การระบุ Lipocalin ที่เกี่ยวข้องกับ Neutrophil Gelatinase เป็นนวนิยาย Biomarker ทางเดินปัสสาวะในช่วงต้นนวนิยายสำหรับการบาดเจ็บของไตขาดเลือด
Mar 22, 2022
ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
JAYA MISHRA* QING MA* ANNE PRADA* MARK MITSNEFES* KAMYAR ZAHEDI* JUN YANG† JONATHAN BARASCH† และ PRASAD DEVARAJAN*
*โรคไตและความดันโลหิตสูง, ศูนย์การแพทย์โรงพยาบาลเด็ก Cincinnati, Cincinnati, Ohio; และ † Nephrology, College of Physicians and Surgeons, Columbia University, New York, New York
เชิงนามธรรม.
เฉียบพลันไตความล้มเหลว (ARF) รองจากการบาดเจ็บจากการขาดเลือดยังคงเป็นปัญหาทั่วไปและอาจก่อให้เกิดความเสียหายร้ายแรง มีการใช้กลยุทธ์การสอบปากคำในวงกว้างเพื่อระบุยีนของไตที่ถูกชักนำให้เกิดขึ้นเร็วมากหลังจากภาวะขาดเลือดของไต ซึ่งผลิตภัณฑ์โปรตีนอาจทำหน้าที่เป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพแบบใหม่สำหรับ ARF มีการระบุยีนเจ็ดตัวที่ได้รับการควบคุมบวก - 10-พับ ซึ่งหนึ่งในนั้น (Cyr61) ได้รับรายงานว่ามีการเหนี่ยวนำหลังจากภาวะไตขาดเลือด โดยไม่คาดคิด การเหนี่ยวนำการถอดเสียงอีกหกฉบับเป็นเรื่องแปลกใหม่สำหรับเขตข้อมูล ARF ในการศึกษานี้ หนึ่งในยีนที่ไม่รู้จักก่อนหน้านี้มีลักษณะเฉพาะเพิ่มเติม คือ นิวโทรฟิลเจลาติเนสที่เกี่ยวข้องกับไลโปคาลิน (NGAL) เนื่องจากเป็นพอลิเปปไทด์ที่หลั่งออกมาขนาดเล็กที่ดื้อต่อโปรตีเอส และอาจตรวจพบได้ง่ายในปัสสาวะ การควบคุมที่เพิ่มขึ้นของ NGAL mRNA และระดับโปรตีนในหนูเมาส์ postischemic ระยะแรกไตได้รับการยืนยัน ตรวจพบการแสดงออกของโปรตีน NGAL อย่างเด่นชัดในเซลล์ที่เพิ่มจำนวนเซลล์นิวเคลียสที่เป็นแอนติเจน-บวก เซลล์ทูบูลที่ใกล้เคียงกัน ในการแจกแจงไซโตพลาสมิกแบบแบ่งจุดที่กำหนดร่วมกับเครื่องหมายของเอนโดโซมตอนปลาย NGAL ตรวจพบได้ง่ายในปัสสาวะในปัสสาวะออกครั้งแรกหลังจากขาดเลือดใน ARF ทั้งแบบจำลองของหนูและหนู การปรากฏตัวของ NGAL ในปัสสาวะสัมพันธ์กับขนาดยาและระยะเวลาของไตภาวะขาดเลือดขาดเลือดและเกิดขึ้นก่อนการปรากฏตัวของเครื่องหมายอื่นๆ ในปัสสาวะ เช่น N-acetyl- -D-glucosaminidase และ 2-microglobulin ต้นกำเนิดของ NGAL จากเซลล์ทูบูลได้รับการยืนยันในเซลล์ทูบูลส่วนต้นของมนุษย์ที่เพาะเลี้ยงซึ่งได้รับความเสียหายจากการขาดเลือดในหลอดทดลอง โดยที่ NGAL mRNA ถูกเหนี่ยวนำอย่างรวดเร็วในเซลล์ และโปรตีน NGAL นั้นสามารถตรวจพบได้ง่ายในตัวกลางเพาะเลี้ยงภายใน 1 ชั่วโมงของการสูญเสีย ATP เล็กน้อย NGAL ยังตรวจพบได้ง่ายในปัสสาวะของหนูทดลองที่มีความเป็นพิษต่อไตที่เกิดจากซิสพลาติน ก่อนการปรากฏตัวของ N-acetyl- -D-glucosaminidase และ 2-microglobulin ผลการวิจัยพบว่า NGAL อาจเป็นตัวแทนของ biomarker ทางเดินปัสสาวะในระยะเริ่มต้น มีความละเอียดอ่อนและไม่รุกรานสำหรับการขาดเลือดและพิษต่อไตไตบาดเจ็บ.
Cistanche herbaสามารถรักษาอาการบาดเจ็บที่ไต
รับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับผลิตภัณฑ์ที่เกี่ยวข้องกับ Cistanche
เฉียบพลันไตความล้มเหลว(ARF) รองจากการบาดเจ็บที่ขาดเลือดหรือพิษต่อไตยังคงเป็นปัญหาที่พบได้บ่อยและอาจทำลายล้างในโรคไตทางคลินิก โดยมีอัตราการเสียชีวิตสูงอย่างต่อเนื่องแม้ว่าจะมีความก้าวหน้าอย่างมีนัยสำคัญในการดูแลแบบประคับประคอง (1-4) การศึกษาที่บุกเบิกมาเป็นเวลาหลายทศวรรษได้ให้ความกระจ่างถึงบทบาทของการหดตัวของหลอดเลือดอย่างต่อเนื่อง การอุดตันของท่อ การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างและการเผาผลาญของเซลล์ และการตอบสนองต่อการอักเสบในการเกิดโรคของ ARF (4–7) แม้ว่าการศึกษาเหล่านี้จะปูทางไปสู่แนวทางการรักษาที่ประสบความสำเร็จในแบบจำลองสัตว์ แต่ความพยายามในการวิจัยเชิงแปลในมนุษย์ได้ผลลัพธ์ที่น่าผิดหวัง (2–4) สาเหตุของสิ่งนี้อาจรวมถึงการตอบสนองหลายแง่มุมของไตต่อการขาดเลือดขาดเลือดและ nephrotoxins และความไม่เพียงพอของเครื่องหมายเริ่มต้นสำหรับ ARF ที่มีความล่าช้าในการเริ่มการรักษา (4–8)
ความพยายามที่จะคลี่คลายพื้นฐานระดับโมเลกุลของจำนวนมหาศาลเหล่านี้ในช่วงต้นไตการตอบสนองได้รับการอำนวยความสะดวกโดยความก้าวหน้าล่าสุดในจีโนมเชิงหน้าที่ซึ่งได้ให้เครื่องมือใหม่สำหรับการวิเคราะห์ทั่วทั้งจีโนมของกระบวนการทางชีววิทยาที่ซับซ้อน เช่น ARF ที่ขาดเลือด (8–11) วิธีการ microarray cDNA ให้โปรไฟล์การแสดงออกแบบคู่ขนานและเชิงปริมาณของยีนหลายพันตัว ซึ่งเมื่อรวมกับเครื่องมือชีวสารสนเทศสามารถระบุยีนในวิถีทางชีววิทยา กำหนดลักษณะการทำงานของยีนใหม่ และตรวจหาคลาสย่อยของโรค (9) โดยใช้เทคนิคการคัดกรองนี้ เราได้ระบุชุดย่อยของยีนเจ็ดตัวที่มีการแสดงออกเพิ่มขึ้น0-เท่าภายในสองสามชั่วโมงแรกหลังการขาดเลือดไตบาดเจ็บในรูปแบบเมาส์ หนึ่งในใบรับรองผลการเรียนเหล่านี้ โปรตีนที่อุดมด้วยซิสเทอีน 61 (Cyr61) ได้รับการยืนยันเมื่อเร็ว ๆ นี้ว่าเกิดจากภาวะขาดเลือดของไต (8) แต่พฤติกรรมของยีนที่แสดงออกอย่างแตกต่างอีก 6 ยีนนั้นแปลกใหม่ในวรรณคดี ARF ในการศึกษานี้ เราเลือกที่จะอธิบายลักษณะเพิ่มเติมของยีนที่ไม่เคยรู้จักมาก่อนเหล่านี้ นั่นคือ นิวโทรฟิลเจลาติเนสที่เกี่ยวข้องกับไลโปคาลิน (NGAL) เนื่องจากเป็นพอลิเปปไทด์ขนาดเล็กที่หลั่งออกมาซึ่งอาจตรวจพบได้ในปัสสาวะ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เนื่องจากมีความทนทานต่อโปรตีเอส ผลลัพธ์ของเราบ่งชี้ว่า NGAL อาจเป็นตัวแทนของไบโอมาร์คเกอร์ทางเดินปัสสาวะในระยะเริ่มแรกสำหรับภาวะขาดเลือดและพิษต่อไตไตบาดเจ็บ.
