์ในกลุ่มที่บริหารให้ด้วย 100 ug OVA/WPCD สูงกว่านั้นอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม OVA/Alum และกลุ่ม OVA และคล้ายกับที่อยู่ใน PMA (รูปที่ 6A) นอกจากนี้ IFN- ผลผลิตในเซลล์ CD8 plus และ CD4 plus T ยังถูกทำให้เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในหนูเมาส์ที่ถูกบริหารให้ด้วย OVA/WPCD (20, 100 และ 400 ug) (รูปที่ 6B และ 6C) เมื่อเปรียบเทียบกับสารเสริมสารส้ม WPCD แสดงความสามารถที่ดีกว่าในการเหนี่ยวนำ IL-4 และสารคัดหลั่ง IFN จากทีเซลล์

WPCD กระตุ้นการเจริญเติบโตของ DC และลดความถี่ Treg ในร่างกาย

DCS ได้รับการยอมรับว่าเป็น APC ที่มีศักยภาพมากที่สุดที่เกี่ยวข้องกับการเริ่มต้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันเบื้องต้น ดังนั้น ในวันที่ 3 หลังการฉีดวัคซีนครั้งแรก เรายังได้ตรวจสอบผลของ WPCD ต่อ CD40 และ CD80 ต่อ DCs ในม้ามในหนู (รูปที่ 7A และ 7B) หนูเมาส์ในกลุ่ม OVA/WPCD 100-ug OVA/WPCD สร้างระดับ CD40 และ CD80 บน DC ที่สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม OVA/Alum ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่า WPCD สามารถกระตุ้น DC และกระตุ้นการเจริญเติบโตของ DC ในหนู เซลล์ Treg สามารถปรับสมดุลความอดทนและการตอบสนองของภูมิคุ้มกัน เพื่อตรวจสอบเพิ่มเติมว่า WPCD ปรับการตอบสนองของภูมิคุ้มกันอย่างไร เซลล์ Treg ในม้ามในหนูถูกย้อมด้วยชุดการย้อมสีทีเซลล์ควบคุมด้วยเมาส์ ในวันที่ 21 หลังการฉีดวัคซีนครั้งแรก ความถี่ที่ลดลงของ CD25 บวกกับเซลล์ Foxp3 บวก Treg ถูกสังเกตพบในเซลล์ CD4 บวก T ทั้งหมด (รูปที่ 7C) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม OVA และ OVA/Alum กลุ่ม WPCD แสดงความถี่ Treg ที่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ

การประเมินความปลอดภัยของ WPCD ในหนู

เพื่อประเมินความเป็นพิษเฉียบพลันในช่องปาก เราได้ทำการทดสอบความเป็นพิษเฉียบพลัน หนูที่รับประทานโดยมีน้ำหนักตัว 5,000 มก./กก. ไม่มีพฤติกรรมผิดปกติหรือผลข้างเคียง และไม่พบการตายในการทดสอบประเมินความเป็นพิษ ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในการเพิ่มของน้ำหนักตัว ดัชนีไทมัส และดัชนีม้ามในกลุ่มต่างๆ ของหนูที่ได้รับ WPCD ในปริมาณที่แตกต่างกัน และไม่มีความแตกต่างที่มีนัยสำคัญ (ตารางที่ 1) ไม่พบการตายหลังจาก 14 วัน ดังนั้นค่า LD50 ของ WPCD จึงมากกว่า 5,000 มก. ต่อน้ำหนักตัว 1 กก.

เพื่อทดสอบว่า WPCD มีผลเสียต่อการเจริญเติบโตของหนู ก่อนและหลังการฉีดวัคซีนใต้ผิวหนัง น้ำหนักตัวถูกกำหนดตามลำดับสำหรับหนูแต่ละตัว (ตารางที่ 2) ในการสังเกตหนูในเวลาต่อมา ไม่พบผลข้างเคียงหรือพฤติกรรมผิดปกติ นอกจากนี้ น้ำหนักตัวของหนูที่ได้รับ WPCD และหนูที่ได้รับน้ำเกลือหรือ OVA/สารส้ม ไม่พบความแตกต่างที่มีนัยสำคัญ ผลการสังเกตเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการบริหาร WPCD นั้นปลอดภัย

