ผลของไกลโอไซด์ของซิสตานช์ต่อการรับรู้การเรียนรู้และพลาสติกซินแนปติกในหนูแบบจำลองการอดนอน

เชิงนามธรรม

วัตถุประสงค์:เพื่อสำรวจว่าไกลโคไซด์ของซิสตานช์สามารถปรับปรุงการเรียนรู้และการทำงานของการรับรู้ของหนูแบบจำลองการอดนอนโดยการควบคุมความเป็นพลาสติกของซินแนปติกหรือไม่

วิธีการ: หนูวิสตาร์เพศผู้จำนวน 50 ตัวถูกสุ่มแบ่งออกเป็นกลุ่มควบคุมเปล่า (กลุ่มควบคุม) กลุ่มควบคุมแพลตฟอร์ม (PC) กลุ่มแบบจำลอง (แบบจำลอง)ไกลโคไซด์ของกลุ่มซิสตานช์ (GCs)และกลุ่มเอสตาโซแลม (Est) แบบจำลองการอดนอนของหนูจัดทำโดยวิธีแก้ไขสภาพแวดล้อมทางน้ำแบบหลายแพลตฟอร์ม เขาวงกตน้ำมอร์ริสและการทดสอบภาคสนามถูกนำมาใช้เพื่อตรวจจับการทำงานของการรับรู้เชิงพื้นที่และการเปลี่ยนแปลงทางอารมณ์ของหนู การย้อมสี Nissl ใช้เพื่อสังเกตการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาและปริมาณของเซลล์ประสาทในพื้นที่ฮิปโปแคมปัส CA ของหนู- Western blot และ R'T - PCR ถูกนำมาใช้เพื่อตรวจจับระดับการแสดงออกของ synaptophysin (SY'N), สารหนาแน่นของเยื่อโพสซินแนปติก 95 ( PSD -95 ) และปัจจัย neurotrophic ที่ได้มาจากสมอง (BDNF). 

ผลลัพธ์;ผลลัพธ์เขาวงกตน้ำของมอร์ริสแสดงให้เห็นว่าเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมการเรียนรู้และความสามารถทางปัญญาของหนูในกลุ่ม Model ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ ( P<0. 05 ), and the learning and memory function of rats wasปรับปรุงการรักษา GCs ( P <0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05 ), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05 ), the resting time increased ( P <0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T - PCR showed that the ระดับการแสดงออกของโปรตีนและยีนของ BDNF, SYN และ PSD -95 ในกลุ่ม Mlodel ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ ( P<0. 05 ), while after treatment with GCs, the expression levels ofBDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05). Conclusion: Glycosides of cistanche may af. feet synaptic plasticity by regulating the expression of synaptic-related markers, thereby improving the learning and cognitive function of sleep deprivation model rats.

อาหารเสริมสูตร CITANCHE สมุนไพรสำหรับปรับปรุงฟังก์ชันการเรียนรู้และการรับรู้

คำสำคัญไกลโคไซด์ของ cistanche- ฮิปโปแคมปัส; การอดนอน; การเรียนรู้และความทรงจำ ความวิตกกังวล; ความเป็นพลาสติกแบบซินแนปติก

ความผิดปกติของการนอนหลับ (SD)คือความผิดปกติของการนอนหลับที่ผิดปกติเกิดจากปัจจัยที่ซับซ้อนหลายประการ เช่นนอนไม่หลับ, ความใฝ่ฝัน, และตื่นง่าย- ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมาอุบัติการณ์ของ SDได้เพิ่มขึ้นเรื่อยๆ การศึกษาที่เกี่ยวข้องรายงานว่า SD สามารถทำให้เกิดได้โรคหลอดเลือดหัวใจ,ความผิดปกติของการเผาผลาญ,โรคภูมิคุ้มกัน, และระบบประสาทส่วนกลางโรคความเสื่อม เช่น โรคอัลไซเมอร์ [1] SD อาจทำให้เกิดความเสียหายจากออกซิเดชันต่อเซลล์ประสาทฮิปโปแคมปัส ทำให้เกิดความผิดปกติทางสติปัญญา และทำให้อารมณ์เปลี่ยนแปลง เช่น ความวิตกกังวลและภาวะซึมเศร้า [2] Cistanche Deserticola เป็นยาอันล้ำค่าที่สามารถใช้เป็นทั้งยาและอาหารในประเทศจีน มีฤทธิ์ในการปรับสภาพไตและเติมพลังชี่ ทำให้ลำไส้ชุ่มชื้น ส่งเสริมการขับถ่าย และเสริมพลังหยาง สารสกัดหลักของ Cistanche Deserticola, glycosides of cistanche (GCs) มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ ต้านการตายของเซลล์ ปกป้องตับ และปกป้องระบบประสาท [3] การวิจัยก่อนหน้านี้ของเราพบว่า GC สามารถปรับปรุงการเรียนรู้และการทำงานของการรับรู้ของหนู SAMP8 ได้โดยมีบทบาทเป็นสารต้านอนุมูลอิสระและต่อต้านการตายของเซลล์ [4]

