กาย เจเอ็ม คาเมรอน และคณะ

ไตบาดเจ็บเฉียบพลัน(AKI) อาจถึงแก่ชีวิตและเป็นปัจจัยเสี่ยงที่ชัดเจนสำหรับการพัฒนาเรื้อรังไตโรค. เซลล์ลิมฟอยด์โดยกำเนิดกลุ่มที่ 2 (ILC2s) เป็นผู้ผลิตไซโตไคน์ชนิด-2โดยกำเนิดและเป็นตัวควบคุมที่สำคัญของสภาวะสมดุลในอวัยวะส่วนปลาย อย่างไรก็ตาม ความรู้ของเราเกี่ยวกับหน้าที่ของพวกเขาในไตค่อนข้างจำกัด หลักฐานล่าสุดชี้ให้เห็นว่าการเพิ่มจำนวน ILC2 โดยการบริหารระบบของ recombinant interleukin (IL)-25 หรือ IL-33 ช่วยป้องกันการบาดเจ็บของไต แม้ว่า ILC2s สามารถเหนี่ยวนำให้ป้องกัน AKI ที่เกิดจากการขาดเลือดหรือสารเคมีได้ แต่ไม่ทราบผลกระทบของการขาด ILC2 หรือการหมดไปต่อความรุนแรงของการบาดเจ็บที่ไต ประการแรก ฟีโนไทป์และตำแหน่งของ ILC2 ในไตได้รับการประเมินภายใต้สภาวะสมดุลไตILC2s แสดงออกถึงระดับสูงของ IL-5 และตั้งอยู่ใกล้กับหลอดเลือดในไต เพื่อทดสอบบทบาทหน้าที่ของ ILC2 ในไต, ใช้แบบจำลองการทดลองของการบาดเจ็บที่ไต-การขาดเลือดกลับคืนสู่สภาพเดิม (IRI) และประเมินความรุนแรงของการบาดเจ็บในประเภทพันธุ์ป่า, ILC2-ลดลง, ILC2-ขาด และ ILC{{4} } หนูหมด น่าแปลกที่ไม่มีความแตกต่างในจุลพยาธิวิทยา การสะสมของคอลลาเจน หรือการแสดงออกของ mRNA ที่เกี่ยวข้องกับการบาดเจ็บ (Lcn2) การอักเสบ (Cxcl1, Cxcl2 และ Tnf) หรือปัจจัยภายนอกเซลล์ (Col1a1, Fn1) ตาม IRI ในกรณีที่ไม่มี ILC2 ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าการไม่มี ILC2 ไม่ได้เปลี่ยนแปลงความรุนแรงของอาการบาดเจ็บที่ไต, บ่งบอกถึงความซ้ำซ้อนที่เป็นไปได้ ดังนั้น กลไกอื่นๆ ของการกระตุ้นเซลล์ภูมิคุ้มกันชนิด 2-ซึ่งอาศัยสื่อกลางน่าจะชดเชยในกรณีที่ไม่มี ILC2 ดังนั้นการสูญเสีย ILC2 ไม่น่าจะเพิ่มความอ่อนไหวหรือความรุนแรงของ AKI

คำสำคัญ:ILC2, เซลล์ลิมฟอยด์โดยกำเนิดกลุ่ม 2, IL-5, IL-13,ไต, ไต, IRI, การบาดเจ็บจากการขาดเลือดขาดเลือด

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมกรุณาติดต่อ:emily.li@wecistanche.com

Cistanche tubulosa ป้องกันโรคไต คลิกที่นี่เพื่อรับตัวอย่าง

การแนะนำ

ไตบาดเจ็บเฉียบพลัน(AKI) และพยาธิสภาพที่เกี่ยวข้องมีผลกระทบอย่างลึกซึ้งต่อสุขภาพของมนุษย์ (1) สาเหตุทั่วไปของ AKI คือภาวะไตขาดเลือดซึ่งส่วนใหญ่ส่งผลกระทบต่อเยื่อบุผิวท่อเนื่องจากความหนาแน่นของไมโตคอนเดรียสูงและกิจกรรมการเผาผลาญในเซลล์เหล่านี้ (2); ทบทวนใน Devarajan (3) และ Bonventre และ Yang (4) เนื้อร้ายท่อเฉียบพลันบั่นทอนการขับของเสีย เปลี่ยนแปลงน้ำและความไม่สมดุลของอิเล็กโทรไลต์ และทำให้เกิดการอักเสบที่รุนแรง ทบทวนใน Bonventre และ Yang (4) การไหลเข้าของนิวโทรฟิลและโมโนไซต์มีส่วนทำให้เกิดการบาดเจ็บ อย่างไรก็ตาม เซลล์ภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดอื่นๆ สามารถช่วยให้กลับสู่สภาวะสมดุล (5); ทบทวนใน Friedewald และ Rabb (6). เซลล์ลิมฟอยด์โดยกำเนิด (ILC) เป็นส่วนเพิ่มเติมล่าสุดของตระกูลนี้และถูกแบ่งออกเป็น 3 กลุ่มตามปัจจัยการถอดรหัสที่จำเป็นสำหรับการพัฒนาและโดยเอฟเฟกเตอร์ไซโตไคน์ที่ผลิต (7) ILC ของกลุ่ม 2 (ILC2s) คือผู้ผลิตที่มีศักยภาพของไซโตไคน์ชนิดที่ 2, อย่างเด่นคืออินเตอร์ลิวคิน (IL)-5 และ IL-13 (8, 9) เซลล์เหล่านี้ยังส่งเสริมการฟื้นตัวของเนื้อเยื่อหลังการดูถูกอวัยวะต่างๆ และมีหน้าที่ที่หลากหลายในร่างกาย (10) ตัวอย่างเช่น ภายหลังการติดเชื้อไวรัสทางเดินหายใจที่มีไวรัสไข้หวัดใหญ่ ILC2s จะประสานการซ่อมแซมเยื่อบุทางเดินหายใจโดยการผลิต growth factor amphiregulin (AREG) (11) เมื่อเร็วๆ นี้ ILC2 ได้รับการตรวจสอบในรูปแบบของการบาดเจ็บที่ไต ซึ่งรวมถึงการบาดเจ็บที่ภาวะขาดเลือดซ้ำ (IRI) และการบาดเจ็บที่เกิดจากสารเคมีที่เป็นพิษต่อไตด้วย doxorubicin หรือ cisplatin (12-16) โดยทั่วไปแล้ว IRI ของไตจะทำได้โดยการจำกัดการไหลเวียนของเลือดไปยังไตชั่วคราวเป็นเวลา 20–30 นาที โดยจำลองการบาดเจ็บจากการปลูกถ่ายหรือการผ่าตัด (17–21) โดยรวมแล้ว การศึกษาเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการบริหารให้ภายในร่างกายของไซโตไคน์ของหนูเมาส์ชนิดลูกผสมที่กระตุ้น ILC2 คือ IL-25 หรือ IL-33 เพียงพอที่จะลดความรุนแรงของการบาดเจ็บของเซลล์เยื่อบุผิวแบบท่อ (12–16) ได้ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันด้วยการถ่ายโอนแบบนำ ILC2 ที่ถูกกระตุ้นจากภายนอกร่างกายมาใช้ (12, 15) ในขณะที่ ILC2 สามารถเหนี่ยวนำให้เกิดการแพร่ขยายและป้องกันผลที่ตามมาที่เป็นอันตรายของการบาดเจ็บที่ไตในการทดลอง ผลกระทบของความบกพร่องของ ILC2-ก็ยังไม่เข้าใจอย่างถ่องแท้ แท้จริงแล้ว เซลล์ภูมิคุ้มกันอื่นๆ ซึ่งมีปฏิสัมพันธ์ที่ซับซ้อนกับ ILC2 เช่น เรกูลาทารี ที เซลล์ (Treg) และมาโครฟาจที่กระตุ้นอีกทางหนึ่ง (AAM หรือที่รู้จักในชื่อ M2) มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อผลกระทบต่อเซลล์สืบพันธุ์ (22-25) ในการศึกษานี้ เราพยายามหาลักษณะเพิ่มเติมของ ILC2 ในไต ตำแหน่งของพวกมันภายในอวัยวะนี้ และกำหนดบทบาทหน้าที่ของพวกมันใน IRI โดยใช้วิธีการสูญเสียการทำหน้าที่ ที่นี่เราพบว่าไตILC2s แสดงออกถึง IL- 5 และส่วนใหญ่ตั้งอยู่ใกล้กับหลอดเลือดในไต ภายใน adventitia นอกจากนี้ เราแสดงให้เห็นว่าการลดลง ข้อบกพร่อง หรือการสูญเสีย ILC2 มีผลกระทบน้อยที่สุดต่อความรุนแรงของ IRI ในขณะที่การกระตุ้น ILC2 และการขยายที่เกี่ยวข้องของภูมิคุ้มกันชนิดที่ 2 ในพื้นที่ได้รับการแสดงให้เห็นก่อนหน้านี้เพื่อลดผลกระทบที่เป็นอันตรายของ AKI ผลลัพธ์ของเราเปิดเผยว่าการบาดเจ็บที่คล้ายคลึงกันเกิดขึ้นในกรณีที่ไม่มี ILC2 ซึ่งบ่งชี้ว่า ILC2 อาจซ้ำซ้อนใน IRI เมื่อภูมิคุ้มกันชดเชยอื่น ๆ เซลล์เช่นเซลล์ T มีอยู่

