การสำรวจบทบาทของนวนิยาย Interleukin-17 ที่คล้ายคลึงกันจากหอยแมลงภู่ทะเลที่ไม่มีกระดูกสันหลัง Mytilus Coruscus ในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ: กฎเกณฑ์เชิงลบโดย Mc-Novel_miR_145 คือกุญแจสำคัญหรือไม่
Dec 11, 2023
เชิงนามธรรม: อินเตอร์ลิวคิน-17 (IL-17) แสดงถึงคลาสของไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบที่เกี่ยวข้องกับความผิดปกติของการอักเสบเรื้อรังและความเสื่อม ก่อนการศึกษานี้ มีการคาดการณ์ว่า Mc-novel_miR_145 อาจกำหนดเป้าหมายที่คล้ายคลึงกันของ IL-17 เพื่อมีส่วนร่วมในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของ Mytilus coruscus การศึกษานี้ใช้วิธีการวิจัยทางชีววิทยาระดับโมเลกุลและเซลล์ที่หลากหลายเพื่อสำรวจความสัมพันธ์ระหว่างความคล้ายคลึงกันระหว่าง Mc-novel_miR_145 และ IL-17 และผลการปรับภูมิคุ้มกันของพวกมัน การทำนายทางชีวสารสนเทศศาสตร์ยืนยันความเกี่ยวข้องของความคล้ายคลึงกันของ IL-17 กับตระกูลหอยแมลงภู่ IL-17 ตามด้วยการตรวจ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ (qPCR) เพื่อแสดงให้เห็นว่า McIL-17-3 มีการแสดงออกอย่างสูงใน เนื้อเยื่อที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันและตอบสนองต่อความท้าทายของแบคทีเรีย ผลลัพธ์จากการทดสอบนักข่าวลูซิเฟอเรสยืนยันศักยภาพของ McIL-17-3 ในการกระตุ้น NF-κb ขั้นปลายและการกำหนดเป้าหมายโดย Mc-novel_miR_145 ในเซลล์ HEK293 การศึกษายังได้ผลิตแอนตีซีรัมของ McIL-17-3 และพบว่า Mc-novel_miR_145 ควบคุม McIL-17-3 ในเชิงลบโดยวิธี western blotting และ qPCR assay นอกจากนี้ การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีบ่งชี้ว่า Mc-novel_miR_145 ควบคุม McIL-17-3 ในเชิงลบเพื่อบรรเทาการตายของเซลล์ที่เกิดจาก LPS โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์ในปัจจุบันแสดงให้เห็นว่า McIL-17-3 มีบทบาทสำคัญในการป้องกันระบบภูมิคุ้มกันของหอยจากการโจมตีของแบคทีเรีย นอกจากนี้ McIL- 17-3 ถูกควบคุมเชิงลบโดย Mc-novel_miR_145 เพื่อมีส่วนร่วมในการตายของเซลล์ที่เกิดจาก LPS การค้นพบของเราให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับการควบคุม RNA ที่ไม่เข้ารหัสในแบบจำลองที่ไม่มีกระดูกสันหลัง
ประโยชน์ของซิสตานช์สำหรับระบบภูมิคุ้มกันของผู้ชาย
คำสำคัญ: Mytilus couscous; อินเตอร์ลิวคิน-17; ไมโครอาร์เอ็นเอ; การตายของเซลล์; ภูมิคุ้มกัน
1. บทนำ
ระบบภูมิคุ้มกันมีบทบาทสำคัญในการป้องกันสิ่งมีชีวิตจากการบุกรุกของเชื้อโรคภายนอก ตามอัตภาพ ระบบการป้องกันจะแบ่งออกเป็นภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดและภูมิคุ้มกันที่ได้รับ ภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดถือเป็นด่านแรกของร่างกายในการป้องกันเชื้อโรค ซึ่งสามารถตรวจจับการบุกรุกของเชื้อโรคและกำจัดพวกมันได้บางส่วน [1] ภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดนั้นอาศัยเซลล์หลายชนิดเป็นสื่อกลาง รวมถึงเซลล์นักฆ่าตามธรรมชาติ โมโนไซต์ นิวโทรฟิล อีโอซิโนฟิล เบโซฟิล และเซลล์เดนไดรต์ที่หมุนเวียนอยู่ ซึ่งเรียกรวมกันว่าเซลล์ภูมิคุ้มกันโดยกำเนิด เซลล์เหล่านี้จะปล่อยไซโตไคน์จำนวนมากที่เกี่ยวข้องกับการสื่อสารของเซลล์ และด้วยเหตุนี้จึงช่วยประสานการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกัน [2] ในกรณีของการติดเชื้อและการอักเสบ ไซโตไคน์ทำหน้าที่เป็นตัวปรับ: ไซโตไคน์บางชนิดทำให้โรคแย่ลง (การอักเสบรุนแรง) ในขณะที่ไซโตไคน์บางชนิดส่งเสริมสุขภาพ (ต้านการอักเสบ) [3] ไซโตไคน์อยู่ภายใต้แรงกดดันทางวิวัฒนาการในระดับสูง และด้วยเหตุนี้จึงมีลำดับการกระจายตัวที่หลากหลาย [4] ในขณะที่ตระกูลไซโตไคน์ของ IL-17 แสดงการอนุรักษ์ในระดับสูง ซึ่งแสดงออกมาโดยการพับของปมซิสเทอีนในสถาปัตยกรรมการทำงานที่เกิดขึ้นจากอันตรกิริยาระหว่างสี่ สารตกค้างซิสเตอีนที่อนุรักษ์ไว้ [5] การศึกษาเมื่อเร็วๆ นี้แสดงให้เห็นว่า IL-17 เป็นกลุ่มของไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบที่เกี่ยวข้องกับความผิดปกติของการอักเสบเรื้อรังและความเสื่อม [6] อิล{10}}ทำงานโดยจับกับตัวรับโดยเฉพาะเพื่อส่งเสริมการพัฒนาของการอักเสบ การปฏิเสธภูมิคุ้มกัน และการสร้างเม็ดเลือด ตระกูลไซโตไคน์ของ IL-17 ในมนุษย์ประกอบด้วยสมาชิกหกตัว (IL-17A ถึง IL-17F) ซึ่งผลิตโดยทีลิมโฟไซต์ที่ถูกกระตุ้นและจำนวนเซลล์โดยธรรมชาติอื่นๆ เพื่อตอบสนองต่อ IL -1 และ IL-23 [7,8] อย่างไรก็ตาม หลักฐานจำนวนมากขึ้นบ่งชี้ว่าตระกูล IL-17 มีการขยายตัวอย่างเห็นได้ชัดในหอยทะเลและสายพันธุ์เอไคโนเดิร์ม ในจีโนมของเม่นทะเลสีม่วง Strongylocentrotus purpuratus ตรวจพบยีน IL{20}} ประมาณ 30 ยีน [9] ในทำนองเดียวกัน พบยีนคล้ายปลาหมึกยักษ์ IL-17- จำนวน 31 ยีนในโคลลอยด์เซฟาโลพอด โดยที่ยีน 27 ยีนมีการแสดงออกที่รุนแรงในหน่อและผิวหนัง [10] ซาโก้ และคณะ [11] ดึงลำดับ IL-17 ที่ไม่ซ้ำกัน 379 ลำดับจากจีโนมหอยแมลงภู่ที่จัดลำดับใหม่ 15 จีโนมและจีโนมอ้างอิง M. galloprovincialis [12] และแบ่งออกเป็น 23 ไอโซฟอร์มผ่านการวิเคราะห์สายวิวัฒนาการ นอกจากนี้ พวกเขายังพบว่าไอโซฟอร์มของ IL-17 จากสายพันธุ์ Mytilidae ได้รับการอนุรักษ์ไว้ในหมู่บุคคล และแบ่งปันระหว่างสายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องกันอย่างใกล้ชิด นอกจากสายพันธุ์ Mytilidae แล้ว ตระกูล IL-17 ขนาดใหญ่ยังพบในหอยชนิดอื่นๆ ด้วย เช่น Crassostrea gigas, Mizuhopecten yessoensis และ Pinctada fucata martensii [13] น้ำทะเลเต็มไปด้วยเชื้อโรค และหอยทะเลก็สัมผัสกับพวกมันอยู่ตลอดเวลา ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีคลังแสงอันทรงพลังของโมเลกุลภูมิคุ้มกัน ดังนั้นการขยายตัวของกลุ่ม IL-17 จึงทำให้สัตว์เหล่านี้มีการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่มีประสิทธิภาพมากขึ้น
มีการศึกษาหลายชิ้นที่บ่งชี้ถึงบทบาทสำคัญที่ IL-17 มีต่อภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดของสัตว์จำพวกหอย ตัวอย่างเช่น การวิจัยพบว่าจากการติดเชื้อ Vibrio harveyi ระดับ mRNA ของ IL-17D ได้รับการควบคุมอย่างมากใน Tegillarca granulosa [14] ในขณะที่ใน C. gigas CgIL17-5 แสดงให้เห็นว่า ปฏิกิริยาที่ชัดเจนต่อ Vibrio splendidus [15] นอกจากนี้ IL ของมอลลัสแคน-17ยังแสดงให้เห็นว่าตอบสนองต่อรูปแบบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับเชื้อโรค (PAMPs) หลายชนิด เช่น ไลโปโพลีแซ็กคาไรด์ (LPS), โพลิโนซินิก: กรดโพลีไซติไดลิก (polyI: C) และเพปทิโดไกลแคน (PGN) LPS เป็นองค์ประกอบหลักของผนังด้านนอกของผนังเซลล์แบคทีเรียแกรมลบ และเป็นหนึ่งในสารกระตุ้นภูมิคุ้มกันที่ใช้บ่อยที่สุด ในทางกลับกัน polyI: C เป็นอะนาล็อก RNA แบบเกลียวคู่ที่มักใช้เป็นตัวจำลองไวรัสในการวิจัยทางวิทยาศาสตร์ หลังจากการกระตุ้นโดย LPS การแสดงออกของยีนในตระกูล IL-17 ก็ถูกกระตุ้นอย่างรวดเร็วในหอยนางรมแปซิฟิก C. gigas และหอยนางรมมุก P. fucata [16,17] นอกจากนี้ในหอยมุก ยังพบว่า PfIL-17 มีส่วนเกี่ยวข้องในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันต่อการกระตุ้น polyI: C [17]
cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน
นอกจากนี้ การทดสอบลูซิเฟอเรสแบบคู่แสดงให้เห็นว่า PfIL-17 สามารถกระตุ้นยีนเป้าหมายของสัตว์มีกระดูกสันหลังที่มีตำแหน่งการจับกับ NF-kB และมีส่วนร่วมในวิถีการส่งสัญญาณ NF-kB ในเซลล์ HEK293 [17] PGN มีอยู่ในผนังเซลล์ของแบคทีเรียแกรมบวก และมักใช้เพื่อเลียนแบบแบคทีเรียแกรมบวก C. gigas IL17-5 ชนิดรีคอมบิแนนต์ได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีความสัมพันธ์ที่ดีกับ PGN ซึ่งไม่เคยมีรายงานในอินเตอร์ลิวกินของสัตว์มีกระดูกสันหลัง [18] การศึกษาเหล่านี้เป็นบทนำในการเปิดเผยการทำงานของระบบภูมิคุ้มกันของ IL-17 ในหอย ในฐานะที่เป็นคลาสของไซโตไคน์ที่ทำให้เกิดการอักเสบ การแสดงออกของ IL-17 ที่มากเกินไปสามารถทำให้เกิดความเสียหายร้ายแรงต่อเซลล์ได้ สิ่งมีชีวิตได้พัฒนากลไกต่างๆ เพื่อควบคุมปฏิกิริยาที่มากเกินไปของ IL-17 ซึ่งไมโครอาร์เอ็นเอ (miRNA) เป็นตัวแทนของคลาส RNA ที่ไม่ได้เข้ารหัสที่มีศักยภาพมากที่สุดและได้รับการศึกษามาเป็นอย่างดี MiRNA เป็นตระกูลของ RNA สั้น ๆ ที่มีความยาวประมาณ 22 nt ซึ่งสามารถควบคุมการแสดงออกของยีนเป้าหมายได้โดยการกดขี่การแปลหรือการย่อยสลาย mRNA การวิจัยในปัจจุบันเกี่ยวกับการควบคุม IL{17}} โดย miRNA มุ่งเน้นไปที่ผลเสริมฤทธิ์กันในโรคภูมิต้านตนเองของมนุษย์เป็นหลัก เช่น โรคปลอกประสาทเสื่อมแข็ง โรคข้ออักเสบรูมาตอยด์ โรคสะเก็ดเงิน และอื่นๆ [20] การพัฒนาเทคนิคของการหาลำดับปริมาณงานสูงและการคำนวณทางชีวภาพทำให้สามารถสแกน miRNA ของหอยในระดับจีโนมได้ และ miRNA ที่ได้รับการอนุรักษ์และแปลกใหม่จำนวนมากได้รับการระบุจากสายพันธุ์หอย เช่น หอยนางรมแบน Ostrea edulis หอยนางรมแปซิฟิก C. gigas , Lymnaea stagnalis, หอยแมลงภู่ M. galloprovincialis ฯลฯ [21–29] การศึกษาเหล่านี้ให้ข้อมูลพื้นฐานและการสนับสนุนที่ดีเยี่ยมสำหรับการตีความการทำงานของ miRNA ในหอย เกี่ยวกับบทบาทการควบคุมภูมิคุ้มกันของ miRNA บางชนิดในหอย, Tian และคณะ [30] พบว่า Pm-miR-29a สามารถควบคุม IL-17 ในเชิงบวกใน Pinctada martensii; หลังจากการแสดงออกของ Pm-miR-29a มากเกินไป การแสดงออกของ IL-17 ในเนื้อโลกและเหงือกของสายพันธุ์ก็ได้รับการควบคุม ใน C. gigas, cgi-miR-2 ได้เพิ่มการทำลายเซลล์เม็ดเลือดแดงของหอยนางรมโดยการควบคุม CgIκB2 ในเชิงลบ [31] และควบคุมการแสดงออกของยีนที่คล้ายตัวขนส่งโคลีนในทางลบในระยะแรกของการติดเชื้อ ซึ่งเกี่ยวข้องกับการปรับภูมิคุ้มกันที่ซับซ้อน [32].