วัสดุและวิธีการ
แบบจำลองเมาส์ของการบาดเจ็บที่ไต
เราใช้แบบจำลอง murine ที่เป็นที่ยอมรับ ซึ่งผลที่ตามมาของโครงสร้างและหน้าที่ของช่วงเวลาสั้น ๆ ของไตขาดเลือดขาดเลือดได้รับการบันทึกไว้ก่อนหน้านี้ (11–15) กล่าวโดยย่อ หนูเมาส์สวิส-เว็บสเตอร์เพศผู้ (Taconic Farms, Germantown, NY) ที่มีน้ำหนัก 25 ถึง 35 กรัม ถูกเลี้ยงด้วยแสง 12:{6}}h: รอบมืด และได้รับอนุญาตให้เข้าถึงอาหารและน้ำได้ฟรี สัตว์ถูกวางยาสลบด้วยโซเดียม เพนโทบาร์บิทัล (50 มก./กก. ในช่องท้อง) และวางไว้บนโต๊ะอุ่นเครื่องเพื่อรักษาอุณหภูมิทางทวารหนักไว้ที่ 37 องศา ใช้โปรโตคอลที่แยกกันสามแบบ: (1) ภาวะขาดเลือดขาดเลือดข้างเดียวโดยไม่มี ARF, (2) ภาวะขาดเลือดขาดเลือดทวิภาคีกับ ARF และ (3) ภาวะขาดเลือดขาดเลือดแบบไม่แสดงอาการระดับทวิภาคีที่ไม่รุนแรง สำหรับการทดลองภาวะขาดเลือดข้างเดียว ไตด้านซ้ายถูกปิดด้วยแคลมป์หลอดเลือดที่ไม่ทำให้เกิดบาดแผลเป็นเวลา 45 นาที ในระหว่างนั้นไตจะอุ่นและชื้น จากนั้นถอดแคลมป์ออก สังเกตการทำงานของไตเพื่อให้เลือดไหลเวียนกลับมา และเย็บแผล หนูได้รับอนุญาตให้ฟื้นตัวในกรงที่อบอุ่นและได้รับการเก็บปัสสาวะตามกำหนดเวลา หลังจากผ่านไป 0, 3, 12 หรือ 24 ชั่วโมงสัตว์ได้รับการดมยาสลบอีกครั้ง ช่องท้องถูกเปิดออก และได้รับเลือดผ่านการเจาะของ Vena Cava ที่ด้อยกว่าเพื่อวัดค่า creatinine ในซีรัมโดยชุดทดสอบสีเชิงปริมาณ (Sigma, เซนต์หลุยส์ มิสซูรี) หนูถูกฆ่าตาย ไตถูกกระจายไปในแหล่งกำเนิดโดยมีพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์ใน PBS และไตทั้งสองถูกเก็บเกี่ยว (ไตขวาทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมสำหรับสัตว์แต่ละตัว) สัตว์ที่แยกจากกันอย่างน้อยสามตัวถูกตรวจสอบในแต่ละช่วงการไหลซ้ำ ครึ่งหนึ่งของไตแต่ละข้างถูกแช่แข็งอย่างรวดเร็วในไนโตรเจนเหลวและเก็บไว้ที่ 70 องศาจนกว่าจะดำเนินการต่อไป ตัวอย่างถูกตรึงในฟอร์มาลิน ฝังพาราฟิน และแบ่งส่วน (4 ม.) ส่วนของพาราฟินถูกย้อมด้วย hematoxylin-eosin และตรวจทางจุลพยาธิวิทยา ไตที่ยึดไว้แสดงการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาที่เป็นลักษณะเฉพาะซึ่งเป็นผลมาจากการบาดเจ็บของการขาดเลือดขาดเลือด-การกลับเป็นซ้ำ ตามที่เผยแพร่โดยคนอื่นๆ (12–14) และเรา (11) อีกครึ่งหนึ่งของไตแต่ละข้างถูกฝังในสารประกอบ OCT (เนื้อเยื่อ-เต็ก) และส่วนที่เป็นน้ำแข็ง (4 ม.) ได้รับสำหรับอิมมูโนฮิสโตเคมี สำหรับภาวะขาดเลือดขาดเลือดในระดับทวิภาคีด้วยการทดลอง ARF ไตทั้งสองข้างถูกจับยึดเป็นเวลา 30 นาที และตรวจสอบในช่วงเวลาต่างๆ ของการไหลย้อนตามรายละเอียดด้านบน สัตว์กลุ่มนี้จำนวนแปดตัวได้รับการออกแบบเพื่อเป็นตัวแทนของ ARF ทางคลินิกและแสดงระดับครีเอตินินในเลือดสูงอย่างมีนัยสำคัญที่ 24 ชั่วโมงหลังการบาดเจ็บ สำหรับการทดลองภาวะขาดเลือดขาดเลือดแบบไม่แสดงอาการเล็กน้อยในระดับทวิภาคี ไตทั้งสองข้างถูกจับเป็นเวลา 5, 10 หรือ 20 นาทีเท่านั้น และตรวจดูในช่วงเวลาต่างๆ ระดับการบาดเจ็บที่ไม่รุนแรงนี้ได้รับการออกแบบมาเพื่อจำลองภาวะขาดเลือดของไตแบบไม่แสดงอาการ และหนูในกลุ่มนี้ไม่ได้แสดงระดับครีเอตินีนในซีรัมที่วัดที่ 24 ชั่วโมงหลังการบาดเจ็บ
แบบจำลองหนูของการบาดเจ็บที่ไต
เราใช้แบบจำลองหนูที่มีชื่อเสียงของไตการบาดเจ็บที่ขาดเลือด - กลับเลือด (10). โดยสังเขป หนู Sprague-Dawley เพศผู้ที่มีน้ำหนัก 200 ถึง 250 กรัม (Taconic Farms) ได้รับการดมยาสลบด้วยคีตามีน (150 ก./กรัม) และไซลาซีน (3 ก./กรัม) และได้รับการอุดหลอดเลือดแดงไตทวิภาคีด้วยที่หนีบหลอดเลือดขนาดเล็กเป็นเวลา 30 นาทีตามรายละเอียดใน โปรโตคอลเมาส์ เก็บปัสสาวะตามกำหนดเวลาที่ 3, 6, 9, 12 และ 24 ชั่วโมงของการให้เลือดกลับคืนมา และเก็บเลือดเพื่อวัดค่าครีอะตินีนในเวลาที่ฆ่า (24 ชั่วโมง)
แบบจำลองเมาส์ของการบาดเจ็บที่ไตที่เกิดจากซิสพลาติน
เราใช้แบบจำลอง murine ที่เป็นที่ยอมรับซึ่งผลที่ตามมาจากโครงสร้างและหน้าที่ของการบริหารซิสพลาตินได้รับการบันทึกไว้ก่อนหน้านี้ (16–18) โดยสรุป หนูเมาส์ได้รับการฉีดซิสพลาตินในช่องท้องเพียงครั้งเดียว (20 มก./กก. ของร่างกายโดยน้ำหนัก) ส่งผลให้เนื้อร้ายเซลล์ทิวบูลและการตายของเซลล์แบบอะพอพโทซิสและยูเรียไนโตรเจนในเลือดสูงขึ้นภายใน 3 วันหลังการฉีดซิสพลาติน (16–18) สัตว์ถูกเลี้ยงในกรงเมตาบอลิซึม และได้รับการเก็บปัสสาวะทุกวัน
การแยกอาร์เอ็นเอ
เนื้อเยื่อไตทั้งหมดของหนูเมาส์ (หรือเซลล์ทูบูลส่วนต้นของมนุษย์ที่เพาะเลี้ยง ดูด้านล่าง) ถูกรบกวนด้วย Tissue Terror (Biospec Products, Racine, WI) RNA ทั้งหมดจากไตควบคุมและไตขาดเลือดถูกแยกออกโดยใช้ RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) และหาปริมาณโดย spectrophotometry
ขั้นตอน Microarray
คำอธิบายโดยละเอียดของฮาร์ดแวร์และขั้นตอน microarray ได้รับการเผยแพร่ก่อนหน้านี้ (11) โดยสังเขป สำหรับการทดลองแต่ละครั้ง RNA ไตของหนูเมาส์ทั้งหมด 100 กรัมถูกกรองแบบย้อนกลับด้วย Superscript II reverse transcriptase (Life Technologies, Rockville, MD) ต่อหน้า Cy3-dUTP (Amersham, Piscataway, NJ) สำหรับการควบคุมและ Cy5-dUTP สำหรับตัวอย่างขาดเลือด ตัวอย่าง cDNA ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ตัวกรอง Microcon YM-50 (Millipore, Madison, WI) และถูกไฮบริไดซ์กับสไลด์ microarray ที่มีโพรบเมาส์ที่ผ่านการตรวจสอบลำดับที่ไม่ซ้ำกัน 8979 (11) สัตว์ที่แยกจากกันสามตัวถูกตรวจสอบสำหรับแต่ละช่วงการไหลซ้ำ และการทดลองไมโครอาร์เรย์ที่เป็นอิสระอย่างน้อยสองการทดลองถูกดำเนินการสำหรับสัตว์แต่ละตัว สไลด์อาร์เรย์ถูกสแกนโดยใช้เครื่องสแกนไมโครอาร์เรย์ (GenePix 4000B; Axon Instruments, Foster City, CA) เพื่อรับภาพ TIFF แยกต่างหากสำหรับการเรืองแสง Cy3 และ Cy5 ความเข้มของสัญญาณสำหรับ Cy3 และ Cy5 ถูกกำหนดสำหรับยีนแต่ละตัวโดยใช้ซอฟต์แวร์การแยกข้อมูล GenePix Pro 3.0 (Axon Instruments) การควบคุมคุณภาพและการวิเคราะห์ข้อมูลเสร็จสิ้นตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (11)
cistanche พืชสำหรับไต
การถอดความแบบย้อนกลับกึ่งเชิงปริมาณ–PCR
จำนวนที่เท่ากัน (1 บวก - g) ของ RNA ทั้งหมดจากไตควบคุมและไตของหนูทดลองถูกคัดลอกย้อนกลับด้วย Superscript II reverse transcriptase (Life Technologies) ต่อหน้า hexamers แบบสุ่มตามคำแนะนำของผู้ผลิต PCR ทำได้สำเร็จโดยใช้ชุดเครื่องมือ (Roche, Indianapolis, IN) และไพรเมอร์ต่อไปนี้: mouse NGAL sense 5'-CACCACGGACTACAACCAGT TCGC-3', NGAL antisense 5'-TCAGTTGTCAATGCATTG GTCGGTG-3' ของเมาส์, NGAL ของมนุษย์ ความรู้สึก 5'-TCAGCCGTCGATACACT GGTC-3' และแอนติเซนส์ NGAL ของมนุษย์ 5'-CCTCGTCCGAGTGG TGAGCAC-3' คู่ไพรเมอร์สำหรับหนูเมาส์และ -แอกตินของมนุษย์และกลีซาลดีไฮด์-3- ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนส (GAPDH) ได้มาจากคลอนเทค (La Jolla, CA) ปฏิกิริยาจำลองที่ปราศจาก cDNA ทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมเชิงลบ ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกวิเคราะห์โดย agarose gel electrophoresis ตามด้วยการย้อมสีด้วยเอทิเดียมโบรไมด์และหาปริมาณโดยการวัดความหนาแน่น การเปลี่ยนแปลงแบบพับในการแสดงออกของ NGAL mRNA ในไตขาดเลือดเทียบกับไตกลุ่มควบคุมถูกแสดงออกหลังจากการทำให้ปกติสำหรับ -แอกตินหรือการขยาย GAPDH
กล้องจุลทรรศน์
สำหรับการตรวจหา NGAL ส่วนที่แช่แข็งถูกซึมผ่านด้วย {0}}.2 เปอร์เซ็นต์ Triton X-100 ใน PBS เป็นเวลา 10 นาที บล็อกด้วยซีรัมของแพะเป็นเวลา 1 ชั่วโมง และบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิกับ NGAL ( เจือจาง 1:500) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นสไลด์ถูกเปิดเผยเป็นเวลา 30 นาทีในความมืดจนถึงแอนติบอดีทุติยภูมิที่คอนจูเกตด้วย Cy5 (Amersham, Arlington Heights, IL) และแสดงภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง (Zeiss Axiophot) ที่ติดตั้งตัวกรองโรดามีน สำหรับการโลคัลไลเซชันร่วมกันของ NGAL กับ Rab11 ส่วนลำดับขั้นแรกถูกบ่มด้วยแอนติบอดี NGAL หรือโมโนโคลนัลแอนติบอดีไปที่ Rab11 (การเจือจาง 1:500; Transduction Laboratories) จากนั้นด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่คอนจูเกตด้วย Cy5 (สำหรับ NGAL) หรือ Cy3 (สำหรับ Rab11) ) และแสดงภาพด้วยตัวกรองโรดามีนหรือฟลูออเรสซีนตามลำดับ สำหรับการโลคัลไลเซชันร่วมกันของ NGAL กับแอนติเจนของเซลล์นิวเคลียสที่เพิ่มจำนวนขึ้น (PCNA) ส่วนต่างๆ ถูกบ่มร่วมกับแอนติบอดี NGAL และโมโนโคลนัลแอนติบอดีกับ PCNA (1:500 การเจือจาง; ตอนเหนือ) และตรวจพบได้สำเร็จโดยการย้อมสีอิมมูโนเปอร์ออกซิเดส (ImmunoCruz Staining System, ซานตาครูซ เทคโนโลยีชีวภาพ). สำหรับการทดสอบ TUNEL เราใช้ ApoAlert DNA Fragmentation Assay Kit (Clontech) ส่วนของพาราฟินถูกทำให้ปราศจากพาราฟินผ่านไซลีนและเกรดเอธานอลจากมากไปน้อย ตรึงด้วยฟอร์มาลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์/PBS เป็นเวลา 30 นาทีที่ 4 องศา ซึมซับด้วยโปรตีเอส K ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาที และ 0.2 เปอร์เซ็นต์ไทรทัน X-100/PBS เป็นเวลา 15 ขั้นต่ำที่ 4 องศา และบ่มด้วยส่วนผสมของนิวคลีโอไทด์และเอนไซม์ TdT เป็นเวลา 60 นาทีที่ 37 องศา ปฏิกิริยาสิ้นสุดลงด้วย 2 SSC และส่วนต่างๆ ถูกล้างด้วย PBS และติดด้วย Crystal/ Mount (Biomed, Foster City, CA) ตรวจพบนิวเคลียส apoptotic ที่เป็นบวกของ TUNEL โดยการสร้างภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง
เก็บปัสสาวะ
หนูหรือหนูถูกวางไว้ในกรงเมตาบอลิซึม (Nalgene, Rochester, NY) และเก็บปัสสาวะก่อนและหลังทวิภาคีทุกชั่วโมงไตการอุดตันของหลอดเลือดแดง ตัวอย่างปัสสาวะถูกหมุนเหวี่ยงที่ 5,000 กรัมเพื่อกำจัดเศษ และวิเคราะห์ส่วนลอยเหนือตะกอนโดยวิธี Western blotting ครีเอตินีนในปัสสาวะถูกวัดโดยชุดทดสอบสีเชิงปริมาณ (ซิกมา) เพื่อทำให้ตัวอย่างเป็นปกติสำหรับการตรวจวัด NGAL ในปัสสาวะ โรชได้ชุดทดสอบสีสำหรับการตรวจวัด N-acetyl -D-glucosaminidase (NAG) ในปัสสาวะ
การเพาะเลี้ยงเซลล์
มนุษย์ไตเซลล์เยื่อบุผิวท่อใกล้เคียง (RPTEC) ได้มาจาก Clonetics (ซานดิเอโก, แคลิฟอร์เนีย) เซลล์ถูกปลูกในไตสารตั้งต้นของเซลล์เยื่อบุผิวเสริมด้วยไตEpithelial Cell Growth Medium (REGM) complex ({{0}}.5 l/ml hydrocortisone, 10 pg/ml hEGF, 0.5 - g/ml อะดรีนาลีน, 6.5 pg/ml ไตรไอโอโดไทโรนีน, 10 บวก - g/ml transferrin, 5 - g/ml อินซูลิน, 1 -g/ml gentamicin sulfate และ 2 เปอร์เซ็นต์ FBS) ตามที่ผู้ผลิตแนะนำ
การพร่อง ATP เล็กน้อยของเซลล์เพาะเลี้ยง
เราได้แก้ไขโปรโตคอลที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ของภาวะขาดเลือดขาดเลือดในหลอดทดลองโดยการลด ATP ด้วยสารยับยั้งการเกิดออกซิเดชันฟอสโฟรีเลชัน (19,20) ในวันที่สองหลังการบรรจบกัน เซลล์ RPTEC ถูกบ่มด้วย antimycin A (Sigma) 1 ม. สำหรับช่วงเวลาที่ต่างกันจนถึง 6 ชั่วโมง ก่อนหน้านี้ เราได้แสดงให้เห็นแล้วว่าสิ่งนี้ส่งผลให้เกิดการพร่อง ATP แบบย้อนกลับได้บางส่วนที่ไม่รุนแรง และไม่มีการสูญเสียความมีชีวิตของเซลล์ในเซลล์เยื่อบุผิวไตประเภทอื่นที่เพาะเลี้ยง เช่น MDCK (19) และเซลล์ 786-O (20) ระดับ ATP ถูกเฝ้าติดตามโดยใช้ชุดทดสอบที่มีลูซิเฟอเรสเป็นพื้นฐาน (Sigma) และแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของค่าควบคุม เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวที่จุดเวลาต่างๆ ของการสูญเสีย ATP และวิเคราะห์สำหรับการแสดงออกของ NGAL mRNA โดยการถอดรหัสแบบย้อนกลับ–PCR (RT-PCR) และการแสดงออกของโปรตีน NGAL โดยการวิเคราะห์แบบตะวันตก นอกจากนี้ยังมีการตรวจสอบการหลั่งของ NGAL ในอาหารเลี้ยงเชื้อ
วัสดุและวิธีการอื่นๆ
ซื้อสารเคมีทั้งหมดจาก Sigma เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น สำหรับ Western blotting ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดโดยการทดสอบ Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA) และบรรจุโปรตีนทั้งหมดในปริมาณที่เท่ากันในแต่ละเลน โมโนโคลนัลแอนติบอดีกับ- -ทูบูลิน (ซิกมา) ถูกใช้ที่ 1:10,000 การเจือจางเพื่อยืนยันปริมาณโปรตีนที่เท่ากัน และใช้โพลีโคลนัลแอนติบอดีกับ NGAL ที่ 1:500 (21) โมโนโคลนัลแอนติบอดีต่อ 2-ไมโครโกลบูลินถูกใช้ที่ 1:500 (ซิกมา) การตรวจหาภูมิคุ้มกันของโปรตีนที่ถูกถ่ายโอนทำได้โดยใช้เคมีลูมิเนสเซนซ์ที่ปรับปรุง (Amersham)
ผลลัพธ์
การหาลักษณะเฉพาะของแบบจำลองสัตว์ของการบาดเจ็บที่ไตระยะแรกเริ่มขาดเลือด-การกลับเป็นซ้ำ
เราใช้แบบจำลองของหนูซึ่งมีการบันทึกถึงผลที่ตามมาจากโครงสร้างและหน้าที่ของช่วงเวลาสั้นๆ ของภาวะขาดเลือดในไต (11–15) ลักษณะทางจุลพยาธิวิทยาที่เป็นลักษณะเฉพาะของการบาดเจ็บจากการขาดเลือดสามารถเห็นได้อย่างชัดเจนในตัวอย่างการกลับคืนชีพ 24-ชั่วโมง หลังจากขาดเลือดขาดเลือดทั้งข้างเดียว (45 นาที) และระดับทวิภาคี (30 นาที) สิ่งเหล่านี้รวมถึงการสูญเสียเยื่อหุ้มขอบแปรง, การขยายท่อ, เยื่อบุผิวท่อที่แบน, เศษซากของแสงและการแทรกซึมของสิ่งของคั่นระหว่างหน้า (รูปที่ 1) เราบันทึกการมีอยู่ของเซลล์ apoptotic โดยใช้การทดสอบ TUNEL การตายของเซลล์อะพอพโทซิสส่วนใหญ่ถูกแปลเป็นภาษาท้องถิ่นไปยังเซลล์ท่อส่วนปลายและแขนขาจากน้อยไปมากของลูปของ Henle ทั้งในเซลล์ที่แยกออกมาภายในลูเมนและเซลล์ที่เชื่อมต่อ เซลล์ท่อส่วนต้นที่ใกล้เคียงกันเป็นครั้งคราวก็เป็นอะพอพโทซิสเช่นกัน แต่โกลเมอรูไลนั้นปราศจากอะพอพโทซิส ไม่พบเซลล์ที่เป็นบวกของ TUNEL ในไตควบคุมหรือในตัวอย่างขาดเลือดที่ละ TdT (ไม่แสดง) การเปลี่ยนแปลงทางจุลกายวิภาคและอะพอพโทติกข้างต้นไม่อยู่ในไตที่มีระดับของการขาดเลือดขาดเลือดในระดับที่รุนแรงกว่า (5, 10 หรือ 20 นาทีของการขาดเลือดขาดเลือดทวิภาคี; ไม่แสดง) ระดับครีเอตินีนในเลือดสะท้อนถึงการเปลี่ยนแปลงทางจุลพยาธิวิทยาที่สังเกตพบ ดังนั้น หนูที่มีภาวะไตขาดเลือดข้างเดียวหรือระดับเล็กน้อยของภาวะขาดเลือดทวิภาคีที่ไม่แสดงอาการแสดงระดับครีเอตินีนในซีรัมซึ่งแยกไม่ออกจากสัตว์ควบคุม ในขณะที่หนูที่มีภาวะขาดเลือดในระดับทวิภาคีเป็นเวลา 30 นาที พบว่ามีระดับครีเอตินีนในเลือดสูงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 1)
รูปที่ 1 การแสดงคุณลักษณะของแบบจำลองเมาส์ของการขาดเลือดไตบาดเจ็บ. แผงด้านซ้ายแสดงผลของการย้อม hematoxylin และ eosin (บนสุด) และการย้อมสี TUNEL (ด้านล่าง) ของไตจากหนูควบคุมหรือหลังจาก 24 ชั่วโมงของ ischemia-reperfusion (IRI) (ขวา) ผลการตรวจครีเอตินีนในซีรัมในหนูควบคุม (Con) หลังขาดเลือดข้างเดียวเป็นเวลา 45 นาที (U45) หรือหลังขาดเลือดทวิภาคีเป็นระยะเวลาต่างๆ ตามที่แสดง *P 0.05 เทียบกับกลุ่มควบคุม ตัวเลขในแถบระบุจำนวนสัตว์
NGAL mRNA ได้รับการกระตุ้นอย่างเห็นได้ชัดในไต Postischemic ระยะแรก
โดยการวิเคราะห์ microarray ของหนูที่มีข้างเดียวไตขาดเลือด พบว่า NGAL ถูกเหนี่ยวนำอย่างสม่ำเสมอ (3.2 บวก - 05-เท่า, 11.1 บวก - 1.2-เท่า และ 4.3 บวก {{1{{30} }}}.6-พับที่ 3, 12 และ 24 ชั่วโมงของการเกิดซ้ำ) ในไตของหนูเมาส์ที่ขาดเลือดเมื่อเปรียบเทียบกับไตควบคุมจากสัตว์ตัวเดียวกัน (ค่าเฉลี่ยบวก - SD จากสัตว์สามตัวในแต่ละจุดเวลา) การค้นพบนี้ได้รับการยืนยันโดย RT-PCR แบบกึ่งปริมาณ โดยใช้โปรโตคอลการทำให้เป็นมาตรฐานที่มีทั้งบวก -แอกตินและ GAPDH ไม่มีการเปลี่ยนแปลงที่มีนัยสำคัญในการแสดงออกของ mRNA ของ plus -actin หรือ GAPDH ที่ช่วงเวลาการกลับคืนสู่สภาพเดิมใดๆ ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (11) อย่างไรก็ตาม เมื่อใช้ไพรเมอร์เฉพาะเมาส์ เราตรวจพบการควบคุมที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของการแสดงออก NGAL mRNA (4.1 บวก -0.5-เท่า, 9 บวก -0.6-เท่า และ 4.2 บวก 0.4-เท่า ที่ 3, 12 และ 24 ชั่วโมงของการแพร่กลับ ตามลำดับ โดยที่ค่าแสดงถึงค่าเฉลี่ยบวก - SD จากสัตว์สามตัวที่แยกจากกัน) ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงไว้ในรูปที่ 2 และสอดคล้องกับการเปลี่ยนแปลงที่ตรวจพบโดยการวิเคราะห์การถอดรหัส
รูปที่ 2 การเหนี่ยวนำของไตหนูเมาส์ neutrophil เจลาติเนสที่เกี่ยวข้องกับ lipocalin (NGAL) mRNA หลังขาดเลือด (บนสุด) การถอดรหัสแบบย้อนกลับที่เป็นตัวแทน–PCR (RT-PCR) พร้อมไพรเมอร์สำหรับแอคตินของเมาส์และ NGAL โดยใช้ RNA ที่สกัดจากไตของหนูกลุ่มควบคุม (C) หรือหลังจากช่วงเวลาการกลับคืนสู่สภาพเดิมต่างๆ ตามที่แสดง (ชั่วโมง) เลน M มีบันไดดีเอ็นเอ 100-bp (ล่าง) การเพิ่มขึ้นของนิพจน์ NGAL mRNA ที่จุดเวลาต่างๆ จากกลุ่มควบคุม (CON) เพิ่มขึ้นเท่าตัว ค่าที่ได้จาก microarray (เส้นทึบ) กับ RT-PCR (เส้นประ) หมายถึง SD จากการทดลองสามครั้งในแต่ละช่วงเวลา
โปรตีน NGAL แสดงออกอย่างเด่นชัดในท่อใกล้เคียงของไตหนูเมาส์ที่ขาดเลือดในระยะแรก
เป็นเรื่องที่น่าสนใจต่อไปที่จะพิจารณาว่าการแสดงออกของโปรตีน NGAL ในไตที่สัมพันธ์กับปฏิกิริยาหลังเคมีในไตนั้นสอดคล้องกับ mRNA หรือไม่ โดยการวิเคราะห์แบบตะวันตก NGAL ตรวจพบได้เพียงเป็น 25-kD immunoreactive peptide ในไตของหนูเมาส์ควบคุม เอกลักษณ์ของแถบนี้ในชื่อ NGAL ถูกสร้างขึ้นในชุดการทดลองที่แยกจากกัน โดยที่การฟักไข่ของแอนติบอดีปฐมภูมิด้วยไลโปคาลินของเมาส์รีคอมบิแนนท์ขัดขวางภูมิคุ้มกันบกพร่องนี้อย่างสมบูรณ์ (ไม่แสดง) ในการทดลองภาวะขาดเลือดข้างเดียว การแสดงออกของ NGAL ถูกกระตุ้นสามถึงสี่เท่าโดยการวัดความหนาแน่นในไตขาดเลือดจากสัตว์ห้าตัวที่แยกจากกันภายใน 3 ชั่วโมงของการบาดเจ็บ ดังแสดงในรูปที่ 3 การตอบสนองนี้เพิ่มขึ้นอย่างมากในการทดลองภาวะขาดเลือดแบบทวิภาคีจากสัตว์แปดตัวที่แยกจากกัน . NGAL ในหนูเหล่านี้ถูกเหนี่ยวนำสามเท่าหลังจาก 3 ชั่วโมงของการเกิดซ้ำ สูงสุดที่ 12-เท่าในตัวอย่าง 24- ชั่วโมง และลดลงสู่ระดับปกติภายในระยะเวลาการกู้คืน 72- ชั่วโมง (รูปที่ 3) .
