พันธุศาสตร์ของ Osteopontin ในผู้ป่วยโรคไตเรื้อรัง: การศึกษาโรคไตเรื้อรังของเยอรมัน Ⅳ

ตัวแปรพื้นฐานและการวัด

ชุดตัวชี้วัดทางชีวภาพที่ได้มาตรฐานถูกวัดในห้องปฏิบัติการกลางที่ได้รับการรับรองโดยใช้โปรโตคอลสแตนดาร์ไดซ์ [81] ในบรรดาสิ่งอื่นๆ ครีเอตินีนและอัลบูมินจากซีรั่มและปัสสาวะถูกวัดปริมาณโดยใช้วิธีการตรวจสอบย้อนกลับของ IDMS (ครีเอตินีนพลัส, โรช, เยอรมนี) และวิธีการวัดความขุ่น (Tina-quant, โรช, เยอรมนี) Roche/Hitachi MODULAR P ตามลำดับ อัตราการกรองของไต (GFR) ถูกประมาณโดยใช้ CKD-EPI ที่มีครีเอตินีนเป็นหลักสำหรับมูลา (หน่วย: มล./นาที/1.73 ม.2, [82]) UACR ถูกคำนวณเป็นอัลบูมินในปัสสาวะ/ยูริ nary ครีเอตินีนที่วัดได้ (มก./กรัม, [83]) มีการรายงานอายุและเพศด้วยตนเองในการนัดตรวจวัดพื้นฐาน ในปี 2015 OPN ถูกวัดจากตัวอย่างซีรั่มพื้นฐานของกลุ่มการศึกษา GCKD ที่สมบูรณ์โดยใช้เทคนิคการตรวจวิเคราะห์อิมมูโนแอสเสย์ของเอนไซม์แซนวิชเชิงปริมาณ (ELISA เฟสของแข็ง; Quantikine Human OPN Immunoassay DOST00 จาก R&D Systems (R&D Systems Europe, Abingdon, UK )). การหาปริมาณดำเนินการที่สถาบันเคมีคลินิกและเวชศาสตร์ในห้องแล็บ Greifswald ประเทศเยอรมนี ค่าสัมประสิทธิ์การเปลี่ยนแปลง (การทดสอบภายใน) อยู่ที่ 4.5%, 5.3% และ 3.5% สำหรับระดับต่ำ ค่ามัธยฐาน และสูง ตามลำดับ ค่าสัมประสิทธิ์การเปลี่ยนแปลงระหว่างการทดสอบคือ 6.4% มีการใช้รีเอเจนต์และมาตรฐานทุติยภูมิตามคำแนะนำของผู้ผลิต

สมุนไพรออร์แกนิกดั้งเดิมเพื่อสุขภาพไต

จีโนไทป์ การควบคุมคุณภาพ และการใส่ร้าย

ข้อมูลโดยละเอียดเกี่ยวกับจีโนไทป์และการทำความสะอาดข้อมูลในการศึกษา GCKD ได้รับการอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [18] โดยสรุป DNA ถูกแยกออกจากเลือดครบส่วนและมีจีโนไทป์ที่ 2,612,357 vari ants สำหรับผู้เข้าร่วม 5,123 GCKD โดยใช้อาร์เรย์ Illumina HumanOmni2.5 Exome BeadChip (Illumina, GenomeStudio, Genotyping Module เวอร์ชัน 1.9.4) ที่ Helmholtz Center Munich การทำความสะอาดข้อมูลดำเนินการแยกกันสำหรับเนื้อหา Omni2.5 และเนื้อหาชิปภายนอกของอาเรย์ ตามโปรโตคอลมาตรฐาน [84] สคริปต์ที่เขียนแบบกำหนดเอง (R, Perl) และ Plink1.9 [85] ใช้สำหรับการควบคุมคุณภาพ (QC) ของเนื้อหา Omni2.5 ขั้นตอนการควบคุมคุณภาพตามตัวอย่างประกอบด้วยการตรวจสอบอัตราการโทร เพศ เฮเทอโรไซโกซิตี บรรพบุรุษทางพันธุกรรม และความเกี่ยวข้อง ซึ่งนำไปสู่การแยกตัวอย่าง 89 ตัวอย่าง ในระดับตัวแปรนั้น single nucleotide polymorphisms (SNPs) จะถูกแยกออกหากอัตราการโทรเป็น<0.96, and whenever the assumption of the Hardy-Weinberg equilibrium was violated (p-value <1.0E-05). After removing SNPs on duplicate positions, the cleaned dataset contained 5,034 individuals and 2,337,794 SNPs (S1 Fig). Genotypes were then imputed using minimac3 v2.0.1 at the Michigan Imputation Server [86]. The Haplotype Reference Consortium (HRC) haplotypes version r1.1 were used as the reference panel, and Eagle 2.3 was used for phasing. The final dataset contains data of 5,034 participants and 7,750,367 high-quality autosomal bi-allelic variants (imputation quality of R2 �0.3, MAF �1%). For the exome chip content, QC was similarly conducted [18]. In addition, checks specific for exome variants were added [87]. In brief, 96 individuals and 3,818 SNPs were removed, the latter of which had a call rate <0.95 and a Hardy-Weinberg equilibrium p-value <1.0E−05. The final exome chip dataset contains 5,027 participants with 226,233 variants (S1 Fig). For the exome chip association analysis, the genotypes were post-processed using zCall with a zscore threshold of six [88]. Genomic positions base on human genome build GRCh37.

