การเพิ่มประสิทธิภาพโปรตีโอมิกส์จากบนลงล่างของเนื้อเยื่อสมองด้วย FAIMS ตอนที่ 1

เชิงนามธรรม

การตรวจสอบโปรตีโอมิกของโรคอัลไซเมอร์และพาร์กินสันได้ให้ข้อมูลเชิงลึกที่มีคุณค่าเกี่ยวกับความผิดปกติของระบบประสาทเสื่อม จนถึงขณะนี้ การตรวจสอบเหล่านี้ส่วนใหญ่ถูกจำกัดจากแนวทางจากล่างขึ้นบน ซึ่งเป็นอุปสรรคต่อระดับที่สามารถระบุลักษณะสถานะ "ไม่เสียหาย" ของโปรตีนได้

โรคอัลไซเมอร์เป็นโรคที่เกิดจากความเสื่อมของระบบประสาทซึ่งส่งผลต่อความจำและความสามารถทางปัญญาของบุคคลอย่างถาวร แม้ว่าผู้คนจะไม่สามารถรักษาโรคให้หายขาดได้ แต่ด้วยการรักษาและป้องกันอย่างระมัดระวัง การลุกลามของโรคสามารถชะลอลงได้มากที่สุด และสามารถรักษาสุขภาพกายและสุขภาพจิตของผู้ป่วยได้

ความจำเป็นหนึ่งในลักษณะที่ชัดเจนที่สุดที่ได้รับผลกระทบจากผู้ป่วยอัลไซเมอร์ พวกเขามักจะลืมข้อมูลสำคัญ เช่น ชื่อ ชื่อคนที่พวกเขารัก วันสำคัญ และอื่นๆ นอกจากนี้ คำศัพท์การเรียนรู้ด้วยตนเองขั้นสูงบางคำ เช่น แนวคิดเชิงนามธรรมและคำพ้องความหมาย อาจถูกลืมไปเช่นกัน อย่างไรก็ตาม ด้วยการฝึกอบรมและการรักษาความรู้ความเข้าใจ ผู้ป่วยอัลไซเมอร์ยังสามารถรักษาความทรงจำได้ในบางด้าน

แม้ว่าโรคอัลไซเมอร์อาจส่งผลเสีย แต่เราควรมองในแง่บวก ประการแรก โดยการเพิ่มความตระหนักและความเข้าใจเกี่ยวกับโรคนี้ เราก็จะสามารถป้องกันและรักษาได้ดีขึ้น ประการที่สอง ผู้ดูแลและสมาชิกในครอบครัวของผู้ป่วยอัลไซเมอร์ยังสามารถเรียนรู้วิธีการสื่อสารและมีปฏิสัมพันธ์กับพวกเขาอย่างมีประสิทธิภาพ เพื่อช่วยให้ผู้ป่วยรักษาศักดิ์ศรีในตนเองและใช้ชีวิตอย่างมีความสุขมากที่สุด

โดยทั่วไป แม้ว่าโรคอัลไซเมอร์อาจส่งผลต่อความจำและความสามารถทางปัญญาอย่างถาวร แต่เราควรรักษาทัศนคติในแง่ดีและพยายามชะลอการลุกลามของโรคด้วยมาตรการรักษาและป้องกัน ในเวลาเดียวกัน เราควรให้ความช่วยเหลือและสนับสนุนเพิ่มเติมแก่ผู้ที่ดูแลผู้ป่วยโรคอัลไซเมอร์ และร่วมกันสร้างชุมชนที่อบอุ่นและมีปฏิสัมพันธ์มากขึ้น จะเห็นได้ว่าเราต้องปรับปรุงความจำ Cistanche สามารถปรับปรุงความจำได้อย่างมากเนื่องจากเป็นสมุนไพรจีนโบราณที่มีลักษณะพิเศษมากมาย หนึ่งในนั้นคือการปรับปรุงความจำ ผลของ Cistanche มาจากส่วนผสมออกฤทธิ์หลายชนิดใน Cistanche รวมถึงกรดแทนนิก โพลีแซ็กคาไรด์ ฟลาโวนอยด์ไกลโคไซด์ ฯลฯ ส่วนผสมเหล่านี้สามารถส่งเสริมสุขภาพสมองได้หลายวิธี

