การสะสมของ Amyloid P ในซีรัมเป็นคุณสมบัติที่ละเอียดอ่อนและเฉพาะของ Glomerulopathy คล้ายเมมเบรนด้วยการสะสม IgG Kappa ที่สวมหน้ากาก
Mar 04, 2022
ติดต่อ: emily.li@wecistanche.com
Christopher P. Larsen1, Shree G. Sharma1, Tiffany N. Caza1, Daniel J. Kenan1, Aaron J. Storey2, Ricky D. Edmondson2, Christian Herzog2 และ John M. Arthur2
คีย์เวิร์ด:glomerulonephritis; เงินฝากที่สวมหน้ากาก; แมสสเปกโตรเมตรี glomerulopathy เหมือนเยื่อหุ้ม; การสะสมของเยื่อบุผิว
Cistanche สามารถปรับปรุงการทำงานของไต
glomerulopathy คล้ายเยื่อหุ้มที่มีการสะสมของ IgG kappa แบบสวมหน้ากาก (MGMID) เป็นรูปแบบที่อธิบายเมื่อเร็ว ๆ นี้ของ glomerulonephritis ที่มีจุลพยาธิวิทยาเฉพาะ รูปแบบนี้มีลักษณะเฉพาะคือ subepithelial และ/หรือ mesangialมีภูมิคุ้มกันสารสะสมที่ "ปิดบัง" เพื่อย้อมอิมมูโนโกลบูลินโดยอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ตามปกติ แต่จะเปื้อนอย่างแรงสำหรับสายเบาของ IgG และแคปปาหลังจากการย่อยโปรตีเอส ผู้ป่วยที่มีรูปแบบของไตอักเสบจากไตวายนี้มักเป็นหญิงสาวที่มีโปรตีนในปัสสาวะและมีประวัติโรคภูมิต้านตนเองที่คลุมเครือ เช่น แอนติบอดีต้านนิวเคลียร์ที่มีระดับไตต่ำ ในที่นี้ เราเปรียบเทียบโปรไฟล์แมสสเปกโตรเมตรีของเลเซอร์ดักจับ microdissected glomeruli จากการตรวจชิ้นเนื้อไต MGMID เก้าชิ้น กับการตรวจชิ้นเนื้อ 8 ชิ้นที่แสดงรูปแบบอื่นๆ ของเนื้องอกในเยื่อหุ้มเซลล์ โปรตีนที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญที่สุดใน MGMID คือซีรั่ม amyloid P. Immunostaining แสดง serum amyloid P colocalized กับ IgG ใน glomeruli ของ MGMID แต่ไม่ใช่กับ PLA2R-associated membranous glomerulopathy เซรั่ม amyloid P มีผลบวกใน glomeruli ของการตรวจชิ้นเนื้อ MGMID ทั้งหมด 32 ชิ้น แต่ให้ผลลบในการตรวจชิ้นเนื้อของ glomerulopathies ของเยื่อหุ้มชนิดอื่น เช่น สิ่งที่เกี่ยวข้องกับ PLA2R และ THSD7A มีการตรวจชิ้นเนื้อสี่ชิ้นที่มีการย้อมซีรั่ม amyloid P ในไตในการตรวจชิ้นเนื้อ 173 ชิ้นที่ไม่ผ่านเกณฑ์สำหรับ MGMID หรือ amyloidosis การตรวจชิ้นเนื้อทั้งสี่ชิ้นนี้ที่มีการย้อมซีรั่ม amyloid P ในซีรัมในเชิงบวกมีรูปแบบเยื่อหุ้มของโกลเมอรูโลพาทีที่มีการสะสมของแคปปา IgG ซึ่งแตกต่างจาก MGMID เท่านั้นโดยขาด "การกำบัง" ดังนั้น การย้อมสีที่เป็นบวกภายในการสะสมของไตในซีรัม amyloid Pidentify ทำให้เกิดรูปแบบเฉพาะของ glomerulonephritis ซึ่งน่าจะใช้กลไกทางพยาธิสรีรวิทยาร่วมกันของโรค
glomerulopathy คล้ายเยื่อหุ้มที่มีการสะสมของ IgG kappa ที่ปิดบัง (MGMID) เป็นรูปแบบทางจุลพยาธิวิทยาของไตอักเสบจากไตที่อธิบายไว้ในปี 2014 ซึ่งเป็นคำอธิบายแรกของสิ่งที่เรียกว่าการสะสมของไตที่สวมหน้ากาก1 ลักษณะทางจุลพยาธิวิทยาของโรคนี้รวมถึงการปรากฏตัวของ mesangial และ subepithelial ฝากด้วยข้อ จำกัด IgG แคปปา น่าแปลกที่แม้ว่าการย้อมสีองค์ประกอบเสริม 3 (C3) มักจะปรากฏชัดโดยอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ตามปกติบนเนื้อเยื่อที่ถูกแช่แข็ง แต่การย้อม Ig มักจะมาสก์ ซึ่งหมายความว่าจะแสดงการย้อมสีเชิงลบที่ผิดพลาดโดยอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ตามปกติ แต่จะเกิดการย้อมสีในเชิงบวกเมื่อทำซ้ำบนเนื้อเยื่อที่ฝังด้วยพาราฟินหลังจากการย่อยโปรตีเอส ดังนั้น เว้นแต่ว่านักพยาธิวิทยาจะรักษาดัชนีความสงสัยในระดับสูงไว้สำหรับเอนทิตีนี้ การวินิจฉัยอาจผิดพลาดได้ว่าเป็น C3 glomerulopathy เอนทิตีอื่นๆ ที่ได้รับการอธิบายว่าแสดงปรากฏการณ์การกำบังนี้ในสิ่งสะสมของไตรวมถึงโรคไตอักเสบจากเยื่อหุ้มเซลล์ที่มีการสะสม Ig แบบโมโนไทป์และไครโอโกลบูลิเนมิก glomerulonephritis2,3
ผู้ป่วยที่ตรวจพบ MGMID จากการตรวจชิ้นเนื้อมักเป็นหญิงสาว<40 years="" of="" age,="" and="" many="" have="" positive=""> serologic study results such as antinuclear antibodies, although few carry a diagnosis of any well-defined autoimmune disease such as lupus.4 Mean proteinuria in a recent case series of 41 patients was 3.5 g/24 h, and mean serum creatinine was found to be 1.4 mg/dl.4 The deposits of all reported cases that could be tested for IgG subclass were of the IgG1 kappa subclass. Despite this monotypic staining on biopsy, the vast majority of patients tested (>ร้อยละ 95 ) เป็นผลลบต่อ monoclonal Igs โดยโปรตีนในซีรัมอิเล็กโตรโฟรีซิส และไม่พบกรณีใดที่เกี่ยวข้องกับความร้ายกาจทางโลหิตวิทยา4
มีการตั้งสมมติฐานว่าการค้นพบทางคลินิกร่วมกันระหว่างผู้ป่วย MGMID อาจบ่งบอกถึงกลไกทางพยาธิสรีรวิทยาระดับโมเลกุลทั่วไปที่ผลักดันให้เกิดโรค ความตั้งใจของเราในการรายงานเอนทิตีนี้ในครั้งแรกคือการกำหนดกลุ่มประชากรตามรุ่นสำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติม เราอธิบายการมีอยู่ของโปรตีนในซีรัม amyloid p component (SAP) ที่พบในแหล่งสะสมของ MGMID glomeruli การสร้างภูมิคุ้มกันสำหรับ SAP ในตะกอนไตเป็นเทคนิคที่ละเอียดอ่อนและเฉพาะเจาะจงสำหรับการวินิจฉัยโรค MGMID ที่ให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับการเกิดโรคด้วย