วัสดุและวิธีการ

หนู

ประเภทไวด์เพศชายอายุแปดถึงสิบสองสัปดาห์ (WT; C57BL/6JAusb), ยานพาหนะ (Icosdtr ที่บำบัดน้ำเกลือ/ บวก Cd4cre/ บวก ), ILC2-ลดลง (Roraflfl/ บวก Il7rcre/ บวก ), ILC{{ 8}}ขาด (Roraflfl/flfl Il7rcre/ plus ), ILC2- หมด (Diptheria toxoid-treated [DTx] Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus ) และ IL-5/IL-13 หนูรายงานคู่ (Il5venus/ บวกมะเขือเทศ Il13td/ บวก ) ได้รับจากทรัพยากรชีวภาพของออสเตรเลีย (Moss Vale, ออสเตรเลีย) Il5td มะเขือเทศCre; Rosa26-หนูตัวติดตามนักข่าว CAG-RFP ได้มาจาก Jackson Labs (อ้างอิง # 030926 และ 007914) หนูทุกตัวที่ได้รับการผ่าตัดถูกเลี้ยงไว้ภายใต้สภาวะกักกันทางกายภาพ 2 ที่ปราศจากเชื้อก่อโรคในกรงที่มีการระบายอากาศแยกกัน หนูได้สัมผัสกับอากาศในห้องปกติภายในสภาพแวดล้อมที่ปลอดเชื้อระหว่างการผ่าตัด หนูได้รับอนุญาตให้ปรับตัวให้ชินกับสภาพแวดล้อมได้ 1 สัปดาห์ก่อนเริ่มการทดลอง และได้รับการบำรุงรักษาในรอบกลางวัน/กลางคืน 12-ชม. พร้อมการเข้าถึงห้องทดลองมาตรฐานและน้ำเปล่า

Flow Cytometry และการวิเคราะห์ t-SNE

ไตและปอดถูกเก็บจากหนูนักข่าว สารแขวนลอยเซลล์เดียวถูกเตรียมขึ้นตามที่อธิบายไว้ใน "การเตรียมสารแขวนลอยเซลล์เดียวจากปอดของหนูเมาส์ด้วยการบำบัดด้วยคอลลาเจนเนส ดี" (Miltenyi Biotec GmbH, 2008; Bergisch Gladbach ประเทศเยอรมนี) เซลล์ถูกปิดกั้นด้วย Fc block (แอนติ-เมาส์ CD16/32 ที่บริสุทธิ์; Biolegend, ซานดิเอโก, สหรัฐอเมริกา) เป็นเวลา 30 นาทีและย้อมด้วยแอนติบอดีที่คอนจูเกตด้วยฟลูออเรสเซนต์ที่ต้านแอนติเจนที่ผิวเซลล์เป้าหมาย (ตารางเสริมที่ 1) ขั้นตอนการย้อมสีและการล้างดำเนินการด้วยบัฟเฟอร์คราบ BSA (BD Biosciences, North Ryde, Australia) ตัวอย่างได้มาบนโฟลว์ไซโตมิเตอร์ BD LSR Fortessa X20 ข้อมูลโฟลว์ไซโตเมทรีถูกวิเคราะห์โดยใช้ FlowJo v10.5.3 (ทรีสตาร์, แอชแลนด์, สหรัฐอเมริกา) การฝังตัวเพื่อนบ้านแบบสุ่ม t-distributed (t-SNE) ถูกดำเนินการบน ILC2s (CD45 บวก Lineage [TCR [TCR TCR δ CD8 CD4 ]CD11b GR-1 B220 TER-119 CD3 NK-1 .1] IL7R บวก CD90.2 บวก ST2 บวก FSClowSSC เซลล์เดียวต่ำ) การใช้ปลั๊กอินสุ่มตัวอย่างลดจำนวนเหตุการณ์ในแต่ละตัวอย่างถูกทำให้เป็นมาตรฐานให้เท่ากับค่าต่ำสุด ปัดเศษเป็น 10 เหตุการณ์ที่ใกล้ที่สุด ประชากรทั้งหมดถูกรวมเป็นไฟล์ .fcs ไฟล์เดียวโดยการต่อกลุ่มประชากรที่ลดขนาดตัวอย่าง การวิเคราะห์ t-SNE ดำเนินการกับตัวอย่างที่ต่อกันซึ่งมีประชากรที่มีรั้วรอบขอบชิดจากตัวอย่างไตและปอดทั้งหมดรวมกัน สำหรับสิ่งนี้ ช่องที่ชดเชยซึ่งไม่ได้ใช้สำหรับ gating ได้รับการประเมินภายใต้การตั้งค่า t-SNE ต่อไปนี้: Iteration 1000, Perplexity 20, Eta 224 ฮิสโตแกรมถูกใช้เพื่อแสดงการแสดงออกที่แตกต่างกันของแอนติเจนและไซโตไคน์ที่ผิวเซลล์ในปอดและไต

Immunofluorescence Il5td มะเขือเทศCre; Rosa26-หนูตัวติดตามตัวรายงาน CAG-RFP ถูกทำการุณยฆาตและให้ perfused ในหัวใจด้วยน้ำเกลือที่บัฟเฟอร์ด้วยฟอสเฟต (PBS) และพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์ (PFA) ใน PBS ไตถูกกำจัดออกและเก็บไว้ใน PFA 4 เปอร์เซ็นต์ที่สดใหม่เป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 4◦C แล้วล้างใน PBS สามร้อยไมโครเมตรเตรียมโดยใช้ไวบราโทม ต่อจากนั้น ส่วนของเนื้อเยื่อถูกบ่มในบัฟเฟอร์การซึมผ่าน (PBS/0.2 เปอร์เซ็นต์ Triton X-100/0.3M glycine) จากนั้นถูกบล็อกใน PBS/0.2 เปอร์เซ็นต์ Triton X- 100/5 เปอร์เซ็นต์ Donkey Serum ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสในชั่วข้ามคืน ตัวอย่างถูกล้างใน PBS/0.2 เปอร์เซ็นต์ Tween-20 ครั้ง จากนั้นบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิที่เจือจางใน PBS/0.2 เปอร์เซ็นต์ Tween-20/3 เปอร์เซ็นต์ Donkey Serum ที่อุณหภูมิห้องจนถึงวันถัดไป ต่อไป ตัวอย่างถูกล้างใน PBS/0.2 เปอร์เซ็นต์ Tween-20 เป็นเวลา 30 นาที 3-4 ครั้ง จากนั้นบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่เจือจางใน PBS/0 .2 เปอร์เซ็นต์ Tween-20/3 เปอร์เซ็นต์ donkey serum ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 6-8 ชั่วโมง ตัวอย่างถูกล้างใน PBS/0.2 เปอร์เซ็นต์ Tween-20 เป็นเวลา 1 วัน จากนั้นทำให้แห้งในชุดเอทานอลจากน้อยไปมาก (20, 30, 50, 70, 95, 100 เปอร์เซ็นต์ ), 10 นาทีในแต่ละขั้นตอน . ในที่สุด ส่วนของไตถูกล้างโดยการแช่ในเมทิลซาลิไซเลต (M-2047; Sigma-Aldrich, Castle Hill, Australia) จากนั้นจึงติดตั้งในเมทิลซาลิไซเลตสดบนฝาครอบเว้าหรือห้อง รูปภาพถูกถ่ายด้วยคอนโฟคอลการสแกนด้วยเลเซอร์ Nikon A1R ซึ่งประกอบด้วยเส้นเลเซอร์ 405, 488, 561 และ 650 สำหรับการกระตุ้นและการถ่ายภาพด้วย 16X/0.8 หรือ 25X1.1, NA Plan Apo เพื่อวัตถุประสงค์ในการแช่น้ำในระยะทางการทำงานระยะไกล ขั้นตอน Z ได้มาทุกๆ 6µm รูปภาพได้รับการประมวลผลด้วย ImageJ (NIH, Bethesda, MD, US) และซอฟต์แวร์ Bitplane Imaris v8 (Andor Technology PLC, Belfast, N. Ireland) การสร้างพื้นผิวใหม่ของหลอดเลือดที่ติดฉลากแอคตินของกล้ามเนื้ออัลฟ่านั้นดำเนินการด้วย Imaris และ pseudocolored ตามสถาปัตยกรรมและปริมาตรที่มีลักษณะเฉพาะเพื่อให้เห็นภาพหลอดเลือดแดงและเส้นเลือดขนาดใหญ่ แอนติบอดีและการเจือจางต่อไปนี้ถูกใช้: Living Colours anti-DsRed Rabbit Polyclonal Pan Antibody (1:500; TaKaRa, Mountain View, USA), แอนติบอดีแอคตินของกล้ามเนื้อแอกตินต่อต้านกล้ามเนื้อแอกตินของแพะ (1:200; Abcam, Cambridge, UK ), eFluor 660 LYVE1 โมโนโคลนัลแอนติบอดี (1:300, โคลน ALY7, eBioscience), แอนติบอดีต่อต้านหนูแฮมสเตอร์ CD3 ของหนูแฮมสเตอร์ (1:100, โคลน 145-2C11, Biolegend), Alexa Fluor R 488 ลาต่อต้านแพะ IgG (H บวก L), Alexa Fluor R 555 ลาต่อต้านกระต่าย IgG (H บวก L) Alexa Fluor R 647 แพะต่อต้านหนูแฮมสเตอร์ IgG (H บวก L) แบบดูดซับข้าม (1:400, ThermoFisher Scientific)