คลิกรู้ 10 วิธีปรับปรุงความจำ

โปรตีโอมิกส์จากบนลงล่าง (TDP) เอาชนะข้อจำกัดนี้ อย่างไรก็ตาม โดยทั่วไปจะมีข้อจำกัดในการสังเกตเฉพาะโปรตีโอฟอร์มที่มีมากที่สุดในขนาดที่ค่อนข้างเล็ก

ดังนั้นเทคนิคการแยกส่วนจึงมักใช้เพื่อลดความซับซ้อนของตัวอย่าง ที่นี่ เราตรวจสอบการแยกส่วนของเฟสก๊าซผ่านสเปกโตรมิเตอร์การเคลื่อนที่ของไอออนรูปคลื่นแบบไม่สมมาตรสนามสูง (FAIMS) ภายใน TDP

ด้วยการใช้ตัวอย่างที่มีความซับซ้อนสูงที่ได้มาจากเนื้อเยื่อสมองของโรคอัลไซเมอร์ (AD) เราอธิบายว่าการเพิ่ม FAIMS ใน TDP สามารถปรับปรุงความลึกของการครอบคลุมของโปรตีโอมได้อย่างไร

ตัวอย่างเช่น การใช้งาน FAIMS โดยมีแรงดันการชดเชยภายนอก (CV) ก้าวที่ −50, −40 และ −30 CV อาจมากกว่าสองเท่าของจำนวนเฉลี่ยของโปรตีโอฟอร์ม ยีน และลำดับโปรตีโอมที่ไม่ซ้ำซ้อนมากกว่าสองเท่าเมื่อเปรียบเทียบกับไม่มี FAIMS

นอกจากนี้เรายังพบว่า FAIMS สามารถมีอิทธิพลต่อการส่งผ่านของโปรตีโอฟอร์มและซองประจุของพวกมันตามขนาดของมัน ที่สำคัญ FAIMS เปิดใช้งานการระบุโปรตีโอฟอร์ม amyloidbeta ( A ) ที่ไม่บุบสลาย รวมถึงตัวแปร A 1–42 ที่มีแนวโน้มการรวมตัวซึ่งเชื่อมโยงอย่างมากกับ AD

ข้อมูลดิบและไฟล์ที่เกี่ยวข้องได้ถูกฝากไว้ที่ ProteomeXchange Consortium ผ่านทางที่เก็บข้อมูลขนาดใหญ่พร้อมตัวระบุชุดข้อมูล PXD023607

การแนะนำ

ในช่วง 2 ทศวรรษที่ผ่านมา อุบัติการณ์ของโรคระบบประสาทเสื่อมมีมากกว่าสองเท่าทั่วโลก โดยโรคอัลไซเมอร์ (AD) เป็นรูปแบบที่แพร่หลายมากที่สุด1 โปรตีนสองสายพันธุ์ ได้แก่ เปปไทด์อะไมลอยด์เบต้า (A ) และโปรตีนเทาว์ที่เกี่ยวข้องกับไมโครทูบูลด้วยฟอสโฟรีเลชั่น (เทา) 2–5 มีความสัมพันธ์อย่างมากกับ AD

ดังนั้นการระบุลักษณะของโปรตีนโดยละเอียดของ AD จึงมีความสำคัญเป็นพิเศษ 6, 7 แมสสเปกโตรเมตรีมีบทบาทสำคัญในการสืบสวนเหล่านี้ 8 โดยส่วนใหญ่ใช้วิธีการจากล่างขึ้นบน 9–16