รูปที่ 1|เซรั่ม amyloid P–component (SAP) ได้รับการเสริมสมรรถนะอย่างมีนัยสำคัญใน microdissected glomeruli จากผู้ป่วยที่มี glomerulopathy คล้ายเยื่อหุ้มที่มีการสะสมของ IgG kappa ที่สวมหน้ากาก ค่าการหาปริมาณแบบสัมบูรณ์แบบอิงความเข้มข้นที่ทำให้เป็นมาตรฐานจาก MaxQuant (สถาบันชีวเคมีของ Max Planck, Planegg ประเทศเยอรมนี) ใช้สำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติ เส้นประแสดงถึงจุดตัดแบบฮิวริสติกสำหรับการเปลี่ยนแปลงการพับและค่า P (a) พล็อตภูเขาไฟที่เปรียบเทียบตัวรับฟอสโฟไลเปส A2 รีเซพเตอร์ (PLA2R) จำนวน 3 เคสกับเคสอื่น ๆ ระบุโปรตีน 2 ตัวที่มีความชัดเจนในจตุภาคขวาบน (b) พล็อตภูเขาไฟที่เปรียบเทียบ 2 thrombospondin type 1 โดเมนที่มี 7A (THSD7A) - เคสเยื่อหุ้มบวกกับกรณีอื่นระบุโปรตีน 2 ตัวที่เป็นค่าผิดปกติที่ชัดเจนด้วย THSD7A ที่แสดงการเปลี่ยนแปลงพับที่ใหญ่ที่สุด (c) พล็อตภูเขาไฟที่เปรียบเทียบตัวอย่างของ glomerulopathy คล้ายเยื่อหุ้มกับฝาก IgG แคปปาที่ปิดบังกับกรณีเยื่อหุ้มชนิดอื่น ๆ ทั้งหมดระบุโปรตีน 6 ตัวที่เป็นค่าผิดปกติที่ชัดเจนในจตุภาคขวาบน C6 ส่วนประกอบเสริม 6; C7, องค์ประกอบเสริม 7; CFHR1, โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับปัจจัยเสริม 1; HP1BP3, โปรตีนเฮเทอโรโครมาติน 1 โปรตีนจับ 3; HPRT1, ไฮโปแซนทีน ฟอสโฟไรโบซิลทรานสเฟอเรส 1; IGHG3, Ig แกมมาคงที่หนัก 3
ผลลัพธ์
แมสสเปกโตรเมทรีของโกลเมอรูไลขนาดเล็กที่ดักจับด้วยเลเซอร์
การวิเคราะห์แมสสเปกโตรเมทรีของไมโครดิสเซคเต็ดโกลเมอรูไลจากการดักจับด้วยเลเซอร์จาก 9 เคสของ MGMID ถูกเปรียบเทียบกับ 8 เคสของเยื่อหุ้มโกลเมอรูโลพาที (MG) รวมถึงฟอสโฟไลเปส A2 รีเซพเตอร์ (PLA2R) จำนวน 3 เคส – MG บวก 2 เคสของทรอมโบสปอนดินประเภท 1 ที่มีโดเมน 7A ( THSD7A)– MG ที่เป็นบวก และ 3 กรณีของโรคลูปัส MG การวิเคราะห์นี้ระบุโปรตีนทั้งหมด 1695 ชนิด การวิเคราะห์พิสูจน์หลักการได้ดำเนินการเพื่อทดสอบว่าโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการเกิดโรคของ MG สามารถตรวจพบโดยแมสสเปกโตรเมทรีหรือไม่ สำหรับเมมเบรนแต่ละชนิดที่รู้จัก ความอุดมสมบูรณ์ของความแตกต่างของโปรตีนถูกเปรียบเทียบกับกลุ่มที่เหลือโดยใช้ค่าการหาปริมาณสัมบูรณ์ที่อิงตามความเข้มของมาตรฐาน (iBAQ) การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้การทดสอบ t ของ Welch และแสดงผลลัพธ์บนแผนผังภูเขาไฟ PLA2R มีปริมาณมากขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกรณีของ MG ที่เกี่ยวข้องกับ PLA2R และแสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงของรอยพับที่รุนแรงที่สุด (รูปที่ 1a) THSD7A แสดงการเปลี่ยนแปลงรอยพับที่แข็งแกร่งที่สุดใน MG ที่เกี่ยวข้องกับ THSD7A แม้ว่าจะมีค่า P ที่มากกว่าเนื่องจากขนาดตัวอย่างต่ำในกลุ่มนี้ (n ¼ 2; รูปที่ 1b) โดยรวมแล้ว การวิเคราะห์แบบพิสูจน์หลักการนี้แสดงให้เห็นว่าแมสสเปกโตรเมตรีของ microdissected glomeruli ที่จับด้วยเลเซอร์สามารถระบุโปรตีนที่มีนัยสำคัญต่อการเกิดโรคในเนื้องอกที่เป็นเยื่อหุ้มเซลล์
ต่อไปเราพยายามค้นหาโปรตีนที่อาจเกี่ยวข้องกับการเกิดโรค MGMID โดยใช้วิธีนี้ โปรทีนทั้งหมด 6 ชนิดมีปริมาณมากขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในตัวอย่าง MGMID เมื่อเทียบกับกลุ่มอื่นๆ (ตารางที่ 1) โปรตีนที่มีการเปลี่ยนแปลงพับสูงสุดคือ SAP (รูปที่ 1c) โปรตีนที่เหลือประกอบด้วย IgG Kappa โปรตีนเสริม 3 ชนิด และโปรตีนจับ 1 เฮเทอโรโครมาติน 3 (HP1BP3) SAP ได้รับการพิจารณาให้เป็นตัวเลือกอันดับต้น ๆ เนื่องจากตรวจพบในตัวอย่าง MGMID ทั้งหมด และแสดงให้เห็นความแตกต่างมากที่สุดในความอุดมสมบูรณ์เมื่อเทียบกับตัวอย่างที่ไม่ใช่ MGMID Igs ทั้งหมดที่ระบุโดยแมสสเปกโตรเมทรีใน glomeruli microdissected microdissected ที่ดักจับด้วยเลเซอร์จากกรณีของ glomerulopathy คล้ายเยื่อหุ้มที่มีการสะสมของ IgG kappa แสดงในตารางเสริม S1 การนับสเปกตรัมโดยการสุ่มตัวอย่างโปรตีนทั้งหมดที่แสดง 1 ดอลลาร์ log2 เพิ่มความอุดมสมบูรณ์ในตัวอย่าง MGMID และค่า P #01 แสดงในตารางเสริม S2
Cistancheสามารถปรับปรุงได้ไตการทำงาน
SAP การย้อมสีในกรณีของ glomerulopathy คล้ายเมมเบรน
แอนติบอดีกระต่ายโพลีโคลนัลที่ต่อต้านโปรตีน SAP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) แสดงให้เห็นการย้อมสีที่เป็นบวกอย่างแรงตามเยื่อหุ้มเซลล์ไตของเคสที่มี MGMID ที่รวมเข้ากับ IgG โดยการวิเคราะห์คอนโฟคอล SAP ไม่แสดง colocalization ด้วย IgG ใน glomeruli จาก MG ที่เกี่ยวข้องกับ PLA2R (รูปที่ 2) โพลีโคลนัลแรบบิทแอนติบอดีต้าน HP1BP3 ได้รับการทดสอบในการตรวจชิ้นเนื้อ 4 ชิ้นด้วย MGMID และแสดงให้เห็นการย้อมติดลบในตะกอนไตของทั้ง 4 ราย