cistanche พืชเพิ่มระบบภูมิคุ้มกัน
คลิกที่นี่เพื่อดูผลิตภัณฑ์ Cistanche Enhance Immunity
【สอบถามเพิ่มเติม】 อีเมล:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
ในระหว่างการผึ่งให้แห้ง พบว่า cgi-miR-365 ถูกกระตุ้นโดย norepinephrine และส่งเสริมการแสดงออกของ CgHSP90AA1 โดยตรง [33] การศึกษาล่าสุดแสดงให้เห็นว่า miRNA scaffold659_26519 กำหนดเป้าหมายไปที่ Calmodulin เพื่อควบคุมการแสดงออกของ IL-17 ในระยะแรกของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของ C. gigas [34] นอกจากนี้ หน้าที่จำเพาะของ miRNA บางชนิดยังได้รับการอธิบายไว้ในสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังอื่นๆ เช่น ปลิงทะเล Apostichopus japonicus [35–39] และกุ้ง Litopenaeus vannamei [40] การศึกษาเหล่านี้ได้เปิดม่านสู่กลไกพื้นฐานของ miRNA ในสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลัง และยังให้ข้อมูลอ้างอิงทางเทคนิคและระเบียบวิธีสำหรับการวิจัยในปัจจุบันของเรา ในการศึกษาก่อนหน้านี้ของเรา miRNA 26 ตัวและยีน 667 ยีนของ M. coruscus ได้รับการคำนวณทางชีววิทยาเพื่อการแสดงออกที่แตกต่างกันหลังจากการท้าทายของ Vibrio alginolyticus ซึ่ง Mcnovel_miR_145 สามารถกำหนดเป้าหมายความคล้ายคลึงของ IL-17 ได้ และมีส่วนร่วมในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันต่อการติดเชื้อแบคทีเรีย [41] วัตถุประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้คือเพื่อระบุยีน IL-17 และตรวจสอบบทบาทที่เป็นไปได้ของมันในการสร้างภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดและการควบคุมโดย miRNA Mcnovel_miR_145 ใน M. coruscus จากการศึกษานี้ เรามุ่งหวังที่จะทำความเข้าใจกลไกการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของหอยให้ดีขึ้น และให้ความกระจ่างเกี่ยวกับพื้นฐานระดับโมเลกุลของการป้องกันทางภูมิคุ้มกันต่อเชื้อโรค งานวิจัยนี้ยังสามารถให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับการควบคุม RNA ที่ไม่เข้ารหัสในแบบจำลองที่ไม่มีกระดูกสันหลัง
2. ผลลัพธ์
2.1. การแสดงลักษณะของ McIL-17-3
ลำดับ cDNA ของ McIL-17-3 ที่มี ORF, 30 -UTR ที่สมบูรณ์ และ UTR บางส่วน 50 - อยู่ในโคลนซิลิโกที่คัดลอกมาจากทรานสคริปโตมแบบเต็มความยาว M. coruscus (หมายเลขภาคยานุวัติ: PRJNA798880, F{ {5}}การถอดเสียง_12404) McIL-17-3 มีบริเวณ ORF 585 bp ซึ่งเข้ารหัสกรดอะมิโน 194 ตัว น้ำหนักโมเลกุลที่คาดการณ์คือ 21.77 kDa และจุดไอโซอิเล็กทริกคือ 5.21 การวิเคราะห์แบบสมาร์ทเผยให้เห็นโดเมน IL-17 โดยทั่วไปในโปรตีนนี้ (รูปที่ 1A) ต้นไม้สายวิวัฒนาการถูกสร้างขึ้นโดยการคัดเลือกสมาชิก IL-17 ของสัตว์มีกระดูกสันหลังและสายพันธุ์ Mytilidae และใช้ IL2 เป็นกลุ่มนอก ดังที่แสดงในรูปที่ 1B IL-17 เหล่านี้ถูกรวบรวมเป็นสาขาเฉพาะเพื่อแยกความแตกต่างจาก IL-2 ภายในกระจุก IL-17 มีการแสดงเคลดที่ชัดเจนสองส่วน อันหนึ่งประกอบด้วย IL-17 ที่มีกระดูกสันหลัง และอีกอันประกอบด้วย IL{23}} ของหอยแมลงภู่ ในกลุ่มหอยแมลงภู่ IL-17 นั้น McIL-17-3 จะรวมกลุ่มกับโมเลกุลที่สอดคล้องกันจากสายพันธุ์ Mytilus อื่น นั่นคือ M. galloprovincialis (รูปที่ 1B)
2.2. การทำนายการจัดตำแหน่งหลายตำแหน่งและการทำนายโครงสร้างตติยภูมิ
แกนกลางของ McIL-17-3 ประกอบด้วยเส้นเกลียวที่ขนานกันสองคู่ คู่หนึ่งประกอบด้วยเส้น 1 (สารตกค้าง 52–58) และ 2 (สารตกค้าง 66–72 และ 77–79) ในขณะที่อีกคู่ประกอบด้วยเส้น 3 (สารตกค้าง 89–103) และ 4 (สารตกค้าง 110–125) (รูปที่ 2B, C) . สะพานไดซัลไฟด์สองอัน (Cys97/Cys134 และ Cys125/Cys169) เชื่อมต่อสาย 1 และ 3, 2 และ 4 ตามลำดับ (รูปที่ 2A, C) อย่างต่อเนื่อง IL-17 ของมอลลัสกาอื่นๆ มีจุดเชื่อมต่อไดซัลไฟด์สองเส้นนี้ระหว่างสาย 1 และ 3, 2 และ 4 (รูปที่ 2A, C) เป็นที่น่าสังเกตว่า แม้ว่า IL ของสัตว์มีกระดูกสันหลัง-17จะมีสะพานไดซัลไฟด์สองสะพาน แต่ก็มีอยู่ระหว่าง 2 ถึง 4 (รูปที่ 2A, C)
2.3. การแสดงออกถอดความของ McIL-17-3
โปรไฟล์การกระจายเนื้อเยื่อของการถอดเสียง McIL {{0}} ได้รับการประเมินโดย qPCR การถอดเสียงของ McIL-17-3 ถูกแสดงออกในเนื้อเยื่อที่ทดสอบทั้งหมด และระดับการแสดงออกในเม็ดเลือดแดงและเหงือกสูงกว่าในกล้ามเนื้อ adductor อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 3A) มีการประเมินการแสดงออกชั่วคราวของการถอดเสียง McIL-17-3 ของเม็ดเลือดแดงเพื่อตอบสนองต่อความท้าทายของ V. alginolyticus ระดับ mRNA ของ McIL-17-3 ได้รับการควบคุมอย่างมีนัยสำคัญที่ 3 และ 12 HPC (3.13- หรือ 4.35-เพิ่มขึ้นเท่าตัวเมื่อเทียบกับ 0 HPC ตามลำดับ) แต่ไม่มี ความสม่ำเสมอชั่วคราวที่ชัดเจนโดยทั่วไป (รูปที่ 3B)
รูปที่ 1. การแสดงลักษณะเฉพาะทางโมเลกุลของ McIL-17-3 (A) การวิเคราะห์สถาปัตยกรรมของโดเมนที่ได้รับการอนุรักษ์ใน McIL-17-3 โดยใช้ SMART แสดงโดเมน IL-17 ที่สงวนไว้ (B) การวิเคราะห์สายวิวัฒนาการของ McIL-17-3 ต้นไม้สายวิวัฒนาการถูกสร้างขึ้นโดยใช้ซอฟต์แวร์ MEGAX พร้อมการบูตสแตรปปิ้งซ้ำ 2, 000 ครั้งโดยใช้วิธีการเข้าร่วมเพื่อนบ้าน McIL-17-3 มีป้ายกำกับด้วยสามเหลี่ยมสีเขียว สปีชีส์ที่รวมอยู่ในต้นไม้สายวิวัฒนาการทั้งหมดถูกดึงมาจากฐานข้อมูล Genebank และหมายเลขภาคยานุวัติก็แสดงอยู่ในต้นไม้ด้วย สามเหลี่ยมสีเขียวในนามของ McIL-17-3 (สำหรับการตีความการอ้างอิงถึงสีในตำนานรูปนี้ ผู้อ่านจะอ้างอิงถึงเวอร์ชันเว็บของบทความนี้)
2.4. การเปิดใช้งานดาวน์สตรีมโดย McIL-17-3
ตามที่แสดงไว้ในรูปที่ 4 รีคอมบิแนนท์ McIL-17-3 เพิ่มการออกฤทธิ์ของลูซิเฟอเรสของ pGLNF-κB-luc ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา ที่ 0.5 และ 1.0 ไมโครกรัม/หลุม กิจกรรมของลูซิเฟอเรสของ pGLNF-κB-luc เพิ่มขึ้น 2.07- และ 11.07- เท่าตามลำดับ
2.5. การยืนยัน McIL-17-3 เป็นยีนเป้าหมายของ Mc-novel_miR_145
ด้วยการทำนายทางชีวสารสนเทศศาสตร์ ยีน McIL{{0}} มีลำดับเป้าหมายมาตรฐานสำหรับ Mc-novel_miR_145 ที่ 30 UTR (รูปที่ 5A) การเลียนแบบและตัวยับยั้งของ Mc-novel_miR_145 ได้รับการทรานส์เฟกร่วมกับพลาสมิดนักข่าว UTR McIL-17-3-30 ชนิดไวด์เข้าไปในเซลล์ HEK293 เพื่อยืนยันความสัมพันธ์ของพวกมัน ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 5B การเลียนแบบ Mc-novel_miR_145 สามารถยับยั้งการออกฤทธิ์ของลูซิเฟอเรสของ McIL-17-3-30 UTR-WT (0.{{2{{58} }}}เท่าลดลงเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม) ขณะที่ตัวยับยั้ง Mc-novel_miR_145 ช่วยบรรเทาผลกระทบได้อย่างน่าทึ่ง (เพิ่มขึ้น 1.64-เท่าเมื่อเทียบกับ Mc-novel_ miR_145 เลียนแบบเป็นเพียงกลุ่มที่เพิ่มเข้ามา) เพื่อประเมินว่า Mc-novel{{30}}miR_145 กำหนดเป้าหมายยีน McIL-17-3 โดยตรงผ่านไซต์เป้าหมายใน 30 UTR หรือไม่ เราได้สร้างพลาสมิดนักข่าวลูซิเฟอร์เรสเวอร์ชันกลายพันธุ์ ที่กลายพันธุ์ลำดับการกำหนดเป้าหมายของ Mc-novel_miR_145 ใน McIL-17-3 30 UTR ดังที่แสดงในรูปที่ 5C การเลียนแบบของ Mc-novel_miR_145 ลดการทำงานของลูซิเฟอเรสของเซลล์ที่ถูกทรานส์เฟกด้วย UTR-WT ของ McIL-17-3-30 ลงอย่างมีนัยสำคัญ (0.27- เท่า ลดลง) ในขณะที่ไม่มีการเปลี่ยนแปลงในการทำงานของลูซิเฟอเรสถูกสังเกตพบในเซลล์ที่ทรานส์เฟกด้วย McIL-17-3-30 UTR-MUT นอกจากนี้ ผลที่ขึ้นกับขนาดยาของ Mc-novel_miR_145 เลียนแบบการยับยั้งการออกฤทธิ์ของลูซิเฟอเรสของ McIL-17-3-30 UTR-WT ยังสามารถสังเกตได้ที่ 24 ชั่วโมงหลังการเปลี่ยนถ่าย (0 .71-, 0.43- และ 0.20- เท่าลดลงเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม ตามลำดับ รูปที่ 5D)
รูปที่ 2 การจัดตำแหน่งหลายจุดของ McIL-17-3 กับสมาชิกในครอบครัว IL-17 คนอื่นๆ (A) ลำดับกรดอะมิโนของ McIL-17-3 สอดคล้องกับลำดับของ IL-17 อื่นๆ ที่ดึงมาจากหอยแมลงภู่และสัตว์มีกระดูกสันหลัง รวมถึงหนูและปลาเซบีฟิช ซีสเตอีนเหล่านี้ซึ่งก่อตัวเป็นปมแบบมาตรฐาน มีเครื่องหมายสีเขียว โดยมีเรซิดิวของกรดอะมิโนที่ถูกแทนที่ซึ่งทำเครื่องหมายด้วยสีแดง ปมซิสเทอีนจะแสดงด้วยเส้นสี สีน้ำเงินหมายถึงมีอยู่ในหอย และสีแดงหมายถึงมีอยู่ในสัตว์มีกระดูกสันหลัง หมายเหตุ: เฉพาะครึ่งหลังของการจัดตำแหน่งเท่านั้นที่จะถูกสงวนไว้สำหรับการแสดงภาพ (B) โครงสร้างตติยภูมิของโปรตีน McIL-17-3 ถูกทำนายโดยใช้แบบจำลองสวิสและซอฟต์แวร์ pyMol ซีสเตอีนเหล่านี้ซึ่งก่อตัวเป็นปมมาตรฐานถูกทำเครื่องหมายไว้ (C) การแสดงการ์ตูนของการพับปมซิสเทอีนที่เป็นที่ยอมรับ สารตกค้างของซิสเทอีนถูกระบุโดยวงกลมที่เต็มไป สิ่งที่มีอยู่ในโปรตีน IL-17 นั้นมีสีเหลือง ในขณะที่โปรตีนทั้งสองที่พลาดไปนั้นเป็นสีเทา (สำหรับการตีความการอ้างอิงถึงสีในตำนานรูปนี้ ผู้อ่านจะอ้างอิงถึงเวอร์ชันเว็บของบทความนี้)
รูปที่ 3 การวิเคราะห์โปรไฟล์นิพจน์ของการถอดเสียง McIL-17-3 (A) การกระจายตัวของ McIL-17-3 ในเนื้อเยื่อหอยแมลงภู่ทั่วไป (B) การเปลี่ยนแปลงการแสดงออกชั่วคราวของการถอดเสียง McIL -17-3 เพื่อตอบสนองต่อความท้าทายของ V. alginolyticus ผลลัพธ์แสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SD (n=3, * p < 0.05, ** p < 0.01) (สำหรับการตีความการอ้างอิงถึงสีในตำนานรูปนี้ ผู้อ่านจะอ้างอิงถึงเวอร์ชันเว็บของบทความนี้)