อย่างไรก็ตาม การย่อยโปรตีเอสที่จำเป็นสำหรับการวิเคราะห์จากล่างขึ้นบนขัดขวางการจับสถานะที่สมบูรณ์ของโปรตีน ซึ่งอาจแตกต่างกันไปเนื่องจากอัลลีลทางพันธุกรรม การต่อรอยแบบอื่น การประมวลผลโปรตีโอไลติก และการดัดแปลงหลังการแปลความหมาย (เรียกว่า "โปรตีโอฟอร์ม") 20

เนื่องจากวิธีโปรตีโอมิกจากบนลงล่าง (TDP) วิเคราะห์โปรตีนในสภาวะที่ไม่บุบสลาย ความน่าจะเป็นของการจับโปรตีโอฟอร์มที่เกี่ยวข้องกับโรคบางอย่างนั้นมีมากกว่าและช่วยให้มีการเชื่อมต่อระหว่างจีโนไทป์และฟีโนไทป์ได้โดยตรงและแข็งแกร่งยิ่งขึ้น

ตัวอย่างเช่น TDP เหมาะอย่างยิ่งสำหรับการจับชิ้นส่วนโปรตีโอไลติกจากภายนอกที่ได้มาจากโปรตีนเช่นเทา ซึ่งเชื่อมโยงกับพยาธิวิทยาของโรคอัลไซเมอร์ 23–26 การใช้งาน TDP ก่อนหน้านี้หลายครั้งได้แสดงให้เห็นถึงคำมั่นสัญญาที่ดีในการเปิดเผยความแตกต่างของโปรตีนในสมองในระดับภูมิภาคและการเปลี่ยนแปลงของเส้นประสาทในการตอบสนองต่อสิ่งเร้าต่างๆ .27–30

อย่างไรก็ตาม TDP ของตัวอย่างที่ซับซ้อนโดยทั่วไปต้องใช้เทคนิคการแยกส่วนแบบออฟไลน์เพื่อลดความซับซ้อนของตัวอย่างเนื่องจากโปรตีโอมของมนุษย์ขยายขนาดและความอุดมสมบูรณ์หลายระดับ และโดยทั่วไปแล้วโปรตีนจะไม่ได้รับการแก้ไขอย่างดีด้วยโครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงแบบรีเวิร์สเฟส (LC)31

การแยกส่วนแบบออฟไลน์นี้สามารถทำได้สำเร็จด้วยอิเล็กโตรโฟเรซิสแบบดักจับของเหลวที่ชะด้วยเจล, โครมาโตกราฟีแบบแยกขนาด, โครมาโตกราฟีแบบแลกเปลี่ยนไอออน หรือการทำให้บริสุทธิ์ด้วยความสัมพันธ์ และอื่นๆ อีกมากมาย22,32–35

น่าเสียดายที่การแยกส่วนแบบออฟไลน์มักจะลดผลผลิตและปริมาณงานโดยต้องมีการจัดการตัวอย่างเพิ่มเติม36 การแยกไอออนแบบเคลื่อนที่ในเฟสก๊าซเป็นทางเลือกที่น่าสนใจในการแยกส่วนซึ่งสามารถนำมาใช้ระหว่างมิติ LC และ MS โดยไม่ต้องมีขั้นตอนการจัดการตัวอย่างเพิ่มเติม

ไอออนโมบิลิตี้สเปกโตรมิเตอร์ (FAIMS) ของรูปคลื่นแบบอสมมาตรสนามสูงเหมาะอย่างยิ่งกับงานนี้ด้วยการเปิดตัวอุปกรณ์ FAIMS Pro เมื่อเร็วๆ นี้ ซึ่งมีการออกแบบแบบโมดูลาร์ช่วยให้สามารถรวมการเคลื่อนที่ของไอออนเข้ากับเครื่องมือ Orbitrap กระแสต่างๆ ได้อย่างง่ายดาย37