รูปที่ 3 การเหนี่ยวนำของโปรตีน NGAL ในไตของหนูเมาส์หลังจากขาดเลือดข้างเดียวหรือทวิภาคี (บนสุด) Western blots ที่เป็นตัวแทนกับตัวอย่างไตทั้งหมดที่ได้รับจากหนูทดลอง (Con) หรือหลังจากช่วงเวลาการกลับคืนสู่สภาพเดิมตามที่แสดง (ชั่วโมง) ถูกตรวจสอบด้วยโพลีโคลนอลแอนติบอดีต่อ NGAL หรือโมโนโคลนัลแอนติบอดีต่อทูบูลิน (เพื่อแสดงปริมาณโปรตีนที่เท่ากัน) เครื่องหมายน้ำหนักโมเลกุลอยู่ทางด้านซ้าย (ล่าง) พับเพิ่มขึ้นในการแสดงออกของโปรตีน NGAL ที่จุดเวลาต่างๆจากการควบคุม (CON) ค่าที่ได้จากการวัดความหนาแน่นหมายถึง SD จากสัตว์ห้าตัวสำหรับการขาดเลือดขาดเลือดข้างเดียวและสัตว์แปดตัวสำหรับการขาดเลือดขาดเลือดทวิภาคี
การใช้เทคนิคอิมมูโนฮิสโตเคมิคัล เราแสดงให้เห็นต่อไปว่าโปรตีน NGAL แทบจะตรวจพบได้ในไตของหนูเมาส์ควบคุม แต่ได้รับการควบคุมอย่างเหนือชั้นในท่อไตใกล้เคียงภายใน 3 ชั่วโมงของภาวะขาดเลือดขาดเลือดดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 4 การระบุท่อส่วนต้นในส่วนเหล่านี้ขึ้นอยู่กับการปรากฏตัวของแปรง เยื่อหุ้มขอบ อัตราส่วนของนิวเคลียร์ต่อขนาดเซลล์ และสัณฐานวิทยาของเซลล์ NGAL ที่ถูกเหนี่ยวนำปรากฏในการกระจายไซโตพลาสมิกแบบแบ่งจังหวะภายในเซลล์ท่อใกล้เคียง ซึ่งชวนให้นึกถึงโปรตีนที่หลั่งออกมา รูปแบบการแสดงออกนี้เหมือนกันทั้งในแบบจำลองข้างเดียวและทวิภาคีของการบาดเจ็บจากการขาดเลือดขาดเลือด-กลับ และเห็นได้ชัดในสัตว์ทุกตัวที่ศึกษา โกลเมอรูไลไม่มีการแสดงออกของ NGAL และไม่มีนิวโทรฟิลที่แสดงออก NGAL ปรากฏชัด เนื่องจาก NGAL แสดงให้เห็นในเซลล์ไตเนื้องอกของ Wilms ที่เพาะเลี้ยงเพื่อกำหนดตำแหน่งร่วมกันอย่างน้อยบางส่วนกับเอนโดโซม (21) เราจึงตรวจสอบการกระจายของ NGAL และ Rab11 ในส่วนอนุกรม ภาพที่รวมเข้าด้วยกันแสดงให้เห็นการโลคัลไลเซชันร่วมกันอย่างมีนัยสำคัญของ NGAL กับ Rab11 (รูปที่ 4) เพื่อสำรวจความสำคัญเชิงหน้าที่ของการแสดงออกของ NGAL ที่ได้รับการปรับปรุงหลังจากภาวะขาดเลือดขาดเลือด เราได้ตรวจสอบส่วนไตต่อเนื่องสำหรับการแสดงออกของ NGAL, นิวเคลียสที่เป็นบวกของ TUNEL หรือนิวเคลียสที่เป็นบวก PCNA ในขณะที่เซลล์หลอดที่แสดง NGAL มากเกินไปไม่ใช่ TUNEL-positive (ไม่แสดง) การโลคัลไลซ์เซชันที่มีนัยสำคัญของ NGAL และ PCNA นั้นชัดเจนในการเพิ่มจำนวนและการสร้างเซลล์ใหม่ที่ช่วงเวลารีโฟลว์ 48-h (รูปที่ 4)
รูปที่ 4 การเหนี่ยวนำโปรตีน NGAL ในไตของหนูเมาส์หลังภาวะขาดเลือด (บนสุด) อิมมูโนฮิสโตเคมีที่เป็นตัวแทนมีผลกับส่วนที่แช่แข็งของไตของหนูเมาส์ที่ได้รับจากหนูเมาส์ควบคุมหรือหลังจากช่วงการไหลย้อนที่ต่างกันตามที่แสดงไว้ (ชั่วโมง) ถูกตรวจสอบด้วยโพลีโคลนอลแอนติบอดีต่อ NGAL ก. โกลเมอรูลัส แผงที่ระบุว่า HP มีกำลังขยายกำลังสูง 100 ดวง และแผงอื่นๆ อยู่ที่ 20 (ด้านล่าง) แผงด้านซ้ายสองแผงแสดงท่อหลังจากผ่านไป 3 ชั่วโมง โดยแสดง NGAL (สีแดง) หรือ Rab11 (สีเขียว) แผงที่สามแสดงรูปภาพที่ผสาน ซึ่งระบุการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นด้วยสีเหลือง แผงทางด้านขวาสุดแสดงการโลคัลไลเซชันร่วมกันของ NGAL กับแอนติเจนของนิวเคลียสของนิวเคลียสที่เพิ่มจำนวนในท่อหลังจาก 48 ชั่วโมงของการไหลซ้ำ
โปรตีน NGAL ตรวจพบได้ง่ายในปัสสาวะทันทีหลังจากการเหนี่ยวนำของ ARF ในหนู
เป็นเรื่องที่น่าสนใจต่อไปที่จะตรวจสอบว่าการแสดงออกของโปรตีน NGAL สามารถตรวจพบได้ในปัสสาวะหรือไม่ ดังนั้นจึงแนะนำประโยชน์ของมันในฐานะตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่ไม่รุกล้ำในระยะเริ่มต้นของภาวะขาดเลือดไตบาดเจ็บ. ด้วยการใช้ความเข้มข้นของครีเอตินีนในปัสสาวะเพื่อให้โหลดตัวอย่างเท่ากัน NGAL จะไม่อยู่ในปัสสาวะก่อนขาดเลือดขาดเลือด ในทางตรงกันข้าม NGAL ปรากฏเป็นแถบ 25-kD ภายใน 2 ชั่วโมงของการบาดเจ็บ (ในปัสสาวะออกครั้งแรกหลังจากขาดเลือดขาดเลือด) ในสัตว์ทุกตัวที่ตรวจ (ห้าตัวมีข้างเดียวและแปดตัวมีภาวะขาดเลือดทวิภาคี) ดังที่แสดงใน รูปที่ 5 เอกลักษณ์ของแถบนี้ในฐานะ NGAL ถูกสร้างขึ้นในชุดการทดลองที่แยกจากกัน ซึ่งการฟักตัวของแอนติบอดีปฐมภูมิด้วย lipocalin ของเมาส์รีคอมบิแนนท์ขัดขวางภูมิคุ้มกันนี้อย่างสมบูรณ์ (ไม่แสดง) อย่างน่าทึ่ง NGAL ตรวจพบได้ง่ายในปัสสาวะที่ยังไม่ผ่านกระบวนการเพียง 1 ลิตรโดยการวิเคราะห์แบบตะวันตกและคงอยู่ตลอดระยะเวลาที่ตรวจสอบ (24 ชั่วโมงของการกลับเป็นเลือด) จากนั้นเราเปรียบเทียบการขับ NGAL ในปัสสาวะกับเครื่องหมายของการบาดเจ็บที่สร้างไว้ก่อนหน้านี้ เช่น 2-micro globulin และ NAG ในขณะที่ NGAL ในปัสสาวะปรากฏชัดภายใน 2 ชั่วโมงของภาวะขาดเลือดขาดเลือด 2-microglobulin สามารถตรวจพบได้ในตัวอย่างปัสสาวะเดียวกันหลังจาก 12 ชั่วโมงของด้านเดียวและ 8 ชั่วโมงของภาวะขาดเลือดทวิภาคี (รูปที่ 5) ในทำนองเดียวกัน การขับถ่าย NAG ในปัสสาวะเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังจาก 12 ชั่วโมงของภาวะขาดเลือดข้างเดียวและ 8 ชั่วโมงของภาวะขาดเลือดขาดเลือดทวิภาคีเมื่อเปรียบเทียบกับสัตว์ที่ควบคุมแบบไม่ขาดเลือด (รูปที่ 5)
รูปที่ 5. การตรวจหาโปรตีน NGAL ในปัสสาวะในระยะเริ่มต้นของหนูที่มีภาวะขาดเลือดเฉียบพลันไตความล้มเหลว (ARF) (บนสุด) ตัวแทนตัวอย่าง Western blots ของตัวอย่างปัสสาวะที่ยังไม่ผ่านกระบวนการ (1 ถึง 2 บวก - l ต่อเลน, ทำให้เป็นมาตรฐานสำหรับเนื้อหา creatinine) ได้รับในช่วงเวลาการกลับเป็นซ้ำตามที่แสดง (ชั่วโมง) หลังจากข้างเดียวหรือทวิภาคีไตหนีบหลอดเลือด เครื่องหมายน้ำหนักโมเลกุลแสดงอยู่ทางด้านซ้าย บล็อตถูกโพรบด้วย NGAL (บนสุด) หรือ {0}}ไมโครโกลบุลิน (เบตา2-M; ตรงกลาง) (ล่าง) การตรวจ N-acetyl- - D-glucosaminidase (NAG) ของปัสสาวะในช่วงเวลาต่างๆ ของการเกิด reperfusion ตามที่ระบุไว้ จากสัตว์ห้าตัวสำหรับภาวะขาดเลือดข้างเดียวและสัตว์แปดตัวสำหรับภาวะขาดเลือดแบบทวิภาคี ค่ามีค่าเฉลี่ย SD *P 0.05 เทียบกับกลุ่มควบคุมที่แต่ละจุดเวลา ANOVA
โปรตีน NGAL ตรวจพบได้ง่ายในปัสสาวะแม้หลังจากภาวะไตขาดเลือดเล็กน้อยในหนู
เพื่อตรวจสอบความไวของการตรวจจับ NGAL ในปัสสาวะในกรณีที่ไม่มี ARF ที่เปิดเผย เราใช้โปรโตคอลโดยแยกชุดของหนูทดสอบทวิภาคีเพียง 5, 10 หรือ 20 นาทีไตการอุดตันของหลอดเลือดแดง การศึกษาเหล่านี้ออกแบบมาเพื่อประเมินการขับ NGAL ในปัสสาวะหลังจากภาวะไตขาดเลือดในไตที่ไม่แสดงอาการเล็กน้อย creatinine ในซีรัมที่วัดหลังจาก 24 ชั่วโมงของ reflow อยู่ในขอบเขตปกติในหนูเหล่านี้ทั้งหมด (รูปที่ 1) เด่นชัด NGAL ตรวจพบได้ง่ายในปัสสาวะที่ยังไม่ผ่านกระบวนการในสัตว์เหล่านี้เพียง 1 ลิตร (รูปที่ 6) แม้ว่าลักษณะที่ปรากฏจะค่อนข้างล่าช้าเมื่อเทียบกับสัตว์ที่มี ARF ที่เปิดเผย ดังนั้น ในขณะที่ 30 นาทีของการขาดเลือดขาดเลือดทวิภาคีส่งผลให้มีการขับ NGAL ในปัสสาวะภายใน 2 ชั่วโมง (รูปที่ 5) หนูที่มีภาวะขาดเลือดขาดเลือดทวิภาคี 20 หรือ 10 นาทีจะแสดง NGAL ในปัสสาวะหลังจาก 4 ชั่วโมงและผู้ที่มีภาวะขาดเลือดขาดเลือด 5 นาทีจะขับ NGAL ออกหลังจากผ่านไป 6 ชั่วโมงเท่านั้น ( รูปที่ 6) ดังนั้นการปรากฏตัวของ NGAL ในปัสสาวะจึงสัมพันธ์กับขนาดยาและระยะเวลาของภาวะไตขาดเลือด