รูปที่ 4 การเปิดใช้งานนักข่าว NF-κBโดย McIL-17-3 เวกเตอร์ลูกผสม pEGFP-McIL- 17-3 ในความเข้มข้นสามระดับ (0.1, 0.5, และ 1.{{10}} ไมโครกรัม/หลุม) ถูกทรานส์เฟกร่วม เข้าไปในเซลล์ HEK293 โดยใช้ Lipo6000TM เป็นเวลา 24 ชั่วโมง กิจกรรมของลูซิเฟอเรสสัมพัทธ์ถูกคำนวณโดยการทำให้ค่า pRLTK เป็นมาตรฐาน ผลการทดลองแสดงเป็นการเปลี่ยนแปลงแบบพับโดยการเปรียบเทียบกิจกรรมของลูซิเฟอเรสของเซลล์ที่เกิดจากเวกเตอร์รีคอมบิแนนท์กับเซลล์ที่เกิดจากเวกเตอร์เปล่าที่ความเข้มข้นเท่ากัน แต่ละค่าแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SD (n=3) และแท่งที่มีเครื่องหมายดอกจันมีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ (* p < 0.05, ** p < 0.01)
รูปที่ 5 Mc-novel_miR_145 กำหนดเป้าหมาย McIL-17-3 (A) ลำดับ UTR ของ McIL-17-3 30 ถูกแทรกเข้าไปในเวกเตอร์ pmiR-RB-Report™ ซึ่งสร้างพลาสมิดชนิดไวด์และกลายพันธุ์ตามลำดับ ลำดับ Mcnovel_miR{{10}} และไซต์เป้าหมาย McIL-17-3-30 UTR และลำดับไซต์กลายพันธุ์ถูกติดป้ายกำกับด้วยเครื่องหมายสีแดง (B) McIL-17-3-30 UTR-WT พลาสมิดถูกทรานส์เฟกร่วมกับ Mc-novel_miR_145 mimic หรือ Mc-novel_miR{{2{{37} }}} สารยับยั้งเข้าไปในเซลล์ HEK293 (C) เซลล์ HEK293 ได้รับการถ่ายด้วย McIL-17-3-30 UTR-WT หรือชนิดกลายพันธุ์ของ McIL-17-3-30 UTR-MUT ร่วมกับ Mc-novel_miR_145 หรือ NC เป็นเวลา 24 ชม. แอคติวิตีของลูซิเฟอเรสถูกวัดโดยใช้ระบบการสอบวิเคราะห์รีพอร์เตอร์แบบดูอัล-ลูซิเฟอเรส (D) การทดลองไล่ระดับความเข้มข้นถูกดำเนินการสำหรับการเปลี่ยนถ่ายของ Mc-novel_miR{_145 ข้อมูลทั้งหมดจะถูกนำเสนอเป็นค่าเฉลี่ย ± SD จากการทดลองที่เพิ่มขึ้นสามเท่าอย่างอิสระอย่างน้อยสามครั้ง **, p < 0.01, *, p < 0.05 เทียบกับส่วนควบคุม (สำหรับการตีความการอ้างอิงถึงสีในตำนานรูปนี้ ผู้อ่านจะอ้างอิงถึงเวอร์ชันเว็บของบทความนี้)
2.6. Mc-novel_miR_145 ควบคุมการแสดงออกของ McIL-17-3 ในทางลบ
เซลล์เม็ดเลือดแดงของ M. coruscus ได้รับการทรานส์เฟกด้วยการเลียนแบบ Mc-novel_miR_145, สารยับยั้ง Mcnovel_miR_145 และส่วนควบคุมตามลำดับ และการเปลี่ยนแปลงใน McIL{{ 5}} ถูกประเมินในระดับการถอดเสียงและโปรตีน ดังที่แสดงในรูปที่ 6A การแสดงออกของ Mc-novel_miR_145 ได้รับการควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ (เพิ่มขึ้น 8.83- เท่า) โดยการเลียนแบบและการควบคุมลง ({{14 }}.41-พับลดลง) โดยตัวกดในเม็ดเลือดแดง ซึ่งบ่งบอกถึงผลที่มีประสิทธิผลของสารสังเคราะห์เหล่านี้ ในรูปที่ 6B การแสดงออกของ McIL-17-3 ภายนอกถูกยับยั้งอย่างมีนัยสำคัญ (0.51-เท่าลดลง) โดย Mc-novel_miR_145 เลียนแบบที่ ระดับการถอดเสียงและเหนี่ยวนำอย่างมีนัยสำคัญ (เพิ่มขึ้น 2.42- เท่า) โดยตัวยับยั้ง Mcnovel_miR_145 เพื่อตรวจสอบผลกระทบของ Mc-novel_miR_145 ต่อการแสดงออกของ McIL-17-3 ในระดับโปรตีน จึงได้มีการผลิตโพลีโคลนอลแอนติบอดีต่อ McIL-17-3 ดังที่แสดงในเลน 2 และ 3 ในรูปที่ 6C โปรตีนรีคอมบิแนนท์ McIL-17-3 ถูกแสดงออกใน E. coli ได้สำเร็จ ตรวจสอบความจำเพาะของแอนติบอดีด้วยโปรตีนหอยแมลงภู่จากเม็ดเลือดแดงโดย Western blot สังเกตแถบความถี่เดี่ยวประมาณ 22 kDa ซึ่งสอดคล้องกับมวลโมเลกุลของ McIL-17-3 (เลน 4 ในรูปที่ 6C) ผลลัพธ์ของเวสเทิร์นบล็อตในรูปที่ 6D แสดงการควบคุมเชิงลบของ McIL-17-3 ที่ระดับโปรตีนโดย Mc-novel_miR_145
Fรูปที่ 6 Mc-novel_miR_145 ยับยั้งการแสดงออกของ McIL-17-3 ใน M. coruscus hemocytes (A) การแสดงออกของ Mc-novel_miR_145 ได้รับการประเมินโดย qPCR ในเซลล์เม็ดเลือดแดงที่แปลงสภาพด้วย 145 เลียนแบบ, 145 สารยับยั้ง และการควบคุมตามลำดับ (B) หลังจากการถ่ายเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ระดับการถอดเสียงของ McIL-17-3 ถูกกำหนดโดย qPCR (C) การแสดงออกของรีคอมบิแนนท์ การทำให้บริสุทธิ์ และการเตรียมแอนติซีรัมสำหรับ McIL-17-3 Lane M เครื่องหมายแสดงน้ำหนักโมเลกุลโปรตีนมาตรฐาน เลน 1 การควบคุมเชิงลบ (ไม่มีการเหนี่ยวนำ) ช่องที่ 2 เหนี่ยวนำโปรตีนรีคอมบิแนนท์ McIL-17-3 เลน 3, McIL บริสุทธิ์- 17-3 ช่องที่ 4 เวสเทิร์นบล็อตที่มีแอนติบอดีต่อต้าน McIL{{20}} ในเม็ดเลือดแดงของ M. coruscus (D) หลังจากการทรานส์เฟกชันเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ระดับโปรตีนของ McIL-17-3 ถูกกำหนดโดย Western blot ** p <0.01 เทียบกับส่วนควบคุม
2.7. การตายของเซลล์เม็ดเลือดแดง
อัตราการตายของเซลล์เม็ดเลือดแดงของสี่กลุ่ม ได้แก่ NC+LPS, McIL-17-3+LPS, Mcnovel_miR_145+McIL-17-3+LPS และ Mc-novel{{6} }miR_145-i+McIL-17-3+LPS ถูกวิเคราะห์โดยโฟลว์ไซโตเมทรีโดยใช้การย้อมสีสองครั้ง หลังจากที่ McIL-17-3 มีการแสดงออกมากเกินไป อัตราการตายของเซลล์เม็ดเลือดแดงที่ถูกท้าทายด้วย LPS ได้รับการควบคุมอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 7A(a,b), B) เมื่อ McIL-17-3 ถูกทรานส์เฟกร่วมด้วย Mc-novel_miR_145 อัตราการตายของเซลล์เม็ดเลือดแดงที่เกิดจาก LPS ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับอัตราการตายของ McIL-17-3 เพียงอย่างเดียว (รูปที่ 7A( ข,ค) ข) ในทางตรงกันข้าม อัตราการตายของเซลล์เม็ดเลือดแดงแสดงการเพิ่มขึ้นอย่างน่าทึ่งในกลุ่ม Mc-novel_miR_145-i+ McIL-17-3+LPS เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม McIL-17-3+LPS (รูปที่ 7A (ข,ง),ข)
รูปที่ 7 อัตราการตายของเซลล์เม็ดเลือดแดงได้รับการประเมินโดยโฟลว์ไซโตเมทรีโดยใช้โพรพิเดียมไอโอไดด์ (PI) และคราบ FITC-Annexin-V
3. การอภิปราย
IL-17 ได้รับการยอมรับว่าเป็นหนึ่งในกลุ่มไซโตไคน์ที่ส่งเสริมการอักเสบที่สำคัญ ซึ่งสามารถมีส่วนร่วมในการก่อโรคของโรคต่างๆ ได้อย่างมีประสิทธิภาพ [42] ในการศึกษาก่อนหน้านี้ ความคล้ายคลึงกันของ M. coruscus IL-17 แสดงการแสดงออกที่แตกต่างกันก่อนและหลังการติดเชื้อ V. alginolyticus ผ่านการเรียงลำดับการถอดเสียง [41] ซึ่งบ่งบอกถึงบทบาทที่เป็นไปได้ในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติต่อความท้าทายของแบคทีเรีย ที่นี่ เราแสดงคุณลักษณะที่คล้ายคลึงกันของ IL-17 นี้และตั้งชื่อมันว่า McIL-17-3 การทำนายโดเมนเชิงฟังก์ชันเผยให้เห็นโดเมน IL-17 โดยทั่วไป ซึ่งทำให้เกิดความเกี่ยวข้องของยีนที่ระบุในปัจจุบันกับตระกูลไซโตไคน์ของ IL-17 ในต้นไม้สายวิวัฒนาการ ยีน IL-17 ใหม่นี้แสดงให้เห็นความสัมพันธ์ที่ใกล้ชิดกับ IL-17- 3 จาก Mytilus สายพันธุ์อื่น M. galloprovincialis นอกจากนี้ พวกมันมีข้อมูลประจำตัวของกรดอะมิโนที่สูงมากถึง 95% ดังนั้นเราจึงเสนอชื่อยีน IL-17 ใหม่ในปัจจุบันเป็น McIL-17-3 เพื่อให้เป็นไปตามแบบแผนการตั้งชื่อที่ใช้ในสายพันธุ์ Mytilus ตระกูล IL-17 ประกอบด้วยสมาชิก 6 ตัวและตัวรับ 5 ตัวในมนุษย์ [43] แต่ก็มีการขยายตัวทางพันธุกรรมอย่างมากในสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังในทะเล โดยเฉพาะในหอยแมลงภู่ [11] จากข้อมูลนี้ ข้อมูลของเราชี้ให้เห็นว่า McIL-17-3 ไม่เกี่ยวข้องโดยตรงกับยีนบางตัวในตระกูล IL-17 ของมนุษย์ รอยพับของปมซิสเทอีนอยู่ที่ -sheets เป็นลักษณะเฉพาะของตระกูล IL-17 [5] ตามที่คาดไว้ การทำนายโครงสร้างระดับตติยภูมิเผยให้เห็นการพับของปมซิสเทอีนในโปรตีน McIL-17-3 ซึ่งทำให้ลักษณะเฉพาะของ McIL-17-3 ในกลุ่มไซโตไคน์ของ IL-17 ลึกซึ้งยิ่งขึ้นไปอีก เพื่อสำรวจเพิ่มเติมเกี่ยวกับความแตกต่างของลำดับกรดอะมิโนของ IL-17 ในสายพันธุ์ต่างๆ หอยแมลงภู่ IL-17 ทั่วไปบางชนิดและ Mus musculus IL-17-A ถึง IL-17-F และ Danio rerio IL-17-1 ถึง IL-17-3 ถูกเลือกเพื่อทำการวิเคราะห์การจัดตำแหน่งหลายตำแหน่ง ผลลัพธ์แสดงให้เห็นการค้นพบที่น่าสนใจว่าตำแหน่งการเชื่อมโยงไดซัลไฟด์ของ IL-17 ในหอยแมลงภู่และสัตว์มีกระดูกสันหลังไม่สอดคล้องกัน: การเชื่อมโยงไดซัลไฟด์ทั้งสองนี้มีอยู่ระหว่างเส้นที่ 1 และ 3, 2 และ 4 ตามลำดับในหอยแมลงภู่ แต่เฉพาะระหว่าง - เส้นที่ 2 และ 4 ในสัตว์มีกระดูกสันหลัง ที่ตำแหน่งของซิสเทอีนที่หนึ่งและสี่ IL ของสัตว์มีกระดูกสันหลังจะแทนที่ซิสเทอีนด้วยซีรีน ในทางตรงกันข้าม ที่ตำแหน่งซิสเทอีนแห่งที่สอง หอยแมลงภู่ IL-17 จะเข้ามาแทนที่ซิสเทอีนด้วยการสร้าง Threoninentiation ที่การเชื่อมโยงไดซัลไฟด์ในหอยแมลงภู่และสัตว์มีกระดูกสันหลัง และกลไกพื้นฐานของมันไม่ชัดเจนและจำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติม เมื่อพิจารณาถึงความหลากหลายของ IL-17 ในหอยแมลงภู่ การเชื่อมโยงไดซัลไฟด์ระหว่างเส้นที่ 1 และ 3 อาจไม่รุนแรงเท่ากับเส้นที่ระหว่าง 2 ถึง 4 ทำให้พวกมันมีความเป็นพลาสติกมากขึ้นในหอยแมลงภู่ อย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์ขอบเขตการทำงานและโครงสร้างตติยภูมิแสดงให้เห็นว่า McIL-17-3 ที่ถูกระบุในปัจจุบันนั้นเป็นเรื่องปกติของไซโตไคน์ IL{51}} ของหอยแมลงภู่ และอาจมีบทบาทหน้าที่คล้ายคลึงกันกับตัวอื่นๆ ในหอย การแสดงออกของยีน IL-17 ในเนื้อเยื่อของมนุษย์นั้นแตกต่างกันไปอย่างมาก โดยบางส่วนแสดงออกในเซลล์เพียงไม่กี่เซลล์และบางส่วนแสดงออกมาในเนื้อเยื่อจำนวนมาก [44,45] การศึกษาเกี่ยวกับหอยส่วนใหญ่แสดงให้เห็นว่า IL-17 มีโปรไฟล์การแสดงออกที่เป็นส่วนประกอบ [13,15,17,46,47] อย่างไรก็ตาม Li, Zhang, Zhang, Xiang, Tong, Qu และ Yu [47] แสดงผลลัพธ์ที่ไม่สอดคล้องกันใน C. gigas IL-17s: CgIL-17-2, -3, {{ 65}} และ -6 มีการแสดงออกอย่างมากในเหงือก C. gigas ต่อมย่อยอาหารและเนื้อโลก แต่แทบจะไม่แสดงออกในเนื้อเยื่ออื่น ในที่นี้ พบบันทึกของ McIL-17-3 ในเนื้อเยื่อทั้งหมดที่ตรวจสอบ ซึ่งบ่งบอกถึงบทบาทหน้าที่หลายอย่างของมันในกิจกรรมทางสรีรวิทยาที่หลากหลาย อย่างไรก็ตาม ระดับการแสดงออกที่สูงของ McIL-17-3 ในเนื้อเยื่อที่เกี่ยวข้องกับระบบภูมิคุ้มกันของมอลลัสกาบางชนิด เช่น เม็ดเลือดแดง เหงือก และต่อมย่อยอาหาร บ่งชี้ว่า McIL{68}} มีส่วนเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกัน ต่อไปนี้การตอบสนองอย่างรวดเร็วต่อการโจมตีของ V. alginolyticus ทำให้จุดนี้ลึกซึ้งยิ่งขึ้น การฉีด V. alginolyticus ควบคุมการแสดงออกของ McIL-17-3 อย่างมีนัยสำคัญ และยังพบผลลัพธ์ที่คล้ายกันใน IL-17 ของมอลลัสกาอื่นๆ อีกด้วย การฉีด V. anguillarum เข้าไปใน C. gigas ทำให้เกิดการเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วของปริมาณการถอดเสียง CgIL-17 ในเซลล์เม็ดเลือดแดง ซึ่งบ่งบอกว่าเป็นยีนระยะเริ่มต้นของภูมิคุ้มกัน [46] เมื่อ C. gigas ถูกโจมตีโดยเชื้อโรคอื่น V. splendidus ระดับ mRNA ของ CgIL-17-5 ในเม็ดเลือดแดงก็เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเช่นกัน [15] การกระตุ้นของ LPS ซึ่งเป็นองค์ประกอบหลักที่ทำให้เกิดโรคของแบคทีเรีย ทำให้การแสดงออกของ PfIL-17 เพิ่มขึ้นอย่างมากในต่อมย่อยอาหารของหอยมุก P. fucata [17] นอกจากนี้ LPS สามารถกระตุ้นการแสดงออกของ CgIL-17-3 ใน C. gigas [47] และ PmIL-17-2 ใน P. fucata martensii [13] ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้โดยรวมว่า IL-17 มีบทบาทสำคัญในการป้องกันภูมิคุ้มกันของหอยจากการโจมตีของแบคทีเรีย ในการศึกษานี้ McIL-17-3 แสดงความสามารถในการกระตุ้นของวิถี NF-κB ที่อยู่ปลายน้ำ นอกจากนี้ยังพบผลลัพธ์ที่คล้ายกันในหอยบางชนิดอีกด้วย ในหอยมุก P. fucata นั้น PfIL-17 ยังแสดงการกระตุ้นวิถี NF-κB ในเซลล์ HEK293 โดยวิธีวิเคราะห์ luciferase Reporter [17] ใน C. gigas, CgIL-17-5 ส่งเสริมการกระตุ้น CgMAPK และการโยกย้ายนิวเคลียร์ของ CgRel และ CgAP-1 เพื่อส่งเสริมการแสดงออกของ mRNA ของไซโตไคน์และเปปไทด์ต้านเชื้อแบคทีเรีย [15] ได้รับการสาธิตแล้วว่ารูปแบบการออกฤทธิ์ของ IL-17 ขึ้นอยู่กับการรวมตัวของมันเข้ากับไดเมอร์ (โฮโมไดเมอร์หรือเฮเทอโรไดเมอร์) ซึ่งการออกฤทธิ์ขึ้นอยู่กับการเกาะติดของพวกมันกับรีเซพเตอร์เป็นอย่างสูง (IL-17Rs) ที่พวกมัน เป้า. รีเซพเตอร์เหล่านี้มีโดเมนไซโตพลาสมิกแบบอนุรักษ์ (SEFIR) ที่ทำปฏิกิริยากับโปรตีนอะแดปเตอร์เพื่อเริ่มต้นเส้นทางการถ่ายโอนสัญญาณดาวน์สตรีมสำหรับการกระตุ้นปัจจัยการถอดรหัส เช่น NF-κB และส่งเสริมการแสดงออกของยีนเป้าหมายทางภูมิคุ้มกันและการอักเสบ เช่น ไซโตไคน์และเปปไทด์ต้านจุลชีพ 11,48,49].
cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน
ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า IL-17 ของหอยอาจมีรูปแบบการออกฤทธิ์เช่นเดียวกับในสัตว์มีกระดูกสันหลัง สิ่งนี้จะต้องได้รับการยืนยันในการศึกษาในอนาคต พบความสัมพันธ์ระหว่าง miRNA และ IL-17 ในแบบจำลองโรคของมนุษย์หลายแบบ นิอิโมโตะ และคณะ [50] ยืนยันความสัมพันธ์เชิงบวกระหว่างการแสดงออกของ miR-146a และ IL-17 ในเซลล์โมโนนิวเคลียร์ในเลือดส่วนปลายและซินโนเวียมจากผู้ป่วยโรคข้ออักเสบรูมาตอยด์ และสรุปการทำงานที่สำคัญของ miR-146a ใน การแยกความแตกต่างของ IL-17- ที่สร้างเซลล์ ในผู้ป่วยโรคสะเก็ดเงิน miR-146a ทำหน้าที่เป็นตัวยับยั้งที่มีศักยภาพของการอักเสบที่ผิวหนังที่ขับเคลื่อนด้วย IL-17- และระดับที่ต่ำของ miR-146a ทำหน้าที่เป็นตัวยับยั้งที่มีศักยภาพของการอักเสบของผิวหนังที่ขับเคลื่อนด้วย IL-17- และระดับที่ต่ำของ miR-146a อาจทำให้เกิดโรคในระยะเริ่มแรกในบุคคลที่มีความอ่อนไหวทางพันธุกรรม [51] MiR-146a อาจช่วยรักษาโรคปริทันต์อักเสบได้โดยการควบคุมการแสดงออกของ IL-17 และยับยั้งการแพร่กระจายของเซลล์ต้นกำเนิดจากเอ็นปริทันต์ของมนุษย์ [52] MiR-155 ควบคุมการแสดงออกของ IL-17 ในเชิงลบเพื่อมีส่วนร่วมในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของโฮสต์ต่อโรคปอดบวมจากแบคทีเรียหลังไวรัสในปอดของหนู หนูที่ถูกยับยั้ง miR-155 แสดงการแสดงออกของ IL-17 ในปอดได้ดีขึ้น พร้อมด้วยการกวาดล้างแบคทีเรียที่ดีขึ้น [53] การศึกษาเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า IL-17 ถูกควบคุมโดย miRNA หลายตัว และแตกต่างกันไปตามโรคและประเภทของเซลล์ [20] ในการศึกษาก่อนหน้านี้ เราทำการวิเคราะห์แบบผสมผสานของ miRNAome และ transcriptome เพื่อสำรวจการควบคุมเชิงโต้ตอบของ miRNA-mRNA โดย M. coruscus เพื่อตอบสนองต่อการติดเชื้อ V. alginolyticus ผลลัพธ์คาดการณ์ว่า Mc-novel_miR_145 สามารถกำหนดเป้าหมาย McIL-17-3 ให้มีส่วนร่วมในการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติต่อการติดเชื้อแบคทีเรีย [41] ด้วยความมุ่งหมายที่จะสำรวจกลไกเบื้องหลังของการควบคุม Mcnovel_miR_145 ของ McIL-17-3 ในเชิงลึก จึงได้ทำการทดลองในห้องปฏิบัติการหลายชุดในการศึกษานี้ การคำนวณทำนายว่า Mc-novel_miR_145 สามารถกำหนดเป้าหมายที่ 30 UTR ของ McIL-17-3 การสอบวิเคราะห์ลูซิเฟอเรสรีพอร์เตอร์ต่อไปนี้ดำเนินการในเซลล์ HEK293 ทรานส์เฟกร่วมกันโดยการเลียนแบบ Mc-novel_miR_145, เลียนแบบ NC, สารยับยั้ง, สารยับยั้ง NC กับ McIL-17-3-30 UTR-WT, ผู้รายงาน -MUT พลาสมิดยืนยันประเด็นนี้เพิ่มเติม นอกจากนี้ Mc-novel_miR_145 mimic, mimic NC, inhibitor และ inhibitor NC ถูกแปลงร่างไปเป็น M. coruscus hemocytes เพื่อประเมินผลของพวกมันต่อการแสดงออกของ McIL-17-3 ในระดับการถอดรหัสและโปรตีน . การแสดงออกของ McIL-17-3 มีการควบคุมต่ำลงอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่มการเลียนแบบการเลียนแบบ Mc-novel_miR_145 ในขณะที่มีการควบคุมมากขึ้นอย่างมีนัยสำคัญใน Mc-novel_miR กลุ่มทรานส์เฟกชันของสารยับยั้ง _145 เสนอแนะการควบคุมเชิงลบของ McIL-17-3 โดย Mc-novel_miR_145 ผลลัพธ์ปัจจุบันขัดแย้งกับการศึกษาครั้งก่อน ใน Pinctada martensii, Tian, Zheng, Huang, Jiao และ Du [30] พบว่าแม้ว่า Pm-miR-29a สามารถกำหนดเป้าหมาย IL-17 ได้ แต่กฎระเบียบก็เป็นไปในเชิงบวก เนื่องจากการแสดงออกของ IL{{ 65}} ในเนื้อโลกและเหงือกของ Pinctada martensii ได้รับการควบคุมหลังจากการแสดงออกของ Pm-miR-29a มากเกินไป เนื่องจาก P. martensii และ M. coruscus ต่างก็อยู่ในหอยสองฝาและมีความสัมพันธ์กันค่อนข้างมาก ผลลัพธ์ที่ไม่สอดคล้องกันเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการควบคุมของ IL-17 ในหอยอาจแตกต่างกันไปตาม miRNA นอกเหนือจากนี้ ไม่มีวรรณกรรมใดรายงานความสัมพันธ์ระหว่าง miRNA และ IL-17 ในหอย ดังนั้นจึงไม่มีการศึกษาแบบคู่ขนานอีกต่อไปเพื่อเปรียบเทียบผลลัพธ์ในปัจจุบัน อย่างไรก็ตาม มีงานวิจัยบางชิ้นรายงานความสัมพันธ์ในการกำหนดเป้าหมายระหว่าง miRNA เฉพาะกับยีนที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันเฉพาะในหอย
ตัวอย่างเช่น cgi-miR-2d เพิ่ม phagocytosis ของเม็ดเลือดแดงของหอยนางรมโดยการควบคุม CgIκB2 ในเชิงลบใน Crassostrea gigas [31] นอกจากนี้ cgi-miR-2d ยังควบคุมการแสดงออกของยีนที่คล้ายตัวขนส่งโคลีนหนึ่งยีนในเชิงลบเพื่อมีส่วนร่วมในการปรับภูมิคุ้มกันที่ซับซ้อนของเม็ดเลือดแดงของหอยนางรมในระหว่างระยะแรกของการติดเชื้อ [32] อย่างน้อยการศึกษาเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า miRNA มีบทบาทสำคัญในการส่งสัญญาณภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติโดยการกำหนดเป้าหมายยีนเฉพาะในหอย เช่นเดียวกับที่ทำในสัตว์มีกระดูกสันหลัง ต่อไป เราพยายามที่จะสำรวจการทำงานที่เป็นไปได้ของปฏิสัมพันธ์ระหว่าง Mcnovel_miR_145 และ McIL{{10}} ในภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดของ M. coruscus และบทบาทของพวกมันใน การตายของเซลล์ที่เกิดจาก LPS เป็นจุดสนใจของเรา LPS เป็นโมเลกุลที่มีการอักเสบสูงซึ่งเป็นส่วนประกอบของเปลือกนอกของแบคทีเรียแกรมลบทั้งหมด LPS แสดงให้เห็นว่ากระตุ้นการตายของเซลล์ในเซลล์และเนื้อเยื่อต่างๆ เช่น มาโครฟาจ [54] เซลล์บุผนังหลอดเลือด [55] และปอดของหนูเมาส์ [56] การทดลองเบื้องต้นได้แสดงให้เห็นว่าการได้รับ LPS ที่ความเข้มข้นปกติที่ 0.1 มก./มล. เป็นเวลา 24 ชั่วโมงทำให้เกิดการตายของเซลล์เม็ดเลือดแดงจาก M. coruscus อย่างมีนัยสำคัญ หลังจาก McIL-17-3 มีการแสดงออกมากเกินไป ระดับการตายของเซลล์ของเม็ดเลือดแดง M. coruscus เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม ซึ่งบ่งชี้ว่า McIL-17-3 อาจทำให้การตายของเซลล์เม็ดเลือดแดงที่เกิดจาก LPS ดีขึ้นใน M. coruscus ผลลัพธ์ในปัจจุบันสอดคล้องกับการศึกษาก่อนหน้านี้บางส่วน ในนิวโทรฟิลของมนุษย์ IL-17A สามารถลดผลการต่อต้านการตายของเซลล์ที่เกิดจากปัจจัยกระตุ้นกลุ่มมาโครฟาจของแกรนูโลไซต์ [57] IL-17 ทำให้เกิดการตายของเซลล์บุผนังหลอดเลือดในหลอดเลือด ซึ่งเป็นกลไกที่เป็นไปได้ของโรคหลอดเลือดหัวใจเฉียบพลัน [58] การลบล้างทางพันธุกรรมของ IL-17A ช่วยลดการตายของเซลล์ถุงลมประเภท II และบรรเทาอาการโรคปอดอุดกั้นเรื้อรัง [59] อย่างไรก็ตาม ยังมีข้อโต้แย้งที่ขัดแย้งกันอยู่บ้าง เมื่อหนูติดเชื้อไวรัสไข้สมองอักเสบในหนูของ Theiler IL-6 และ IL-17 จะส่งเสริมการคงอยู่ของไวรัสด้วยการยับยั้งการตายของเซลล์ [60] ข้อขัดแย้งเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่ากลไกพื้นฐานของการตายของเซลล์ที่เป็นสื่อกลางของ IL-17- นั้นซับซ้อน และ IL{34}} อาจทำหน้าที่ตรงกันข้าม ขึ้นอยู่กับประเภทของการติดเชื้อ