FAIMS หรือที่เรียกอีกอย่างว่าสเปกโตรเมทรีการเคลื่อนที่แบบดิฟเฟอเรนเชียล แยกไอออนในก๊าซพาหะตามปัจจัยต่างๆ รวมกัน เช่น ขนาด ประจุ หรือรูปร่าง โดยการใช้รูปคลื่นแบบอสมมาตรที่มีสนามไฟฟ้าสูงและต่ำ38 เพื่อป้องกันการชนกันของไอออนกับ อิเล็กโทรด การเบี่ยงเบนในเส้นทางของไอออนเกิดขึ้นผ่านการใช้แรงดันไฟฟ้าชดเชยกระแสตรง (CV) 39 ช่วยให้สามารถเลือกการส่งสัญญาณของไอออนนั้นได้ 38

การประยุกต์ใช้ FAIMS ในการวิเคราะห์โปรตีนที่สมบูรณ์นั้นส่วนใหญ่ถูกจำกัดอยู่เพียงการแยกตัวของโปรตีนแต่ละตัวหรือการรวมโปรตีนขนาดเล็ก 40–45

อย่างไรก็ตาม เมื่อเร็ว ๆ นี้ FAIMS ได้ถูกนำมาใช้กับการวิเคราะห์โปรตีนที่สมบูรณ์และดั้งเดิมโดยใช้การวิเคราะห์พื้นผิวการสกัดด้วยของเหลว ที่นี่ เราใช้การวิเคราะห์ FAIMS-TDP กับตัวอย่างเนื้อเยื่อทั้งหมดจาก medial frontalcortex (MFC) ของผู้ป่วยอัลไซเมอร์

การสแกนในช่วง CV ที่ −50 ถึง −20 CV ด้วยการก้าวภายนอกทำให้เราสามารถระบุได้ว่าการปรับ FAIMS CV มีอิทธิพลต่อลักษณะของไอออนที่ส่งผ่านหน่วย FAIMS ทรงกระบอกอย่างไร และวิธีที่ความสัมพันธ์นี้สามารถนำไปใช้เพื่อกำหนดเป้าหมายโปรตีโอฟอร์มตามขนาดได้อย่างไร

FAIMS-TDP มีการระบุโปรตีโอฟอร์มมากกว่าสองเท่าใน CV เดียวเมื่อเปรียบเทียบกับที่ไม่มี FAIMS และเปิดใช้งานการซักถามเชิงลึกของโปรตีโอฟอร์มที่เกี่ยวข้องกับโรคทางระบบประสาทซึ่งรวมถึง -, - และ -synucleins, PARK7, ไอโซฟอร์ม tau splice และโปรตีโอฟอร์ม A ที่ไม่บุบสลายหลายตัว

เมื่อนำมารวมกัน งานนี้อธิบายว่าการระบุโปรตีโอฟอร์มและการครอบคลุมโปรตีโอมีมากขึ้นสามารถทำซ้ำได้อย่างไรผ่านการแยกส่วนเฟสก๊าซด้วย FAIMS ใน TDP

วิธีการ

การเตรียมตัวอย่าง

ตัวอย่าง MFC ได้รับจาก Rush University Alzheimer's Disease Center ผู้เข้าร่วมเป็นผู้สูงอายุในคลินิกที่ลงทะเบียนเรียนเกี่ยวกับปัญหาด้านความจำและ/ความผิดปกติตั้งแต่ปี 1992 ถึง 2005

พวกเขาได้รับการประเมินที่ Rush Memory Clinic ว่ามีภาวะสมองเสื่อมที่เป็นไปได้ และตกลงที่จะบริจาคสมองโดยเป็นส่วนหนึ่งของแกนหลักทางคลินิกของ Rush Alzheimer'sDisease Core Center การศึกษานี้ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการพิจารณาประจำสถาบันของศูนย์การแพทย์มหาวิทยาลัย Rush

หลังการเสียชีวิต ญาติคนถัดไปยินยอมให้ชันสูตรพลิกศพ หมวดหมู่การวินิจฉัยความรู้ความเข้าใจโดยรวมของผู้ป่วยคือโรคอัลไซเมอร์โดยไม่มีสาเหตุอื่นของความบกพร่องทางสติปัญญา51 ในขณะที่ช่วงชันสูตรศพคือ 230 นาที