ทำการย้อมสี SAP ทั้งหมด 211ไตการตรวจชิ้นเนื้อด้วย glomerulonephritis (ตารางที่ 2) รวม 36 รายที่มีคราบสะสมประเภทภูมิคุ้มกันเป็นบวกสำหรับ SAP ทุกกรณีที่มีการย้อมสีในเชิงบวกมีลักษณะทางจุลพยาธิวิทยาร่วมกัน รวมถึงการมีอยู่ของการสะสมของ mesangial และ subepithelial ที่มีการจำกัด IgG kappa และไม่มีการเปลี่ยนแปลงของ endocapillary หรือ membranoproliferative ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง SAP มีค่าเป็นลบในทุกกรณี โดยมีเงินฝากที่ปิดบังซึ่งไม่ใช่ MGMID รวมถึงโรคไตอักเสบจากไครโอโกลบูลิเนมิก 3 ราย และโรคไตอักเสบจากเยื่อหุ้มปอด 3 รายที่สวมหน้ากาก นอกจากนี้ยังเป็นลบในทั้งหมด 19 กรณีของ glomerulonephritis ที่มีการงอกขยายด้วย monoclonal Ig deposits (PGNMID) รวมถึงกรณีที่มี IgG1 kappa (4 ราย), IgG2 lambda (1 ราย), IgG 3 kappa (8 ราย) และ IgG3 lambda (6 ราย) ). polyclonal membranous glomerulopathy ทั้ง 30 ราย (PLA2R, THSD7A, lupus และ segmental) เป็นลบสำหรับ SAP glomerulonephritis รูปแบบเพิ่มเติมยังได้รับการศึกษาและเป็นลบ ในบรรดาโรคไตอักเสบจากการติดเชื้อนั้น พบการย้อมสี IgG 7 ผลบวก และ 6 รายที่มีหลักฐานว่ามีการสะสมของก้อนเนื้อใต้เยื่อบุผิว อย่างที่คาดไว้ ทั้ง 6 รายของ amyloidosis มีการย้อมสีที่เป็นบวกในคราบ amyloid อย่างไรก็ตาม รูปแบบการตกตะกอนที่เลอะเลือนนั้นตรงกันข้ามอย่างสิ้นเชิงกับการย้อมสีแบบละเอียดในกรณีของ MGMID photomicrographs ที่เป็นตัวแทนของ glomeruli บนคราบ SAP จากโรคไตต่างๆ ที่แสดงในรูปที่ S1 เพิ่มเติม
ทั้ง 32 กรณีที่ระบุก่อนหน้านี้ว่าเป็น MGMID เป็นผลบวกสำหรับ SAP นอกจากนี้ยังมีการย้อมสี SAP ใน glomeruli เป็นบวกจาก 4 ใน 25 กรณีของ membranous glomerulopathy ที่มีการสะสม IgG แบบ monotypic ที่ไม่ได้ปิดบังตามกิจวัตร
อิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ 4 ใน 13 รายที่มี IgG1 kappa, 0 จาก 2 รายที่มี IgG1 lambda, 0 จาก 5 รายที่มี IgG2 kappa, 0 จาก 4 รายที่มี IgG3 kappa และ {{ 12}} จาก 1 เคสที่มี IgG4 kappa โดยรวมแล้ว 32 จาก 36 (89 เปอร์เซ็นต์) ของ SAP-positive glomerulopathy ถูกปิดบังและจัดอยู่ในหมวดหมู่ MGMID ในขณะที่อีก 4 ใน 36 (11 เปอร์เซ็นต์) ถูกเปิดโปงและวินิจฉัยว่าเป็น MG ด้วย IgG1 kappa deposits ผู้ป่วยที่มีโรคเนื้องอกต่อมน้ำเหลืองชนิดโมโนไทป์ที่ไม่ได้ปิดบังแต่มีผลบวกต่อ SAP มีอายุเฉลี่ย 33 ปี โดยมีอัตราส่วนระหว่างเพศหญิงต่อเพศชายเท่ากับ 4:0 กรณีที่มีโรคเนื้องอกต่อมน้ำเหลืองชนิดโมโนไทป์ที่ไม่ได้ปิดบังแต่มีผลลบสำหรับ SAP มีอายุเฉลี่ย 59.3 ปี โดยมีอัตราส่วนระหว่างหญิงกับชายที่ 15:4
ตารางที่ 1|โปรตีนเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญใน glomeruli ของผู้ป่วยด้วยglomerulopathy คล้ายเยื่อหุ้มด้วยฝากแคปปา IgG, ดังแสดงโดยแมสสเปกโตรเมตรี
ปฏิกิริยาของเซรั่มต่อ SAP
Sera จากผู้ป่วย 22 รายที่เป็น MGMID, 12 รายที่มี PLA2R-positive membranous glomerulopathy และกลุ่มควบคุมปกติ 6 รายได้รับการทดสอบสำหรับปฏิกิริยาของ IgG กับ SAP โดยการทดสอบอิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ELISA) แม้ว่าผู้ป่วยแต่ละกลุ่มจะมีความแปรปรวนบางอย่าง แต่ก็ไม่มีความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในการเกิดปฏิกิริยาของ IgG ต่อ SAP ระหว่างกลุ่ม (รูปที่ S2) เสริม
รูปที่ 2|Colocalization ของ IgG และซีรัม amyloid P–component (SAP) (a–c) การทดลองด้วยอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ที่ทำกับตัวอย่างชิ้นเนื้อไตจากผู้ป่วยที่ได้รับการวินิจฉัยว่าเป็นโรคไตที่มีลักษณะเป็นพังผืดที่มีตะกอนคัปปา IgG ที่ปิดบังแสดงการย้อมสีเมมเบรนชั้นใต้ดินที่เป็นเม็ดละเอียดสำหรับ (a) SAP และ (b) IgG (c) มีการ colocalization ที่แข็งแกร่งของ SAP และ IgG ในการสะสมของเมมเบรนชั้นใต้ดินของไต (d–f) การทดลองอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ที่ทำกับตัวอย่างชิ้นเนื้อไตจากผู้ป่วยที่มี 3 phospholipases A2 receptor-positive membranous glomerulopathies แสดง (d) การย้อมสีเมมเบรนของเยื่อหุ้มชั้นใต้ดินที่เป็นลบสำหรับ SAP และ (e) การย้อมสีเมมเบรนของเยื่อหุ้มชั้นใต้ดินที่เป็นเม็ดเล็กที่เป็นบวกสำหรับ IgG (f) ไม่มี colocalization ในผู้ป่วยรายนี้ที่มี 3 phospholipases A2 receptor-associated membranous glomerulopathies เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการรับชมภาพนี้ โปรดดูเวอร์ชันออนไลน์ของบทความนี้ในตารางที่ 2|ผลลัพธ์ของการย้อมสีเซรั่ม amyloid p component (SAP) ในการตรวจชิ้นเนื้อไต
AA, อะไมลอยด์ เอ; AL, โซ่เบาอะไมลอยด์; C3 องค์ประกอบเสริม 3; GBM, เมมเบรนชั้นใต้ดินของไต; MG, glomerulopathy เยื่อหุ้ม; MGMID, glomerulopathy คล้ายเยื่อหุ้มที่มีการสะสมของ IgG kappa ที่ปิดบัง; MPGN, เยื่อหุ้มเซลล์; glomerulonephritis; PGMNID, glomerulonephritis ที่มีการเพิ่มจำนวนที่มีโมโนโคลนอล IgG แคปปาฝาก; PLA2R, ตัวรับฟอสโฟไลเปส A2; THSD7A, thrombospondin ประเภท 1 โดเมนที่มี 7A