เมื่อ McIL-17-3 ถูกทรานส์เฟกร่วมกับ Mc-novel_miR_145 ระดับของการตายของเซลล์ที่เกิดจาก LPS นั้นมีการควบคุมลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับ McIL{6}} เพียงตัวเดียวที่ถูกทรานส์เฟก ตามลำดับ ระดับการตายของเซลล์ได้รับการควบคุมอย่างมีนัยสำคัญหลังจากที่ McIL-17-3 ได้รับการทรานส์เฟกร่วมกับตัวยับยั้ง Mc-novel_miR_145 Mc-novel_miR_145 แสดงให้เห็นว่าควบคุม McIL-17-3 ในเชิงลบ ดังนั้นเราจึงสรุปได้ว่า McIL-17-3 ทำให้การตายของเซลล์เม็ดเลือดแดงที่เกิดจาก LPS รุนแรงขึ้น ในขณะที่ Mc-novel _miR_145 บรรเทาผลกระทบ miRNA หลายตัวที่แสดงให้เห็นว่าเกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ของมนุษย์และเมาส์ถูกระบุในหอยในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา ตัวอย่างเช่น พบ miR-125b และ miR- 335 ในหอยนางรม Ostrea edulis [21] พบ miR-184 ในเซลล์เม็ดเลือดของหอยนางรม Crassostrea gigas [23] และ miR{{ พบเชื้อ 26}}, -29, -96, -182 และ -193 ในระบบประสาทส่วนกลางที่สร้างใหม่ของ L. stagnalis [25] miRNA ที่เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์เหล่านี้ระบุผ่านการเรียงลำดับปริมาณงานสูงและการคำนวณทางชีววิทยายืนยันการมีอยู่ของการตายของเซลล์ที่เป็นสื่อกลาง miRNA ในหอย เฉินและคณะ รายงานการควบคุม miR-2d ที่เพิ่มขึ้นหลังจากการท้าทายของเชื้อ Vibrio splendidus ในเซลล์เม็ดเลือดของ Crassostrea gigas การแสดงออกที่มากเกินไปของ miR-2d มีความสัมพันธ์กับการแสดงออกของ IκB2 ที่ลดลง และการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในอัตราการทำลายเซลล์ของเม็ดเลือดแดง ซึ่งเชื่อมโยงกับการยับยั้งการตายของเซลล์ [31] ผลลัพธ์สอดคล้องกับการศึกษาในปัจจุบันของเรา โดยรวม ดูเหมือนว่าจะบอกเป็นนัยว่า miRNA ออกแรงทำหน้าที่ยับยั้งการตายของเซลล์ในหอย ในความเป็นจริง miRNA ที่เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ส่วนใหญ่ในมนุษย์ได้แสดงผลการยับยั้งการตายของเซลล์ MiR -146 ปกป้องเซลล์ A549 และ H1975 จากการตายของเซลล์และการบาดเจ็บจากการอักเสบที่เกิดจาก LPS ผ่าน Sirt1 ที่ควบคุมขึ้นซึ่งจะปิดกั้นเส้นทาง NF-κBและ Notch [61] นอกจากนี้ miR{50}} ยังลดการตายของเซลล์ตับที่เกิดจากรังสีและ LPS ผ่านการยับยั้งวิถี TLR4 [62] MiR-93 ยับยั้งการตายของเซลล์คอนโดในโรคข้อเข่าเสื่อมโดยการกำหนดเป้าหมายเส้นทางการส่งสัญญาณ TLR4/NF-κB [63] MiR-129-5p บรรเทาอาการบาดเจ็บที่ไขสันหลังในหนูด้วยการยับยั้งการตายของเซลล์ผ่านวิถีทาง HMGB1/TLR4/NF-κB [64] อย่างไรก็ตาม ยังมี miRNA บางตัวที่แสดงการเสริมแรงต่อการตายของเซลล์ ตัวอย่างเช่น พบว่า miR-203 ช่วยเร่งการตายของเซลล์ที่เกิดจาก LPS โดยการกำหนดเป้าหมาย PIK3CA ในเซลล์เยื่อบุผิวในถุงลม [65] ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นถึงความซับซ้อนของกลไกพื้นฐานของการตายของเซลล์แบบอะพอพโทซิสที่ใช้ miRNA
4. วัสดุและวิธีการ
4.1. การออกแบบการทดลอง
ประการแรก McIL-17-3 ได้รับการระบุและจำแนกลักษณะจาก M. coruscus ผ่านการวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศ ต่อจากนี้ การกระจายตัวของเนื้อเยื่อของสำเนา McIL-17-3 รวมถึงการตอบสนองต่อความท้าทายของแบคทีเรียได้รับการประเมินโดยการตรวจวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ (qPCR) ต่อไป ความสัมพันธ์ระหว่าง McIL-17-3 และ Mc-novel_miR_145 ถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์ลูซิเฟอร์เรสรีพอร์ตเตอร์ที่ดำเนินการในเซลล์ HEK293 และ M. coruscus hemocytes นอกจากนี้ บทบาทหน้าที่ของพวกมันในการตายของเซลล์ที่เกิดจาก LPS ได้รับการประเมินโดยโฟลว์ไซโตเมทรี
4.2. น้ำทะเลเทียม
หลังจากการเติมอากาศประปาเทศบาลเป็นเวลาสามวัน ผลึกทะเลสำเร็จรูป (Haiding LTD, Ji'an, China) ก็ถูกเติมลงไป คนให้เข้ากัน และละลายจนมีความเค็ม 30‰ น้ำทะเลเทียมที่กำหนดค่าไว้จะต้องเติมอากาศเป็นเวลา 2 ชั่วโมงก่อนนำไปใช้
4.3. สัตว์
หอยแมลงภู่เปลือกหนา M. coruscus (ความยาวเปลือก 9.82 ± 0.53 ซม. ความกว้างของเปลือก 4.68 ± 0.45 ซม. น้ำหนักเปียก 71.2 ± 2.7 กรัม) ซื้อจากตลาดตงเหอ ในเมืองโจวซาน มณฑลเจ้อเจียง ประเทศจีน หอยแมลงภู่ทั้งหมดถูกเก็บไว้ในถังที่เต็มไปด้วย ASW ประมาณ 25 ◦C และความเค็ม 30‰ เป็นเวลานานกว่าหนึ่งสัปดาห์ก่อนการทดลองครั้งต่อไป
4.4. การระบุ cDNA ของ McIL-17-3
IL-17 โฮโมล็อก (McIL-17-3) อยู่ในโคลนซิลิโกจากทรานสคริปโตมแบบเต็มความยาวของ M. coruscus (หมายเลขภาคยานุวัติ: PRJNA798880, F01_การถอดเสียง_12404) ขั้นตอนการระเบิดถูกดำเนินการเพื่อทำนายลำดับกรดอะมิโน McIL-17-3 สมมุติ ตามด้วยการวิเคราะห์โดเมนเชิงฟังก์ชันด้วย SMART และการประเมินความสัมพันธ์สายวิวัฒนาการด้วย MEGA-X การจัดตำแหน่งหลายจุดดำเนินการโดยใช้ขั้นตอน ClustalW แบบจำลองและพูลของสวิสถูกนำมาใช้เพื่อทำนายโครงสร้างระดับตติยภูมิของโปรตีน McIL-17-3 ขั้นตอนโดยละเอียดเป็นไปตามการศึกษาก่อนหน้าของเรา [66]
4.5. การตรวจ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ
การตรวจ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ (qPCR) เป็นเครื่องมืออันทรงพลังสำหรับการตรวจจับและวัดระดับการแสดงออกของยีน ในที่นี้ การกระจายตัวของเนื้อเยื่อของ McIL-17-3 ได้รับการประเมินโดยใช้วิธี qPCR นอกจากนี้ qPCR ยังตรวจพบการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของ McIL{2}} mRNA ในการตอบสนองต่อการติดเชื้อแบคทีเรียอีกด้วย โปรไฟล์การกระจายเนื้อเยื่อของ McIL-17-3 ถูกกำหนดในเหงือก เสื้อคลุม ต่อมย่อยอาหาร อวัยวะสืบพันธุ์ กล้ามเนื้อแอดดักเตอร์ และเม็ดเลือดแดงโดยใช้ qPCR ที่ตั้งโปรแกรมไว้ที่ 95 ◦C เป็นเวลา 10 นาที ตามด้วย 40 รอบของ 95 °C เป็นเวลา 10 วินาที, 60 °C เป็นเวลา 45 วินาที เนื้อเยื่อเหล่านี้ถูกผ่าออกจากหอยแมลงภู่เก้าตัวและรวมเข้าด้วยกันเพื่อบรรเทาความแตกต่างของแต่ละบุคคล ในการทดลองท้าทายแบคทีเรีย มีการใช้ V. alginolyticus ที่มีชีวิตเป็นตัวกระตุ้นภูมิคุ้มกัน แบคทีเรีย 100 µL ที่ละลายในน้ำทะเล (1 × 108 CFU mL−1 ) ถูกฉีดเข้าไปใน adductor ของหอยแมลงภู่ ไม่มีการใช้หอยแมลงภู่ฉีดเป็นตัวควบคุม หอยแมลงภู่เก้าตัวถูกสุ่มตัวอย่างจากแต่ละกลุ่มที่ 0, 3, 6, 12, 24 และ 36 ชั่วโมงหลังความท้าทาย (hpc) เม็ดเลือดแดงจากหอยแมลงภู่สามตัวถูกรวมเข้าด้วยกันเพื่อให้ถือเป็นหนึ่งตัวอย่าง และมีสามตัวอย่างสำหรับแต่ละช่วงเวลา MicroRNAs ถูกสกัดโดยใช้ miRNA Extraction Kit (HaiGENE, Cat. No.: B1802) และ cDNA ถูกสังเคราะห์โดยใช้ miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit (Tiangen, Cat. No.: 4992786) และ qPCR ดำเนินการโดยใช้ ชุด miRcute Plus miRNA qPCR (Tiangen, Cat. No.: 4992887) ยีน U6 และ -actin ถูกใช้เป็นข้อมูลอ้างอิงภายในสำหรับ qPCR และ miRNAs qPCR ตามลำดับ คู่ไพรเมอร์เฉพาะที่ใช้ในการทดลองนี้แสดงอยู่ในตารางที่ 1 ระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ถูกวัดโดยใช้วิธี 2−∆∆Ct [67]
ตารางที่ 1. คู่ไพรเมอร์ PCR ถูกนำมาใช้ในการศึกษานี้
4.6. การเพาะเลี้ยงเซลล์
เซลล์ HEK293 ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม (RiboBio Ltd., กวางโจว, จีน) ถูกนำมาใช้เพื่อดำเนินการตรวจวิเคราะห์ลูซิเฟอเรสรีพอร์ตเตอร์เพื่อตรวจสอบการกระตุ้นดาวน์สตรีมโดย McIL- 17-3 เช่นเดียวกับความสัมพันธ์ระหว่าง Mc-novel_miR{{ 4}} และแมคอิล-17-3 เพาะเลี้ยงเซลล์ HEK293 ในอาหารเลี้ยงเชื้อ OPTI-MEM (GIBCO) ที่ 37 ◦C, 5% CO2 เพื่อสำรวจเพิ่มเติมเกี่ยวกับกฎระเบียบของ McIL-17-3 โดย Mc-novel_miR_145 และบทบาทการทำงานของพวกมันในการตายของเซลล์ที่เกิดจาก LPS เม็ดเลือดแดงของ M. coruscus ถูกดึงมาจากกล้ามเนื้อ adductor ของแต่ละตัว หอยแมลงภู่ที่มีเข็มแบบใช้แล้วทิ้งที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 0.5 มม. (25 กรัม) ซึ่งมีสารกันเลือดแข็งตัว 0.5 มล. เซลล์เม็ดเลือดแดงถูกรวบรวมโดยการปั่นเหวี่ยงเป็นเวลา 5 นาทีที่ 3000 รอบต่อนาที, 4 ◦C และเติมทริปซิน 0.25% (โซลาร์ไบโอ) เม็ดเลือดแดงถูกแขวนลอยในอาหารเลี้ยงเชื้อ L-15 ที่มีซีรั่มของวัวของทารกในครรภ์ 15% (โซลาร์ไบโอ) และเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 26 ◦C โดยมี CO2 5%