การบาดเจ็บจากภาวะขาดเลือดขาดเลือดข้างเดียว - การกำเริบของโรค

การดมยาสลบเกิดจากการสูดดมไอโซฟลูเรน 4 เปอร์เซ็นต์ และรักษาด้วยการสูดดมไอโซฟลูเรนอย่างต่อเนื่อง 1–1.5 เปอร์เซ็นต์ผ่านกรวยจมูก ตลอดขั้นตอนนั้น หนูถูกเก็บไว้บนแท่นผ่าตัดที่รักษาไว้ที่ 37 ± 1◦C โดยใช้แผ่นความร้อนที่ควบคุมด้วยเทอร์โมสตัทแบบดิจิตอล การผ่าตัด Nephrectomy ของไตขวาในสัตว์ทุกชนิด เพื่อกระตุ้นให้เกิดภาวะขาดเลือดข้างเดียว หลอดเลือดของไตด้านซ้ายถูกยึดไว้ใกล้กับปลายของไตเป็นเวลา 29-นาที โดยใช้แคลมป์หลอดเลือดปลอดเชื้อที่ไม่ทำให้เกิดบาดแผล (Coherent Scientific; Hilton, Australia) โดยใช้กำลังที่เพียงพอเพื่อป้องกันไม่ให้เพื่อนเลือดเข้าและออกจากไตโดยไม่ทำให้เรือเสียหายอย่างไม่สามารถกลับคืนสภาพเดิมได้ การกลับมาของ . ที่สม่ำเสมอและรวดเร็วไตสังเกตได้หลังจากถอดแคลมป์หลอดเลือดในหนูทั้งหมด ปิดแผลของกล้ามเนื้อและผิวหนังโดยใช้ไหมเย็บ 5/0 vicryl (Johnson & Johnson Medical, North Ryde, Australia) จากนั้นจึงปิดผิวหนังโดยใช้กาวที่ผิวหนัง (Provet, Charlestown, Australia) เพื่อปกป้องบาดแผลและ ป้องกันการติดเชื้อ สัตว์ควบคุมได้รับการผ่าตัดหลอกโดยใช้เวลาดมยาสลบเท่ากันและได้รับการผ่าตัดไตทางช่องท้องเท่านั้น สำหรับการระงับปวดอย่างมีประสิทธิผล หนูได้รับ 0.1 มก./กก. ของบูพรีนอร์ฟีนใต้ผิวหนัง 30 นาทีก่อนการผ่าตัด และจากนั้น 0.05–0.1 มก./กก. ทุกๆ 8–12 ชั่วโมง ตามความจำเป็น. สัตว์ต่างๆ มักจะหย่านมจากยาแก้ปวดโดย 4 วันหลังการผ่าตัดโดยไม่มีอาการเจ็บปวดหรือความทุกข์ตามที่กำหนดโดยลักษณะใบหน้าโดยใช้มาตราส่วนหน้าตาบูดบึ้งของหนูเมาส์มาตรฐาน ตามที่อธิบายไว้ (26) หนูทุกตัวรอดชีวิตจากจุดสิ้นสุดที่กำหนดไว้ล่วงหน้า

การพร่องของ ILC2s ในร่างกาย

ILC2 หมดลงใน Icosdtr/ บวก Cd4cre/ บวกหนูเมาส์โดยการฉีดเข้าช่องท้องของ DTx (Sigma-Aldrich) 0.025 มก./กก. ตามที่บรรยายไว้ก่อนหน้านี้ (27) DTx ถูกบริหารให้ 30 นาทีก่อนการผ่าตัดและทุกวันหลังจากนั้นจนถึงจุดสิ้นสุด เพื่อยืนยันการหมดของ ILC2- ชุดย่อยของสัตว์ไร้เดียงสาได้รับ DTx เป็นเวลา 3 วัน กลุ่มควบคุม Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus ได้รับการฉีดน้ำเกลือในช่องท้อง

มิญชวิทยา

ตัดตอนไตถูกผ่าผ่าครึ่งตามยาวผ่านฮิลัมทันที ครึ่งหนึ่งได้รับการแก้ไขในฟอร์มาลินบัฟเฟอร์ 10 เปอร์เซ็นต์ ซึ่งประกอบด้วยฟอร์มาลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 24 ชั่วโมงก่อนการจัดเก็บชั่วคราวในเอทานอล 10 เปอร์เซ็นต์ การฝังพาราฟิน และการแบ่งส่วน สี่ไมโครเมตร ส่วนที่ตัดตามยาวถูกย้อมด้วยกรดชิฟฟ์เป็นระยะ (PAS) และไตรโครมของแมสสัน จุลพยาธิวิทยาถูกหาปริมาณโดยการแสดงภาพการขยายของ tubules, apoptosis หรือการหล่อหลอมโดยผู้ตรวจสอบแบบ single-blinded โดยใช้วิธีกึ่งเชิงปริมาณที่เป็นที่ยอมรับ (28) โดยมีการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยตามที่อธิบายไว้ (15) ค่าเฉลี่ยถูกนำมาจากคะแนนจากส่วนที่ย้อมด้วย PAS ที่ซ้ำกันจากสัตว์แต่ละตัว คะแนน 0=0 เปอร์เซ็นต์ของ tubules ได้รับผลกระทบจากลักษณะทางจุลพยาธิวิทยาข้างต้น 1=1–10 เปอร์เซ็นต์ ; 2=11–25 เปอร์เซ็นต์ ; 3=26–50 เปอร์เซ็นต์ ; 4=51–75 เปอร์เซ็นต์ ; 5=76–100 เปอร์เซ็นต์ การประเมินการสะสมของคอลลาเจนโดยใช้ไตรโครมของ Masson และคอลลาเจนถูกระบุว่าเป็นปริมาณเมทิลบลูระหว่างท่อที่อยู่ติดกัน