อภิปรายผล
MGMID เป็นรูปแบบเฉพาะของ glomerulopathy ที่อธิบายไว้เมื่อเร็วๆ นี้ โดยมีลักษณะเฉพาะจากการสะสมของเยื่อบุผิวและเยื่อบุผิวที่เกาะอยู่ซึ่งย้อม IgG kappa ด้วย paraffin IF (รูปที่ 3) ผู้ป่วยที่มีรูปแบบของ glomerulopathy นี้มักจะเป็นหญิงสาว (age<40 years)="" and="" often="" have="" vague="" autoimmune="" phenomena.="" we="" report="" here="" the="" discovery="" by="" mass="" spectrometry="" of="" increased="" sap="" in="" the="" glomeruli="" of="" these="" patients="" and="" show="" positive="" staining="" for="" this="" protein="" in="" the="" glomerular="" deposits="" of="" 100%="" of="" cases="" diagnosed="" as="" mgmid.="" positive="" staining="" for="" sap="" was="" also="" tested="" in="" a="" wide="" variety="" of="" igmediated="" glomerulonephritis="" types="" and="" found="" to="" be="" present="" in="" 4="" of="" the="" 173="" cases="" tested="" that="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" or="" amyloidosis.="" all="" of="" these="" cases="" that="" stained="" positive="" for="" sap="" but="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" shared="" histopathologic="" fifindings="" with="" mgmid,="" including="" the="" pattern="" of="" immune="" deposition="" and="" igg1="" kappa="" restriction,="" only="" differing="" by="" the="" fact="" that="" they="" did="" not="" mask="" by="" routine="" immunofluorescence.="" additionally,="" these="" patients="" were="" demographically="" similar="" to="" mgmid="" patients="" in="" that="" they="" tended="" to="" be="" young="">
SAP เป็นโปรตีนเพนทาเมอริก 25-kDa ภายในตระกูลเพนตราซินที่เข้ารหัสโดยยีน APCS และมีมากในซีรัมและเป็นส่วนประกอบของเยื่อหุ้มชั้นใต้ดินของไต5 แม้ว่าฟังก์ชันที่แน่นอนของ SAP จะไม่ชัดเจน แต่ก็เป็นที่ทราบกันดี เพื่อโต้ตอบในพลาสมากับโปรตีนหลากหลายชนิด รวมถึงส่วนประกอบเสริม อะโพลิโปโปรตีน และสารควบคุมการแข็งตัวของเลือดและการสลายโปรตีน6 ทำให้เกิดปฏิกิริยาที่ขึ้นกับแคลเซียมที่เสถียรกับลิแกนด์ของมัน ซึ่งรวมถึงโปรตีน ไลโปโปรตีน และดีเอ็นเอ ปกป้องพวกมันจากการเสื่อมสลาย SAP ทำหน้าที่เป็นโมเลกุลการจดจำรูปแบบที่ละลายน้ำได้ซึ่งเกี่ยวข้องกับการตอบสนองของภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ โดยจดจำรูปแบบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับเชื้อโรคและความเสียหายที่หลากหลาย รวมถึงส่วนประกอบของจุลินทรีย์และเศษเซลล์ apoptotic7 ปฏิสัมพันธ์ของ SAP กับโมเลกุลที่ก่อให้เกิดโรคหรือความเสียหาย รูปแบบส่งเสริมการขจัดเศษเซลล์ apoptotic ที่อาศัยสื่อกลางโดยการจับโดยตรงกับส่วนประกอบ 1q (C1q) และการกระตุ้นเส้นทางการเติมเต็มแบบคลาสสิก แม้จะมีการเปิดใช้งานส่วนเสริม เป็นที่ทราบกันดีว่า SAP ให้การควบคุมภูมิคุ้มกันโดยลด neutrophilicการอักเสบภายในเนื้อเยื่อผ่านการยึดเกาะของบุผนังหลอดเลือดที่ลดลง,8 การทำงานของอีลาสเทสลดลง,9 และลดการกลับบ้านของเนื้อเยื่อ10 SAP เป็นที่รู้จักกันว่าเป็นโปรตีนจับหลักสำหรับดีเอ็นเอและโครมาตินภายในพลาสมา11
สำหรับโรค SAP เป็นที่รู้จักกันเป็นอย่างดีในการเป็นส่วนหนึ่งของการสะสมของ amyloidosis แม้ว่าจะมีการศึกษาน้อยกว่านี้ แต่ก็ยังมีหลักฐานว่าสามารถมีบทบาทในแบบจำลองโรคภูมิต้านตนเองของมนุษย์และสัตว์ แอนติบอดี SAP ได้รับการระบุในผู้ป่วยที่มีแพ้ภูมิตัวเองโรคและนิพจน์ SAP ที่ลดลงได้รับการแสดงเพื่อส่งเสริมภูมิต้านทานตนเองในแบบจำลองหนู แอนติบอดีที่ต่อต้าน SAP ได้รับการระบุใน 44 เปอร์เซ็นต์ของผู้ป่วยที่เป็นโรคลูปัส erythematosus โดยที่ระดับแอนติบอดีที่สัมพันธ์กับการเกิดโรค 12 การขาด SAP พบว่าส่งผลให้เกิดการพัฒนาของภูมิต้านทานผิดปกติที่เกิดขึ้นเองในหนู C57BL/6 ที่มีแนวโน้มแพ้ภูมิตัวเอง และในหนูที่ไม่ใช่ภูมิต้านตนเอง หนูมีแนวโน้มที่ 129/Sv เมื่อผสมกับหนู C57BL/ 6 ตัว (129/Sv x C57BL/6 F2)13 แต่ไม่ได้อยู่ในสายพันธุ์ 129/Sv เพียงอย่างเดียว ซึ่งบ่งชี้ว่าอาจจำเป็นต้องมีความอ่อนไหวทางพันธุกรรมพื้นฐานสำหรับการขาด SAP เพื่อทำให้เกิดภูมิต้านทานผิดปกติ14 หนูแสดงการผลิตแอนติบอดีต้านนิวเคลียร์, DNA ต่อต้านสายเดี่ยว, แอนติบอดีต่อต้าน DNA สายคู่ และปัจจัยเกี่ยวกับรูมาตอยด์ พวกเขาพัฒนาการแพร่กระจายมีภูมิคุ้มกันglomerulonephritis ที่อาศัยความซับซ้อนซึ่งพบได้บ่อยในผู้หญิง13 ในรูปแบบ murine ของโรคไตอักเสบลูปัสที่ glomerulonephritis เกิดขึ้นจากการฉีด DNA ที่กระตุ้นในตัวเองในซีรัม การบำบัดด้วยยีน SAP โดยพลาสมิดเวคเตอร์ช่วยลดการผลิตแอนติบอดี DNA แบบแอนตี้-ดับเบิ้ล , การสะสมเชิงซ้อนของภูมิคุ้มกัน และการอักเสบของไต และป้องกันการเริ่มมีอาการของโรคไตอักเสบลูปัส15