4.7. การสังเคราะห์ miRNA Mimic และ Inhibitor
นิวคลีโอไทด์เลียนแบบ สารยับยั้ง และการควบคุมของ Mc-novel_miR_145 ถูกแต่งโดย GenePharma (เซี่ยงไฮ้) ลำดับของพวกมันมีดังนี้: Mc-novel_miR_145 mimic, 52032- UCAGAAAAGCGCUUCGGACG-30; ตัวยับยั้ง Mc-novel_miR_145, 50 -CGUCCGAAGCG CUUUUCUGGA-30 (ดัดแปลงทางเคมีโดย 20 Ome); เลียนแบบการควบคุมเชิงลบ 50 -UUGUA CUACACAAAAGUACUG-30; และสารยับยั้งกลุ่มควบคุมเชิงลบ 50 -CAGUACUUUUGUGU AGUACAA-30 (ดัดแปลงทางเคมีโดย 20 Ome)
4.8. การวิเคราะห์นักข่าวของลูซิเฟอเรส
การทดสอบนักข่าวของลูซิเฟอเรสถูกนำมาใช้อย่างกว้างขวางเพื่อศึกษาการแสดงออกของยีนและกิจกรรมด้านกฎระเบียบ ปริมาณแสงที่สร้างขึ้นเป็นสัดส่วนกับปริมาณของเอนไซม์ลูซิเฟอเรสที่ผลิตได้ ซึ่งจะสะท้อนถึงกิจกรรมขององค์ประกอบด้านกฎระเบียบตามลำดับ จากนั้นกิจกรรมของลูซิเฟอเรสจะถูกวัดโดยใช้ลูมิโนมิเตอร์ และผลลัพธ์จะถูกวิเคราะห์และตีความเพื่อกำหนดกิจกรรมด้านกฎระเบียบขององค์ประกอบที่ศึกษา การสอบวิเคราะห์ของนักข่าวลูซิเฟอเรสถูกนำมาใช้เพื่อวิเคราะห์การกระตุ้นดาวน์สตรีมของ McIL{{0}} ในการทดลองนี้ pEGFP-McIL-17-3 พลาสมิด (0.1, 0.5 และ 1.0 µg/well) พร้อมด้วย pGLNF-κb- พลาสมิดของนักข่าว luc (0.25 ไมโครกรัม/หลุม) ถูกทรานส์เฟกร่วมไปในเซลล์ HEK293 โดยใช้ Lipo6000TM เป็นเวลา 24 ชั่วโมง พลาสมิด pEGFP-N1 เปล่าถูกใช้เป็นตัวควบคุม กิจกรรมของลูซิเฟอเรสถูกวัดโดยใช้ระบบทดสอบนักข่าวคู่-ลูซิเฟอเรส (โพรเมกา, เมดิสัน, วิสคอนซิน, สหรัฐอเมริกา) ตามข้อกำหนด โดยที่เรนิลลา ลูซิเฟอเรสใช้เป็นตัวควบคุมระหว่างกัน Mc-novel_miR_145 ที่มุ่งเป้า McIL-17-3 ยังได้รับการยืนยันโดยการสอบวิเคราะห์ของผู้รายงานลูซิเฟอเรส การคำนวณทางชีวสารสนเทศทำนายว่า Mc-novel_miR_145 สามารถกำหนดเป้าหมาย 30 -UTR ของ McIL-17-3 และต่อมาก็ทำการโคลน 30 -UTR ของ McIL{{ 29}} ลงในเวกเตอร์รีพอร์เตอร์ลูซิเฟอเรส pmiR-RB-ReportTM เพื่อสร้างพลาสมิดรีพอร์เตอร์ McIL-17-3-30 UTR-WT แบบป่า เวกเตอร์นักข่าว UTR-MUT ของ McIL{35}} ชนิดกลายพันธุ์ถูกสร้างขึ้นโดยการกลายพันธุ์นิวคลีโอไทด์ที่ตำแหน่ง 1,023–1,040: TCCGAAGCGCTTTTCTGG ถึง AGGCTTCGCGAAAGACC RNA โอลิโก (Mc-novel_miR_196 NC, mimic, NCi, inhibitor) ได้รับการแปลงสภาพพร้อมกับ McIL-17-3- 3 0 UTR-WT หรือ McIL-17-3-30 UTR-MUT เข้าไปใน HEK293 เซลล์ที่ใช้ Lipo6000TM
4.9. การแสดงออกรีคอมบิแนนท์ การทำให้บริสุทธิ์ และการเตรียมแอนติซีรัม
เพื่อประเมินผลของ Mc-novel_miR_145 ต่อการแสดงออกของโปรตีน McIL-17-3 จึงมีการเตรียมแอนติซีรัมของ McIL-17-3 แฟรกเมนต์ cDNA ที่ครอบคลุม open reading frame (ORF) ของ McIL-17-3 ถูกขยายด้วยไพรเมอร์คู่เฉพาะหนึ่งคู่ (ตารางที่ 1) และแทรกเข้าไปในเวกเตอร์ pET-32 รีคอมบิแนนท์พลาสมิด pET-32a-McIL{{10}} ถูกเปลี่ยนเป็น Escherichia coli (DE3) (Takara) และบ่มในตัวกลาง LB (ที่มี 50 mg L−1 คานามัยซิน) ที่ 37 —C โดยเขย่าที่ 130 รอบต่อนาที เป็นเวลา 4 ชั่วโมง หลังจากที่ความหนาแน่นของแสงถึงค่าการดูดกลืนแสง 0.6 ที่ 600 นาโนเมตร ไอโซโพรพิล-เบตา-D-ไทโอแลกโตปี้ภายใน (IPTG) ที่มีความเข้มข้นสุดท้ายคือ 1 มิลลิโมลาร์ถูกเติมลงในสารละลายแบคทีเรียเพื่อกระตุ้นการแสดงออกของรีคอมบิแนนท์ McIL{ โปรตีน {24}} (rMcIL-17-3) หลังจากการฟักตัวที่ 37 ◦C เป็นเวลา 6 ชั่วโมง ตัวกลางถูกปั่นแยกที่ 8000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 30 นาทีเพื่อรวบรวมแบคทีเรีย ตามด้วยสารแขวนลอยในบัฟเฟอร์ TBS (Tris-HCl 20 มิลลิโมลาร์, NaCl 150 มิลลิโมลาร์, pH 8.0) rMcIL-17-3 ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยโครมาโตกราฟีที่มีอัฟฟินิตี้ของกรดไน-ไนไตรโลไตรอะซิติก (NI-NTA) และโปรตีนที่ถูกทำให้บริสุทธิ์ถูกไดอะไลซ์ออกจากอิมิดาโซลเป็นเวลา 24 ชั่วโมง โปรตีนที่เป็นผลลัพธ์ถูกแยกออกโดยการลด 12% SDS-โพลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส (SDS-PAGE) โปรตีนบริสุทธิ์ถูก refolded ในบัฟเฟอร์กลีเซอรอลยูเรีย -TBS กลีเซอรอลไล่ระดับสี (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, กลูตาไธโอนลดลง 2 mM, กลีเซอรอล 10%, กลูตาไธโอนออกไซด์ 0.2 mM, ความเข้มข้นของยูเรียไล่ระดับที่ 6, 4, 3, 2 ยูเรีย , 1 และ 0 โมลาร์ในแต่ละเกรเดียนต์, pH 7.4, แต่ละเกรเดียนต์ที่ 4 °C เป็นเวลา 12 ชั่วโมง) จากนั้น โปรตีนที่เป็นผลลัพธ์จะถูกนำมาใช้เพื่อสร้างภูมิคุ้มกันให้กับหนูอายุ {60}} สัปดาห์เพื่อรับโพลีโคลนอล แอนติบอดี
4.10. การซับแบบตะวันตก
ตัวอย่างโปรตีนถูกสกัดจากฮีโมไซต์ด้วย RIPA lysis buffer (Beyotime) จากนั้นตรวจพบความเข้มข้นด้วยชุด BCA หลังการแยกโดย SDS-PAGE โปรตีนถูกถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF ด้วยการปิดผนึกด้วยนมผงพร่องมันเนย 5% ใน TBST (ทริส-HCl 20 มิลลิเมตร, NaCl 150 มิลลิโมลาร์, ทวีน 1%-20, pH 8.0) ตามด้วยแอนติบอดีต้านการฟักตัวของ McIL-17-3 ข้ามคืน ต่อจากนั้น เมมเบรนถูกบ่มด้วยสารละลายเจือจางของแอนติบอดี IgG ที่ต้านหนูเมาส์ของแพะและคอนจูเกตอัลคาไลน์ฟอสฟาเตส (Thermo Fisher Scientific, Cat. No.: 31324) ในบัฟเฟอร์การเจือจางแอนติบอดีทุติยภูมิ (Beyotime, P0258) เป็นเวลา 3 ชั่วโมง ในที่สุด โปรตีนอิมมูโนรีแอกทีฟถูกตรวจพบโดยระบบการตรวจจับ ECL
4.11. อะพอพโทซิส
การตายของเซลล์เม็ดเลือดแดงได้รับการประเมินโดยใช้โฟลว์ไซโตเมทรีตามคู่มือของชุดตรวจการตายของเซลล์ FITC-Annexin-V (Beyotime) โดยสรุป เม็ดเลือดแดงที่รวบรวมไว้ได้รับการบำบัดเป็นเวลา 24 ชั่วโมงด้วย LPS (0.1 มก./มล.), พลาสมิด pEGFP-McIL-17-3 20 นาโนโมลาร์, Mc โนเวล_miR{{9} } เลียนแบบ และตัวยับยั้ง Mc-novel_miR_145 หลังจากการล้างด้วย PBS เซลล์จะถูกแขวนลอยอีกครั้งในตัวกลาง L15 ที่ความเข้มข้นสุดท้ายที่ 1 × 106 เซลล์ มล. − 1 และถูกย้อมด้วย FITC-Annexin-V และ PI โดยการบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 25 นาทีในที่มืด . ในที่สุด เครื่องมือโฟลว์ไซโตเมทรี (Beckman CytoFLEX FCM) ถูกใช้เพื่อตรวจหาการตายของเซลล์ และวิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ซอฟต์แวร์ FlowJoTM 10 4.12. การวิเคราะห์ทางสถิติ ผลการทดลองนำเสนอเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) ผลลัพธ์ได้รับการประมวลผลโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองทางของความแปรปรวนด้วยการทดสอบการเปรียบเทียบหลายรายการของ Tukey และใช้ซอฟต์แวร์ Origin2021 เพื่อวิเคราะห์ข้อมูลและสร้างตัวเลข
cistanche พืชเพิ่มระบบภูมิคุ้มกัน
5. สรุปผลการวิจัย
ในการศึกษานี้ IL-17 โฮโมล็อกชนิดใหม่ McIL-17-3 ได้รับการระบุจาก M. coruscus และพบว่ามีบทบาทสำคัญในการป้องกันภูมิคุ้มกันของหอยจากการโจมตีของแบคทีเรีย ยิ่งไปกว่านั้น มันถูกค้นพบว่า McIL-17-3 ถูกควบคุมเชิงลบโดย Mc-novel_miR_145 ซึ่งมีส่วนในการมีส่วนร่วมในการตายของเซลล์ที่เกิดจาก LPS ผลการศึกษานี้ให้ข้อมูลเชิงลึกที่มีคุณค่าเกี่ยวกับบทบาทด้านกฎระเบียบของ IL-17 ในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของหอยแมลงภู่ และเน้นย้ำถึงศักยภาพของ RNA ที่ไม่เข้ารหัสในการควบคุมกลไกการป้องกันภูมิคุ้มกันที่ไม่มีกระดูกสันหลัง อย่างไรก็ตาม สิ่งสำคัญคือต้องทราบว่ามีข้อจำกัดบางประการในการศึกษานี้ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง กลไกที่เป็นพื้นฐานของโหมดการทำงานของ McIL-17-3 ไม่ได้รับการศึกษา และจำเป็นต้องมีการตรวจสอบเพิ่มเติม นอกจากนี้ การศึกษานี้มุ่งเน้นไปที่ปฏิสัมพันธ์ระหว่าง Mc-novel_miR_145 และ McIL-17-3 เท่านั้น และไม่ได้สำรวจความเกี่ยวข้องที่เป็นไปได้ของ miRNA อื่นๆ ในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน โดยรวมแล้ว การศึกษาครั้งนี้เน้นย้ำถึงบทบาทที่สำคัญของการไม่เข้ารหัส RNA ในกลไกการป้องกันภูมิคุ้มกัน และชี้ให้เห็นว่าการปรับค่าเหล่านี้สามารถใช้เป็นกลยุทธ์ที่มีศักยภาพในการรักษาโรคต่างๆ แบบกำหนดเป้าหมาย
อ้างอิง
1. เมดซิตอฟ ร.; Janeway, C., Jr. ภูมิคุ้มกันโดยกำเนิด น. ภาษาอังกฤษ เจ.เมด. 2000, 343, 338–344. [CrossRef] [PubMed]
2. เลซี่ พี.; Stow, JL Cytokine ปล่อยจากเซลล์ภูมิคุ้มกันโดยกำเนิด: เชื่อมโยงกับเส้นทางการค้ามนุษย์เมมเบรนที่หลากหลาย บลัด เจ.แอม สังคมสงเคราะห์ เฮมาทอล 2011, 118, 9–18. [CrossRef] [PubMed]
3. Dinarello, CA โปรอักเสบไซโตไคน์ อก 2000, 118, 503–508 [CrossRef] [PubMed]
