เปปไทด์ที่ได้รับจากเนทรินแบบใหม่ช่วยเพิ่มการป้องกันการตายของเส้นประสาทและบรรเทาอาการตกเลือดในสมองในหนู ตอนที่ 2

นอกจากนี้ เราพบว่าเปปไทด์ E1 กระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณของ FAK และ SFK โดยเฉพาะ ดังนั้นเปปไทด์ E1 อาจมีผลเฉพาะเจาะจงสูงและมีประสิทธิผลในกระบวนการฟื้นฟูหลัง ICH

มีความสัมพันธ์ระหว่างความจำเพาะและความจำสูง ความจำเพาะสูงหมายถึงกิจกรรมที่รุนแรงขึ้นในพื้นที่เฉพาะของสมองเมื่อผู้คนกำลังทำงานอยู่ หน่วยความจำหมายถึงความสามารถของผู้คนในการเรียนรู้และจดจำข้อมูล เมื่อเราเรียนรู้ที่จะใช้ความจำเพาะสูงในการทำงาน ความจำของเราก็จะเพิ่มมากขึ้นเช่นกัน

การวิจัยแสดงให้เห็นว่าเมื่อเรามีทักษะและประสบการณ์เฉพาะด้าน สมองจะค่อยๆ สร้างวงจรประสาทและรูปแบบความจำเฉพาะทาง วงจรและรูปแบบเหล่านี้จะมีผลเฉพาะต่อการตอบสนองต่องาน ซึ่งจะช่วยปรับปรุงประสิทธิภาพของงาน ในขณะเดียวกัน เมื่อทำงานที่คล้ายกันในอนาคต วงจรและรูปแบบเหล่านี้จะถูกเปิดใช้งานเพื่อช่วยให้เราจดจำและปฏิบัติงานได้ดียิ่งขึ้น

งานที่มีความเฉพาะเจาะจงสูง ได้แก่ ดนตรี ภาษา กีฬา ฯลฯ และการเรียนรู้ทักษะเหล่านี้สามารถช่วยเพิ่มความจำของเราได้ ตัวอย่างเช่น เมื่อนักเปียโนฝึกเล่น สมองจะเรียนรู้ทักษะเฉพาะของเปียโนและเสริมสร้างวงจรเหล่านี้ต่อไปในระหว่างกระบวนการฝึกซ้อม การจัดตั้งและการเสริมความแข็งแกร่งของวงจรเหล่านี้จะช่วยเพิ่มความเข้าใจและความทรงจำของนักเปียโนด้วย

ดังนั้นจึงมีความสัมพันธ์เชิงบวกระหว่างความจำเพาะและความจำสูง การเรียนรู้ทักษะและประสบการณ์เฉพาะไม่เพียงแต่สามารถปรับปรุงประสิทธิภาพการดำเนินการของเราเท่านั้น แต่ยังเสริมสร้างความจำของเราอีกด้วย ช่วยให้เราเรียนรู้และจดจำข้อมูลต่างๆ ได้ดียิ่งขึ้น จะเห็นได้ว่าเราต้องปรับปรุงความจำ และ Cistanche สามารถปรับปรุงความจำได้อย่างมีนัยสำคัญเนื่องจากมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ และต่อต้านวัย ซึ่งสามารถช่วยลดปฏิกิริยาออกซิเดชันและการอักเสบในสมอง จึงช่วยปกป้องสุขภาพของ ระบบประสาท นอกจากนี้ Cistanche ยังสามารถส่งเสริมการเจริญเติบโตและการซ่อมแซมเซลล์ประสาท ซึ่งจะช่วยปรับปรุงการเชื่อมต่อและการทำงานของโครงข่ายประสาทเทียม ผลกระทบเหล่านี้สามารถช่วยปรับปรุงความจำ ความสามารถในการเรียนรู้ และความเร็วในการคิด และยังสามารถป้องกันการเกิดความผิดปกติทางสติปัญญาและโรคทางระบบประสาทได้อีกด้วย

คลิกรู้อาหารเสริมเพื่อเพิ่มความจำ

เปปไทด์ E2 ต่างจากเปปไทด์ E1 ตรงที่สามารถกระตุ้นการส่งสัญญาณ ERK ซึ่งส่งเสริมการตายของเส้นประสาท สิ่งนี้อาจเกิดจาก Cx(1–2)Cx(3–4)Tx(0 –1)G motifin E2 ซึ่งสามารถกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณ ERK ได้ [28]