โปรตีน NGAL ตรวจพบได้ง่ายในปัสสาวะทันทีหลังจากการเหนี่ยวนำของ ARF ในหนู
รูปที่ 6 การตรวจหาโปรตีน NGAL ในปัสสาวะในหนูที่มีภาวะไตขาดเลือดแบบไม่แสดงอาการ ตัวอย่าง Western blot ของตัวอย่างปัสสาวะที่ยังไม่ผ่านกระบวนการ (1 ถึง 2 ลิตรต่อเลน ทำให้เป็นมาตรฐานสำหรับเนื้อหาครีเอตินีน) ที่ได้รับในช่วงเวลาการกลับเป็นซ้ำตามที่แสดง (ชั่วโมง) หลังจาก 5, 10 หรือ 20 นาทีของการหนีบหลอดเลือดแดงไตทวิภาคี เครื่องหมายน้ำหนักโมเลกุลแสดงอยู่ทางด้านซ้าย สัตว์เหล่านี้แสดง creatinine ในซีรัมปกติที่ 24 ชั่วโมงของการไหลย้อน
เนื่องจากมีการอภิปรายเกี่ยวกับความแตกต่างของสปีชีส์ในการตอบสนองต่อการอุดหลอดเลือดแดงในไต (22) ต่อไปเราจึงตรวจสอบพฤติกรรมของ NGAL ในแบบจำลองสัตว์ที่แตกต่างกัน กล่าวคือแบบจำลองของหนูที่มีอาการบาดเจ็บจากการขาดเลือดของไต-การกลับเป็นซ้ำ ด้วยการใช้ความเข้มข้นของครีเอตินีนในปัสสาวะเพื่อให้โหลดตัวอย่างเท่ากัน NGAL จะไม่อยู่ในปัสสาวะก่อนขาดเลือดขาดเลือด ในทางตรงกันข้าม NGAL ปรากฏเป็น 25-kD immunoreactive peptide ภายใน 3 ชั่วโมงของการบาดเจ็บ (ในปัสสาวะออกครั้งแรกหลังขาดเลือดขาดเลือด) ดังแสดงในรูปที่ 7 ในการเปรียบเทียบ creatinine ในซีรัมในแบบจำลองนี้ การบาดเจ็บจากการขาดเลือดเพิ่มขึ้นเฉพาะหลังจาก 24 ชั่วโมงของการให้เลือดกลับคืนสู่สภาพเดิม (ไม่แสดง) เป็นอีกครั้งที่ตรวจพบ NGAL ในปัสสาวะที่ยังไม่ผ่านกระบวนการ 1 ลิตร และคงอยู่ตลอดระยะเวลาที่ตรวจ (24 ชั่วโมงของการเกิดซ้ำ)
รูปที่ 7 การตรวจหาโปรตีน NGAL ในปัสสาวะในระยะเริ่มต้นของหนูที่มี ARF ขาดเลือด ตัวอย่าง Western blot ของตัวอย่างปัสสาวะที่ยังไม่ผ่านกระบวนการ (1 ถึง 2 ลิตรต่อเลน ทำให้เป็นมาตรฐานสำหรับเนื้อหาครีเอตินีน) ที่ได้รับในช่วงเวลาการกลับเป็นซ้ำตามที่แสดง (ชั่วโมง) หลังจาก 30 นาทีของการหนีบหลอดเลือดแดงไตทวิภาคีในหนู เครื่องหมายน้ำหนักโมเลกุลแสดงอยู่ทางด้านซ้าย สัตว์เหล่านี้แสดงการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในซีรัมครีเอตินีนที่ 24 ชั่วโมงของการไหลย้อน
NGAL mRNA ถูกกระตุ้นในเซลล์ท่อใกล้เคียงของมนุษย์ที่เพาะเลี้ยงหลังจากขาดเลือดขาดเลือดในระยะแรก
เพื่อยืนยันที่มาของ NGAL จากเซลล์ทูบูลใกล้เคียงที่ขาดเลือด เราได้แก้ไขโปรโตคอลที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ของภาวะขาดเลือดขาดเลือดในหลอดทดลองโดยการลด ATP ในเซลล์ทูบูลใกล้เคียงของมนุษย์ที่เพาะเลี้ยง (RPTEC) การฟักตัวคือ 1-m ของ antimycin ส่งผลให้ ATP บางส่วนลดลงเล็กน้อยถึงประมาณ 83 บวก 3 เปอร์เซ็นต์ของการควบคุมภายใน 1 ชั่วโมง โดยค่อยๆ ลดลงเหลือประมาณ 75 บวก - 3 เปอร์เซ็นต์ของการควบคุมโดย 6 ชั่วโมง ( ค่าเฉลี่ย-SD จากการทดลองสี่ครั้ง) ไม่มีผลทางสัณฐานวิทยาของการพร่อง ATP ที่ไม่รุนแรงนี้ที่มองเห็นได้ NGAL mRNA ตรวจพบได้ในเซลล์ที่พักเท่านั้น อย่างไรก็ตาม หลังจากการพร่องของ ATP บางส่วน การเหนี่ยวนำอย่างรวดเร็วและขึ้นอยู่กับระยะเวลาของ NGAL mRNA นั้นชัดเจนโดย RT-PCR ดังแสดงในรูปที่ 8
โปรตีน NGAL ตรวจพบได้ง่ายในตัวกลางหลังการขาดเลือดขาดเลือดในระยะแรกเริ่มในหลอดทดลอง
ต่อไปเราจะตรวจสอบการแสดงออกของโปรตีน NGAL ในเซลล์ RPTEC และสื่อการเพาะเลี้ยงหลังจากการพร่อง ATP เล็กน้อย โปรตีน NGAL ตรวจพบได้ในเซลล์ RPTEC ควบคุม และการแสดงออกของมันเพิ่มขึ้นหลังจากการสูญเสีย ATP ในลักษณะที่ขึ้นกับระยะเวลาดังแสดงในรูปที่ 8 ไม่พบโปรตีนภูมิคุ้มกัน NGAL ในอาหารเลี้ยงเชื้อจากเซลล์ควบคุม แต่ NGAL ตรวจพบได้ง่ายภายใน 1 ชั่วโมงของการสูญเสีย ATP เล็กน้อย (รูปที่ 8) การเพิ่มขึ้นของปริมาณโปรตีน NGAL เพิ่มเติมนั้นสัมพันธ์กับระยะเวลาของการสูญเสีย ATP ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าโปรตีน NGAL ที่ถูกเหนี่ยวนำจะถูกหลั่งออกมาอย่างรวดเร็วในตัวกลาง คล้ายคลึงกับลักษณะที่ปรากฏอย่างรวดเร็วของ NGAL ในปัสสาวะหลังภาวะขาดเลือดของไตในร่างกาย
รูปที่ 8 การเหนี่ยวนำของ NGAL mRNA หลังจากขาดเลือดขาดเลือดในหลอดทดลอง (บน) RT-PCR ที่เป็นตัวแทนพร้อมไพรเมอร์สำหรับ NGAL ของมนุษย์ โดยใช้ RNA ที่สกัดจากเซลล์เยื่อบุผิวท่อใกล้เคียงของไต (RPTEC) หลังจากช่วงเวลาต่างๆ ของการสูญเสีย ATP บางส่วนตามที่แสดง (ชั่วโมง) เลน M มีบันไดดีเอ็นเอ 100-bp (ตรงกลาง) การเพิ่มขึ้นของการแสดงออกของ NGAL mRNA ที่จุดเวลาต่างๆ จากกลุ่มควบคุม (0) ทำให้เป็นมาตรฐานสำหรับการแสดงออกของกลีเซอรอลดีไฮด์-3-ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนส ค่าที่แสดงหมายถึง SD จากการทดสอบสามครั้งในแต่ละช่วงเวลา (ด้านล่าง) ตัวแทน Western blot กับตัวอย่าง RPTEC หลังจากช่วงเวลาต่างๆ ของการสูญเสีย ATP บางส่วนตามที่แสดง (ชั่วโมง) ที่ได้รับจากปริมาณเม็ดเซลล์ (Pel) หรืออาหารเลี้ยงเชื้อ (Sup) ในปริมาณที่เท่ากัน ซึ่งตรวจสอบด้วยโพลีโคลนัลแอนติบอดีต่อ NGAL เครื่องหมายน้ำหนักโมเลกุลอยู่ทางด้านซ้าย รูปนี้เป็นตัวแทนของการทดลองสามแบบแยกกัน
โปรตีน NGAL ตรวจพบได้ง่ายในปัสสาวะตั้งแต่เนิ่นๆ หลังจากการชักนำให้เกิดพิษต่อไตที่เกิดจากซิสพลาติน
ต่อไปเราต้องการที่จะตรวจสอบว่าสามารถตรวจพบ NGAL ในปัสสาวะได้หรือไม่หลังจากการบาดเจ็บของเซลล์ท่อในรูปแบบอื่น ในรูปแบบเมาส์ที่พิสูจน์แล้วว่าเป็นพิษต่อไตของซิสพลาติน NGAL ตรวจพบได้ง่ายในปัสสาวะภายใน 1 วันของการบริหารซิสพลาติน (รูปที่ 9) ในทางตรงกันข้าม 2-ไมโครโกลบูลินในปัสสาวะแทบจะไม่สามารถตรวจพบได้หลังจากผ่านไป 2 วัน และไม่สามารถตรวจพบได้อย่างน่าเชื่อถือจนถึงวันที่ 4 ถึง 5 หลังจากซิสพลาติน ในทำนองเดียวกัน การขับถ่าย NAG ในปัสสาวะเพิ่มขึ้นไม่ชัดเจนจนกระทั่งวันที่ 4 และ 5 หลังการให้ซิสพลาติน (รูปที่ 9)
รูปที่ 9 การตรวจหาโปรตีน NGAL ในปัสสาวะในระยะเริ่มต้นของหนูที่มีอาการบาดเจ็บจากซิสพลาติน (A) Western blots ที่เป็นตัวแทนในตัวอย่างปัสสาวะที่ยังไม่ผ่านกระบวนการ (1 ถึง 2 ลิตรต่อเลน ทำให้เป็นมาตรฐานสำหรับเนื้อหาครีเอตินีน) ที่ได้รับในวันที่แสดงหลังจากให้ยาซิสพลาติน ตรวจด้วยแอนติบอดีกับ 2-ไมโครโกลบูลินหรือ NGAL เครื่องหมายน้ำหนักโมเลกุลแสดงอยู่ทางด้านซ้าย (B) การตรวจวัด NAG ของปัสสาวะในวันต่างๆ หลังการให้ซิสพลาติน (n 4) ค่ามีค่าเฉลี่ยบวก -SD *P 0.05 เทียบกับวันที่ 0
การอภิปราย