รูปที่ 3|การตรวจชิ้นเนื้อไตตรวจชิ้นเนื้อไตในโรคไตคล้ายเยื่อหุ้มเซลล์ที่มีการสะสมของแคปปา IgG Photomicrographs จากการตรวจชิ้นเนื้อที่แสดงในรูปที่ 2 แสดงไว้ที่นี่ (a) มีหนามแหลมเป็นปล้องอยู่ตามเยื่อหุ้มชั้นใต้ดินของไต โดยโจนส์ เมธามีน ซิลเวอร์สเตน (กำลังขยายดั้งเดิม×400) (b) กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนเผยให้เห็นการสะสมของเยื่อบุผิวใต้เยื่อหุ้มเซลล์ใต้เยื่อหุ้มไต (กำลังขยายดั้งเดิม×12,000) (c) Glomeruli ย้อมเป็นลบสำหรับ IgG โดยอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ตามปกติบนเนื้อเยื่อสด (อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์โดยตรง กำลังขยายดั้งเดิม× 400) (d) Glomeruli จากกรณีเดียวกันมีคราบบวกบนเนื้อเยื่อที่ฝังด้วยพาราฟินหลังจากการย่อยโปรตีนโปรตีเอส (อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์โดยตรง กำลังขยายดั้งเดิม× 400) (e) Glomeruli แสดงการย้อมสีสำหรับคัปปาและ (f) ไม่ใช่แลมบ์ดาบนเนื้อเยื่อที่ฝังด้วยพาราฟินที่ย่อยด้วยโปรตีเอส เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการรับชมภาพนี้ โปรดดูเวอร์ชันออนไลน์ของบทความนี้ที่ www.ไต-international.org
แม้จะมีข้อ จำกัด ของสายโซ่เบาที่เห็นในการตรวจชิ้นเนื้อ แต่ขณะนี้ยังไม่มีหลักฐานว่าเอนทิตีนี้เกี่ยวข้องกับความผิดปกติของต่อมน้ำเหลืองหรือโมโนโคลนัล Igs ที่ไหลเวียน4 ดังนั้น MGMID ไม่ควรถูกพิจารณาว่าอยู่ในสเปกตรัมของโมโนโคลนัลแกมโมพาธีย์ที่มีนัยสำคัญต่อไตในเรื่องนี้ เวลา. บทบาทของ autoantibodies ของ SAP ก็ยังไม่แน่นอนเช่นกัน ไม่เหมือนกับรูปแบบอื่น ๆ ของเยื่อหุ้มปอดอักเสบจากเยื่อหุ้มปอดที่มีโปรตีนเฉพาะในการสะสมของภูมิคุ้มกัน เช่น โรคที่เกี่ยวข้องกับ PLA2R ดูเหมือนว่า 16 MGMID จะไม่ถูกขับเคลื่อนโดย autoantibodies ที่ต่อต้าน SAP เนื่องจากเราล้มเหลวในการตรวจหาปฏิกิริยาของแอนติบอดีในซีรัมต่อ SAP ในผู้ป่วย MGMID . คำอธิบายทางเลือกคือ IgG kappa มีอยู่อันเป็นผลมาจากปฏิสัมพันธ์ปกติระหว่าง 2 โปรตีนนี้มากกว่าปฏิกิริยาระหว่างแอนติเจนและแอนติบอดีต่อภูมิต้านทานผิดปกติ เนื่องจากสาย Ig kappa เป็นที่รู้จักกันว่าเป็นส่วนหนึ่งของการโต้ตอบปกติของเซรั่ม SAP.6 ดังนั้น แม้ว่าจะมีประโยชน์สำหรับการวินิจฉัยเนื้อเยื่อของเอนทิตีนี้ การทดสอบหาแอนติบอดี SAP ในซีรัมไม่ได้ทำหน้าที่เป็นการวินิจฉัยแบบไม่รุกล้ำในเวลานี้ และสาเหตุของโรคนี้ยังคงเป็นปริศนา
ผลลัพธ์ทางคลินิกใน MGMID มีความแปรปรวนอย่างมาก ตั้งแต่การให้อภัยที่เกิดขึ้นเอง จนถึงการลุกลามไปจนถึงระยะสุดท้ายไตโรคด้วยการกลับเป็นซ้ำในการปลูกถ่าย การวิเคราะห์ย้อนหลังล้มเหลวในการแสดงความสัมพันธ์ใดๆ ระหว่างการรักษาที่ใช้และผลลัพธ์ทางคลินิก4 การค้นพบการมีส่วนร่วมของ SAP ในโรคนี้อาจมีผลกระทบต่อการรักษา การรักษาที่กำหนดเป้าหมายโดยตรงที่ SAP ได้แสดงให้เห็นในช่วงต้นของการรักษา amyloidosis17,18 นอกจากนี้ ผลการแมสสเปกโตรเมตรียังระบุว่าการรักษาที่กำหนดเป้าหมายไปที่น้ำตกคอมพลีเมนต์อาจมีประโยชน์ในการรักษา glomerulonephritis รูปแบบนี้ เนื่องจากโปรตีนส่วนใหญ่เพิ่มขึ้น ใน MGMID glomeruli เป็นส่วนประกอบที่เกี่ยวข้อง จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อระบุตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของกิจกรรมสำหรับโรคนี้ เช่นเดียวกับการบำบัด
สาเหตุของการปิดบังการสะสมของภูมิคุ้มกันในการตรวจชิ้นเนื้อ MGMID ในการเรืองแสงอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ตามปกติยังคงเป็นปริศนา การปรากฏตัวของ SAP ในเงินฝากทำให้เกิดคำอธิบายที่เป็นไปได้ใหม่สำหรับปรากฏการณ์นี้ในกรณีของ MGMID ตัวอย่างเช่น การทำงานร่วมกันของโปรตีน SAP เป็นที่ทราบกันดีว่าขึ้นอยู่กับ Ca2þ อย่างมาก6 และสื่อการขนส่งและบัฟเฟอร์จำนวนมากที่ใช้ในการประมวลผลเนื้อเยื่อชิ้นเนื้อไตสำหรับ immunoflfluorescence นั้นปราศจาก Ca2þ การขาด Ca2þ ในหลอดทดลองนี้อาจส่งผลให้เกิดการหยุดชะงักของการสะสมของภูมิคุ้มกัน ดังนั้นจึงไม่สามารถตรวจหาโดยอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์บนเนื้อเยื่อที่แช่แข็งได้อีกต่อไป การสะสมเชิงซ้อนของภูมิคุ้มกันจะยังคงมีอยู่สำหรับการตรวจหาในเนื้อเยื่อที่ยึดกับฟอร์มาลิน อย่างไรก็ตาม อันเป็นผลมาจากพันธะเคมีโควาเลนต์ที่เกิดจากฟอร์มาลินระหว่างโปรตีนในเนื้อเยื่อ
เราอธิบายที่นี่เป็นครั้งแรกถึงการมีอยู่ของ SAP ในแหล่งสะสมของ MGMID นอกจากนี้เรายังแสดงให้เห็นว่าการย้อมสีของไตการตรวจชิ้นเนื้อสำหรับ SAP จะระบุกรณีที่มีลักษณะทางคลินิกคล้ายกับใน MGMID โดยไม่ต้องปิดบัง โดยอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ตามปกติ จากผลลัพธ์เหล่านี้ เราเชื่อว่าการย้อมสีในเชิงบวกภายในแหล่งสะสมของไตสำหรับ SAP ระบุรูปแบบเฉพาะของไตอักเสบจากไตซึ่งมีกลไกทางพยาธิสรีรวิทยาร่วมกันของโรค จนกระทั่งมีคำอธิบายล่าสุดของ MGMID กรณีเหล่านี้ได้รับการวินิจฉัยว่าเป็นประเภทที่แตกต่างกันมากมายตั้งแต่ C3 glomerulopathy ไปจนถึง glomerulonephritis ที่เกี่ยวข้องกับการติดเชื้อไปจนถึง glomerulopathy ที่ผิดปรกติ1 วิวัฒนาการอย่างรวดเร็วของเกณฑ์การวินิจฉัยและความเข้าใจของเราเกี่ยวกับรูปแบบของ glomerulonephritis นี้เน้นถึงพลังของมวล spectrometry เพื่อให้ข้อมูลเชิงลึกทางพยาธิสรีรวิทยาใน glomerulonephritis ที่มีภูมิคุ้มกัน