สิ่งนี้บ่งชี้ว่าเปปไทด์ที่ได้รับจาก Netrin-1- ที่แตกต่างกันนั้นทำหน้าที่ต่างกัน ตัวรับหลักของ Netrin -1 คือ DCC และสมาชิกของตระกูล UNC5 [50] บทบาทของ DCC และ UNC5H2 ใน ICH ยังคงเป็นที่ถกเถียงกันอยู่ [51,52]

ลำดับของ Netrin-1ที่เราระบุมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อปฏิสัมพันธ์ของ Netrin-1 กับ DCC [19] ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า DCC อาจมีส่วนร่วมในการ-1-ฟื้นฟูการทำงานของ Netrin หลังจาก ICH

จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อตรวจสอบกลไกพื้นฐานของกระบวนการเหล่านี้และเส้นทางการส่งสัญญาณที่เกี่ยวข้อง ในการทดลองในอนาคต เราจะประเมินคุณสมบัติทางชีวภาพของเปปไทด์ E1 เพื่อสำรวจความเป็นพิษและครึ่งชีวิตสำหรับการใช้งานทางคลินิก

4. วัสดุและวิธีการ

4.1. สัตว์

ห้องปฏิบัติการเป็นห้องปฏิบัติการปลอดเชื้อโรค (SPF) โดยเฉพาะ หนูทุกตัวถูกกักขังภายใต้วงจรแสงถึงความมืด 12- ชั่วโมง โดยเปิดไฟตั้งแต่เวลา 6.00 น. ถึง 18.00 น. และสามารถเข้าถึงอาหารได้โดยไม่จำกัด หนู DCC+/− ถูกสร้างขึ้นตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า [53]

หนูตัวอ่อน DCC +/− ถูกนำมาใช้เพื่อการเพาะเลี้ยงเซลล์ประสาทในเยื่อหุ้มสมอง การสร้างจีโนไทป์ดำเนินการโดยปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [53] หนู C57BL/6J ถูกซื้อจาก Beijing Huafukang Bioscience Co., Ltd. (ปักกิ่ง, จีน)

4.2. โครงสร้าง

โครงสร้างนิพจน์เข้ารหัส DCC ของมนุษย์ (HGNC: 2701), Netrin ของมนุษย์-1 (HGNC:8029) และ UNC5A ของมนุษย์ (HGNC:12567) ถูกสร้างขึ้นในห้องปฏิบัติการของเรา [14,32,45]

pcDNA 3.1-hNetrin-1 (∆407–443)-myc-His ถูกสร้างขึ้นด้วย Seamless AssemblyCloning Kit (Clone Smarter, C5891, USA) พบลำดับ cDNA ของ hNetrin -1 (∆407–443) ในตารางเสริม S2

ลำดับ cDNA ที่สอดคล้องกับโดเมน FN5 ของDCC และกรดอะมิโน 407–443 ของ Netrin-1 ถูกสร้างขึ้นโดยการผูกเข้าในเวกเตอร์ pGEX-5x-1 เพื่อผลิตฟิวชันโปรตีน GST

4.3. การรวบรวม Netrin-1 มีเดียมปรับสภาพ

สื่อที่มีการปรับสภาพ netrin-1- ได้รับการรวบรวมและตรวจสอบความถูกต้องตามที่อธิบายไว้ในรายงานก่อนหน้าของเรา [13,14] โดยสรุป Netrin ของมนุษย์ที่แท็ก Myc-His-1 ถูกแสดงออกใน HEK293Tcells

หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมง เซลล์จะถูกล้าง 3 ครั้งด้วย Opti-MEM (Invitrogen, 31985070, Carlsbad, CA, USA) จากนั้นบ่มเป็นเวลาสามวันใน Opti-MEM ที่ไม่มีซีรั่ม

สื่อได้รับการเสริมสมรรถนะด้วยการกรองแบบแรงเหวี่ยง (มิลลิพอร์, UFC903096, Billerica, MA, USA) และเก็บไว้ที่ −80 ◦C เนทรินเสริมสมรรถนะ-1 ถูกอิมมูโนบล็อตด้วยแอนติ-ฮิส และหาปริมาณด้วยการเปรียบเทียบกับ BSA ที่เป็นตัวควบคุมการโหลด