การแยก RNA การถอดความแบบย้อนกลับ และ qPCR

ครึ่งหนึ่งของไตหนึ่งตัวถูกเก็บไว้สำหรับการวิเคราะห์การแสดงออกของยีน เนื้อเยื่อถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันใน 400 ไมโครลิตรของ PBS โดยใช้ TissueLyser LTTM (Qiagen, Chadstone Centre, ออสเตรเลีย) ผ่านการแกว่ง 50 ครั้งต่อวินาทีเป็นเวลา 2 นาที ตัวอย่างสองร้อยไมโครลิตรถูกลบออกสำหรับการวิเคราะห์อื่น เติม TRI Reagent R (Sigma-Aldrich) หนึ่งมิลลิลิตรลงในตัวอย่างที่เหลือ 200 ไมโครลิตร ซึ่งได้รับการสั่นอีก 50 ครั้งต่อวินาทีเป็นเวลา 1-2 นาที จนกระทั่งเป็นเนื้อเดียวกันโดยสมบูรณ์ หลังจากการบ่ม 5 นาทีที่อุณหภูมิห้องและการหมุนเหวี่ยงที่ 12,000xg เป็นเวลา 10 นาที สารเหนือตะกอนถูกสกัดและปั่นด้วยคลอโรฟอร์ม 250 ไมโครลิตร (Sigma-Aldrich) หลังจากการฟักไข่เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้องและการหมุนเหวี่ยงที่ 12,000xg เป็นเวลา 15 นาที สารเหนือตะกอนถูกสกัดและปั่นด้วยไอโซโพรพานอล 70 เปอร์เซ็นต์ (ซิกมา-อัลดริช) 500 ไมโครลิตร ตัวอย่างถูกบ่มอีกครั้งเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้องจากนั้นถูกหมุนเหวี่ยงที่ 12,000xg เป็นเวลา 10 นาที ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกทิ้งโดยไม่กระทบกับเม็ดที่อุดมด้วยอาร์เอ็นเอ เม็ดถูกล้างสองครั้งด้วย 1 มล. ของเอทานอลเกรดอาร์เอ็นเอ 75 เปอร์เซ็นต์ (ซิกมา-อัลดริช) หมุนเหวี่ยงที่ 10,000xg เป็นเวลา 5 นาที และส่วนลอยเหนือตะกอนถูกทิ้งในแต่ละครั้ง เม็ดถูกทำให้แห้งด้วยอากาศที่อุณหภูมิห้องชั่วครู่ก่อนที่จะระงับอีกครั้งใน 80–100 µl ของน้ำกลั่นสองเท่า UltraPureTM DNase/RNase (ddH2O; Thermo-Fisher Scientific) และเก็บที่อุณหภูมิ 80◦C ก่อนทำการถอดรหัสย้อนกลับ . ทันทีก่อนการถอดรหัสย้อนกลับ ผลผลิตอาร์เอ็นเอถูกกำหนดโดยการประเมินสเปกโตรโฟโตเมตริกโดยใช้ Nanodrop2000TM (Thermo-Fisher Scientific) ห้าไมโครลิตรของแต่ละตัวอย่างถูกเจือจางใน ddH2O ในลักษณะที่ว่า 1,000 ng ของ RNA ถูกโหลดต่อตัวอย่าง หลังจากการบำบัดด้วย DNAse (Sigma-Aldrich) cDNA ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ขั้นตอนการปฏิบัติงานมาตรฐานของเอนไซม์ M-MLV (Thermo-Fisher Scientific, North Ryde, ออสเตรเลีย) โดยใช้วงจรความร้อน T100TM (BioRad Laboratories, Gladesville, Australia) การใช้วิธีการแบบ SYBR นั้น qPCR ถูกดำเนินการโดยใช้ CFX384 TouchTM (BioRad Laboratories) ตามขั้นตอนการปฏิบัติงานมาตรฐาน ชุดไพรเมอร์แต่ละชุดได้รับการทดสอบการไล่ระดับเพื่อกำหนดอุณหภูมิที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการขยายเสียง (ตารางเสริม 2) การหาปริมาณตามวัฏจักรถูกตีความโดยใช้การถดถอยสำหรับแต่ละเป้าหมาย การแสดงออกของยีนถูกทำให้เป็นมาตรฐานที่สัมพันธ์กับไฮโปแซนไทน์-กัวนีน ฟอสโฟไรโบซิลทรานสเฟอเรส (Hprt) กราฟหลอมเหลวถูกประเมินสำหรับสัญญาณของไพรเมอร์ไดเมอไรเซชันและการขยายแบบไม่จำเพาะ ในทุกเพลต จะมีการใช้การควบคุมเชิงลบและการควบคุมแบบไม่มีเทมเพลตอย่างน้อยหนึ่งรายการสำหรับแต่ละเป้าหมายเพื่อให้แน่ใจว่าไม่มีการปนเปื้อนภายในแต่ละส่วนผสมหลักหรือ ddH2O ที่ใช้

RT2 Profiler Array

RT² ProfifilerTM PCR Array Mouse Extracellular Matrix & Adhesion Molecules (Qiagen) ดำเนินการตามคำแนะนำของผู้ผลิต และข้อมูลถูกอัปโหลด จากนั้นจึงวิเคราะห์ด้วยเครื่องมือออนไลน์ ดูได้จาก https://dataanalysis qiagen.com/pcr/arrayanalysis.php. อาร์เรย์นี้อนุญาตให้สร้างโปรไฟล์ของยีน 84 ยีนในตัวอย่างสูงสุด 4 ตัวอย่าง ดังนั้นปริมาณ cDNA ที่เท่ากันสำหรับการทำซ้ำแต่ละครั้งในกลุ่มถูกรวมจากหนูเมาส์ WT ในวันที่ 1, 3 หรือ 7 ตาม IRI และหลอกที่รวบรวมจากการทำซ้ำแต่ละครั้งจากแต่ละตัว ของจุดเวลาเหล่านี้ สำหรับแต่ละเป้าหมาย การเปลี่ยนแปลงพับหลัง IRI ถูกเปรียบเทียบกับนิพจน์หลอกลวง

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลทั้งหมดได้รับการวิเคราะห์ด้วยซอฟต์แวร์ Graphpad Prism v8.02 โดยใช้การทดสอบ t ที่ไม่มีการจับคู่แบบไม่มีพารามิเตอร์ (Mann-Whitney U-test) P < 0.05="" ถูกกำหนดให้เป็นเกณฑ์สำหรับกำหนดความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติ="" ∗p="">< 0.05,="" ns="" ไม่มีนัยสำคัญ="" ข้อมูลทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±="" sem="" ในการวิเคราะห์แต่ละครั้ง="" มีการทำซ้ำ="" n="4–8" ครั้งต่อกลุ่ม="" และผลลัพธ์เป็นตัวแทนของการทดลองอย่างน้อยสองครั้ง="">

ผลลัพธ์

ILC2 ของไตแสดงออกถึง IL-5 และแปลเป็นภาษาท้องถิ่นของหลอดเลือดไตภายใต้สภาวะ Homeostatic

การวิเคราะห์โดยละเอียดของฟีโนไทป์ของ ILC2 ของไตและตำแหน่งภายใต้สภาวะสมดุลย์ถูกดำเนินการ มี ILC2s ที่มากกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (CD45 บวก Lineage IL- 7R บวก CD90.2 บวก ST2 บวก FSClowSSC เซลล์เดี่ยวต่ำ) ในไตเมื่อเปรียบเทียบกับปอดเมื่อแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของ CD45 ทั้งหมดบวกเซลล์เดี่ยว (รูปที่ 1A; รูปประกอบ 1A, B) การวิเคราะห์ t-SNE ของ ILC2 ของไตและปอดแสดงให้เห็นการจัดกลุ่มที่มีลักษณะเฉพาะ แม้ว่ากระจุกเหล่านี้จะไม่แตกต่างจากกันโดยสิ้นเชิง (รูปที่ 1B) อย่างไรก็ตาม ILC2 ของไตมีการแสดงออกที่ต่ำกว่าอย่างเห็นได้ชัดของ CD25, การแสดงออกที่สม่ำเสมอของ ICOS และ KLRG1 แต่การแสดงออกของ IL-5 ที่สูงกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับ ILC2 ของปอด (รูปที่ 1C) ILC2 ของไตมีการแสดงออกของ IL-5 ที่สูงกว่า IL-13 (รูปที่ 1D; รูปที่ 1C, D) ILC2 ถูกกำหนดให้เป็น IL หลัก-5ชนิดเซลล์ที่สร้างในไต โดยมีส่วนสนับสนุนเล็กน้อยจากเซลล์ชนิด T helper-2 (TH2) (รูปที่ 1E, รูปที่ 1E, F) ดังนั้น IL-5 จึงถูกใช้เป็นเครื่องหมายตัวแทนเพื่อระบุตำแหน่งของ ILC2 ภายในไตของหนูเมาส์ ดังที่ได้อธิบายไว้สำหรับอวัยวะส่วนปลายหลายส่วน (29–31) สิ่งนี้ทำได้โดยการใช้หนูเมาส์ที่แสดง Cre-recombinase ที่เชื่อมโยง IL-5 ที่ข้ามไปยังตัวติดตามเชื้อสาย Rosa-tomato (30, 31) IL-5 บวกเซลล์ (ส่วนใหญ่คือ ILC2s) ถูกพบตลอดไตแต่ถูกแปลเป็นภาษาท้องถิ่นเป็นหลักไปยังหลอดเลือดหลัก ตามที่มองเห็นด้วยการย้อมสีที่เป็นบวกของกล้ามเนื้ออัลฟาเรียบ ( -SMA) (รูปที่ 2A; รูปที่ 2A, B) ที่สอดคล้องกับรายงานล่าสุดของเรา (29) พบว่า ILC2 สัมพันธ์กับทั้งหลอดเลือดที่เกี่ยวเนื่องกับหลอดเลือดในไตและส่วนโค้งในเยื่อหุ้มสมองและบริเวณไขกระดูก ตามที่แสดงโดยการแสดงออกของ Lyaluronan receptor-1 (LYVE1) ของต่อมน้ำเหลือง (รูปที่ 2B) ภาพเพิ่มเติมแสดงให้เห็นว่ามีเซลล์ CD3 บวกน้อยมาก (เซลล์ TH2 ที่โดดเด่น) มีส่วนทำให้เกิดสัญญาณบวก IL-5 บวก (รูปที่ 2C) ILC2 ถูกระบุในการถือกำเนิดของหลอดเลือดโดยใช้การสร้างพื้นผิวสีเทียมของหลอดเลือดแดง -SMA