การอภิปราย

สารเสริมเป็นส่วนประกอบสำคัญในวัคซีน [31] เนื่องจากความก้าวหน้าของจีโนมและโปรตีโอมิกส์ จึงมีการระบุสารรีคอมบิแนนท์และโมเลกุลวัคซีนสังเคราะห์มากขึ้นเรื่อยๆ ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีสารเสริมและสูตรมากขึ้น สารเสริมที่มีศักยภาพบางชนิดโดยทั่วไปเกี่ยวข้องกับความเป็นพิษที่เพิ่มขึ้น ตัวอย่างเช่น FCA ดังนั้นจึงจำเป็นต้องค้นหาสูตรที่ปลอดภัยซึ่งมีส่วนประกอบเสริมฤทธิ์กันที่แตกต่างกันในที่สุดซึ่งขับเคลื่อนการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่ต้องการ โพลิแซ็กคาไรด์จากสมุนไพรจีนไม่เป็นพิษและไม่มีผลข้างเคียงที่มีนัยสำคัญ [32,28] วัคซีนบางชนิดจำเป็นต้องมีสารเสริมที่ปลอดภัย

Cistanche Deserticola เป็นสมุนไพรบำรุงที่สำคัญและมีอยู่ทั่วไปในดินแดนที่แห้งแล้งและทะเลทรายอันอบอุ่นทางตะวันตกเฉียงเหนือของจีน Cistanche deserticola มีความกังวลอย่างกว้างขวางเนื่องจากฤทธิ์ทางชีวภาพรวมถึงผลกระทบของภูมิคุ้มกัน สารต้านอนุมูลอิสระ ต้านเชื้อแบคทีเรีย และต้านเนื้องอก [20,21] มีความคืบหน้าบางประการในการจำแนกลักษณะโครงสร้างและกิจกรรมทางภูมิคุ้มกันของ Cistanche Deserticola ซึ่งเป็นตัวเลือกที่ดีสำหรับการพัฒนาสารเสริม เราทดลองประเมินผลเสริมและกลไกของ WPCD ในหลอดทดลอง และในร่างกาย การบริหารทางใต้ผิวหนังของ WPCD ช่วยส่งเสริมการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันทางร่างกายและเซลล์อย่างมีนัยสำคัญโดยการเพิ่มแอนติบอดีในซีรัมและการเพิ่มจำนวนของเซลล์เม็ดเลือดขาว เสริมการแสดงออกของไซโตไคน์ ควบคุมการเจริญเต็มที่ของ DC เพิ่มขึ้น และควบคุมความถี่ของ CD4 บวก CD25 บวก Foxp3 บวก Treg ลง

DCS เป็น APC ที่สำคัญสำหรับการเตรียมทีเซลล์ที่ไร้เดียงสา การเปิดใช้งาน DCs เป็นสิ่งสำคัญสำหรับ adjuvants DCS โดยเฉพาะอย่างยิ่ง DCS ที่ได้มาจากไขกระดูก มักใช้ในการประเมินสารเสริมและวัคซีน Flow cytometry สามารถแยกแยะเซลล์ที่ถูกกระตุ้นหลังจากจับแอนติเจนจากเซลล์โดยรอบ ในการวิเคราะห์ FCM ระดับการรวมตัวของเซลล์ที่ถูกกระตุ้นเป็นตัวบ่งชี้ทางอ้อมในการประเมินความปลอดภัยของเครื่องกระตุ้นภูมิคุ้มกัน [3] ดังนั้น ข้อมูลกิจกรรมเสริมของ WPCD ใน DCs ในหลอดทดลอง อาจให้ข้อมูลที่มีค่าสำหรับแบบจำลองสัตว์ โดยอิงตามแบบจำลอง BM-DC ระดับการแสดงออกของ MHC-II, CD86, CD80 และ CD40, การผลิตไซโตไคน์ และการเพิ่มจำนวนเซลล์ของทีเซลล์ allogeneic ถูกตรวจพบในช่วงความเข้มข้น WPCD ที่เหมาะสมที่สุด ระดับการแสดงออกของ MHC-II, CD86, CD80 และ CD40 ถูกควบคุมใน BM-DC และผลผลิตของ TNF-a และ IL-12 เพิ่มขึ้นในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา การงอกขยายของทีเซลล์แบบ allogeneic ถูกสังเกตพบ สัณฐานวิทยาของ BM-DC ไม่เปลี่ยนแปลง โดยการกระตุ้นการกระตุ้น BM-DCs และการหลั่งของไซโตไคน์ที่อักเสบในหลอดทดลอง สารเสริม WPCD อาจเพิ่มปริมาณของแอนติเจนและปริมาณของ APC อย่างมีนัยสำคัญ และกระตุ้นทีเซลล์ให้หลั่ง IFN- ซึ่งมีส่วนช่วยในการเพิ่มประสิทธิภาพของกิจกรรมการปรับภูมิคุ้มกัน