วิธีการ
เทคนิคการตรวจชิ้นเนื้อไต
ใช้เทคนิคการประมวลผลตรวจชิ้นเนื้อไตมาตรฐาน รวมทั้งแสง อิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ และกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน 19,20 ตัวอย่างกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงทั้งหมดถูกย้อมด้วยฮีมาทอกซิลินและอีโอซิน ส่วนอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์โดยตรงทั้งหมดถูกตัดที่ 4 มม. และทำปฏิกิริยากับแอนติบอดีต่อต้านมนุษย์โพลีโคลนอลกระต่ายที่ติดแท็ก flfluorescein กับ IgG, IgA, IgM, C3, C1q, ไฟบริโนเจน และ k- และสายแสง l (Dako, Carpenteria, CA) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงแล้วล้างออก แผ่นปิดถูกนำไปใช้โดยใช้สื่อสำหรับยึดที่มีน้ำ บางกรณีถูกย้อมสีสำหรับแอนติบอดีต่อต้านมนุษย์ของหนูเมาส์โพลีโคลนอลที่แท็ก flfluorescein กับ IgG1, IgG2, IgG3 และ IgG4 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) พาราฟินอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ดำเนินการหลังจากการย่อยโปรตีเอสตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 2,3 การตรวจชิ้นเนื้อ MGMID ทั้งหมด 9 ชิ้นและการตรวจชิ้นเนื้อควบคุมเปรียบเทียบ 8 ชิ้นที่มีเนื้องอกต่อมไร้ท่อประเภทอื่นถูกเลือกสำหรับการวิเคราะห์แมสสเปกโตรเมทรี โปรโตคอลการศึกษาได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการตรวจสอบสถาบันโซลูชั่นและสอดคล้องกับปฏิญญาหลักการเฮลซิงกิ
Cistanche cantonifyไต
แมสสเปกโตรเมทรีของโกลเมอรูไลขนาดเล็กที่ดักจับด้วยเลเซอร์
เนื้อเยื่อตรวจชิ้นเนื้อไตจากเนื้อเยื่อฝังพาราฟินตรึงฟอร์มาลินถูกตัดที่ความหนา 10 มม. บนสไลด์ Leica PET-membrane frame (Leica, Wetzlar, Germany) สไลด์เหล่านี้ถูกย้อมด้วยฮีมาทอกซิลิน โกลเมอรูไลถูกไมโครดิสเซกชันไปในหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Leica DM60{{20}}0B microdissected glomeruli ถูก lysed ในโซเดียม dodecyl sulfate 2 เปอร์เซ็นต์และ dithiothreitol 0.1M ที่ 99 องศาเป็นเวลา 1 ชั่วโมงและประมวลผลโดยการเตรียมตัวอย่างโดยใช้ตัวกรอง (FASP) 21 lysate ที่ทำให้กระจ่างถูกถ่ายโอนไปยังเครื่องผลิต Vivacon 500 concentrator (MWCO ที่ 30 kDa; Sartorius , Göttingen ประเทศเยอรมนี). โซเดียมโดเดซิลซัลเฟตถูกกำจัดออกโดยการล้างซ้ำด้วยยูเรีย 8 โมลาร์ใน 0.1 โมลาร์ (ไฮดรอกซีเมทิล)-อะมิโนมีเทน/Cl, pH 8.5; จากนั้นตัวอย่างถูกอัลคิลเลตด้วยไอโอโดอะซีตาไมด์ 0.05 โมลาร์ ไอโอโดอะซีตาไมด์ถูกกำจัดออกโดยการล้าง 3 ครั้งด้วยยูเรีย 8 โมลาร์/0.1 โมลาร์ ทริส(ไฮดรอกซีเมทิล)- อะมิโนมีเทน/Cl, pH 8.5 ตามด้วยการล้าง 3 ครั้งด้วยแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต 0.05 โมลาร์ โปรตีนถูกย่อยด้วยทริปซิน (เกรดการจัดลำดับ, Promega, Madison, WI) ที่อัตราส่วน 40:1 โดยน้ำหนัก ที่ 37 องศาเป็นเวลา 16 ชั่วโมง เปปไทด์ถูกรวบรวมโดยการหมุนเหวี่ยงและแยกเกลือออกจากขั้นตอน C18-เคล็ดลับ (Thermo Scientific, Waltham, MA)
เปปไทด์ที่ย่อยแล้วถูกวิเคราะห์โดยแมสสเปกโตรมิเตอร์แบบตีคู่ NanoLC โดยใช้แมสสเปกโตรมิเตอร์ Thermo Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific) เปปไทด์ถูกบรรจุลงในคอลัมน์กับดักแบบรีเวิร์สเฟส (Integra-frit, New Objective, Woburn, MA) ที่มีเรซินไฮบริดพื้นผิวที่มีประจุ 2.5 มม. Waters XSelect (Waters Corp., Milford, MA) จับคู่กับ 150 มม. X 0.0คอลัมน์วิเคราะห์ 75 มม. ที่มีเรซินแบบย้อนกลับแบบเดียวกับที่ใช้ในกับดัก จากนั้นจึงใช้ระบบโครมาโตกราฟีของเหลวที่มีสมรรถนะสูงของ nanoAcquity (Waters Corp.) เพื่อสร้างการไล่ระดับสี 60-นาทีจาก 98:2 เป็น 60:40 อัตราส่วนบัฟเฟอร์ A: B (บัฟเฟอร์ A กรดฟอร์มิก 0.1 เปอร์เซ็นต์ อะซิโตไนไทรล์ 0.5 เปอร์เซ็นต์ บัฟเฟอร์ B กรดฟอร์มิก 0.1 เปอร์เซ็นต์ อะซิโตไนไทรล์ 99.9 เปอร์เซ็นต์)
เปปไทด์ถูกชะออกจากคอลัมน์ด้วยปลายสเปรย์แบบบูรณาการ (Picofrit, New Objective) และแตกตัวเป็นไอออนโดยอิเล็กโตรสเปรย์ (2.0 kV) ตามด้วยการวิเคราะห์แมสสเปกโตรเมทรีแบบตีคู่โดยใช้การแตกตัวที่เหนี่ยวนำการชนกันของพลังงาน (HCD) ที่สูงขึ้น การสแกนแบบสำรวจของสารตั้งต้นเปปไทด์ดำเนินการที่ความละเอียด 240K (ที่ 400 m/z) โดยมีเป้าหมายจำนวนไอออน 5×10⁵ แมสสเปกโตรเมตรีแบบตีคู่ถูกดำเนินการโดยการแยกที่ 1.6 Th ด้วยควอดรูโพล การกระจายตัวของ HCD ที่มีพลังงานการชนกันที่ทำให้เป็นมาตรฐานที่ 30 และการวิเคราะห์แมสสเปกโตรเมทรีแบบสแกนอย่างรวดเร็วในกับดักไอออน ข้อมูลแมสสเปกโตรเมตรีแบบตีคู่ที่ได้รับถูกค้นหาโดยเทียบกับฐานข้อมูลมนุษย์ของ Uniprot ล่าสุดที่มีทั้งรายการ Swiss Prot และ TREMBLE โดยใช้