การลด ความบกพร่อง หรือการสูญเสียของ ILC2 ไม่ได้เปลี่ยนความรุนแรงของการบาดเจ็บจากภาวะไตขาดเลือด-การสะท้อนกลับในการทดลองในหนูทดลอง

Given ILC2s were present in the kidney and localized to the renal vasculature, the impact of ILC2 reduction, deficiency, or depletion on the severity of experimental renal IRI was assessed. This was achieved by using ILC2-reduced (Roraflfl/+Il7rcre/+)-deficient (Roraflfl/flfl Il7rcre/+), and -depleted (DTx-treated Icosdtr/+Cd4cre/+) mice compared to WT and vehicle (saline-treated Icosdtr/+Cd4cre/+) controls. These mice have been previously described as appropriate tools for assessing ILC2 function in vivo in other organs such as the lung (27, 32). Here we show that these tools are also appropriate for assessing ILC2 function in the kidney. Indeed, kidney ILC2s were significantly lower in the ILC2-reduced, -defificient, and -depleted groups compared to WT or saline-treated controls (Figure 3A). Time-course analysis of IRI in wild-type mice identified day 7 as the most appropriate time point for the assessment of injury severity due to the presence of histopathological features of acute tubular necrosis, collagen deposition and increased mRNA expression of extracellular matrix, injury-associated, and inflflammatory factors (Supplementary Figures 3, 4). At day 7, 25/84 extracellular matrix factors were increased >2-เท่าเมื่อเทียบกับการควบคุมหลอก ขณะที่ 1/84 และ 6/84 เพิ่มขึ้นในวันที่ 1 และ 3 ตามลำดับ (รูปที่ 4A เพิ่มเติม) IRI เหนี่ยวนำให้เกิดเนื้อร้ายแบบเฉียบพลันของท่อซึ่งแสดงคุณลักษณะโดยท่อขยายและการก่อตัวหล่อ เปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมหลอก (รูปที่ 3B, รูปที่ 3A, 4B) สิ่งนี้ถูกหาปริมาณเป็นคะแนนการบาดเจ็บของท่อและความรุนแรงของการบาดเจ็บมีความคล้ายคลึงกันในจีโนไทป์ทั้งหมด (รูปที่ 3C) IRI ยังเหนี่ยวนำให้เกิดการสะสมของคอลลาเจน ซึ่งทำเครื่องหมายด้วยปริมาณเมทิลบลูระหว่างทูบูลในไขกระดูกและเยื่อหุ้มสมอง เมื่อเปรียบเทียบกับส่วนควบคุมหลอก (ภาพที่ 3D; รูปที่ 3B เพิ่มเติม) การสะสมของคอลลาเจนไม่ได้รับผลกระทบจากการไม่มี ILC2 IRI ยังเพิ่มการแสดงออกของ mRNA ของปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับการบาดเจ็บ คีโมไคน์ และไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบ (รูปที่ 3E–J, รูปที่ 4C–K เพิ่มเติม) ไลโปคาลินที่เกี่ยวข้องกับนิวโทรฟิลเจลาติเนส (Lcn2; NGAL) ซึ่งเป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของการบาดเจ็บที่ไต (33, 34) เพิ่มขึ้นโดย IRI และไม่ได้รับผลกระทบจากการลด การขาด หรือการสูญเสียของ ILC2 (รูปที่ 3E) CXC motif คีโมไคน์ลิแกนด์ 1 (Cxcl1) และ Cxcl2 ยังเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญโดย IRI ในจีโนไทป์ทั้งหมด (รูปที่ 3F, G) ในทำนองเดียวกัน ปัจจัยเนื้อร้ายของเนื้องอกไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบ (Tnf) เพิ่มขึ้นโดย IRI เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมหลอก (รูปที่ 3H) สอดคล้องกับการสะสมคอลลาเจนที่มองเห็นได้ การแสดงออกของ mRNA ของปัจจัยภายนอกเซลล์ของคอลลาเจนชนิดที่ 1 สายอัลฟา 1 (Col1a1) และไฟโบรเนกติน 1 (Fn1) เพิ่มขึ้นโดย IRI ในจีโนไทป์ทั้งหมด (รูปที่ 3I, J)

อภิปรายผล

ILC2s เป็นตัวควบคุมที่สำคัญของสภาวะสมดุลของเนื้อเยื่อ แต่บทบาทของพวกมันในไตยังคงต้องได้รับการอธิบายอย่างเต็มที่ แม้ว่า ILC2s สามารถเหนี่ยวนำให้เกิดการเพิ่มจำนวนและป้องกันผลร้ายของการบาดเจ็บที่ไตจากการทดลอง แต่ก็ยังไม่ทราบว่าเกิดอะไรขึ้นหากไม่มีเซลล์เหล่านี้ ก่อนอื่นเราตรวจสอบว่าตัวเลข ILC2 ตามสัดส่วนของ CD45 บวกเซลล์เม็ดเลือด มีความแตกต่างกันในปอดและไตหรือไม่ ILC2s คิดเป็นสัดส่วนของ CD45 บวกเซลล์ในไตมากกว่าในปอด การวิเคราะห์ t-SNE จัดกลุ่ม ILC2 จากทั้งสองตำแหน่งต่างกัน อย่างไรก็ตาม คลัสเตอร์ไม่แตกต่างกันอย่างสิ้นเชิงระหว่างเนื้อเยื่อเหล่านี้ มีความแตกต่างในแอนติเจนที่ผิวเซลล์ของพวกมันและการแสดงออกของไซโตไคน์ชนิดที่ 2 โดยที่ ILC2 ของไตแสดงปริมาณ IL-5 ที่มากกว่า อันที่จริง ILC2s ของไตแสดงระดับ IL-5 สูงภายใต้สภาวะสภาวะสมดุล นอกจากนี้ ILC2 ยังเป็นแหล่งสำคัญของ IL-5 ในไต โดยมีส่วนสนับสนุนเล็กน้อยจากเซลล์ TH2 ดังนั้น IL-5 จึงถูกใช้เป็นเครื่องหมายตัวแทนเพื่อกำหนดตำแหน่งของเซลล์เหล่านี้ในไต ILC2s ถูกระบุภายในไตและถูกจำกัดตำแหน่งเกือบทั้งหมดตามเส้นเลือดในไต ในการศึกษาเหล่านี้ Cre-recombinase ที่เชื่อมโยงกับ IL-5 ถูกใช้ร่วมกับลำดับฟล็อกซ์-สต็อป-ฟล็อกซ์ที่อัพสตรีมของตลับเทป CAG-RFP-WPRE ในโลคัส ROSA26 ที่แสดงออกเป็นส่วนประกอบเพื่อระบุตำแหน่ง ILC2 LYVE1 ซึ่งแสดงออกโดยเซลล์บุผนังหลอดเลือดน้ำเหลืองในไต ถูกใช้เพื่อกำหนดตำแหน่งของเซลล์เหล่านี้เพิ่มเติมภายในไตของหนูเมาส์ (35) ตามที่คาดไว้ การย้อมสี LYVE1 ถูกฝังอยู่ภายในเนื้อเยื่อเกี่ยวพันของหลอดเลือดแดงไตของคอร์เทกซ์ แต่ไม่ใช่ภายในไขกระดูกเนื่องจากไม่มีเครือข่ายน้ำเหลืองที่มองเห็นได้ในบริเวณนี้ของไต (35–37) สันนิษฐานได้ว่า ILC2 ตั้งอยู่ใกล้กับหลอดเลือดเนื่องจากเซลล์บุผนังหลอดเลือดในไตเป็นแหล่งสำคัญของ IL-33 ในไต (38, 39) เพื่อยืนยันการสังเกตของเราโดย FACS ของสารแขวนลอยไตเซลล์เดียวพบว่า ILC2 เป็นผู้ผลิตรายใหญ่ของ IL-5 ในส่วนเนื้อเยื่อไต โดยมีส่วนร่วมน้อยที่สุดจาก CD3 บวกทีเซลล์ แม้ว่าการศึกษาเหล่านี้จะแสดงตำแหน่งของ ILC2 ในไตโดยใช้หนูที่ใช้รายงาน แต่ก็ยังคงต้องพิจารณาว่า ILC2 นั้นตั้งอยู่ติดกับหลอดเลือดในไตของมนุษย์ด้วยหรือไม่ และตำแหน่งของ ILC2 จะเปลี่ยนไปตามอาการบาดเจ็บของไตหรือไม่ แม้ว่ารายงานหลายฉบับจะพบว่าตัวเลข ILC2 นั้นไม่เปลี่ยนแปลงจากอาการบาดเจ็บที่ไต แต่ฟีโนไทป์และสถานะการกระตุ้นหลังจากได้รับบาดเจ็บนั้นจำเป็นต้องมีการอธิบายเพิ่มเติม (12–16) ต่อไป เราระบุบทบาทหน้าที่ของ ILC2 ในไตโดยใช้วิธีการสูญเสียการทำงาน เพื่อให้บรรลุสิ่งนี้ เราใช้ประโยชน์จาก ILC2-หนูที่ลดลงและบกพร่อง และหนูเมาส์ที่สามารถทำให้ ILC2 หมดตามเงื่อนไขหลังจากการบริหารให้ของ DTx (27) เราตรวจสอบการใช้เครื่องมือเหล่านี้เพื่อทำให้ ILC2s ล้มลงหรือระเหยในไต เลือกแบบจำลองการทดลองของ IRI โดยให้ความใกล้ชิดของ ILC2 กับหลอดเลือดในไต แม้ว่าลักษณะของการบาดเจ็บจะเห็นได้ชัดหลังจาก IRI แต่การลดลง ความบกพร่อง หรือการพร่องของ ILC2 ไม่ได้เปลี่ยนแปลงทางจุลพยาธิวิทยาในไต และไม่ก่อให้เกิดการตาย โดยแท้จริงแล้ว การเปลี่ยนแปลงรูปแบบที่เหนี่ยวนำโดย IRI และการสะสมคอลลาเจนเกิดขึ้นอย่างอิสระจาก ILC2 แม้ว่าจะเป็นไปได้ที่จุดเวลาก่อนหน้าหลังการบาดเจ็บอาจระบุความแตกต่างในจุลพยาธิวิทยาและการแสดงออกของยีน จุดเวลาในการศึกษาของเรายังอนุญาตให้ประเมินการสะสมของคอลลาเจน ซึ่งเป็นคุณลักษณะสำคัญของการเปลี่ยนแปลงรูปแบบที่ควบคุมโดย ILC2s (16, 32, 40) –44) เป็นไปได้เช่นกันที่การลดลงของ ILC2 ในช่วง