การศึกษาที่เกี่ยวข้องแสดงให้เห็นว่าความผิดปกติทางความรู้ความเข้าใจที่เกิดจาก SD มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับความเป็นพลาสติกของซินแนปติก [5] อย่างไรก็ตาม มีรายงานไม่กี่ฉบับเกี่ยวกับกลไกที่ GCs ควบคุมความเป็นพลาสติกของซินแนปติก และปรับปรุงการเรียนรู้และความจำเสื่อม และการรับรู้ลดลงในหนูที่เกิดจากการอดนอน ดังนั้น การศึกษานี้จึงมีจุดมุ่งหมายเพื่อสำรวจว่า GC ส่งผลต่อความเป็นพลาสติกแบบซินแนปติกหรือไม่ โดยการควบคุมการแสดงออกของเครื่องหมายที่เกี่ยวข้องกับซินแนปติก ซึ่งจะช่วยปรับปรุงฟังก์ชันการเรียนรู้และการรับรู้ของหนูด้วยแบบจำลองการอดนอน และจัดเตรียมแนวคิดและแผนการรักษาใหม่สำหรับ GC เพื่อรักษาการเรียนรู้และการรับรู้ ความบกพร่องที่เกิดจากความผิดปกติของการนอนหลับ

1 วัสดุและวิธีการ

1.1 สัตว์ทดลอง

หนูวิสตาร์เพศผู้อายุ 6 ถึง 8 สัปดาห์ น้ำหนัก 280 ถึง 300 กรัม ซื้อจาก Beijing Sibeifu โดยมีใบอนุญาตการผลิตสัตว์ [SCXK (ปักกิ่ง) 2019-0010] สัตว์ทุกตัวถูกเก็บไว้ในศูนย์ทดลองสัตว์ของวิทยาลัยการแพทย์เป่าโถวภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้: อุณหภูมิ (24 ± 1) องศา ความชื้น 50% ถึง 55% แสงสว่าง 12 ชั่วโมง และความมืด 12 ชั่วโมง และไม่มีข้อจำกัดด้านอาหารและน้ำ การทดลองนี้ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมของโรงเรียน [Baoyi Lunshen 2022 ฉบับที่ (63)]

1. 2 รีเอเจนต์และเครื่องมือหลัก

ไกลโคไซด์ทั้งหมดของ Cistanche Deserticola ถูกซื้อจาก Chengdu Xiyu Cistanche Biotechnology Co., Ltd. (หมายเลขแบทช์: KSM20220609011); ซื้อแท็บเล็ต Estazolam จาก CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (หมายเลขแบทช์: 044220343); บัฟเฟอร์การโหลดโปรตีน (P1015), บัฟเฟอร์ RIPA lysis (R0010), สารละลายเคมีเรืองแสง (PE0010) ฯลฯ ล้วนซื้อจาก Beijing Solebao ซื้อสารความหนาแน่นโพสต์ซินแนปติกในแอนติบอดี 95 (PSD -95) (AB192757) และแอนติบอดีซินแนปโตฟิซิน (SYN) (ab32127) จาก Abcam บริษัท สหรัฐอเมริกา ซื้อปัจจัย neurotrophic ที่ได้มาจากสมอง (BDNF) (48503-2) และ -actin (52901) จากบริษัท SAB ประเทศสหรัฐอเมริกา ซื้อแอนติบอดีรอง IgG ต่อต้านกระต่ายแพะ (SA 00001-20) จากบริษัท Proteintech ประเทศสหรัฐอเมริกา ซื้อเมลาโทนินของหนู (MT) และชุดวิจัยทางวิทยาศาสตร์ของ ELISA (MM-0657R1) จาก Jiangsu Enzyme Immunoassay Industry Co., Ltd. เครื่องแบ่งพาราฟิน (ไลก้า ประเทศเยอรมนี); กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง (Leica, เยอรมนี);