MaxQuant (สถาบันชีวเคมี Max Planck, Planegg ประเทศเยอรมนี) การสร้างภาพข้อมูลทำได้โดยใช้ Scaffold v4.6 (ซอฟต์แวร์ Proteome, Portland, OR) อัตราการค้นพบที่ผิดพลาดถูกกำหนดไว้ที่ 1 เปอร์เซ็นต์สำหรับการจับคู่เปปไทด์กับสเปกตรัม ค่า iBAQ ที่ทำให้เป็นมาตรฐานจาก MaxQuant ใช้สำหรับการหาปริมาณ การกระจาย iBAQ สำหรับแต่ละตัวอย่างถูกปรับค่ามัธยฐานเพื่อควบคุมความแตกต่างในการโหลด ค่า iBAQ เท่ากับศูนย์ถูกลบออกจากชุดข้อมูล สำหรับการทดสอบสมมติฐานทางสถิติ การทดสอบ 2-ตัวอย่างของ Welch ถูกดำเนินการสำหรับโปรตีนแต่ละตัวโดยใช้ค่า iBAQ ที่ทำให้เป็นมาตรฐานสำหรับ 2 กลุ่ม หากตรวจพบโปรตีนในกลุ่มเดียวเท่านั้น จะทำการทดสอบ 1-ตัวอย่างของ Welch โดยใช้ค่า iBAQ ที่ตรวจพบน้อยที่สุดเป็นสมมติฐานว่าง
SAP ย้อมสี
ส่วนที่ฝังพาราฟินตรึงฟอร์มาลิน ตัดที่ 3 มม. ถูกแยกพาราฟินออก และดำเนินการดึงแอนติเจนที่ 99 องศา ส่วนต่างๆ ถูกทำปฏิกิริยากับโพลีโคลนัลแอนติบอดีต้าน SAP โพลีโคลนอลแอนติบอดี (1:400; ThermoFisher, Waltham, MA) ตามด้วยโรดามีนแดง X-conjugated แพะต้านกระต่ายทุติยภูมิที่ถูกดูดซับในเฟสของแข็งเพื่อให้แน่ใจว่ามีปฏิกิริยาข้ามน้อยที่สุดกับมนุษย์ IgG (1:100; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) แต่ละกรณีดำเนินการด้วยการควบคุมเชิงบวกและเชิงลบ รอยเปื้อนถูกประเมินโดยกล้องจุลทรรศน์อิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์มาตรฐาน มีการตัดสินว่าเป็นบวกหากมีการย้อมสีลูปของเส้นเลือดฝอยที่เป็นบวกในโกลเมอรูไลและเป็นค่าลบหากไม่มีลูปของเส้นเลือดฝอย
การย้อมสีในโกลเมอรูลี Colocalization ของ IgG และ SAP ในเยื่อหุ้มชั้นใต้ดินของไตได้รับการตรวจสอบโดยกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลโดยใช้กล้องจุลทรรศน์สแกนเลเซอร์คอนโฟคอล Zeiss LSM 880 (กล้องจุลทรรศน์ Zeiss, Jena, Germany) สำหรับการวิเคราะห์นี้ polyclonal (flfluorescein isothiocyanate–conjugated) rabbit anti-human IgG (1:40; Agilent, Santa Clara, CA) ถูกทำปฏิกิริยากับเนื้อเยื่อที่ได้รับความร้อนหลังจากการย้อมสีสำหรับ SAP ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น การควบคุมเชิงลบถูกดำเนินการเพื่อให้แน่ใจว่ามีความจำเพาะของแอนติบอดีโดยการละเว้นแอนติบอดีปฐมภูมิ MGMID สี่กรณีได้รับการทดสอบสำหรับการมีอยู่ของ HP1BP3 (1:100; Thermo Fisher, Waltham, MA) โดยการย้อมสีอิมมูโนเปอร์ออกซิเดส
การทดสอบแอนติบอดีในซีรัมกับ SAP
โปรตีน SAP (ระบบ R & D, Minneapolis, MN; {0}}SAB-050) ถูกเจือจางเป็น 3 ng/ml ในบัฟเฟอร์คาร์บอเนต-ไบคาร์บอเนต (pH 9.6) และเคลือบบน {{ 6}}อย่างดี แผ่น Immulon H2 (Thermo Scientific) ค้างคืนที่ 4 องศา ล้างเพลต x3 โดยใช้บัฟเฟอร์สำหรับล้าง 200 มิลลิลิตร (น้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 1 × และทวีน 0.05 เปอร์เซ็นต์) และบล็อกเป็นเวลา 2 ชั่วโมงด้วยบัฟเฟอร์ขัดขวาง (น้ำเกลือบัฟเฟอร์บัฟเฟอร์ 1 × ฟอสเฟต 0.05 เปอร์เซ็นต์) ทวีนเจลาตินปลา 1 เปอร์เซ็นต์) จากนั้นล้างจาน×3ด้วยบัฟเฟอร์ล้าง 200 มล. เซรั่มเจือจาง 20 ไมโครลิตร (1:100 ในบัฟเฟอร์สำหรับล้าง) ถูกเติมต่อหลุมและบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง เพลตถูกล้าง×7 ด้วยบัฟเฟอร์ล้าง 200 มล. ตามด้วยการเติมแอนติบอดีสำหรับตรวจหา, แอนติ–Human IgG-HRP (Jackson ImmunoResearchLaboratories; 309-035-003) ล้างจาน×7 ด้วยบัฟเฟอร์ล้าง 200 มล. ต่อมา, 3,3',5,5'-เตตระเมทิลเบนซิดีน เปอร์ออกซิเดส ซับสเตรตและเปอร์ออกซิเดสซับสเตรต Sol B ถูกผสมในอัตราส่วน 1:1 และ 100 มล. ถูกเติมลงในจาน ปฏิกิริยาหยุดลงโดยเติม 2M H2SO4 100 มล. ทิ้งไว้บนม้านั่งเป็นเวลา 20 นาทีก่อนอ่านค่าที่ 450 นาโนเมตร สำหรับการควบคุมเพื่อให้แน่ใจว่าโปรตีน SAP ถูกผูกไว้กับเพลท เราใช้ Rabbit anti-SAP (Invitrogen, Carlsbad, CA; PA1-28361) ในการเจือจางแบบต่อเนื่องตามด้วย anti-rabbit IgG-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories ; 111-035-144). กลุ่มควบคุมแสดงความสัมพันธ์ที่ดีระหว่างการเจือจางของแอนติบอดีกับการดูดกลืนแสง โดยมีค่า R-squared เฉลี่ยที่ 0.95
Cistanche สำหรับการปรับปรุงไตการทำงาน
การเปิดเผยข้อมูล
ผู้เขียนทั้งหมดประกาศว่าไม่มีผลประโยชน์ที่แข่งขันกัน
เสริม
ไฟล์เสริม MATERIAL (PDF)
รูปที่ S1 ภาพตัวแทนของ SAP ไตที่เปื้อนจากโรคไตต่างๆ
รูปที่ S2 การศึกษา seroreactivity ของ Anti-SAP โดยการทดสอบอิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์
ตาราง S1 Igs ทั้งหมดถูกระบุโดยแมสสเปกโตรเมทรีในโกลเมอรูลีที่ผ่าด้วยเลเซอร์ที่ดักจับด้วยเลเซอร์จากกรณีของโกลเมอรูโลพาทีคล้ายเยื่อหุ้มที่มีการสะสมของแคปปา IgG
ตาราง S2 การนับสเปกตรัมโดยการสุ่มตัวอย่างโปรตีนทั้งหมดพบว่ามีปริมาณ 1 log2 เพิ่มขึ้นในตัวอย่าง MGMID และค่า P-value # 0.1
ข้อมูลอ้างอิง
1. Larsen CP, Ambruzs JM, Bonsib SM และอื่น ๆ glomerulopathy คล้ายเมมเบรนที่มีการสะสม IgG kappa ที่ปิดบังไตอินเตอร์ 2014;86: 154–161.