AKI อาจเป็นอันตรายต่อโครงสร้างและการทำงานของไตเมื่อประเมินในเวลาต่อมา เนื่องจากอาจมีการตอบสนองการซ่อมแซมที่ไม่เหมาะสมในกรณีที่ไม่มี ILC2 เพื่อแก้ไขปัญหานี้ การศึกษาในอนาคตจะต้องตรวจสอบบทบาทของ ILC2 ในการลุกลามของ AKI ไปสู่โรคไตเรื้อรัง (45, 46)

โดยรวมแล้ว การศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าการลดลง ความบกพร่อง หรือการสูญเสียใน ILC2 ไม่ได้เปลี่ยนแปลงความรุนแรงของ AKI ในการทดลองในหนูทดลอง ในขณะที่การกระตุ้น ILC2 และการขยายที่เกี่ยวข้องของภูมิคุ้มกันชนิดที่ 2 ในพื้นที่ได้รับการแสดงให้เห็นก่อนหน้านี้เพื่อลดผลกระทบที่เป็นอันตรายของ AKI การบาดเจ็บที่เปรียบเทียบกันได้เกิดขึ้นเมื่อ ILC2 ลดลง ไม่มีอยู่ หรือหมดลง ซึ่งบ่งชี้ถึงความซ้ำซ้อนที่เป็นไปได้และการชดเชยโดยเซลล์ภูมิคุ้มกันอื่นๆ เช่น Treg , AAM และเซลล์ TH2 แนวคิดนี้ได้รับการสนับสนุนโดยการศึกษาโดยใช้ Rag1 / หรือ Rag2 / หนูที่ไม่มีเซลล์ T และ B ที่โตเต็มที่ในแบบจำลองของอาการบาดเจ็บที่ไต(13, 15, 47, 48) ในการศึกษาหนึ่ง การบริหารให้แอนติ-CD90.2 ถูกใช้เพื่อทำให้ ILC2 หมดสิ้นลง อย่างไรก็ตาม สัตว์เหล่านี้ยังขาดในเซลล์ Treg และ TH2 (15) ในระบบโมเดลนี้ แม้ว่า ILC2s ที่มีแอนติ-CD90.2 จะหมดลง แต่ก็ไม่สามารถชดเชยจากช่องทีเซลล์ได้ ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นว่าการสูญเสีย ILC2 เมื่อส่วนทีเซลล์ยังคงไม่บุบสลาย มีผลกระทบน้อยที่สุดต่อความรุนแรงของ IRI ข้อมูลของเราสนับสนุนแนวคิดที่ว่า ILC2s นอกเหนือจากเซลล์ภูมิคุ้มกันอื่นๆ เช่น Treg และ AAM มีส่วนทำให้เกิด AKI อันที่จริงการพร่อง Treg ทำให้จุลพยาธิวิทยาแย่ลงหลังจาก IRI (15) ในทำนองเดียวกัน โพลาไรซ์ของมาโครฟาจไปยัง AAM ส่งเสริมความละเอียดของการบาดเจ็บ (5, 12, 46, 49, 50) จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อชี้แจงสาเหตุของการมี ILC2 ในไต รวมถึงการติดเชื้อทางเดินปัสสาวะที่เพิ่มขึ้นและการดูถูกไตอื่นๆโรคเรื้อรัง.

คำชี้แจงจริยธรรม

ขั้นตอนการผ่าตัดทั้งหมดได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการการดูแลสัตว์และจริยธรรมของมหาวิทยาลัยนิวคาสเซิลตามประมวลกฎหมายออสเตรเลียสำหรับการดูแลและการใช้สัตว์เพื่อวัตถุประสงค์ทางวิทยาศาสตร์ ขั้นตอนสำหรับการถ่ายภาพด้วยอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ได้รับการอนุมัติและดำเนินการตามแนวทางที่กำหนดโดยคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ของ UCSF และศูนย์ทรัพยากรสัตว์ในห้องปฏิบัติการ

ผลงานของผู้เขียน

ผลงานที่นำเสนอได้ดำเนินการร่วมกับผู้เขียนทุกคน GC ดำเนินการแบบจำลองการผ่าตัด โฟลว์ไซโตเมทรี การประเมินทางเนื้อเยื่อ การวิเคราะห์การแสดงออกของยีน และวิเคราะห์ข้อมูล KC และ ABM ทำการทดลอง immunofluorescence SL ช่วยในการเฝ้าติดตามสัตว์และโฟลว์ไซโตเมตรี SJ และ AD ให้ข้อมูลเชิงลึกทางคลินิกสำหรับการออกแบบการศึกษาและเทคนิคการผ่าตัด ANM สร้าง จัดหา และให้คำแนะนำเกี่ยวกับการใช้ ILC2-หนูมะเขือเทศที่ขาด & -หมด และ Il13td PF จัดหาและให้คำแนะนำเกี่ยวกับการใช้สายรายงาน Il5venus PF และ PH แนะนำเกี่ยวกับการออกแบบการทดลอง MS ออกแบบ ดูแล และอำนวยความสะดวกในทุกด้านของการศึกษา ผู้เขียนทุกคนมีส่วนร่วมในการตีความข้อมูล การเตรียมการ และการแก้ไขต้นฉบับสำหรับเนื้อหาทางปัญญา

เงินทุน

MS ได้รับการสนับสนุนจาก Australian Research Council (ARC) Discovery Early Career Researcher Award (DECRA) และทุนสนับสนุนจาก National Health and Medical Research Council (NHMRC), Hunter Medical Research Institute และ Hunter Children's Research Foundation

ข้อมูลอ้างอิง

1. Susantitaphong P, Cruz DN, Cerda J, Abulfaraj M, Alqahtani F, Koulouridis I, et al. อุบัติการณ์โลกของ AKI: การวิเคราะห์เมตาคลินิก J เป็น ซอค เนฟรอล (2013) 8:1482–93.