เขาวงกตน้ำมอร์ริส กล่องทดสอบสนามเปิด (เซี่ยงไฮ้ซินร่วน); เครื่องอิเล็กโตรโฟรีซิสแนวตั้ง (บริษัท Beijing Liuyi); เครื่องปั่นลดสี (บริษัท Beijing Liuyi); ระบบวิเคราะห์ภาพโปรตีน (Shanghai Tanon Technology) เครื่องมือ PCR เชิงปริมาณเรืองแสง (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.)

1.3 วิธีการทดลอง

1.3.1 การจัดกลุ่มสัตว์และการบริหารยา

หนูวิสตาร์เพศผู้ 50 ตัวถูกสุ่มแบ่งออกเป็นกลุ่มควบคุมเปล่า (กลุ่มควบคุม) กลุ่มควบคุมแพลตฟอร์ม (กลุ่มควบคุมแบบแพลตฟอร์ม กลุ่ม PC) กลุ่มแบบจำลอง (กลุ่มแบบจำลอง) ไกลโคไซด์รวมของกลุ่ม Cistanche Deserticola (กลุ่ม GCs , 50 มก./กก.) และกลุ่มเอสตาโซลิน (กลุ่มเอสต์ 0.54 มก./กก.) โดยมีหนู 10 ตัวในแต่ละกลุ่ม กลุ่มควบคุมและกลุ่ม PC ได้รับน้ำเกลือ 0.9% โดยสายยาง ทุกกลุ่มได้รับการดูแลบ่อน้ำในเวลา 7.00 น. ทุกวันหลังจากการสร้างแบบจำลองเริ่มขึ้น และระบบบำบัดน้ำเสียจะคงอยู่เป็นเวลา 21 วัน

1.3. 2. จัดทำแบบจำลองสัตว์อดนอน

แบบจำลองการกีดกันการนอนหลับถูกสร้างขึ้นโดยใช้วิธีสภาพแวดล้อมทางน้ำหลายแพลตฟอร์มที่ได้รับการดัดแปลง [6] อุปกรณ์ทดลองคือถังเก็บน้ำโพลีเอทิลีนเรซินทรงสี่เหลี่ยมขนาด 130 ซม. × 50 ซม. × 45 ซม. วางแท่นขนาดเล็กที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 5 ซม. และสูง 20 ซม. ไว้ในถังเก็บน้ำ แท่นของกลุ่มพีซีมีเส้นผ่านศูนย์กลาง 10 ซม. และสูง 20 ซม. ถังเก็บน้ำเต็มไปด้วยน้ำที่ระดับความลึกประมาณ 18 ซม. และรักษาอุณหภูมิของน้ำไว้ที่ (20 ± 1) องศา หนึ่งสัปดาห์ก่อนเริ่มการทดลอง หนูจะถูกวางในกล่องป้องกันการอดนอนทุกวันเป็นเวลา 60 นาทีเพื่อทำความคุ้นเคยกับสภาพแวดล้อม หลังจากสร้างแบบจำลองแล้ว ยกเว้นกลุ่มควบคุม หนูของแต่ละกลุ่มจะถูกวางบนแท่นขนาดเล็กตรงเวลาตั้งแต่ 8.00 น. ถึง 20.00 น. ทุกวัน เพื่อการอดนอนเป็นเวลา 21 วันติดต่อกัน

หนูทุกตัวสามารถเข้าถึงอาหารและน้ำได้ฟรี และเคลื่อนไหวได้อย่างอิสระบนแท่น วงจรแสงและความมืดใช้เวลา 12 ชั่วโมงทุกวัน