พอลิแซ็กคาไรด์สมุนไพรจีนหลายชนิดสามารถกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันและมีความสามารถเสริมที่ยอดเยี่ยมผ่านการกระตุ้นการเจริญเติบโตของ DCs โดยวิถี TLR4 [33,28] ดังนั้นเราจึงถือว่า TLR4 มีส่วนร่วมในเส้นทางการส่งสัญญาณของการสุกของ DC ที่เกิดจาก WPCD ตามที่คาดไว้ การบำบัดด้วยสารยับยั้ง TLR4 ส่งผลให้ TNF-a และ IL-12 ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ นอกจากนี้ การยับยั้งวิถี TLR4 ยังขัดขวางการแสดงออกของ CD 40 และ CD80 บน DC ซึ่งบ่งชี้ว่าการเจริญเต็มที่ของ DCs ขึ้นอยู่กับ TLR4 ดังนั้นจึงเห็นได้ชัดว่า TLR4 มีส่วนร่วมในการสร้าง DCs ที่เกิดจาก WPCD

ปริมาณที่เหมาะสมของสารเสริมและสูตรวัคซีนถูกกำหนดโดยสังเกตจากการทดลองหลายครั้ง เพื่อที่จะสำรวจความสัมพันธ์ของการตอบสนองต่อขนานยาของ WPCD adjuvant และแอนติเจน OVA ในหนูทดลอง เราได้เลือกขนาดยา WPCD ที่แตกต่างกันโดยอิงจากข้อมูลที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้จาก BM-DCs ในหลอดทดลอง เพื่อจัดการหนู ICR ใต้ผิวหนังสองครั้ง เราพบว่า WPCD เพิ่มผลผลิตของแอนติบอดีจำเพาะ OVA อย่างมีนัยสำคัญและกระตุ้นการตอบสนองของภูมิคุ้มกัน Th1/Th2 ที่สมดุลด้วยการเพิ่มประสิทธิภาพของระดับ IgG1 และ IgG2a โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ระดับ IgG2a นั้นสูงกว่าที่บำบัดด้วยสารส้มในปริมาณที่เหมาะสม ดังนั้น WPCD จึงส่งผลให้มีแอนติบอดีจำเพาะในระดับที่สูงขึ้นและประสิทธิภาพที่สูงขึ้นด้วยการฉีดที่ต่ำกว่า

วัคซีนชนิดใหม่ต้องการการกระตุ้นการตอบสนองของเซลล์ที่รุนแรง ซึ่งเกี่ยวข้องกับแอนติบอดี เซลล์ T helper (Th) และเซลล์ T lymphocytes ที่เป็นพิษต่อเซลล์ (CTLs) วัคซีนรักษาโรคมีจุดมุ่งหมายเพื่อกระตุ้นการตอบสนองของ T-cell ที่แข็งแกร่งขึ้น สารเสริมในอุดมคติช่วยเพิ่มศักยภาพของวัคซีนและส่งเสริมภูมิคุ้มกันของเซลล์โดยไม่ก่อให้เกิดผลกระทบที่เป็นพิษ [34] จากการสังเกตในแบบจำลองหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกัน WPCD ทำให้เกิดการเพิ่มจำนวนเซลล์ม้ามที่จำเพาะต่อ OVA และไม่จำเพาะเมื่อเทียบกับสารส้ม สารเสริมบางชนิดควบคุมไซโตไคน์และระบบภูมิคุ้มกัน ตัวอย่างเช่น ซาโปนินอาจกระตุ้นการตอบสนองของภูมิคุ้มกันที่อาศัยเซลล์เป็นสื่อกลางต่อแอนติเจนซึ่งปกติจะกระตุ้นเฉพาะแอนติบอดีเท่านั้น เราเลือก IL-4 และ IFN- เป็นตัวบ่งชี้เพื่อประเมินระดับภูมิคุ้มกันในหนูเมาส์ทางอ้อม WPCD สามารถกระตุ้นการหลั่ง IL-4 และ IFN- ได้มากกว่าสารส้ม ดังนั้น การตอบสนองของ T-cell ของตัวช่วยที่แข็งแกร่งและการหลั่งของ cytokine เป็นผลจากการฉีดวัคซีน WPCD ซึ่งชี้ให้เห็นว่า WPCD สามารถกระตุ้นเซลล์เม็ดเลือดขาวได้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้นเพื่อหลั่ง cytokine ชนิด Th1- และ cytokine ชนิด Th2- มากกว่า สารส้ม.