เราใช้กลยุทธ์การสอบสวนทั้งแบบทรานสคริปโทมเพื่อระบุยีนของไตที่ชักนำหลังจากภาวะขาดเลือดของไต ซึ่งผลิตภัณฑ์โปรตีนอาจทำหน้าที่เป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพแบบใหม่สำหรับ ARF เราระบุยีนเจ็ดตัวที่ได้รับการควบคุม10-การพับ ซึ่งหนึ่งในนั้น (Cyr61) เพิ่งได้รับรายงานว่ามีการเหนี่ยวนำหลังจากภาวะขาดเลือดของไต (8) โดยไม่คาดคิด การเหนี่ยวนำการถอดเสียงอีกหกฉบับเป็นเรื่องแปลกใหม่สำหรับเขตข้อมูล ARF ในการศึกษานี้ เราเลือกที่จะอธิบายลักษณะเพิ่มเติมของยีนที่ไม่รู้จักก่อนหน้านี้เหล่านี้อีกตัวหนึ่ง ซึ่งก็คือ NGAL
NGAL อยู่ใน superfamily lipocalin ของ - 20 โปรตีนที่ถูกคัดหลั่งที่เกี่ยวข้องกับโครงสร้างซึ่งคิดว่าจะขนส่งลิแกนด์หลากหลายชนิดภายในกลีบเลี้ยงที่มีลำกล้อง (23) NGAL ของมนุษย์แต่เดิมถูกระบุว่าเป็นโปรตีน 25-kD ที่จับโควาเลนต์กับเจลาติเนสจากนิวโทรฟิลของมนุษย์ โดยที่มันแสดงแทนหนึ่งในโปรตีนแกรนูลทุติยภูมิของนิวโทรฟิล (24,25) การศึกษาการโคลนระดับโมเลกุลได้เปิดเผยว่า NGAL ของมนุษย์มีความคล้ายคลึงกับยีน 24p3 ของหนูเมาส์ที่ระบุครั้งแรกในวัฒนธรรมหลักของไตของหนูเมาส์ที่ถูกชักนำให้มีการแพร่กระจาย (26) NGAL แสดงที่ระดับต่ำมากในเนื้อเยื่อของมนุษย์อื่น ๆ รวมถึงไต หลอดลม ปอด กระเพาะอาหาร และลำไส้ใหญ่ (27) การแสดงออกของ NGAL เกิดขึ้นอย่างเห็นได้ชัดในเยื่อบุผิวที่ถูกกระตุ้น ตัวอย่างเช่น มันถูกควบคุมในเซลล์เยื่อบุผิวลำไส้ใหญ่ในบริเวณที่มีการอักเสบหรือเนื้องอก แต่ไม่มีจากการแทรกแซงบริเวณที่ไม่เกี่ยวข้องหรือภายในรอยโรคระยะแพร่กระจาย (28) ความเข้มข้นของ NGAL เพิ่มขึ้นในซีรัมของผู้ป่วยที่ติดเชื้อแบคทีเรียเฉียบพลัน (29) เสมหะของผู้ป่วยโรคหอบหืดหรือโรคปอดอุดกั้นเรื้อรัง (30) และของเหลวในหลอดลมจากปอดถุงลมโป่งพอง (31) ในกรณีเหล่านี้ทั้งหมด การเหนี่ยวนำ NGAL ถูกสันนิษฐานว่าเป็นผลจากปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์อักเสบและเยื่อบุผิว โดยการควบคุมการแสดงออกของ NGAL ที่เพิ่มสูงขึ้นจะเห็นได้ชัดทั้งในนิวโทรฟิลและเยื่อบุผิว (28–32)
การควบคุม NGAL ในไตที่โตเต็มที่ยังไม่ได้มีการอธิบายไว้ หลักฐานหลายบรรทัดที่รวบรวมจากการศึกษาของเราแนะนำว่าการเหนี่ยวนำ NGAL ที่ตรวจพบนั้นแสดงถึงการตอบสนองภายในแบบใหม่ของเซลล์ท่อไตส่วนต้นของไตต่อการบาดเจ็บที่ขาดเลือด และไม่ได้มาจากเพียงนิวโทรฟิลที่ถูกกระตุ้นเท่านั้น ประการแรก การตอบสนองรวดเร็วมาก โดย NGAL ปรากฏในปัสสาวะภายใน 2 ชั่วโมงของการบาดเจ็บ (ในปัสสาวะออกครั้งแรกหลังจากการอุดหลอดเลือดแดงไต) และการสะสมนิวโทรฟิลในไตในแบบจำลองของ ARF ขาดเลือดนี้มักจะสังเกตเห็นครั้งแรกที่ 4 ชั่วโมง หลังจากได้รับบาดเจ็บ (33–35) ประการที่สอง รูปแบบชั่วขณะของการเหนี่ยวนำ NGAL และการสะสมนิวโทรฟิลต่างกัน NGAL mRNA และการแสดงออกของโปรตีนถูกบันทึกไว้สูงสุดที่ 12 ชั่วโมงของการไหลย้อนกลับ ในขณะที่ยอดสะสมนิวโทรฟิลสูงสุดที่ 24 ชั่วโมง (33–35) เมื่อถึงเวลาที่การแสดงออกของ NGAL ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ ประการที่สาม ไม่พบนิวโทรฟิลที่แสดง NGAL โดยอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ในตัวอย่างไตที่ตรวจ (รูปที่ 4) ประการที่สี่และโน้มน้าวใจได้มากที่สุด NGAL mRNA และการเหนี่ยวนำโปรตีนได้รับการบันทึกไว้ว่าเกิดขึ้นในเซลล์ท่อใกล้เคียงของมนุษย์ที่เพาะเลี้ยงหลังจากขาดเลือดขาดเลือดในหลอดทดลอง โดยที่ NGAL หลั่งลงในอาหารเลี้ยงเชื้อภายใน 1 ชั่วโมงของการสูญเสีย ATP ในระบบที่ไม่มีนิวโทรฟิลอยู่โดยเด็ดขาด อย่างไรก็ตาม การศึกษาในร่างกายของเราไม่อนุญาตให้เราแยกการมีส่วนร่วมบางส่วนออกจากการแทรกซึมของนิวโทรฟิลที่ถูกกระตุ้นไปยังการปรับเพิ่ม NGAL ที่สังเกตได้ อันที่จริง เป็นไปได้ว่าการควบคุม NGAL ในเซลล์ของท่อไตอาจถูกกระตุ้นโดยการปล่อยไซโตไคน์เฉพาะที่จากนิวโทรฟิลที่ติดอยู่ในจุลภาคก่อนหลังการบาดเจ็บจากการขาดเลือด
cistanche คืออะไร ? Cistancheรักษาได้ไตบาดเจ็บ
ยังไม่มีคำอธิบายที่เพียงพอสำหรับการเหนี่ยวนำ NGAL โดยเยื่อบุผิวที่ถูกกระตุ้น และไม่ว่า NGAL จะป้องกันหรือใกล้เคียงกับการบาดเจ็บ หรือแม้แต่ผู้ยืนดูที่ไร้เดียงสาก็ยังไม่ชัดเจน หลักฐานล่าสุดชี้ให้เห็นว่า อย่างน้อยในกลุ่มย่อยของเซลล์ NGAL อาจเป็นตัวแทนของโมเลกุลโปรอะพอพโทซิส (36–38) ในสายพันธุ์ของเซลล์ลิมโฟซิติก pro-B ของหนูเมาส์ การถอนไซโทไคน์ทำให้เกิดการเหนี่ยวนำที่ทำเครื่องหมายไว้ของ NGAL รวมทั้งการเริ่มต้นของการตายของเซลล์ (36,37) NGAL ยังเชื่อมโยงกับการตายของเซลล์ในเนื้อเยื่อสืบพันธุ์ เซลล์เยื่อบุผิวของต่อมน้ำนมและมดลูกที่บิดเบี้ยวแสดงระดับ NGAL ในระดับสูง ซึ่งเกิดขึ้นพร้อมกันชั่วขณะกับช่วงเวลาของการตายแบบอะพอพโทซิสสูงสุด (38) มีแนวโน้มว่า NGAL จะควบคุมกลุ่มย่อยของประชากรเซลล์โดยการกระตุ้นการตายของเซลล์ เยื่อบุผิวที่กระตุ้นอาจเพิ่มการควบคุม NGAL เพื่อกระตุ้นการตายของเซลล์นิวโทรฟิลที่แทรกซึม ด้วยวิธีนี้ทำให้เซลล์ที่อาศัยอยู่สามารถรอดพ้นจากการทำลายล้างของการตอบสนองต่อการอักเสบ อีกทางหนึ่ง เซลล์เยื่อบุผิวอาจใช้กลไกนี้เพื่อควบคุมการตายของเซลล์ดังกล่าว อย่างไรก็ตาม เป็นที่น่าสนใจที่จะสังเกตในการศึกษาของเราว่าการชักนำของ NGAL หลังจากการบาดเจ็บของไตขาดเลือด-การกลับคืนมาในระยะแรกเกิดขึ้นอย่างเด่นชัดในเซลล์ท่อใกล้เคียงที่ไม่แสดงนิวเคลียสที่เป็นบวกของ TUNEL
การศึกษาล่าสุดอื่น ๆ เปิดเผยว่า NGAL ช่วยเพิ่มฟีโนไทป์ของเยื่อบุผิว NGAL แสดงโดยตาของท่อไตที่เจาะทะลุและกระตุ้นการสร้างไตโดยกระตุ้นการเปลี่ยนเซลล์ mesenchymal เป็นเยื่อบุผิวของไต (21) ไลโปคาลินอีกชนิดหนึ่งคือไกลโคเดลินสามารถกระตุ้นฟีโนไทป์ของเยื่อบุผิวเมื่อแสดงออกในเซลล์มะเร็งเต้านมของมนุษย์ (40) การค้นพบนี้มีความเกี่ยวข้องโดยเฉพาะอย่างยิ่งกับไตที่โตเต็มที่ ซึ่งหนึ่งในการตอบสนองที่ได้รับการบันทึกไว้อย่างดีต่อการบาดเจ็บจากการขาดเลือดคือลักษณะที่โดดเด่นของเซลล์เยื่อบุผิวที่แยกความแตกต่างซึ่งเรียงรายอยู่ในท่อใกล้เคียง (41) ลักษณะสำคัญของการฟื้นฟูและซ่อมแซมไตหลังการบาดเจ็บจากการขาดเลือดเกี่ยวข้องกับการได้มาซึ่งฟีโนไทป์ของเยื่อบุผิวซึ่งเป็นกระบวนการที่สรุปพัฒนาการปกติหลายประการ (42) สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่า NGAL อาจแสดงออกโดยท่อที่เสียหายเพื่อกระตุ้นการสร้างเยื่อบุผิวใหม่ การสนับสนุนแนวคิดนี้มาจากการระบุล่าสุดของ NGAL ว่าเป็นโปรตีนที่ขนส่งธาตุเหล็กซึ่งเป็นส่วนประกอบเสริมของ transferrin ในระหว่างการสร้างไต (21) เป็นที่ทราบกันดีว่าการส่งธาตุเหล็กเข้าสู่เซลล์มีความสำคัญต่อการเจริญเติบโตและการพัฒนาของเซลล์ และสิ่งนี้น่าจะมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการสร้างใหม่ของไตหลังเกิดปฏิกิริยาเคมี เช่นเดียวกับที่เกิดขึ้นระหว่างการสร้างเนื้องอก เนื่องจาก NGAL ดูเหมือนจะจับและขนส่งธาตุเหล็ก (21) จึงมีแนวโน้มว่า NGAL อาจทำหน้าที่เป็นอ่างสำหรับเหล็กที่หลุดออกจากเซลล์เยื่อบุผิวท่อใกล้เคียงที่เสียหาย เนื่องจาก NGAL สามารถเอนโดไซโตสได้โดยท่อใกล้เคียง (K. Mori และ J. Barasch, การสังเกตที่ไม่ได้เผยแพร่) โปรตีนจึงอาจรีไซเคิลธาตุเหล็กเป็นเซลล์ที่มีชีวิตได้ สิ่งนี้อาจกระตุ้นการเจริญเติบโตและการพัฒนา เช่นเดียวกับการกำจัดธาตุเหล็ก ซึ่งเป็นโมเลกุลที่ทำปฏิกิริยาออกจากบริเวณที่เกิดการบาดเจ็บของเนื้อเยื่อ ซึ่งจะเป็นการจำกัดความเป็นพิษต่อเซลล์ของธาตุเหล็ก ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นถึงการโลคัลไลเซชันร่วมกันของ NGAL ในเซลล์ทูบูลที่สร้างใหม่โดย PCNA และการเพิ่มจำนวนซึ่งสนับสนุนสมมติฐานนี้ต่อไป