จากนั้นประเมินผลของ Netrin{{0}} โดยฟอสโฟรีเลชั่นของ FAK โดยปกติ Netrin-1 0.1 มก./มล. กระตุ้นให้เกิดฟอสโฟรีเลชันของ FAK ได้อย่างมีประสิทธิภาพ และความเข้มข้นนี้ถูกนำมาใช้ในการศึกษาของเรา ระยะเวลาของการกระตุ้นเนทริน-1คือ 20 นาทีในการทดลองทั้งหมด เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น

4.4. การวิเคราะห์แบบ Western Blot

การซับแบบตะวันตกดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า [54] ตัวอย่างถูกกำจัดในบัฟเฟอร์สลาย (1% โนนิเดต P-40, 0.5% โซเดียม ดีออกซีโคเลต, 0.1% SDS, 1 มิลลิโมลาร์ EDTA, EGTA 1 มิลลิโมลาร์, 150 มิลลิโมลาร์ NaCl, กลีเซอรอล 10%, ไทรทัน X-100 1%, NaF 100 มิลลิโมลาร์, วานาเดต 1 มิลลิโมลาร์ และสารยับยั้งโปรตีเอส) เพื่อสลายเซลล์และเนื้อเยื่อสมองใหม่

แอนติบอดีปฐมภูมิที่ใช้คือ: mouse anti-DCC (1:500, #554223, BD, San Jose, CA, USA ), mouse anti-His(1:1000, TA-02, ZSGB-BIO, ปักกิ่ง, จีน ), เมาส์ต่อต้าน myc (1:1000, 22E8, Sungene Biotech, Tianjin, China), เมาส์ต่อต้าน Netrin-1 (1:1000, ALX804838, Enzo Life Sciences, Farmingdale, New York, USA ), เมาส์ anti-flag (1:1000, F3165, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA), กระต่าย anti-phospho-FAK(pTyr861) (1:1000, F9176, Sigma Aldrich, St Louis, MO, สหรัฐอเมริกา), กระต่ายต่อต้าน FAK (1:200, sc-557, ซานตาครูซ, ซานตาครูซ, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา), กระต่ายต่อต้านฟอสโฟเอสอาร์ซี (Tyr418)(1:1000, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) , ตระกูลแอนติ-SRC ของกระต่าย (1:1000,#2123, CST, Danvers, MA, USA), แอนติ-GAPDH ของหนูเมาส์ (1:5000, TransGene Biotech, ปักกิ่ง,จีน), แอนติ-เบตาแอกตินของหนูเมาส์ (1:3000, A5441, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA), rabbit anti-phospho-ERK(Thr202/Tyr204) (1:1000, #9101, CST, Danvers, MA, USA), rabbitanti-ERK (1:1000, # 4695, CST, Danvers, MA, USA), แอนติบอดีรอง HRP-conjugated กับหนู, แพะหรือกระต่ายถูกซื้อจาก Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA)

4.5. การยึดเกาะผิวเซลล์

เซลล์ HEK293 ที่ชุบบนแผ่นปิดถูกถ่ายด้วยพลาสมิด Flag-DCC โดยใช้วิธีแคลเซียมฟอสเฟตตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า [55] ประมาณ 40 ชั่วโมงหลังจากการทรานส์เฟกชัน เซลล์ถูกบ่มด้วย 100 µg/mL myc-Netrin-1 หรือ myc-Netrin-1 (∆407–443) เป็นเวลา 30 นาที ก่อนที่จะถูกล้างเป็นเวลา 5 นาทีด้วย HBHA (HEPES 20 มิลลิโมลาร์, pH 7.0 และ 0.5 มก./มล.LBSA ใน HBSS), ล้างด้วย 1× PBS และคงที่ตามลำดับด้วย 4% พาราฟอร์มัลดีไฮด์ inPBS เป็นเวลา 10 นาที แอนติบอดีปฐมภูมิที่ใช้คือแอนติบอดีต่อต้าน myc ของกระต่าย (1:200, Abcam, ab9106, Cambridge, MA, USA) และแอนติบอดีต่อต้านธงของเมาส์ (1:100, Sigma Aldrich, F3165)