ขั้นตอนการจัดการตัวอย่างทั้งหมดถูกดำเนินการด้วยข้อควรระวัง BSL{{0}} เนื้อเยื่อ MFC 33 มก. ที่เก็บไว้ที่ −80 องศาถูกถ่ายโอนไปยังหลอด LoBind Eppendorf 1.5 มล. (Eppendorf, Cat# 022431081) ด้วยการเติมบัฟเฟอร์การทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน 0.5 มล. ซึ่งประกอบด้วยยูเรีย 8 โมลาร์, แมมโมเนียมไบคาร์บอเนต 10 มม. (ABC) และ 10 มม. ทริส(2-คาร์บอกซีเอทิล)ฟอสฟีน (TCEP) ที่ pH7.5

การทำให้เป็นเนื้อเดียวกันทำได้โดยการหยุดชะงักทางกายภาพโดยการใช้สากอัดเม็ดที่ขับเคลื่อนด้วยมอเตอร์มือถือเป็นเวลา 30 วินาที (BioVortexer พร้อม SpiralPestle; Biospec 1083 และ 1017) ก่อนที่จะเติมบัฟเฟอร์ที่ทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน 0.5 มล. ที่อุณหภูมิห้อง

จากนั้นตัวอย่างถูกบ่มที่ 37 องศาเป็นเวลา 60 นาทีที่ 1200 รอบต่อนาทีโดยใช้ ThermoMixer เพื่อให้เกิดการสกัดและการทำให้โปรตีนในเซลล์เสื่อมสภาพ การอัดเป็นก้อนของวัสดุที่ไม่ละลายยูเรียทำได้สำเร็จด้วยการปั่นแยกที่ 18,000 กรัม เป็นเวลา 20 นาทีที่ 22 องศา และต่อมาสารเหนือตะกอนที่เป็นผลลัพธ์ถูกเติมลงในบัฟเฟอร์ล้าง 3 มิลลิลิตร (WB; 8 โมลาร์ ยูเรีย, 10 มิลลิโมลาร์ ABC, pH7 .5) ภายในตัวกรองจุดตัดน้ำหนักโมเลกุล (MWCO) ขนาด 4 มล. 100 kDa เพื่อกำจัดสายพันธุ์ MW ขนาดใหญ่

หลังจากการปั่นแยกเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 22 องศาและ 5,000 กรัม ปริมาตรของสิ่งที่กักไว้คือ 200 ไมโครแลนด์ และปริมาตรของการกรองคือ 3.8 มล. สารกรอง 3.8 มล. ถูกถ่ายโอนไปยังตัวกรอง MWCO ขนาด 3 kDa เพื่อกำจัดสิ่งปนเปื้อนที่เป็นโมเลกุลขนาดเล็กและเปปไทด์ MW ต่ำ

ตัวกรอง MWCO ขนาด 3 กิโลดัลตันถูกหมุนเหวี่ยงที่ 22 องศาและ 7300 กรัมเป็นเวลา 1 ชั่วโมง โดยให้ปริมาตรที่กักไว้ที่ 200 ไมโครลิตร 200ไมโครลิตรของสิ่งที่กักไว้จากตัวกรอง MWCO 100 กิโลดาลตันถูกล้างอีกครั้งโดยการเจือจางมันเป็น 4 มิลลิลิตรด้วย WB และกรองอีกครั้งผ่านตัวกรองเดียวกัน

การไหลผ่านนี้ถูกเติมไปยังตัวกรอง MWCO ขนาด 3 kDa เดียวกันตามที่กล่าวไว้ข้างต้นและทำให้เข้มข้นอีกครั้งหนึ่ง