2. Hall AM, Unwin RJ, Parker N, Duchen MR. การถ่ายภาพด้วยมัลติโฟตอนเผยให้เห็นความแตกต่างในการทำงานของไมโตคอนเดรียระหว่างกลุ่มของเนฟรอนเจ แอม ซ็อก เนโฟรล (2009) 20:1293–302.

3. Devarajan P. อัพเดทกลไกการบาดเจ็บของไตเฉียบพลันที่ขาดเลือดเจ แอม ซอค เนฟรอล (2006) 17:1503–20. 

4. Bonventre JV, Yang L. พยาธิสรีรวิทยาของเซลล์ของการบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลันขาดเลือดเจ คลิน อินเวสท์(2011) 121:4210–21. ดอย: 10.1172/JCI 45161

5. Lee S, Huen S, Nishio H, Nishio S, Lee HK, Choi BS และอื่น ๆ ฟีโนไทป์ของมาโครฟาจที่แตกต่างกันมีส่วนทำให้เกิดอาการบาดเจ็บที่ไตและการซ่อมแซมเจ แอม ซ็อก เนโฟรล (2011) 22:317–26. 

6. Friedewald JJ, Rabb H. เซลล์อักเสบในภาวะไตวายเฉียบพลันขาดเลือดเฉียบพลันไตอินเตอร์(2004) 66:486–91. 

7. Spits H, Artis D, Colonna M, Diefenbach A, Di Santo JP, Eberl G และอื่น ๆ เซลล์น้ำเหลืองโดยกำเนิด - ข้อเสนอสำหรับการตั้งชื่อแบบสม่ำเสมอแนทรายได้อิมมูนอล(2013) 13:145–9. 

8. Moro K, Yamada T, Tanabe M, Takeuchi T, Ikawa T, Kawamoto H และอื่น ๆ การผลิตโดยธรรมชาติของ T(H)2 cytokines โดย c- Kit( plus )Sca-1( plus ) ที่เกี่ยวข้องกับเนื้อเยื่อไขมันธรรมชาติ. (2010) 463:540–4. 

9. Neill DR, Wong SH, Bellosi A, Flynn RJ, Daly M, Langford TKA และอื่น ๆ นิวโอไซต์เป็นตัวแทนของเม็ดเลือดขาวเอฟเฟกเตอร์ที่มีมาแต่กำเนิดซึ่งทำหน้าที่ไกล่เกลี่ยภูมิคุ้มกันของชนิด-2ธรรมชาติ. (2010) 464:1367–70. 

10. Loering S, คาเมรอน GJM, Starkey MR, Hansbro PM การพัฒนาปอดและบทบาทใหม่ของภูมิคุ้มกันชนิดที่ 2เจ ปทุม.(2018) 247:686–96. 

11. Monticelli LA, Sonnenberg GF, Abt MC, Alenghat T, Ziegler CG, Doering TA และอื่น ๆ เซลล์น้ำเหลืองโดยธรรมชาติส่งเสริมสภาวะสมดุลของเนื้อเยื่อปอดหลังจากติดเชื้อไวรัสไข้หวัดใหญ่แนท อิมมูนอล (2011) 12:1045–54. 

12. Huang Q, Niu Z, Tan J, Yang J, Liu Y, Ma H, et al. IL-25 กระตุ้นเซลล์ลิมฟอยด์โดยกำเนิดและเซลล์ต้นกำเนิดหลายชนิดที่มีหลายศักยภาพซึ่งลดอาการบาดเจ็บที่ไต/การขาดเลือดของไตเจ แอม ซ็อก เนโฟรล(2015) 26:2199–211. 

13. Riedel JH, Becker M, Kopp K, Duster M, Brix SR, Meyer-Schwesinger C, et al. IL-33-การขยายตัวของเซลล์น้ำเหลืองโดยธรรมชาติชนิดที่ 2 เป็นสื่อกลางปกป้องจากโรคหลอดเลือดตีบแบบก้าวหน้าเจ แอม ซ็อก เนโฟรล(2017) 28:2068–80. 

14. Stremska ME, Jose S, Sabapathy V, Huang L, Bajwa A, Kinsey GR, และคณะ IL233 ไซโตไคน์ลูกผสมของ IL-2 และ IL-33 ใหม่ ปรับปรุงอาการบาดเจ็บที่ไตเจ แอม ซ็อก เนโฟรล (2017) 28:2681–93. 

15. Cao Q, Wang Y, Niu Z, Wang C, Wang R, Zhang Z, และคณะ กระตุ้นเซลล์น้ำเหลืองโดยกำเนิดชนิดที่ 2 ในเนื้อเยื่อโดย IL-33 เพื่อป้องกันการบาดเจ็บที่ไตขาดเลือด-การกลับเป็นซ้ำเจ แอม ซ็อก เนโฟรล(2018) 29:961–76. 

16. Sabapathy V, Cheru NT, Corey R, Mohammad S, Sharma R. ไซโตไคน์ลูกผสม IL233 ใหม่เป็นสื่อกลางในการงอกใหม่หลังจากได้รับบาดเจ็บจากพิษต่อไตที่เกิดจาก doxorubicinวิทยาศาสตร์ ตัวแทน (2019) 9:3215. 

17. คาเมรอน GJM, Jiang SH, Loering S, Deshpande AV, Hansbro PM, Starkey MR. ศักยภาพในการรักษาที่เกิดขึ้นใหม่ของเซลล์น้ำเหลืองโดยกำเนิดกลุ่มที่ 2 ในการบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลันJ ปทุม. (2019) 2019:5242. 

18. Singh AP, Junemann A, Muthuraman A, Jaggi AS, Singh N, Grover K, และคณะ แบบจำลองสัตว์ของภาวะไตวายเฉียบพลันPharmacol ตัวแทน (2012) 64:31–44. 

19. Ramesh G, Ranganathan P. Mouse model และวิธีการศึกษาโรคในมนุษย์ การบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลัน (AKI)วิธีการ โมลไบโอล.(2014) 1194:421–36. 

20. Skrypnyk NI, Harris RC, ส.ส. Caestecker แบบจำลองการขาดเลือดกลับของภาวะไตวายเฉียบพลันและการเกิดพังผืดหลังการบาดเจ็บในหนูทดลองJ วีซ่าประสบการณ์(2013) 9:78. 

21. Wei Q, Dong Z. แบบจำลองหนูเมาส์ของการบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลันขาดเลือด: บันทึกทางเทคนิคและลูกเล่นแอม เจ ฟิสิออล รีนัล ฟิสิออล(2012) 303:F1487–94? 

22. Starkey MR, McKenzie ANJ, Belz GT, Hansbro PM เซลล์น้ำเหลืองโดยกำเนิดในปอดกลุ่มที่ 2: ความประหลาดใจและความท้าทายอิมมูนอลของเยื่อเมือก(2019) 12:299–311. 

23. Jang HR, Rabb H. เซลล์ภูมิคุ้มกันในการทดลองอาการบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลันแนท อาจารย์เนโฟรล.(2015) 11:88–101. ดอย: 10.1038/nrneph.2014.180

24. Turner JE, Becker M, Mittrucker HW, Panzer U. เซลล์เม็ดเลือดขาวที่มีเนื้อเยื่อในไตเจ แอม ซ็อก เนโฟรล(2018) 29:389–99. 

25. Jang HR, Rabb H. การตอบสนองของภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติในภาวะไตวายเฉียบพลันที่ขาดเลือดคลินิก อิมมูนอล (2009) 130:41–50. 

26. Langford DJ, Bailey AL, Chanda ML, Clarke SE, Drummond TE, Echols S, และคณะ การเข้ารหัสการแสดงออกทางสีหน้าของความเจ็บปวดในหนูทดลองแนทวิธีการ(2010) 7:447–9.

27. Oliphant CJ, Hwang YY, Walker JA, Salimi M, Wong SH, Brewer JM และอื่น ๆ บทสนทนาที่อาศัย MHCII ระหว่างเซลล์ต่อมน้ำเหลืองโดยกำเนิดกลุ่ม 2 และเซลล์ CD4 บวก T กระตุ้นภูมิคุ้มกันประเภทที่ 2 และส่งเสริมการขับพยาธิหนอนพยาธิภูมิคุ้มกัน (2014) 41:283–95. 