สารเสริมที่มีอิทธิพลต่อการนำเสนอแอนติเจนอาจส่งผลต่อกระบวนการภูมิคุ้มกันที่ซับซ้อน เซลล์ Treg สามารถปรับการตอบสนองของ Th1 และ Th2 [35] ปริมาณที่เหมาะสมของ WPCD อาจส่งเสริมการเจริญเติบโตของ DCs ในหนูโดยการเพิ่มระดับการแสดงออกของ CD80 และ CD40 และขยายความสามารถของการนำเสนอแอนติเจน OVA ในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันในระยะเริ่มต้น ผลการทดลองของการกระตุ้น DCS และความถี่ Treg แสดงให้เห็นว่า WPCD กระตุ้นการเจริญเติบโตของ DCs และลดความถี่ Treg ในม้ามในหนูทดลอง ผลลัพธ์เหล่านี้พิสูจน์ให้เห็นว่า WPCD เพิ่มประสิทธิภาพของวัคซีน OVA โดยการเพิ่มการกำหนดเป้าหมายเซลล์ที่สร้างแอนติเจนและส่งเสริมการกระตุ้นเฉพาะทีเซลล์

ในการพัฒนาสารเสริม เป็นการยากที่จะเลือกกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่เหมาะสมกับการติดเชื้อที่เกี่ยวข้อง สารเสริมที่เหมาะสมควรมีผลข้างเคียงและความเป็นพิษต่ำต่อมนุษย์หรือสัตว์ต่ำ ดังนั้นควรพิจารณาความปลอดภัยของ WPCD รวมถึงผลข้างเคียงที่เกิดขึ้นทันทีและระยะยาว ในการศึกษานี้ เราสำรวจความเป็นพิษเฉียบพลันของ WPCD และผลกระทบเชิงลบของ WPCD ต่อประสิทธิภาพการเจริญเติบโตของหนูเมาส์เป็นเวลา 110 วัน ผลความเป็นพิษเฉียบพลันของ WPCD พบว่าน้ำหนักตัว ดัชนีต่อมไทมัส หรือดัชนีม้ามไม่มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ ค่า LD50 ของ WPCD มากกว่า 5,000 มก. ต่อน้ำหนักตัว 1 กก. ตลอดการทดลองสังเกตภายหลังของหนู ไม่พบผลข้างเคียงหรือพฤติกรรมผิดปกติในหนู ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า WPCD ปลอดภัย

โดยสรุป ในการศึกษานี้ WPCD ซึ่งเป็นพอลิแซ็กคาไรด์ดิบที่สกัดจาก C. deserticola จากซินเจียง แสดงคุณสมบัติบางอย่างของสารเสริม ตัวอย่างเช่น WPCD เพิ่มการตอบสนองทั้ง Th1 และ Th2 โดยการกระตุ้น DC เพิ่มการตอบสนองของแอนติบอดี ปรับปรุงการผลิตไซโตไคน์ ยิ่งไปกว่านั้น เราได้สำรวจกลไกของประสิทธิภาพของ WPCD โดยการวิเคราะห์ความสมบูรณ์ของ DC และฟังก์ชันผ่านเส้นทาง TLR4 ในหลอดทดลอง ในหนูที่ได้รับการรักษาด้วย WPCD เท่านั้น ไม่พบผลข้างเคียงที่ชัดเจน ดังนั้น WPCD จึงมีกิจกรรมกระตุ้นภูมิคุ้มกันที่สูงขึ้นในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันระดับเซลล์และทางร่างกาย สารเสริมเป็นส่วนผสมของสารประกอบหลายชนิด ส่วนผสมของสารสกัดหยาบหลายชนิดอาจมีผลประโยชน์มากกว่าสารสกัดจากพืชชนิดเดียว จำเป็นต้องสำรวจสารสกัด WPCD อย่างเป็นระบบ ทดสอบประสิทธิภาพและความปลอดภัย และอธิบายกลไกของผลกระทบ

ข้อมูลสนับสนุน

ไฟล์ S1 รายการตรวจสอบมาถึง (DOCX)

รับทราบ

ขอขอบคุณเป็นพิเศษกับ Bing Wang และ Daocheng Wu ที่ให้แนวคิดดีๆ ในการทดลอง

ผลงานของผู้เขียน

แนวความคิด: Ailian Zhang, Bin Wang, Daocheng Wu

การจัดการข้อมูล: Xiumei Yang, Yu Yang การวิเคราะห์อย่างเป็นทางการ: Ailian Zhang, Quanxiao Li

การจัดหาเงินทุน: Ailian Zhang การบริหารโครงการ: Ailian Zhang

แหล่งข้อมูล: Ailian Zhang, Gan Zhao.Writing – ร่างต้นฉบับ: Ailian Zhang

การเขียน – ทบทวนและแก้ไข: Ailian Zhang, Daocheng Wu