สารกักขังสุดท้าย00 ไมโครลิตรจากการล้างตัวกรอง MWCO ขนาด 3 กิโลดาลตันถูกถ่ายโอนไปยังหลอด LoBindEppendorf ขนาด 1.5 มิลลิลิตร หากต้องการทำให้ตัวอย่างเป็นกรด ให้เติมกรดฟอร์มิก (FA) 10% 10 ไมโครลิตร ส่งผลให้มีความเข้มข้น FA 0.5% ในตัวอย่างสุดท้าย

ตัวอย่างถูกปั่นเหวี่ยงที่ 18000 กรัมเป็นเวลา 15 นาทีเพื่อกำจัดวัสดุที่ตกตะกอนออกก่อนจะวัดความเข้มข้นของโปรตีนโดยใช้การทดสอบกรดไบซินโคนิก (BCA)

สารมาตรฐานในซีรัมอัลบูมินของวัวถูกเตรียมใน 8 โมลาร์ยูเรีย, 10 มิลลิโมลาร์ ABC และ0.5% FA เพื่อพิจารณาการมีส่วนร่วมของบัฟเฟอร์ที่เป็นไปได้ใดๆ ในการสอบวิเคราะห์ BCA ความเข้มข้นของโปรตีนโดยการทดสอบ BCA ถูกกำหนดให้เป็น 1.1 มก./มล. ซึ่งสอดคล้องกับผลผลิตสุดท้ายที่ 0.22 มก. ของโปรตีนที่นำกลับมาใช้ใหม่ทั้งหมดในตัวอย่าง ∼200 μL ตัวอย่างคือ เจือจางเป็น 0.5 มก./มล. ด้วย WB ที่มี FA 0.5% และเก็บไว้ที่ −80 องศาจนกระทั่งวิเคราะห์ LC-MS

เราควรสังเกตว่าการทดลองเบื้องต้น (ไม่มีการเผยแพร่ข้อมูล) โดยใช้ค็อกเทลตัวยับยั้งโปรตีเอส/ฟอสฟาเตสแบบดั้งเดิมภายในบัฟเฟอร์ที่ทำให้เป็นเนื้อเดียวกันของเรา ทำให้เกิดผลลัพธ์ BCAassay และ LC-MS ที่ทำให้เข้าใจผิด เนื่องจากการคงส่วนประกอบค็อกเทลหลายอย่างไว้โดยตัวกรอง 3KMWCO

นอกจากนี้ สารยับยั้งฟอสฟาเตสและโปรตีเอสจำนวนมากที่ใช้กันโดยทั่วไปไม่สามารถเข้ากันทางเคมีกับสารรีดิวซ์ เช่น TCEP เมื่อพิจารณาถึงความไม่ลงรอยกันเหล่านี้ และคาดว่าเงื่อนไขการเสื่อมสภาพอย่างรุนแรงของยูเรีย 8 M กับ TCEP 10 mM จะทำให้โปรตีเอสส่วนใหญ่ไม่ทำงาน เราเชื่อว่าการย่อยสลายโปรตีนจะยังคงลดลงภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้

การวิเคราะห์ LC-MS/MS และการตั้งค่า FAIMS

ตัวอย่างถูกวิเคราะห์โดยใช้ระบบ Waters NanoACQUITY UPLC ที่มีเฟสเคลื่อนที่ซึ่งประกอบด้วย {{0}}.2% FA ใน H2O (เฟสเคลื่อนที่ A) และ 0.2% FA ใน ACN (เฟสเคลื่อนที่ B)

ทั้งคอลัมน์ล่วงหน้าสำหรับดัก (100 μm id ความยาว 5 ซม.) และคอลัมน์การวิเคราะห์ (75 μm id ความยาว 50 ซม.) ถูกบรรจุสารละลายด้วยวัสดุบรรจุภัณฑ์ C2 (5 และ 3 μm สำหรับกับดัก/การวิเคราะห์ ตามลำดับ 300 Å เทคโนโลยีวิธีการแยก) . ตัวอย่างถูกโหลดลงในลูป 5 μL ซึ่งสอดคล้องกับปริมาณวัสดุที่โหลด 2.5 ไมโครกรัม และถูกฉีดเข้าไปในคอลัมน์กับดักด้วยการไหลแบบไอโซเครติก 5% b ที่ 3 μL/นาทีตลอด 20 นาที