การศึกษาความสัมพันธ์ทั่วทั้งจีโนมของตัวแปรทั่วไป

ตามที่รายงานก่อนหน้านี้ [17,18] GWAS ได้ดำเนินการสำหรับผู้เข้าร่วม GCKD ที่มีข้อมูลการวัดจีโนไทป์ที่สมบูรณ์ (Omni2.5), eGFR, UACR และ log2 (OPN) (N=4, 897) โดยใช้การถดถอยของ lin ear ของ log2 (OPN) บน SNP (แบบจำลองทางพันธุกรรมเพิ่มเติม) ที่มี MAF �1% ปรับตามอายุ เพศ บันทึก (eGFR) และบันทึก (UACR) (รูปที่ S1) การวิเคราะห์ความสัมพันธ์ถูกดำเนินการโดยใช้ SNPTEST v2.5 [89] สถิติสรุปได้รับการตรวจสอบคุณภาพโดยใช้ GWAtoolbox [90] และสำหรับอัตราเงินเฟ้อโดยใช้การควบคุมจีโนม [91] อย่างไรก็ตาม ไม่มีการร้องขอการแก้ไขการควบคุมจีโนม (γ=1.01) การเชื่อมโยงด้วยค่า p<5.0E-08 were considered significant. Per chromosome, an index SNP was defined as the SNP with the lowest genome-wide p-value with a 1-Mb interval centered around this SNP. This approach was repeated until no further SNP outside the interval(s) was available passing the genome-wide significance threshold. In order to discover further independent signals, we repeated GWAS analysis for chromosomes with significant results by conditioning on the genotype of the SNP with the lowest association pvalue of the respective chromosome. This procedure was repeated until no further genomewide signal was observed.

คำอธิบายประกอบการทำงานของตัวแปรได้ดำเนินการโดยใช้ ANNOVAR [92], SNiPA [93], Open Targets Genetics [94], FAVOR [95] และ RegulomeDB [96] แผนการเชื่อมโยงระดับภูมิภาคถูกวางแผนโดยใช้ LocusZoom v1.3 [97]

การทำแผนที่แบบละเอียด

Statistical fine-mapping [21] was carried out as previously described [17] for the two replicated SNPs within a region ±500kb. Approximate Bayes factors (ABFs) were then derived from the original GWAS statistics estimates. The SD prior was chosen as 0.61 because 95% of the effect size estimates fell within the −1.2 to 1.2 interval [21]. The ABF of the SNPs were used to calculate the posterior probability for each variant driving the association signal (PPA, 'causal variant'). Credible sets were determined by summing up PPA-ranked variants until the cumulative PPA was >99%.

การวิเคราะห์การจัดระเบียบ

เพื่อทำความเข้าใจเพิ่มเติมเกี่ยวกับกลไกระดับโมเลกุลและฟีโนไทป์ที่เกี่ยวข้องภายใต้การเชื่อมโยง เราได้ทำการวิเคราะห์การจัดกลุ่มของสถิติสรุป OPN GWAS ที่เกี่ยวข้องกับตำแหน่ง OPN ที่จำลองแบบสองตำแหน่งพร้อมสถิติสรุป GWAS จากแหล่งอื่นสามแหล่งตามที่ระบุไว้ด้านล่าง สำหรับการวิเคราะห์การรวมกลุ่มทั้งหมด เราใช้ฟังก์ชัน 'coloc.fast' จากแพ็คเกจ R gtx พร้อมพารามิเตอร์เริ่มต้นและคำจำกัดความก่อนหน้า (https://github.com/ tobyjohnson/gtx) ซึ่งเป็นการนำเวอร์ชันดัดแปลงของวิธีการจัดกลุ่มมาใช้ โดย Giambartolomei และคณะ [98]. เราพิจารณาการจัดกลุ่มเชิงบวกเมื่อความน่าจะเป็น pos terior ของตัวแปรเชิงสาเหตุที่ใช้ร่วมกันที่ตำแหน่งการเชื่อมโยงสำหรับลักษณะทั้งสอง (H4, p12) คือ > 0.8

การแสดงออกของยีน

อันดับแรก เราใช้สถิติสรุป GWAS ของข้อมูลการแสดงออกของยีนจากโครงการ GTEx [99] และการศึกษา NEPTUNE [100] ข้อมูล eQTL จาก GTEx V8 (เนื้อเยื่อ 49 ชิ้น) และการศึกษา NEPTUNE (NephQTL จากส่วนไตของไตและ tubulointerstitial) ถูกดาวน์โหลดจาก GTEx Portal (//www.gtexportal.org/home/) และเว็บไซต์ NephQTL (// //nephqtl.org/) ตามลำดับ ขั้นตอนการวิเคราะห์ของการรวมตัวกันมีการอธิบายรายละเอียดไว้ในที่อื่นแล้ว [17] ประการแรก สรุป GWAS ของ GTEx และ NephQTL ในภูมิภาคจีโนม ± 100kb ของ OPN SNP ทั้งสองถูกแยกออกมา มีการระบุยีนใน GWAS ที่แยกออกมา และสำหรับแต่ละยีน จะมีการกำหนด win-down ที่ถูกต้องที่ 500kb ขนาบข้างจุดเริ่มต้นและจุดสิ้นสุดของยีน จากนั้น สำหรับทุกหน้าต่างยีนที่ถูกต้อง โดยมี SNP อย่างน้อยหนึ่งรายการที่มีค่า p-value เชื่อมโยง <0.001 สรุป GWAS ของเนื้อเยื่อ GTEx และ NephQTL รวมถึง OPN GWAS จะถูกแยกและใช้เป็นอินพุตสำหรับการวิเคราะห์การจัดกลุ่ม