ความหมายที่สำคัญของการค้นพบของเราเกี่ยวข้องกับความเป็นไปได้ที่ NGAL จะเป็นไบโอมาร์คเกอร์ทางเดินปัสสาวะแบบใหม่สำหรับภาวะขาดเลือดไตบาดเจ็บที่เปรียบเทียบได้ดีกับไบโอมาร์คเกอร์อื่นๆ ที่ได้รับการอธิบายไว้ บางทีตัวอย่างที่ได้รับการศึกษาที่ดีที่สุดคือโมเลกุลของการบาดเจ็บที่ไต-1 (KIM-1) ซึ่งเป็นโมเลกุลการยึดเกาะแบบสมมุติที่เกี่ยวข้องกับการสร้างใหม่ของไต (43,44) ในแบบจำลองของการบาดเจ็บจากการขาดเลือดขาดเลือด-กลับของหนู พบว่า KIM-1 ถูกควบคุม 24 ถึง 48 ชั่วโมงหลังจากการดูถูกครั้งแรก ทำให้เป็นตัวบ่งชี้ความเสียหายของเซลล์ท่อที่เชื่อถือได้แต่ค่อนข้างช้า การศึกษาที่หรูหราเมื่อเร็ว ๆ นี้แสดงให้เห็นว่าสามารถตรวจพบ KIM-1 ในการตรวจชิ้นเนื้อไตและปัสสาวะของผู้ป่วยที่มีเนื้อร้ายท่อเฉียบพลันขาดเลือด (45) อย่างไรก็ตาม การตรวจพบนี้ได้รับการบันทึกไว้ในผู้ป่วยที่มีความเสียหายของไตขาดเลือด และประโยชน์ของการวัด KIM-1 ในปัสสาวะสำหรับการตรวจหาอาการบาดเจ็บที่ไม่แสดงอาการในระยะเริ่มแรกยังไม่ได้รับการตรวจสอบ ในอีกตัวอย่างหนึ่งเมื่อเร็วๆ นี้ พบว่า Cyr61 เป็นโปรตีนที่อุดมด้วยซิสเทอีนที่หลั่งออกมาซึ่งสามารถตรวจพบได้ในปัสสาวะ 3 ถึง 6 ชั่วโมงหลังการบาดเจ็บที่ไตขาดเลือด (8) อย่างไรก็ตาม การตรวจจับนี้จำเป็นต้องมีขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ด้วยไบโอฟินนิตีด้วยเม็ดบีดเฮปาริน-เซฟาโรส และแม้กระทั่งหลังจากการทำให้บริสุทธิ์ดังกล่าว เปปไทด์ที่ทำปฏิกิริยาข้ามหลายตัวก็ปรากฏชัด ในทางตรงกันข้าม การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่า NGAL ตรวจพบได้ง่ายและรวดเร็วว่าเป็นเปปไทด์อิมมูโนรีแอคทีฟที่ค่อนข้างสะอาดใน Western blots โดยมีเพียง 1 ลิตรของปัสสาวะที่ยังไม่ผ่านกระบวนการแรกสุดหลังจากภาวะไตขาดเลือดในทั้งหนูและหนู นอกจากนี้ NGAL ในปัสสาวะยังปรากฏชัดแม้หลังจากภาวะไตขาดเลือด "ไม่แสดงอาการ" เพียงเล็กน้อย แม้ว่าระดับครีเอตินีนในเลือดปกติ นอกจากนี้ การตรวจหา NGAL ในปัสสาวะยังมาก่อนการปรากฏตัวของเครื่องหมายแบบดั้งเดิมในปัสสาวะ ซึ่งรวมถึง 2- microglobulin และ NAG
สุดท้าย เป็นที่น่าสังเกตว่า NGAL สามารถตรวจพบได้ในปัสสาวะในระยะแรกหลังการให้ยาซิสพลาติน ในช่วงเวลาที่ตัวบ่งชี้ทางสัณฐานวิทยาและชีวเคมีอื่นๆ ของไตบาดเจ็บไม่อยู่ ดังนั้นการควบคุมที่เพิ่มขึ้นและการขับถ่ายของ NGAL ในปัสสาวะอาจแสดงถึงการตอบสนองอย่างรวดเร็วของเซลล์ท่อไตต่อการดูหมิ่นต่างๆ และการตรวจหา NGAL ในปัสสาวะอาจเป็นเครื่องมือทางคลินิกที่ไม่รุกรานที่ใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับการวินิจฉัยเบื้องต้นของการบาดเจ็บของเซลล์ท่อ
โดยสรุป ข้อมูลของเราระบุว่า NGAL แสดงถึงไบโอมาร์คเกอร์ที่แปลกใหม่ มีความละเอียดอ่อน และไม่รุกรานสำหรับภาวะไตขาดเลือด เป็นสิ่งสำคัญในงานแปลในอนาคตเพื่อตรวจสอบการแสดงออกของ NGAL ในปัสสาวะของผู้ป่วยที่มีภาวะขาดเลือดขาดเลือดในระยะเริ่มต้นและไม่มากไตบาดเจ็บ. หวังว่าการตรวจพบแต่เนิ่นๆ ดังกล่าวอาจทำให้แพทย์สามารถกำหนดความพยายามในการแทรกแซงอย่างทันท่วงทีใน ARF ซึ่งเป็นภาวะที่ยังคงเกี่ยวข้องกับการพยากรณ์โรคที่น่าหดหู่ซึ่งการบำบัดแบบใหม่มีความจำเป็นอย่างยิ่ง นอกจากนี้ ยังหวังว่าการตรวจหา NGAL ในปัสสาวะอย่างรวดเร็วและง่ายดายในผู้ป่วยที่มีภาวะขาดเลือดขาดเลือดแบบไม่แสดงอาการไตบาดเจ็บ(เช่น การปลูกถ่ายไตที่เกี่ยวข้องกับชีวิต การผ่าตัดหลอดเลือด เหตุการณ์เกี่ยวกับหัวใจและหลอดเลือด) หรือความเสียหายต่อไตที่ไม่แสดงอาการ (เช่น การใช้สารทึบรังสีและอะมิโนไกลโคไซด์) จะแจ้งเตือนแพทย์ให้ดำเนินการประลองยุทธ์ที่มุ่งป้องกันการลุกลามของ ARF อย่างโจ่งแจ้ง
รับทราบ
งานนี้ได้รับการสนับสนุนโดยทุนจากสถาบันสุขภาพแห่งชาติ/สถาบันโรคเบาหวานแห่งชาติและการย่อยอาหารและโรคไตถึง PD (DK53289, DK52612) และ JB (DK55388 และ DK58872)
Cistanche tubulosaรักษาได้อาการบาดเจ็บที่ไต
อ้างอิง
1. Thadani R, Pascual M, Bonventre JV: ภาวะไตวายเฉียบพลัน N Engl J Med 334: 1448–1460, 1996
2. Star RA: การรักษาแบบเฉียบพลันไตความล้มเหลว. ไต Int 54: 1817–1831, 1998
3. Liaño F, Pascual J: ปัจจัยทำนายและการให้คะแนน ใน: ภาวะไตวายเฉียบพลัน แก้ไขโดย Molitoris BA และ Finn WF, Philadelphia, WB Saunders, 2001, หน้า 507–518
4. Molitoris BA: การเปลี่ยนไปใช้การรักษาในภาวะไตวายเฉียบพลันที่ขาดเลือด J Am Soc Nephrol 14: 265–267, 2003
5. Brady HR, Brenner BM, Clarkson MR, Lieberthal W: ภาวะไตวายเฉียบพลัน ใน: The Kidney, 6th Ed., แก้ไขโดย Brenner BM, Philadelphia, WB Saunders, 2000, pp 1201–1262
6. Sutton TA, Molitoris BA: กลไกของการบาดเจ็บที่เซลล์ในภาวะไตวายเฉียบพลันที่ขาดเลือด เซมิน เนฟรอล 18: 490–497, 1998
7. Sheridan AM, Bonventre JV: ชีววิทยาของเซลล์และกลไกระดับโมเลกุลของการบาดเจ็บในภาวะขาดเลือดเฉียบพลันไตความล้มเหลว. Curr Opin Nephrol Hypertens 9: 327–334, 2000
8. Muramatsu Y, Tsujie M, Kohda Y, Pham B, Perantoni AO, Zhao H, Jo SK, Yuen PST, Craig L, Hu X, Star RA: การตรวจหาโปรตีนที่อุดมด้วยซิสเทอีน 61 (CYR61, CCN1) ในระยะเริ่มต้นในปัสสาวะ หลังการบาดเจ็บของไตขาดเลือด-กลับ ไต Int 62: 1601-1610, 2002
9. Kurella M, Hsiao LL, Yishida T, Randall JD, Chow G, Sarang SS, Jensen RV, Gullans SR: การวิเคราะห์ DNA microarray ของกระบวนการทางชีววิทยาที่ซับซ้อน J Am Soc Nephrol 12: 1072–1078, 2001
10. Yoshida T, Kurelia M, Beato F, Min H, Ingelfinger JR, Stears RL, Swinford RD, Gullans SR, Tang SS: การเฝ้าติดตามการเปลี่ยนแปลงของการแสดงออกของยีนในไตขาดเลือด - reperfusion ในหนู ไต Int 61: 1646–1654, 2002
11. Supavekin S, Zhanh W, Kucherlapati R, Kaskel FJ, Moore LC, Devarajan P: การแสดงออกของยีนที่แตกต่างกันหลังจากภาวะไตขาดเลือด / การกลับคืนสู่สภาพเดิม ไต Int 63: 1714–1724, 2003
12. Nogae S, Miyazaki M, Kobayashi N, Saito T, Abe K, Saito H, Nakane PK, Nakanishi Y, Koji T: การชักนำให้เกิด apoptosis ในรูปแบบ ischemia-reperfusion ของไตเมาส์: การมีส่วนร่วมของ Fas ที่เป็นไปได้ J Am Soc Nephrol 9: 620–631, 1998