28. Shih W, Hines WH, Neilson EG. ผลของ cyclosporin A ต่อการพัฒนาโรคไตอักเสบคั่นระหว่างหน้าที่มีภูมิคุ้มกันไต อินเตอร์ (1988) 33:1113–8.

29. Dahlgren MW, Jones SW, Cautivo KM, Dubinin A, Ortiz-Carpena JF, Farhat S, และคณะ เซลล์สโตรมอล Adventitial กำหนดช่องเนื้อเยื่อเซลล์ลิมฟอยด์โดยกำเนิดกลุ่มที่ 2ภูมิคุ้มกัน (2019) 50:707–22. 

30. Molofsky AB, Nussbaum JC, Liang HE, Van Dyken SJ, Cheng LE, Mohapatra A และอื่น ๆ เซลล์น้ำเหลืองชนิดที่ 2 โดยธรรมชาติจะคงรักษา eosinophils ของเนื้อเยื่อไขมันในอวัยวะภายในและมาโครฟาจที่กระตุ้นอีกทางหนึ่งเจ เอ็กซ์พี เมด(2013) 210:535–49. 

31. Nussbaum JC, Van Dyken SJ, von Moltke J, Cheng LE, Mohapatra A, Molofsky AB, et al. เซลล์น้ำเหลืองโดยธรรมชาติชนิดที่ 2 ควบคุมสภาวะสมดุลของอีโอซิโนฟิลธรรมชาติ.(2013) 502:245–8. 

32. Donovan C, Starkey MR, Kim RY, Rana BMJ, Barlow JL, Jones B, และคณะ บทบาทของ T/B lymphocytes และ ILC2s ในการทดลองโรคปอดอุดกั้นเรื้อรังเจ เหลืองอค ไบโอล.(2019) 105:143–50. 

33. Mishra J, Ma Q, Prada A, Mitsnefes M, Zahedi K, Yang J และอื่น ๆ การระบุไลโปคาลินที่เกี่ยวข้องกับนิวโทรฟิลเจลาติเนสว่าเป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพทางปัสสาวะในระยะเริ่มแรกสำหรับการบาดเจ็บของไตขาดเลือดเจ แอม ซ็อก เนโฟรล(2003) 14:2534–43. 

34. Supavekin S, Zhang W, Kucherlapati R, Kaskel FJ, Moore LC, Devarajan P. การแสดงออกของยีน Differential หลังการขาดเลือด / การกลับของไตในช่วงต้นไตอินเตอร์(2003) 63:1714–24. 

35. Skorecki K, Chertow GM, Marsden PA, Taal MW, Alan SL, Luyckx V. กายวิภาคของไต: น้ำเหลือง ใน:เบรนเนอร์และอธิการบดีไต E-Book. ฉบับที่ 10 อัมสเตอร์ดัม: เอลส์เวียร์ (2015). หน้า 80-1.

36. Banerji S, Ni J, Wang SX, Clasper S, Su J, Tammi R, et al. LYVE-1 ซึ่งเป็น homologue ใหม่ของ CD44 glycoprotein เป็นตัวรับที่จำเพาะต่อน้ำเหลืองสำหรับ hyaluronanJ เซลล์ ไบโอล. (1999) 144:789–801. 

37. Lee HW, Qin YX, Kim YM, Park EY, Hwang JS, Huo GH และอื่น ๆ การแสดงออกของ LYVE-1 รีเซพเตอร์ hyaluronan ที่จำเพาะต่อต่อมน้ำเหลืองในไตของหนูเมาส์ที่กำลังพัฒนาเซลล์เนื้อเยื่อความละเอียด(2011) 343:429–44.

38. Shelite TR, Liang Y, Wang H, Mendell NL, Trent BJ, Sun J, และคณะ IL- 33-การกระตุ้นที่บุผนังหลอดเลือดที่ขึ้นกับ IL มีส่วนทำให้เกิดการตายของเซลล์และการบาดเจ็บของไตในหนูที่ติดเชื้อ tsutsugamushiPLoS Negl Trop Dis.(2016) 10:e0004467.

39. Ferhat M, Robin A, Giraud S, Sena S, Goujon JM, Touchard G, et al. IL ภายนอก-33มีส่วนทำให้เกิดอาการบาดเจ็บที่ไต-ขาดเลือดกลับเป็นสัญญาณเตือนJ เป็น ซอค เนฟรอล (2018) 29:1272–88. 

40. Mchedlidze T, Waldner M, Zopf S, Walker J, Rankin A, Schuchmann M, และคณะ อินเตอร์ลิวคิน-33-เซลล์ลิมฟอยด์โดยกำเนิดที่ขึ้นต่อกันเป็นสื่อกลางในการเกิดพังผืดในตับภูมิคุ้มกัน (2013) 39:357–71. 

41. Moretti S, Renga G, Oikonomou V, Galois C, Pariano M, Iannitti RG, และคณะ แมสต์เซลล์-ILC2-วิถีทาง Th9 ส่งเสริมการอักเสบของปอดในซิสติกไฟโบรซิสแนท คอมมูนิตี้ (2017) 8:14017. 

42. Hams E, Armstrong ME, Barlow JL, Saunders SP, Schwartz C, Cooke G และอื่น ๆ IL-25 และเซลล์น้ำเหลืองโดยกำเนิดชนิดที่ 2 ทำให้เกิดพังผืดในปอดProcNatlAcad วิทยาศาสตร์ สหรัฐอเมริกา. (2014) 111:367–72.

43. Wohlfahrt T, Usherenko S, Englbrecht M, Dees C, Weber S, Beyer C และอื่น ๆ จำนวนเซลล์ต่อมน้ำเหลืองโดยกำเนิดชนิดที่ 2 จะเพิ่มขึ้นในผู้ป่วยที่มีระบบเส้นโลหิตตีบและมีความสัมพันธ์กับขอบเขตของการเกิดพังผืดแอน รึม ดิส(2016) 75:623–6. 

44. Li D, Guabiraba R, Besnard AG, Komai-Koma M, Jabir MS, Zhang L, et al. IL-33 ส่งเสริมการเกิดพังผืดของปอดที่ขึ้นกับ ST2- โดยการเหนี่ยวนำของมาโครฟาจที่ถูกกระตุ้นอย่างเป็นทางเลือกและเซลล์ลิมฟอยด์โดยกำเนิดในหนูเมาส์เจ ภูมิแพ้ คลินิก อิมมูนอล (2014) 134:1422–32. 

45. Sharp CN, Doll MA, Megyesi J, Oropilla GB, Beverly LJ, Siskind LJ. การบาดเจ็บที่ไตแบบไม่แสดงอาการที่เกิดจากการให้ยาซิสพลาตินซ้ำๆ ส่งผลให้เกิดโรคไตเรื้อรังที่ลุกลามแอม เจ ฟิสิออล รีนัล ฟิสิออล(2018) 315:F161–72? 

46. ​​Liu J, Kumar S, Dolzhenko E, Alvarado GF, Guo J, Lu C และอื่น ๆ ลักษณะทางโมเลกุลของการเปลี่ยนแปลงจากการบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลันเป็นเรื้อรังหลังการขาดเลือดขาดเลือด/การเกิดซ้ำเจซีไอ อินไซต์(2017) 2:94716. 

47. Li L, Huang L, Sung SJ, Lobo PI, Brown MG, Gregg RK, et al. การกระตุ้นเซลล์ NKT ไกล่เกลี่ยการผลิตนิวโทรฟิล IFN-แกมมาและการบาดเจ็บที่ไตขาดเลือด-การกลับเป็นซ้ำเจ อิมมูนอล(2007) 178:5899–911.

48. Chan AJ, Alikhan MA, Odobasic D, Gan PY, Khouri MB, Steinmetz OM, และคณะ IL โดยกำเนิด-17เซลล์เม็ดเลือดขาวที่ผลิต A ส่งเสริมการบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลันผ่านการกระตุ้นตัวรับการอักเสบและคล้ายคลึงกันแอม เจ ปทุม.(2014) 184:1411–8? 

49. Cao Q, Wang C, Zheng D, Wang Y, Lee VWS, Wang YM และอื่น ๆ IL-25 กระตุ้นมาโครฟาจ M2 และลดการบาดเจ็บที่ไตในโรคไตที่มีโปรตีนยูริกJ Am Soc เนฟรอล (2011) 22:1229–39.

50. Chung S, Overstreet JM, Li Y, Wang Y, Niu A, Wang S และอื่น ๆ TGF-beta ส่งเสริมการเกิดพังผืดหลังจากได้รับบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลันรุนแรงโดยการเพิ่มการแทรกซึมของมาโครฟาจในไตเจซีไอ อินไซต์(2018) 3:123563.