ทำการแยกด้วยเกรเดียนต์ 5–50% b ตลอด 180 นาทีที่ 300 นาโนลิตร/นาที สำหรับการวิเคราะห์โปรตีนด้วย MS/MS ระบบ NanoACQUITY จะถูกรวมเข้ากับแมสสเปกโตรมิเตอร์ Thermo Scientific Orbitrap Fusion LumosTribrid ที่มาพร้อมกับอินเทอร์เฟซ FAIMS Pro

พารามิเตอร์แหล่งที่มาประกอบด้วยแรงดันสเปรย์ด้วยไฟฟ้า 2.2 kV อุณหภูมิเส้นเลือดฝอยถ่ายโอน 275 องศา และแอมพลิจูดความถี่วิทยุของกรวยไอออน 60% FAIMS ได้รับการตั้งค่าเป็นความละเอียดมาตรฐานโดยไม่มีการไหลของก๊าซพาหะที่ควบคุมโดยผู้ใช้เพิ่มเติม และแรงดันการกระจายที่ −5 kV (เทียบเท่ากับสนามการกระจายที่ −33.3 kV/cm) 50 ในขณะที่ CV จะแปรผันขึ้นอยู่กับการทดลอง (เรียกว่า "การก้าวจากภายนอก" ")

Fusion Lumos ได้รับการตั้งค่าเป็นโหมดการใช้งาน "intactprotein" ซึ่งจะลดแรงดัน C-trap dissociation (HCD) cellN2 ที่มีพลังงานสูงกว่าลงเหลือ 2 mTorr และข้อมูลจะถูกรวบรวมเป็นโปรไฟล์แบบเต็ม ข้อมูล MS1 และ MS2 ได้มาที่ความละเอียด 120k และ 60k การสแกนระดับไมโครที่ 3 และ 2 ในช่วง 500–2,000 m/z และ400–2,000 m/z และด้วย เป้าหมาย AGC ที่ 5 × 106 และ 5 × 105 ตามลำดับ

ได้รับ MS1 และ MS2 ด้วยเวลาการฉีดสูงสุดที่ 400 มิลลิวินาทีเช่นกัน การตั้งค่าที่ขึ้นกับข้อมูลประกอบด้วยการเลือกไอออนที่มีความเข้มข้นสูงสุด 6 อันดับแรก การแยกไอออนที่ต่ำกว่าสถานะประจุ5+ การรวมสถานะประจุที่ไม่ได้กำหนดไว้ และการแยกออกแบบไดนามิกหลังจากการสังเกตหนึ่งครั้งเป็นเวลา 30 วินาที

ไอออนที่เลือกสำหรับ MS2 ถูกแยกเดี่ยวเหนือหน้าต่าง ±1.5 m/z และถูกแยกส่วนผ่านการแตกตัวที่เกิดจากการชน (CID) ด้วยพลังงานการชนที่ 35% เราใช้ dCID แทน HCD เนื่องจากการพึ่งพาพลังงานการชนกันแบบปกติที่ต่ำกว่าเพื่อให้ได้สเปกตรัมการกระจายตัวของโปรตีนที่ตีความได้ ดังนั้นจึงจัดลำดับความสำคัญความกว้างของการสังเกตโปรตีโอฟอร์มของเราเหนือการครอบคลุมลำดับ

ชุดข้อมูลสำหรับ FAIMS CV แต่ละชุดถูกรวบรวมเป็นสามเท่า ไฟล์ดิบทั้งหมดถูกฝากไว้ในที่เก็บข้อมูล MassIVE และสามารถเข้าถึงได้ผ่านภาคยานุวัติ MSV000086696 หรือด้วย PXD023607 onProteomeXchange

For more information:1950477648nn@gmail.com