แอนติบอดีทุติยภูมิที่ใช้คือแอนติบอดีต่อต้านหนูเมาส์แบบคอนจูเกตของ Alexa Fluor 488- (1:1000; Invitrogen, A21206) และแอนติบอดีต่อต้านเมาส์แพะแบบคอนจูเกตของ Alexa Fluor (1:1000; Invitrogen, A10036) . นิวเคลียสถูกย้อมด้วย 40,6-ไดอะมิโน-2-ฟีนิลินโดล (DAPI) (เทอร์โม ฟิชเชอร์, วอลแทม, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา) ภาพทั้งหมดได้มาจากกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล Zeiss LSM 880

4.6. GST แบบดึงลง

โปรตีนฟิวชั่น GST-DCC ได้รับการทำให้บริสุทธิ์ด้วยเม็ดบีดกลูตาไธโอน-SepharoseTM 4B (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) โดยโปรโตคอลของผู้ผลิต

ประมาณ 500 ไมโครกรัมของเซลล์ไลเซตจากเซลล์ HEK293T ที่ถูกทรานส์เฟกด้วยพลาสมิดที่ระบุถูกบ่มด้วยฟิวชันโปรตีน GST-DCC-FN5 2–5 ไมโครกรัมในบัฟเฟอร์ RIPA ที่ 4 ◦C ข้ามคืน เม็ดบีด Glutathi-one-SepharoseTM 4B ถูกใช้เพื่อจับฟิวชันโปรตีน GST-DCC-FN5 และโปรตีนที่ทำปฏิกิริยาของมัน โปรตีนที่จับกันถูกปล่อยเข้าไปในบัฟเฟอร์การโหลดโปรตีนโดยการเปลี่ยนสภาพด้วยความร้อน

4.7. การเพาะเลี้ยงเซลล์ประสาทในเยื่อหุ้มสมองปฐมภูมิ

เพาะเลี้ยงเซลล์ประสาทในเยื่อหุ้มสมองปฐมภูมิตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [56] โดยสรุป ตัวอ่อน (E17) ถูกนำออกจากหนูที่ตั้งท้องที่ถูกดมยาสลบ เปลือกสมองถูกแยกออกและสับเป็นชิ้นเล็ก ๆ

หลังจากการฟักตัวใน {{0}.125% ทริปซินพลัส ด้วย 0.05%DNase ใน HBSS ที่ 37 ◦C เป็นเวลา 20 นาที เซลล์ถูกบดด้วยปิเปตแก้วปาสเตอร์ขัดไฟและกรองด้วยตัวกรอง 40 ไมโครเมตร

เซลล์ที่แยกตัวออกถูกแขวนลอยใน DMEM ด้วย FBS 10% และชุบบนจานเคลือบโพลี-ดี-ไลซีนหรือแผ่นครอบแก้วที่อุณหภูมิ 37 ◦C ในบรรยากาศ CO2 5% หลังจากผ่านไป 4 ชั่วโมง อาหารเลี้ยงจะถูกแทนที่ด้วยอาหารเลี้ยงประสาทนิวโรเบสที่เสริมด้วย B27 และ GlutaMAX

4.8. โปรโตคอลการเพาะเลี้ยงเซลล์และการรักษา NLT

เซลล์ประสาทที่แสดงออกโดย GnRH ของเมาส์ (NLT) ได้รับการดูแลโดยห้องปฏิบัติการของเรา NLTcells ปลูกใน DMEM (Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA) ที่มี 10% FBS (อุตสาหกรรมชีวภาพ, Kibbutz Beit Haemek, อิสราเอล) และ 1% penicillin / streptomycin (Thermo FisherScientific, Waltham, MA, USA) ที่ 37 ° C ภายใต้ บรรยากาศที่มีความชื้นในอากาศ 95% และ CO2 5%

เพื่อตรวจสอบความเป็นพิษต่อระบบประสาทของเฮมิน ความเข้มข้นต่างๆ (0, 10, 30, 60, 90 และ 120 µM) ของเฮมิน (Sigma-Aldrich) ถูกเพิ่มไปยังเซลล์ NLT และทำการบำบัดเป็นเวลา 6 ชั่วโมง จากความเข้มข้นเหล่านี้ 60 ไมโครโมลาร์ (LD50) ถูกเลือกและใช้ในการทดลองครั้งต่อไป

กลุ่มควบคุมได้รับการบำบัดด้วยกระสายยา (DMSO) เท่านั้น ความมีชีวิตของเซลล์และคราบที่มีชีวิต/ทำให้ตายถูกดำเนินการ 6 ชั่วโมงหลังการบำบัด แต่ละกลุ่มใช้ 3 หลุม ทำซ้ำการทดลองอย่างน้อย 3 ครั้ง