4. เราตา ประชาสัมพันธ์; นายัค บ.; Das, S. ระบบภูมิคุ้มกันและการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันในปลาและบทบาทในการศึกษาภูมิคุ้มกันเชิงเปรียบเทียบ: แบบจำลองสำหรับสิ่งมีชีวิตที่สูงขึ้น อิมมูนอล. เล็ตต์ 2012, 148, 23–33. [ครอสอ้างอิง]
5. ไฮโมวิทซ์, สิงคโปร์; ฟิลวารอฟ, EH; หยินเจ.; ลีเจ.; ไค, ล.; ไรเซอร์ พี.; ม.มารุโอกะ.; เหมาว.; ฟอสเตอร์ เจ.; เคลลีย์, RF IL-17 ใช้รอยพับของปมซีสตีน: โครงสร้างและกิจกรรมของไซโตไคน์ชนิดใหม่, IL-17F และผลกระทบต่อการจับตัวรับ EMBO เจ. 2001, 20, 5332–5341. [ครอสอ้างอิง]
6. บัคลีย์ กม.; โฮ อีซีเอช; ฮิบิโนะ ต.; ชรันเคล, ซีเอส; ชูห์, นอร์ทเวสต์; วัง GZ; ปัจจัย Rast, JP IL17 เป็นตัวควบคุมขั้นต้นในเยื่อบุผิวในลำไส้ในระหว่างการตอบสนองต่อการอักเสบต่อ Vibrio ในตัวอ่อนของเม่นทะเล อีไลฟ์ 2017, 6, e23481. [ครอสอ้างอิง]
7. เชา ดีเจ; Tato, CM Innate IL-17-สร้างเซลล์: ผู้พิทักษ์ของระบบภูมิคุ้มกัน แนท. สาธุคุณอิมมูนอล. 2010, 10, 479–489. [ครอสอ้างอิง]
8. Mills, KH IL-17 และ IL-17-ผลิตเซลล์ในด้านการป้องกันเทียบกับพยาธิวิทยา แนท. สาธุคุณอิมมูนอล. 2022, 10, 479–489. [ครอสอ้างอิง]
9. ฮิบิโนะ ต.; โลซา-คอล ม.; เมสสิเออร์, ค.; มาเจสเก้, เอเจ; โคเฮน, อาห์; เทอร์วิลลิเกอร์ DP; บัคลีย์, กม.; บร็อคตัน, วี.; แนร์, เอสวี; Berney, K. รายการยีนภูมิคุ้มกันถูกเข้ารหัสในจีโนมเม่นทะเลสีม่วง นักพัฒนา ไบโอล 2549, 300, 349–365. [ครอสอ้างอิง]
10. อัลแบร์ติน ซีบี; ซิมาคอฟ โอ.; มิทรอส, ต.; วัง จีดี; ปุนกอร์ เจอาร์; เอดซิงเงอร์-กอนซาเลส อี.; เบรนเนอร์ ส.; แรกส์เดล, CW; Rokhsar, DS จีโนมปลาหมึกยักษ์และวิวัฒนาการของความแปลกใหม่เกี่ยวกับระบบประสาทและสัณฐานวิทยาของปลาหมึก ธรรมชาติ 2015, 524, 220–224. [ครอสอ้างอิง]
11. ซาโก้ อ.; เรย์-กัมโปส ม.; โรซานี สหรัฐ.; โนโวอา บ.; Figueras, A. วิวัฒนาการและความหลากหลายของอินเตอร์ลิวคิน-17 เน้นย้ำถึงการขยายตัวในสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังในทะเล และบทบาทที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้ในการสร้างภูมิคุ้มกันของเยื่อเมือก ด้านหน้า. อิมมูนอล. 2021, 12, 692997. [CrossRef] [PubMed]
12. เกอร์โดล ม.; โมเรรา ร.; ครูซ เอฟ.; โกเมซ-การ์ริโด้ เจ.; วลาโซวา, อ.; โรซานี สหรัฐ.; วีเนียร์ ป.; นารันโจ-ออร์ติซ, แมสซาชูเซตส์; เมอร์กาเรลลา ม.; Greco, S. ความแปรผันของการมีอยู่และขาดยีนจำนวนมากทำให้เกิดจีโนมแพนแบบเปิดในหอยแมลงภู่เมดิเตอร์เรเนียน จีโนมไบโอล 2020, 21, 1–21. [ครอสอ้างอิง]
13. เฉา ย.; หยาง ส.; เฟิง ค.; ซาน ว.; เจิ้ง ซ.; วังคิว.; เติ้ง ย.; เจียว ย.; Du, X. วิวัฒนาการและการวิเคราะห์การทำงานของยีนอินเตอร์ลิวคิน-17 จาก Pinctada fucata martensii ปลา หอย อิมมูนอล. 2019, 88, 102–110. [CrossRef] [PubMed]
14. วัง คิว.; เซียว ก.; กอด.; เฉินร.; หลี่ ม.; Teng, S. Interleukin-17D เป็นสื่อกลางในการเปลี่ยนแปลงที่เกี่ยวข้องกับการติดเชื้อ Vibrio harveyi ใน Tegillarca granulosa ผ่านการกระตุ้นของโปรตีนกระตุ้น 1 ในร่างกาย การเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ 2023, 566, 739178. [CrossRef]
15. เลเวล, X.; ซัน เจ.; หลี่ย.; หยาง ว.; วัง, ล.; เล้ง เจ.; ยัน เอ็กซ์.; กัว ซ.; หยางคิว.; Wang, L. CgIL17-5 ควบคุมการแสดงออกของ mRNA ของเอฟเฟกต์ภูมิคุ้มกันผ่านการกระตุ้นฟอสโฟรีเลชั่นของ CgMAPK และการเคลื่อนย้ายทางนิวเคลียร์ของ CgRel และ CgAP-1 ในหอยนางรม Crassostrea gigas ในมหาสมุทรแปซิฟิก นักพัฒนา คอมพ์ อิมมูนอล. 2022, 127, 104263. [CrossRef] [PubMed]
16. วัง ล.; ซัน เจ.; วูซ.; เหลียน เอ็กซ์.; ฮัน ส.; หวาง ส.; ยางค.; วัง, ล.; Song, L. AP-1 ควบคุมการแสดงออกของ IL17-4 และ IL17-5 ในหอยนางรม Crassostrea gigas ในมหาสมุทรแปซิฟิก ปลา หอย อิมมูนอล. 2020, 97, 554–563. [ครอสอ้างอิง]
17. วู ส.-ซ.; หวง X.-D.; หลี่คิว.; เขา ม.-เอ็กซ์. อินเตอร์ลิวคิน-17 ในหอยมุก (Pinctada fucata): การโคลนระดับโมเลกุลและการแสดงคุณลักษณะเฉพาะเชิงฟังก์ชัน ปลา หอย อิมมูนอล. 2013, 34, 1050–1056. [ครอสอ้างอิง]
18. ซิน ล.; จางฮ.; จางร.; หลี่ฮ.; วังว.; วัง, ล.; วัง, เอช.; ชิว ล.; Song, L. CgIL17-5 ซึ่งเป็นไซโตไคน์อักเสบที่มีมาแต่โบราณใน Crassostrea gigas ซึ่งแสดงการทำงานของความหลากหลายเมื่อเปรียบเทียบกับโมเลกุลของ interleukin17 ที่มีกระดูกสันหลัง นักพัฒนา คอมพ์ อิมมูนอล. 2015, 53, 339–348. [ครอสอ้างอิง]
19. เดนลี AM; ท็อปส์ บีบี; พลาสเตอร์ RH; เคททิง RF; Hannon, GJ การประมวลผล microRNA หลักโดยไมโครโปรเซสเซอร์คอมเพล็กซ์ ธรรมชาติ 2004, 432, 231–235. [ครอสอ้างอิง]
20. ข่าน ดี.; Ansar Ahmed, S. กฎระเบียบของ IL-17 ในโรคแพ้ภูมิตนเองโดยปัจจัยการถอดรหัสและ microRNA ด้านหน้า. เจเนท. 2015, 6, 236. [CrossRef]
21. มาร์ติน-โกเมซ, ล.; วิลลาลบา, อ.; เคอร์โคเฟน RH; Apollo, E. บทบาทของ microRNAs ในกระบวนการสร้างภูมิคุ้มกันของหอยนางรม Ostrea edulis แบบแบนต่อการเกิด miosis ติดเชื้อ เจเนท. อีโวล 2014, 27, 40–50. [CrossRef] [PubMed]
22. ซู่ ฟ.; วังเอ็กซ์.; เฟิง ย.; หวางว.; วังว.; หลี่ ล.; ฝาง เอ็กซ์.; คิวเอช.; Zhang, G. การจำแนก microRNAs ที่ได้รับการอนุรักษ์และแปลกใหม่ในหอยนางรม Crassostrea gigas ในมหาสมุทรแปซิฟิกโดยการจัดลำดับเชิงลึก โปรดหนึ่ง 2014, 9, e104371 [ครอสอ้างอิง]
23. โจว ซ.; วัง, ล.; ซ่ง ล.; หลิวร.; จางฮ.; หวาง ม.; Chen, H. การจำแนกและลักษณะของ microRNAs ที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันในเม็ดเลือดแดงของหอยนางรม Crassostrea gigas โปรดหนึ่ง 2014, 9, e88397 [CrossRef] [PubMed]
24. บูร์โกส-อาเซเวส รัฐแมสซาชูเซตส์; โคเฮน, อ.; สมิธ ย.; Faggio, C. การควบคุม microRNA ที่เป็นไปได้ของยีนที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันในเม็ดเลือดแดงที่ไม่มีกระดูกสันหลัง วิทยาศาสตร์ สภาพแวดล้อมโดยรวม 2018, 621, 302–307. [ครอสอ้างอิง]
25. วอล์คเกอร์ เซาท์อีสต์; สเปนเซอร์, จีอี; เนคาคอฟ, อ.; Carlone, RL การจำแนกและจำแนกลักษณะของ microRNAs ในระหว่างการสร้างระบบประสาทส่วนกลางของหอยด้วยกรดเรติโนอิก นานาชาติ เจ. โมล. วิทยาศาสตร์ 2018, 19, 2741. [CrossRef] [PubMed]
26. อาโบ-อัล-เอลา, เอชจี; Faggio, C. การตอบสนองต่อความเครียดที่ใช้สื่อกลาง MicroRNA ในสายพันธุ์หอยสองฝา อีโคท็อกซิคอล สภาพแวดล้อม ซาฟ. 2021, 208, 111442. [CrossRef] [PubMed]
27. หวาง ส.; โยชิทาเกะ, เค.; อาซาดุซซามาน ม.; คิโนชิตะ ส.; วาตานาเบะ ส.; Asakawa, S. การค้นพบและความเข้าใจเกี่ยวกับการทำงานของ miRNA ในหอย: วิธีการจัดทำโปรไฟล์ทั่วทั้งจีโนม อาร์เอ็นเอ ไบโอล 2021, 18, 1702–1715. [ครอสอ้างอิง]
28. โรซานี ม.; บอร์โตเลตโต อี.; ใบ ช.-ม.; โนโวอา บ.; ฟิเกอรัส, อ.; วีเนียร์ ป.; ฟรอมม์ บี. ขุดลงไปใน miRNAomes หอยสองฝา: ระหว่างการอนุรักษ์และนวัตกรรม ฟิลอส. ทรานส์ ร.ซ. B 2021, 376, 20200165. [CrossRef]
29. ซัน เอ็กซ์.; จาง ต.; หลี่ ล.; ตู่ ก.; ยูท.; วูบ.; โจว ล.; เทียน เจ.; Liu, Z. MicroRNA แสดงออกถึงลายเซ็นในกล้ามเนื้อ adductor ที่มีโครงร่างและเรียบของ Yesso scallop Patinopecten yessoensis จีโนมิกส์ 2022, 114, 110409. [CrossRef]
30. ร.เทียน.; เจิ้ง ซ.; หวางร.; เจียว ย.; Du, X. miR-29มีส่วนร่วมในการก่อตัวของเนเคอร์และการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยกำหนดเป้าหมาย Y2R ใน Pinctada martensii นานาชาติ เจ. โมล. วิทยาศาสตร์ 2015, 16, 29436–29445. [ครอสอ้างอิง]
31. เฉิน ฮ.; โจว ซ.; วัง, เอช.; วัง, ล.; วังว.; หลิวร.; ชิว ล.; เพลง, L. microRNA ที่จำเพาะต่อสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังและตอบสนองต่อระบบภูมิคุ้มกันช่วยเพิ่ม phagocytosis ของเม็ดเลือดแดงของหอยนางรมโดยกำหนดเป้าหมายไปที่CgIκB2 วิทยาศาสตร์ ตัวแทน 2016, 6, 1–10 [CrossRef] [PubMed]
32. เฉิน ฮ.; โจว ซ.; วัง, ล.; วัง, เอช.; หลิวร.; จางฮ.; Song, L. miRNA เฉพาะที่ไม่มีกระดูกสันหลังมุ่งเป้าไปที่ระบบประสาทต่อมไร้ท่อ cholinergic โบราณของหอยนางรม เปิดไบโอล 2016, 6, 160059. [CrossRef]
33. เฉิน ฮ.; ซิน, ล.; ซอง, เอ็กซ์.; วัง, ล.; วังว.; หลิว ซ.; จางฮ.; วัง, ล.; โจว ซ.; Qiu, L. miRNA ที่ตอบสนองต่อ norepinephrine ส่งเสริมการแสดงออกของ CgHSP90AA1 โดยตรงในเซลล์เม็ดเลือดหอยนางรมในระหว่างการผึ่งให้แห้ง ปลา หอย อิมมูนอล. 2017, 64, 297–307. [CrossRef] [PubMed]
34. ฮัน ซ.; หลี่เจ.; วังว.; หลี่เจ.; จ้าวคิว.; หลี่ ม.; วัง, ล.; ซอง แอล. คาลโมดูลินที่กำหนดเป้าหมายโดยโครงสร้าง miRNA659_26519 ควบคุมการแสดงออกของ IL-17 ในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันในระยะเริ่มต้นของหอยนางรม Crassostrea gigas นักพัฒนา คอมพ์ อิมมูนอล. 2021, 124, 104180. [CrossRef] [PubMed]
35. เลเวลซ.; หลี่ ค.; จาง ป.; วังซ.; จาง ว.; จิน ซี.-เอช. miR -200 ปรับกิจกรรมต้านเชื้อแบคทีเรียของโคโลโมไซต์และการเตรียม LPS ผ่านการกำหนดเป้าหมาย Tollip ใน Apostichopus japonicus ปลา หอย อิมมูนอล. 2015, 45, 431–436. [ครอสอ้างอิง]