13. Daemen MARC, Van de Ven MWCM, Heineman E, Buurman WA: การมีส่วนร่วมของ interleukin ภายในร่างกาย-10และปัจจัยเนื้อร้ายของเนื้องอก- ในการบาดเจ็บของไตขาดเลือด-กลับ การปลูกถ่าย 67: 792–800, 1999
14. Kelly KJ, Plotkin Z, Dagher PC: การเสริม Guanosine ช่วยลดการตายของเซลล์และปกป้องไตทำหน้าที่ในการทำให้เกิดการบาดเจ็บจากการขาดเลือด J Clin ลงทุน 108: 1291–1298, 2001
15. Burne NJ, Rabb H: ผลงานทางพยาธิสรีรวิทยาของ fucosyltransferases ในการบาดเจ็บที่ไต เจ อิมมูนอล 169: 2648–2652, 2002
16. Megyesi J, Safirstein RL, Price PM: การเหนี่ยวนำของ p21WAF1/CIP/ SD1 ในเซลล์ท่อไตส่งผลต่อการเกิดภาวะเฉียบพลันที่เกิดจาก cisplatinไตความล้มเหลว. J Clin ลงทุน 101: 777–782, 1998
17. Shiraishi F, Curtis LM, Truong L, Poss K, Visner GA, Madsen K, Nick HS, Agarwal A: Heme oxygenase-1 การทำลายยีนหรือการแสดงออกจะปรับ apoptosis ของไตที่เกิดจาก cisplatin Am J Physiol 278: F726–F736, 2000
18. Ramesh G, Reeves WB: TNF- ไกล่เกลี่ยการแสดงออกของคีโมไคน์และไซโตไคน์และไตบาดเจ็บในความเป็นพิษต่อไตซิสพลาติน J Clin ลงทุน 110: 835–842, 2002
19. Feldenberg LR, Thevananther S, del Rio M, De Leon M, Devarajan P: การพร่อง ATP บางส่วนทำให้เกิดการตายของเซลล์ Fas- และ caspase-mediated ในเซลล์ MDCK Am J Physiol 276: F837–F846, 1999
20. Devarajan P, De Leon M, Talasazan F, Schoenfeld AR, Davidowitz EJ, Burk RD: ผลิตภัณฑ์ยีน von Hippel-Lindau ยับยั้งการตายของเซลล์ไตผ่านทาง Bcl-2-เส้นทางที่ขึ้นกับ เจ ไบโอล เคม 276: 40599–40605, 2001
21. Yang J, Goetz D, Li JY, Wand W, Mori K, Setlik D, Du T, ErdjumentBromage H, Tempst P, Strong R, Barasch J: เส้นทางการส่งเหล็กที่อาศัยไลโปคาลินเป็นสื่อกลาง เซลล์โมล 10: 1045–1056, 2002
22. Molitoris BA, Weinberg JM, Venkatachalam MA, Zager RA, Nath KA, Goligorsky MS: ภาวะไตวายเฉียบพลัน II แบบจำลองการทดลองของภาวะไตวายเฉียบพลัน: ไม่สมบูรณ์ แต่ขาดไม่ได้ Am J Physiol 278: F1–F12, 2000
23. Flower DR, North AC, Sansom CE: ตระกูลโปรตีนไลโปคาลิน: ภาพรวมโครงสร้างและลำดับ Biochim Biophys Acta 1482: 9–24, 2000
24. Kjeldsen L, Cowland JB, Borregaard N: lipocalin ที่เกี่ยวข้องกับนิวโทรฟิลเจลาติเนสของมนุษย์และโปรตีนคล้ายคลึงกันในหนูและหนู Biochim Biophys Acta 1482: 272–283, 2000
25. Xu S, Venge P: Lipocalins เป็นตัวบ่งชี้ทางชีวเคมีของโรค Biochim Biophys Acta 1482: 298–307, 2000
26. Hraba-Renevey S, Turler H, Kress M, Salomon C, Weil R: SV40-การแสดงออกของยีนเมาส์ 24p3 ที่เหนี่ยวนำให้เกิดเกี่ยวข้องกับกลไกหลังการถอดเสียงเป็นคำ เนื้องอก 4: 601–608, 1989
27. Cowland JB, Borregaard N: ลักษณะโมเลกุลและรูปแบบของการแสดงออกของเนื้อเยื่อของยีนสำหรับ lipocalin ที่เกี่ยวข้องกับนิวโทรฟิลเจลาติเนสจากมนุษย์ จีโนม 45: 17–23, 1997
28. Nielson BS, Borregaard N, Bundgaard JR, Timshel S, Sehested M, Kjeldsen L: การเหนี่ยวนำการสังเคราะห์ NGAL ในเซลล์เยื่อบุผิวของมนุษย์และโรคลำไส้อักเสบ ไส้ 38: 414–420, 1996
29. Xu SY, Pauksen K, Venge P: การวัดค่าซีรั่มของ human neutrophil lipocalin (HNL) แยกความแตกต่างระหว่างการติดเชื้อแบคทีเรียเฉียบพลันและไวรัส Scand J Clin Lab ลงทุน 55: 125–131, 1995
30. Keatings VM, Barnes PJ: เครื่องหมายกระตุ้น Granulocyte ในเสมหะที่ถูกเหนี่ยวนำในการเปรียบเทียบระหว่างโรคปอดอุดกั้นเรื้อรัง โรคหอบหืด และผู้ป่วยปกติ Am J Respir Crit Care Med 155: 449–453, 1997
31. Betsuyaky T, Nishimura M, Takeyabu K, Tanino M, Venge P, Xu S, Kawakami Y: โปรตีนเม็ดนิวโทรฟิลในน้ำล้างหลอดลมจากผู้ที่เป็นโรคถุงลมโป่งพองแบบไม่แสดงอาการ Am J Respir Crit Care Med 159: 1985–1991, 1999
32. Carlson M, Raab Y, Severus L, Xu S, Hallgren R, Venge P: มนุษย์ neutrophil lipocalin เป็นเครื่องหมายเฉพาะของการอักเสบของนิวโทรฟิลในอาการลำไส้ใหญ่บวมเป็นแผลและ proctitis ไส้ 50: 501–506, 2002
33. Chiao H, Kohda Y, McLeroy P, Craig L, Housing I, Star RA: - ฮอร์โมนกระตุ้นเมลาโนไซต์ช่วยป้องกันไตบาดเจ็บหลังจากขาดเลือดในหนูและหนู J Clin ลงทุน 99: 1165–1172, 1997
34 Rabb H, Ramirez G, Saba SR, Reynolds D, Xu J, Flavell R, Antonia S: การบาดเจ็บที่ไตขาดเลือด - reperfusion ในหนูที่ขาด L-selectin Am J Physiol 271: F408–F13, 1996
35. Rabb H, Star R: ปฏิกิริยาการอักเสบและผลที่ตามมาเฉียบพลันไตความล้มเหลว. ใน: ภาวะไตวายเฉียบพลัน แก้ไขโดย Molitoris BA และ Finn WF, Philadelphia, WB Saunders, 2001, หน้า 89 –100
36. Devireddy LR, Teodoro JG, Richard FA, Green MR: การชักนำให้เกิดการตายของเซลล์โดย lipocalin ที่หลั่งออกมาซึ่งควบคุมโดยการถอดความโดย IL-3 วิทยาศาสตร์ 293: 829–834, 2001
37 Persengiev SP, Devireddy LR, Green MR: การยับยั้งการตายของเซลล์โดย ATFx: บทบาทใหม่สำหรับสมาชิกของตระกูล ATF/CREB ของปัจจัยการถอดรหัส bZIP ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ยีน Dev 16: 1806–1814, 2002
38. Ryon J, Bendickson L, Nilsen-Hamilton M: การแสดงออกที่สูงในเนื้อเยื่อสืบพันธุ์ของ uterocalin/24p3, lipocalin และโปรตีนระยะเฉียบพลัน Biochem J 367: 271–277, 2002
39. ลบในหลักฐาน
40. Kamarainen M, Seppala M, Virtanen I, Andersson LC: การแสดงออกของไกลโคเดลินใน MCF-7 เซลล์มะเร็งเต้านมทำให้เกิดความแตกต่างในเยื่อบุผิวที่มีการจัดกลุ่ม ห้องปฏิบัติการลงทุน 77: 565–573, 1997
41. Witzgall R, Brown D, Schwarz C, Bonventre JV: การแปลความหมายของแอนติเจนของเซลล์นิวเคลียสที่เพิ่มจำนวน, vimentin, c-fos และคลัสเตอร์ในไต postischemic: หลักฐานสำหรับการตอบสนองทางพันธุกรรมที่ต่างกันในกลุ่ม nephron และสระว่ายน้ำขนาดใหญ่ของ mitotically เซลล์ที่ใช้งานและไม่แตกต่างกัน J Clin ลงทุน 93: 2175–2188, 1994
42. Hammerman MR: บทสรุปของสายวิวัฒนาการโดย ontogeny ในโรคไต ไต Int 57: 742–755, 2000
43. Ichimura T, Bonventre JV, Bailly V, Wei H, Hession CA, Cate RL, Sanicola M: โมเลกุลการบาดเจ็บของไต-1 (KIM-1), โมเลกุลการยึดเกาะของเซลล์เยื่อบุผิวสมมุติที่มีอิมมูโนโกลบูลินแบบใหม่ โดเมนถูกควบคุมในเซลล์ไตหลังได้รับบาดเจ็บ เจ ไบโอล เคม 271: 4135–4142, 1998
44 Bailly V, Zhang Z, Meier W, Cate R, Sanicola M, Bonventre JV: การหลุดลอกของโมเลกุลการบาดเจ็บที่ไต-1 ซึ่งเป็นโปรตีนยึดเกาะที่เกี่ยวข้องกับการฟื้นฟูไต เจ ไบโอล เคม 277: 39739– 39748, 2002
45. Han WK, Bailly V, Abichandani R, Thadani R, Bonventre JV: โมเลกุลการบาดเจ็บของไต-1 (KIM-1): ตัวบ่งชี้ทางชีวภาพแบบใหม่สำหรับการบาดเจ็บของท่อไตส่วนต้นของมนุษย์ ไต Int 62: 237–244, 2002