4.9. แบบจำลองภายนอกร่างกายของการตายของเซลล์ที่ชักนำด้วยเฮมิน

การตายของเซลล์ถูกชักนำในเซลล์ประสาทเยื่อหุ้มสมองปฐมภูมิและเซลล์ NLT โดยการรักษาด้วยเฮมิน 50µM และ 60 µM ตามลำดับ ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า [57,58] เฮมินถูกละลายใน 0.1 โมลาร์ NaOH เพื่อสร้างสารละลายสต๊อก สำหรับการศึกษาการป้องกันระบบประสาท เซลล์ได้รับการบำบัดด้วยเฮมิน 6 ชม. โดยมีสารที่กำหนดอยู่ด้วยหรือโซเดียมซีลีไนต์ละลายน้ำกลั่นแบบอินดับเบิ้ล

4.10. การทดสอบ CCK-8

ความมีชีวิตของเซลล์ถูกวัดโดยการทดสอบ CCK-8 (CK04, โดจินโด, คุมาโมโตะ, ญี่ปุ่น) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [59] โดยสรุป เซลล์ประสาทถูกเพาะในเพลตหลุม 96- ที่ความหนาแน่น 6000 เซลล์/หลุมในอาหารเลี้ยงเชื้อ 100 ไมโครลิตร และป้อนในตู้ฟักข้ามคืน

เซลล์ถูกบำบัดด้วยเฮมินเป็นเวลา 6 ชั่วโมง เซลล์ประสาทถูกล้างใน PBS ที่ถูกอุ่นไว้ล่วงหน้า (37 ◦C) และรีเอเจนต์ CCK-8 (10 µL ต่อตัวกลาง 100 µL) ในแต่ละหลุม

หลังจากนั้น เราฟักแผ่นไว้เป็นเวลา 2 ชั่วโมงในบรรยากาศ CO2 5% และวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท ความมีชีวิตของเซลล์ถูกแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของกลุ่มควบคุม (เซลล์ที่ไม่ได้รับการบำบัด)

4.11. การย้อมสีแบบสด/แบบตาย

ความสามารถของการทดสอบ CCK-8 ในการวัดความมีชีวิตได้รับการตรวจสอบโดยการย้อมด้วย calceinAM/PI ใน PBS (Live/Dead Assay, KeyGEN BioTECH, หนานจิง, จีน) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต

สารละลายการย้อมสีประกอบด้วยรีเอเจนต์ AM ของแคลซีน 2 ไมโครโมลาร์และรีเอเจนต์ PI 8 ไมโครโมลาร์ที่ผสมใน PBS ตัวอย่างถูกบ่มเป็นเวลา 30 นาทีและถ่ายภาพโดยใช้เลนส์ใกล้วัตถุ 20x ของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ (Olympus FSX100, โตเกียว, ญี่ปุ่น) มีการใช้การเพาะเลี้ยงเซลล์อิสระอย่างน้อย 3 ครั้งสำหรับแบบจำลอง ในหลอดทดลอง ของการตายของเซลล์ที่เกิดจากเฮมิน

4.12. การสังเคราะห์และการบริหารเปปไทด์

Pep Ctrl (NH2-TPCCGKTDVGI-CONH2), Pep E1 (NH2- HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), Pep E2 (NH2- CPCKDGVTGIT-CONH2), Tat (NH{{11} }YGRKKRRQRRR-CONH2), TE1 (NH2- YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), FITC ติดป้าย TE1 (NH2-YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), FITC ติดป้าย Pep EGF3 (NH{{ 27}}HPVGAAGKTCNQTTGQCPCKDGVTGITCNRCAKGYQQ-CONH2), แฟล็กที่มีป้ายกำกับ Pep Ctrl(NH{30}}DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGS-TPCRCGKTYDVGI-CONH2), แฟล็กที่มีป้ายกำกับ Pep E1 (NH{36}} DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGS-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CON H2) และติดป้ายกำกับธง Pep E2 (NH2- DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGSCPCKDGVTGIT-CONH2) เปปไทด์ที่มีความบริสุทธิ์ 99% ถูกซื้อโดยบริษัท Shanghai GL Biochem (เซี่ยงไฮ้ จีน) และบริษัท Wuhan Bioyeargene Biosciences (หวู่ฮั่น ประเทศจีน)

For more information:1950477648nn@gmail.com