36. หลี่ ค.; จ้าว ม.; จาง ค.; จาง ว.; จ้าวเอ็กซ์.; ด้วน เอ็กซ์.; Xu, W. miR210 ปรับการระเบิดของระบบทางเดินหายใจใน Apostichopus japonicus coelomocytes ผ่านการกำหนดเป้าหมายตัวรับที่มีลักษณะคล้ายค่าผ่านทาง นักพัฒนา คอมพ์ อิมมูนอล. 2016, 65, 377–381. [ครอสอ้างอิง]
37. เลเวล ม.; เฉิน เอช.; เชา ย.; หลี่ ค.; จาง ว.; จ้าวเอ็กซ์.; จิน, ค.; Xiong, J. miR-92a ควบคุมการตายของเซลล์ซีโลโมไซต์ในปลิงทะเล Apostichopus japonicus ผ่านการกำหนดเป้าหมาย Aj14-3-3ζ ในร่างกาย ปลา หอย อิมมูนอล. 2017, 69, 211–217. [ครอสอ้างอิง]
38. เชา ย.; หลี่ ค.; ซู ว.; จาง ป.; จาง ว.; Zhao, X. miR-31 เชื่อมโยงการเผาผลาญไขมันและการตายของเซลล์ใน Apostichopus japonicus ที่ถูกท้าทายจากแบคทีเรีย ผ่านการกำหนดเป้าหมาย CTRP9 ด้านหน้า. อิมมูนอล. 2017, 8, 263. [CrossRef]
39. กัว ม.; วังย.; ฟู่เอ็กซ์.; เต่าว.; Li, C. circRNA1149 จาก Apostichopus japonicus ยับยั้งการตายของเซลล์ coelomocyte ที่ทำหน้าที่เป็น miR -92 ฟองน้ำเพื่อควบคุมการแสดงออกของ Bax เพื่อตอบสนองต่อการติดเชื้อ Vibrio splendidus การเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ 2023, 562, 738812. [CrossRef]
40. ซูโอ ฮ.; เวง ก.; หลัว ม.; หยาง ล.; เวง ส.; เขาเจ.; Xu, X. A MicroRNA-1–การยับยั้งแบบสื่อกลางของเส้นทาง NF-κB โดยเส้นทาง JAK-STAT ใน vannamei Litopenaeus ที่ไม่มีกระดูกสันหลัง เจ. อิมมูนอล. 2020, 204, 2918–2930. [ครอสอ้างอิง]
41. หยาง เอช.; ซู่ซ.; กัว บ.; จางเอ็กซ์.; เหลียว ซ.; ฉี ป.; Yan, X. การวิเคราะห์แบบบูรณาการของ miRNAome และ transcriptome เผยให้เห็นการควบคุมเครือข่าย miRNA-mRNA ใน Vibrio alginolyticus ที่ติดเชื้อหอยแมลงภู่ Mytilus coruscus โมล อิมมูนอล. 2021, 132, 217–226. [CrossRef] [PubMed]
42. เด โมราเลส, JMGR; ปุยจ์ ล.; เดาเดน อี.; กาเญเต, JD; ปาโบลส เจแอล; มาร์ติน AO; ฮวนนาเตย์, CG; อาดัน, อ.; มอนตาลบาน, X.; Borruel, N. บทบาทที่สำคัญของ interleukin (IL)-17 ในความผิดปกติของการอักเสบและภูมิคุ้มกัน: การทบทวนหลักฐานที่อัปเดตซึ่งเน้นไปที่ข้อโต้แย้ง แพ้ภูมิตัวเอง ฉบับที่ 2020, 19, 102429. [CrossRef] [PubMed]
43. คาวากุจิ ม.; อาดาจิ ม.; โอดะ น.; โคคุบุ ฟ.; หวง เอส.-เค. IL-17 แฟมิลีไซโตไคน์ เจ.คลินิกภูมิแพ้. อิมมูนอล. 2004, 114, 1265–1273. [CrossRef] [PubMed]
44. สตาร์เนส ต.; บรอกซ์เมเยอร์ ฯพณฯ; โรเบิร์ตสัน, เอ็มเจ; Hromas, R. ความล้ำหน้า: IL-17D ซึ่งเป็นสมาชิกใหม่ของตระกูล IL-17 ช่วยกระตุ้นการผลิตไซโตไคน์และยับยั้งการสร้างเม็ดเลือด เจ. อิมมูนอล. 2002, 169, 642–646. [CrossRef] [PubMed]
45. กัฟเฟน SL; เครเมอร์, เจเอ็ม; เจฟฟรี่ เจวายวาย; เชน เอฟ ตระกูลไซโตไคน์ของ IL-17 วิตามิน. ฮอม. 2549, 74, 255–282. [ผับเมด]
46. โรเบิร์ตส์ ส.; เกอเก็น, ย.; เดอ ลอร์เจอริล เจ.; Goetz, F. การสะสมอย่างรวดเร็วของ interleukin 17 homolog transcript ใน Crassostrea gigas hemocytes หลังจากได้รับแบคทีเรีย นักพัฒนา คอมพ์ อิมมูนอล. 2008, 32, 1099–1104. [CrossRef] [PubMed]
47. หลี่ เจ.; จาง ย.; จาง ย.; เซียง ซ.; ตงย.; คูฟ.; Yu, Z. การวิเคราะห์ลักษณะทางพันธุกรรมและการแสดงออกของยีน IL-17 ใหม่ 5 ยีนในหอยนางรมแปซิฟิก Crassostrea gigas ปลา หอย อิมมูนอล. 2014, 40, 455–465. [ครอสอ้างอิง]
48. กัฟเฟน โครงสร้าง SL และการส่งสัญญาณในตระกูลตัวรับ IL-17 แนท. สาธุคุณอิมมูนอล. 2009, 9, 556–567. [ครอสอ้างอิง]
49. ฮาตะ, ก.; อันโด, อ.; ชิมาดะ ม.; ฟูจิโนะ ส.; แบมบา ส.; อารากิ ย.; โอคุโนะ ต.; ฟูจิยามะ ย.; Bamba, T. IL-17 กระตุ้นการตอบสนองต่อการอักเสบผ่านทางวิถี NF-κB และ MAP ไคเนสในไมโอไฟโบรบลาสต์ในลำไส้ของมนุษย์ เช้า. เจ. ฟิสิออล. -ระบบทางเดินอาหาร ตับฟิสิออล 2002, 282, G1035–G1044 [ครอสอ้างอิง]
50. นิโมโตะ ต.; นากาสะ ต.; อิชิกาวะ ม.; โอคุฮาระ, อ.; อิซึมิ บ.; ดีม.; ซูซูกิ โอ.; น.อาดาจิ.; โอชิ, เอ็ม. ไมโครอาร์เอ็นเอ-146แสดงออกในอินเตอร์ลิวคิน-17 ที่สร้างทีเซลล์ในผู้ป่วยโรคข้ออักเสบรูมาตอยด์ BMC กล้ามเนื้อและกระดูก. ความไม่ลงรอยกัน 2010, 11, 1–11. [ครอสอ้างอิง]
51. อ.ศรีวัสทวา.; นิคาโมะ ป.; ว.ว. โลหะเจริญคาล.; หลี่ ด.; ไมส์เกน เอฟ.; ลันเดน, NX; สโตห์เล ม.; ปิวาร์ซี, อ.; Sonkoly, E. MicroRNA- 146a ยับยั้งการอักเสบของผิวหนังที่เป็นสื่อกลางของ IL-17 และมีความเกี่ยวข้องทางพันธุกรรมกับโรคสะเก็ดเงิน เจ.คลินิกภูมิแพ้. อิมมูนอล. 2017, 139, 550–561. [CrossRef] [PubMed]
52. จ้าว ส.; เฉิง ย.; Kim, JG microRNA-146a ปรับลด IL-17 และ IL-35 และยับยั้งการแพร่กระจายของเซลล์ต้นกำเนิดจากเอ็นปริทันต์ของมนุษย์ เจเซลล์. ไบโอเคม 2019, 120, 13861–13866. [CrossRef] [PubMed]
53. พอดเซียด อ.; สแตนดิฟอร์ด, ทีเจ; บัลลิงเกอร์, มินนิโซตา; เอคิน ร.; ปาร์ค ป.; คุนเคล, SL; มัวร์ บีบี; Bhan, U. MicroRNA-155 ควบคุมการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของโฮสต์ต่อโรคปอดบวมจากแบคทีเรียหลังไวรัสผ่านทางวิถี IL-23/IL-17 เช้า. เจ. ฟิสิออล. -เซลล์ปอด โมล ฟิสิออล. 2016, 310, L465–L475. [ครอสอ้างอิง]
54. เซาส์ เจ.; โคมาลาดา ม.; บาเลดอร์, เอเอฟ; โลเบรัส เจ.; โลเปซ-โซเรียโน เอฟ.; อาร์จิเลส, เจเอ็ม; บ็อกดาน, ค.; Celada, A. LPS ทำให้เกิดการตายของเซลล์ในแมคโครฟาจส่วนใหญ่ผ่านการผลิต autocrine ของ TNF- บลัด เจ.แอม สังคมสงเคราะห์ เฮมาทอล 2000, 95, 3823–3831.
55. แบนเนอร์แมน DD; Goldblum, SE กลไกของการตายของเซลล์บุผนังหลอดเลือดที่เกิดจากไลโปโพลีแซ็กคาไรด์จากแบคทีเรีย เช้า. เจ.ฟิสิออล.-เซลล์ปอด. โมล ฟิสิออล. 2003, 284, L899–L914. [ครอสอ้างอิง]
56. ทองเหลือง DM; ฮอลลิงส์เวิร์ธ เจดับบลิว; ชิงเคว ม.; หลี่ ซ.; พอตส์ อี.; โทโลซา อี.; ฟอสเตอร์, ดับเบิลยูเอ็ม; Schwartz, DA การสูดดม LPS แบบเรื้อรังทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงคล้ายถุงลมโป่งพองในปอดของหนูซึ่งสัมพันธ์กับการตายของเซลล์ เช้า. เจ. ทางเดินหายใจ. เซลล์โมล ไบโอล 2008, 39, 584–590. [ครอสอ้างอิง]
57. ดราก้อน ส.; ซัฟฟาร์, AS; ฉาน ล.; Gounni, AS IL-17 ลดฤทธิ์ต้านการตายของเซลล์ของ GM-CSF ในนิวโทรฟิลของมนุษย์ โมล อิมมูนอล. 2008, 45, 160–168. [CrossRef] [PubMed]
58. จู้ฟ.; วังคิว.; กัว ค.; วังเอ็กซ์.; เฉา เอ็กซ์.; ชิย.; เกา ฟ.; แม่ค.; Zhang, L. IL-17 ทำให้เกิดการตายของเซลล์บุผนังหลอดเลือดซึ่งเป็นกลไกที่เป็นไปได้สำหรับโรคหลอดเลือดหัวใจเฉียบพลันของมนุษย์ คลินิก. อิมมูนอล. 2011, 141, 152–160. [ครอสอ้างอิง]
59. ช้าง ย.; อัล-อัลวาน, ล.; ออดุสโซ ส.; ชูอาลี ฟ.; คาร์เลวาโร-ฟิตา, เจ.; อิวาคุระ, ย.; แบ็กโกลล, ซีเจ; ไอเดลมาน, DH; Hamid, Q. การลบ IL-17A ทางพันธุกรรมช่วยลดการอักเสบที่เกิดจากควันบุหรี่และการตายของเซลล์ถุงลมชนิด II เช้า. เจ. ฟิสิออล. -เซลล์ปอด โมล ฟิสิออล. 2014, 306, L132–L143. [ครอสอ้างอิง]
60. โฮวว.; จิน Y.-H.; คัง, HS; Kim, BS Interleukin-6 (IL-6) และ IL-17 ส่งเสริมการทำงานร่วมกันของไวรัสโดยการยับยั้งการตายของเซลล์และการทำงานของทีเซลล์ที่เป็นพิษต่อเซลล์ เจ. วิโรล. 2014, 88, 8479–8489. [ครอสอ้างอิง]
61. วังคิว.; หลี่ ด.; ฮัน ย.; ติง เอ็กซ์.; ซู ต.; Tang, B. MicroRNA-146 ปกป้องเซลล์ A549 และ H1975 จากการตายของเซลล์และการบาดเจ็บจากการอักเสบที่เกิดจาก LPS เจ. ไบโอไซ. 2017, 42, 637–645. [CrossRef] [PubMed]
62. เฉิน ย.; วูซ.; หยวน บ.; ดงย.; จาง ล.; Zeng, Z. MicroRNA-146a-5p ลดการกระตุ้นเซลล์สเตเลทตับที่เกิดจากการฉายรังสีและที่เกิดจาก LPS และการตายของเซลล์ตับผ่านการยับยั้งวิถีทาง TLR4 โรคการตายของเซลล์ 2018, 9, 1–16. [CrossRef] [PubMed]
63. ติ๊งย.; วัง, ล.; จ้าวคิว.; วูซ.; Kong, L. MicroRNA-93 ยับยั้งการตายของเซลล์คอนโดและการอักเสบในโรคข้อเข่าเสื่อมโดยการกำหนดเป้าหมายวิถีการส่งสัญญาณ TLR4/NF-κB นานาชาติ เจ. โมล. ยา 2019, 43, 779–790. [ครอสอ้างอิง]
64. วัน ก.; ใดๆ.; เต๋า เจ.; วังย.; โจวคิว.; หยางร.; Liang, Q. MicroRNA-129-5p บรรเทาอาการบาดเจ็บที่ไขสันหลังในหนูด้วยการยับยั้งการตายของเซลล์และการตอบสนองต่อการอักเสบผ่านทางวิถีทาง HMGB1/TLR4/NF-κB ไบโอไซ ตัวแทน 2020, 40, BSR20193315. [CrossRef] [PubMed]
65. เคะ เอ็กซ์.-ฟ.; ฝาง เจ.; วู, X.-N.; ยู, ซี.-เอช. MicroRNA-203 เร่งการตายของเซลล์ในเซลล์เยื่อบุถุงที่กระตุ้นด้วย LPS โดยการกำหนดเป้าหมาย PIK3CA ไบโอเคม ชีวฟิสิกส์ ความละเอียด ชุมชน 2014, 450, 1297–1303. [CrossRef] [PubMed]
66. ฉี ป.; Tang, Z. โมเลกุล Nrf2 กระตุ้นการป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระจากการสัมผัสกับเบนโซ (a) pyrene เฉียบพลันในหอยแมลงภู่ Mytilus coruscus อควาท ท็อกซิคอล 2020, 226, 105554. [CrossRef]
67. ชมิตเกน TD; Livak, KJ การวิเคราะห์ข้อมูล PCR แบบเรียลไทม์โดยวิธี CT เปรียบเทียบ แนท. โปรโตคอล 2008, 3, 1101–1108. [ครอสอ้างอิง]