1.3.3 การทดลองเขาวงกตน้ำมอร์ริส

เขาวงกตน้ำมอร์ริสถูกแบ่งออกเป็น 4 พื้นที่ ซึ่งเต็มไปด้วยน้ำ และแท่นนั้นถูกวางไว้ในจตุภาคที่ 4 ผิวน้ำอยู่เหนือแท่นประมาณ 2 ซม. เติมเมลานินที่กินได้เกรดอาหารลงในน้ำ และรักษาอุณหภูมิของน้ำไว้ที่ (25 ± 1) องศา (1) การทดลองการนำทางด้วยตำแหน่ง: เลือกจุดศูนย์กลางของแต่ละพื้นที่และวางหนูลงในน้ำอย่างนุ่มนวล พวกเขาได้รับอนุญาตให้สำรวจได้อย่างอิสระ บันทึกเวลาที่หนูใช้ในการค้นหาแพลตฟอร์มเป้าหมายภายใน 60 วินาที หนูที่ไม่พบแท่นจะถูกนำทางไปยังแท่นและคงอยู่เป็นเวลา 20 วินาที การฝึกอบรมดำเนินไปเป็นเวลา 5 วัน (2) การทดสอบการสำรวจเชิงพื้นที่: ในวันที่ 6 แท่นถูกถอดออกและวางหนูไว้ในน้ำจากศูนย์กลางของจตุภาคที่ 2 กับผนัง จำนวนครั้งที่หนูผ่านแท่นภายใน 120 วินาที และเวลาที่พวกมันอยู่ในจตุภาคที่ 4 ได้รับการบันทึก

1. 3. 4 การทดลองภาคสนามแบบเปิด

มีการใช้กล่องทดลองขนาด 100 ซม. × 100 ซม. × 50 ซม. และด้านล่างของกล่องแบ่งออกเป็น 9 ตาราง หนูแต่ละกลุ่มถูกวางไว้ในห้องทดลองทุ่งโล่งล่วงหน้าเพื่อปรับให้เข้ากับสภาพแวดล้อมภายในอาคารเป็นเวลา 60 นาที ในช่วงเริ่มต้นของการทดลอง วางหนูทดสอบไว้ที่มุมคงที่ของกล่องทดลองแบบเปิดตามลำดับ และบันทึกจำนวนเวลาในการยืน ระยะการเคลื่อนไหว และเวลาคงที่ของหนูภายใน 5 นาที โดยใช้ซอฟต์แวร์วิเคราะห์พฤติกรรม สภาพแวดล้อมจำเป็นต้องเงียบในระหว่างการทดลอง และอุปกรณ์ทดลองถูกเช็ดด้วยน้ำและแอลกอฮอล์ตามลำดับระหว่างการทดลองสองครั้ง เพื่อป้องกันไม่ให้กลิ่นของหนูตัวแรกส่งผลต่อการตัดสินพฤติกรรมของหนูตัวถัดไป

1. 3. 5 การทดสอบเอนไซม์ที่เชื่อมโยงกับอิมมูโนซอร์เบนท์ (ELISA)

การตรวจหาระดับ MT ในซีรั่มในหนู หนูได้รับการดมยาสลบโดยการฉีดเข้าช่องท้อง และเก็บเลือด 5 มล. จากหลอดเลือดเอออร์ตาในช่องท้อง หลังจากรอเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง เลือดถูกปั่นแยกเพื่อให้ได้ซีรั่ม เติมสารเจือจางตัวอย่าง 40 ไมโครลิตรลงในแต่ละหลุม และจากนั้นตัวอย่าง 10 ไมโครลิตรที่จะทดสอบถูกเติม หลังจากปิดผนึกด้วยฟิล์มปิดผนึกแล้ว จานจะถูกบ่มที่ 37 องศา เป็นเวลา 30 นาที ล้าง 5 ครั้ง เติมสารละลายการติดฉลากเอนไซม์ 50 ไมโครลิตร และแผ่นถูกปิดผนึกด้วยฟิล์มปิดผนึกและบ่มที่ 37 องศาเป็นเวลา 30 นาที ล้าง 5 ครั้ง จากนั้นจึงเติมสารละลายพัฒนาสีและสารละลายยุติปฏิกิริยาตามลำดับ ค่า OD ของแต่ละหลุมถูกวัดโดยเครื่องติดฉลากเอนไซม์ที่ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตร

1. 3. 6 การย้อมสี Nissl

เลือกหนูสามตัวจากแต่ละกลุ่ม และเนื้อเยื่อสมองถูกเอาออกโดยการตัดหัวและตรึงด้วยสารละลายโพลีออกซีเอทิลีน 4% เนื้อเยื่อถูกทำให้แห้ง แช่ในสารละลายขี้ผึ้ง ฝัง และหั่นด้วยวิธีปกติ ชิ้นถูกเก็บไว้ที่ความหนา 5 ไมโครเมตร ล้างด้วย PBS ย้อมด้วยโทลูอิดีนบลู 0.1% เป็นเวลา 0.5 ชั่วโมง แยกความแตกต่างด้วยแอลกอฮอล์ 95% ทำให้แห้งด้วยแอลกอฮอล์ 100% ทำให้โปร่งใส ด้วยไซลีน และปิดผนึกด้วยหมากฝรั่งที่เป็นกลาง การเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาและจำนวนเซลล์ประสาทในภูมิภาค CA1 ของหนูฮิปโปแคมปัสถูกสังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์และรวบรวมภาพ

1.3.7 การทดลอง Western blot

มีการคัดเลือกหนูสี่ตัวจากแต่ละกลุ่ม และฮิบโปแคมปัสถูกแยกโดยการตัดหัว เนื้อเยื่อฮิบโปผสมกับบัฟเฟอร์ RIP A lysis ในสภาพแวดล้อมอ่างน้ำแข็งและเนื้อเยื่อถูกปั่นแยกเพื่อให้ได้ส่วนลอยเหนือตะกอน ตรวจพบความเข้มข้นของโปรตีนโดยวิธี BCA โปรตีน 20 ไมโครกรัมถูกเติมด้วยบัฟเฟอร์การโหลดโปรตีนสำหรับอิเล็กโตรโฟรีซิส หลังจากโปรตีนอิเล็กโตรโฟรีซิสเสร็จสมบูรณ์ เมมเบรนถูกถ่ายโอนที่การไหลคงที่ 300 mA ซึ่งปิดกั้นด้วยนมผงพร่องมันเนย 5% แอนติบอดีปฐมภูมิถูกบ่มที่ 4 องศาข้ามคืน และแอนติบอดีทุติยภูมิถูกบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 ชั่วโมง หลังจากใช้สารละลายการพัฒนาสีแล้ว แถบโปรตีนได้รับการวิเคราะห์ทางสถิติโดยใช้ระบบการวิเคราะห์ด้วยการถ่ายภาพด้วยเคมีบำบัด

1. 3. การทดลอง RT-PCR 8 ครั้ง

หนูสามตัวถูกเลือกจากแต่ละกลุ่มเพื่อเตรียมเนื้อเยื่อฮิปโปแคมปัสให้เป็นเนื้อเดียวกัน RNA ทั้งหมดในของเหลวในเนื้อเยื่อถูกสกัดโดยวิธี Trizol และวัดความเข้มข้น ชุดการสังเคราะห์ cDNA แบบฟาสต์คิงถูกใช้สำหรับการถอดรหัสแบบย้อนกลับ และปฏิกิริยาการขยายเชิงปริมาณฟลูออเรสเซนซ์ถูกดำเนินการโดยใช้ชุดการสังเคราะห์เชิงปริมาณฟลูออเรสเซนซ์เพื่อตรวจจับระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ของ mRNA โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไซแนปติก ผลลัพธ์ถูกวิเคราะห์โดยใช้ 2-ΔΔCt ลำดับไพรเมอร์แสดงไว้ในตารางที่ 1

ตารางที่ 1 ลำดับไพรเมอร์ RT-PCR

1.4 วิธีการทางสถิติ

ผลลัพธ์ข้อมูลที่สอดคล้องกับการแจกแจงแบบปกติแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (x ± s) และทำการวิเคราะห์ทางสถิติโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism 9.5 การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวใช้สำหรับการเปรียบเทียบระหว่างตัวอย่างหลายตัวอย่าง และ P < 0.05 บ่งชี้ว่าความแตกต่างมีนัยสำคัญทางสถิติ