2. Messias NC, วอล์คเกอร์ PD, เสนซีพี. พาราฟินอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ในห้องปฏิบัติการพยาธิวิทยาไต: เป็นมากกว่าเทคนิคการกอบกู้ มด ปทุม. 2015;28:854–860.
3. Larsen CP, Messias NC, Walker PD และอื่นๆ Membranoproliferative glomerulonephritis ที่มีการสะสมของ monotypic immunoglobulin แบบสวมหน้ากาก ไตอินเตอร์ 2015;88:867–873.
4. Larsen CP, Boils CL, Cossey LN และอื่น ๆ ลักษณะทางคลินิกของ glomerulopathy คล้ายเยื่อหุ้มที่มีการสะสมของ IgG kappa ที่สวมหน้ากาก ไต Int Rep. 2016;1:299–305.
5. Emsley J, White HE, O'Hara BP และอื่น ๆ โครงสร้างของส่วนประกอบ amyloid P ในซีรัมมนุษย์ในซีรัมเพนทาเมอริก ธรรมชาติ. 1994;367:338–345.
6. Poulsen ET, Pedersen KW, Marzeda AM และอื่น ๆ เซรั่ม amyloid P component (SAP) โต้ตอบในพลาสมาของมนุษย์ที่มีระดับแคลเซียมทางสรีรวิทยา ชีวเคมี. 2017;56:896–902.
7. Agrawal A, Singh PP, Bottazzi B และอื่น ๆ การจดจำรูปแบบโดยเพนตราซิน Adv Exp Med จิตเวช 2009;653:98–116.
8. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M และอื่น ๆ Pentaxins PTX3 และ SAP ในภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ การควบคุมการอักเสบและการเปลี่ยนแปลงเนื้อเยื่อ เจ เฮปาตอล. 2016;64:1416–1427.
9. หลี่ เจเจ แมคอดัม เคพี ส่วนประกอบ amyloid P ของมนุษย์: สารยับยั้งอีลาสเทส สแกน เจ อิมมูนอล 1984;20:219–226.
10. Cox N, Pilling D, Gomer RH Serum amyloid P: ตัวควบคุมระบบของการตอบสนองภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ เจ เหลืองอค ไบโอล. 2014;96:739–743.
11. Kravitz MS, Pitashny M, Shoenfeld Y. โมเลกุลป้องกัน—C-reactive protein (CRP), เซรั่ม amyloid P (SAP), pentraxin3 (PTX3), mannose-binding lectin (MBL) และ apolipoprotein A1 (Apo A1), และ autoantibodies ของพวกมัน: ความชุกและความสำคัญทางคลินิกในภูมิต้านทานผิดปกติ เจ คลิน อิมมูนอล 2005;25:582–591.
12. Zandman-Goddard G, Blank M, Langevitz P และอื่น ๆ Anti-serum amyloid component P แอนติบอดีในผู้ป่วยที่มี systemic lupus erythematosus มีความสัมพันธ์กับการเกิดโรค แอน รึม ดิส 2005;64:1698–1702.
13. Bickerstaff MC, Botto M, Hutchinson WL และอื่น ๆ ส่วนประกอบของเซรั่ม amyloid P ควบคุมการเสื่อมสลายของโครมาตินและป้องกันภูมิคุ้มกันทำลายตนเองจากปฏิกิริยานิวเคลียร์ นัท เมด. 1999;5:694–697.
14. Gillmore JD, Hutchinson WL, Herbert J และอื่น ๆ ภูมิต้านทานผิดปกติและไตในหนูที่มีการลบเป้าหมายของยีน amyloid P ในซีรัม: การขาด SAP หรือความเครียดรวมกัน? ภูมิคุ้มกันวิทยา 2004;112:255–264.
15. Zhang W, Wu J, Qiao B, และคณะ การแก้ไขของโรคไตอักเสบลูปัสโดยการบำบัดด้วยยีน amyloid P component ในซีรัมด้วยกลไกที่แตกต่างกันไปในแต่ละระยะของโรค ปล.หนึ่ง. 2011;6:e22659.
16. เบ็ค LH, Bonegio RG, Lambeau G และอื่น ๆ ตัวรับฟอสโฟลิเปส A2 ชนิด M เป็นแอนติเจนเป้าหมายในโรคไตที่ไม่ทราบสาเหตุ N Engl เจ เมด. 2009;361:11–21.
17. Richards DB, Cookson LM, Berges AC, และคณะ การรักษา amyloid โดยแอนติบอดีต่อซีรัม amyloid P ส่วนประกอบ N Engl เจ เมด. 2015;373:1106–1114.
18. Richards DB, Cookson LM, Barton SV และอื่น ๆ ทำซ้ำปริมาณของแอนติบอดีต่อซีรั่ม amyloid P ส่วนประกอบล้างคราบ amyloid ในผู้ป่วยที่เป็นโรค amyloidosis ทั่วร่างกาย วิทย์ทรานส์เมด 2018;10.
19. Walker PD, Cavallo T, Bonsib SM. แนวทางปฏิบัติสำหรับการตรวจชิ้นเนื้อไต มด ปทุม. 2004;17:1555–1563.
20. วอล์คเกอร์ พีดี. การตรวจชิ้นเนื้อไต ห้องปฏิบัติการ Arch Pathol 2552;133:181–188.
21. Wisniewski JR, Zougman A, Nagaraj N และอื่น ๆ วิธีการเตรียมตัวอย่างสากลสำหรับการวิเคราะห์โปรตีน วิธีการของแนท 2009;6: 359–362.
