ผลของกรดเพอร์ฟลูออโรออกตาโนอิกต่อจุลินทรีย์ในลำไส้และเมตาบอไลต์ของจุลินทรีย์ในหนู C57BL/6JⅡ

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. สัตว์

หนูตัวผู้ C57BL/6J ปลอดเชื้อโรคเฉพาะอายุสี่สัปดาห์ถูกซื้อจากห้องปฏิบัติการแจ็คสัน (บาร์ฮาร์เบอร์, เมน, สหรัฐอเมริกา) หนูกินน้ำดื่มโดยไม่จำกัด สิ่งอำนวยความสะดวกสำหรับสัตว์ที่มหาวิทยาลัยจอร์เจียได้รับการดูแลที่อุณหภูมิ 22 ◦C และความชื้น 40−70% ภายใต้แสง 12:12 ชั่วโมง: วงจรมืด ก่อนการทดลองสัมผัสกับ PFOA หนูห้าตัวถูกเลี้ยงไว้ในกรงเดียว และหนูเปลี่ยนกรงแบบสุ่มสัปดาห์ละครั้งเป็นเวลาสี่สัปดาห์ การสัมผัส PFOA เริ่มต้นเมื่อหนูมีอายุแปดสัปดาห์และระยะเวลาการสัมผัสนานสี่สัปดาห์ ที่จุดเริ่มต้นของการทดลอง หนูถูกกำหนดให้อยู่ในกลุ่มการสัมผัส PFOA หรือกลุ่มควบคุมโดยการสุ่ม (หนู=10 ตัวในแต่ละกลุ่ม) โดยมีหนูหนึ่งตัวอยู่ในกรงเดียว PFOA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ให้กับหนูผ่านน้ำดื่ม ความเข้มข้นสุดท้ายของ PFOA ในน้ำดื่มคือ 1 ส่วนในล้านส่วน (ppm) ขนาดยาถูกเลือกตามการศึกษาก่อนหน้าของเรา [24] หนูควบคุมบริโภคน้ำดื่มโดยไม่ต้องเติม PFOA ระเบียบการเกี่ยวกับสัตว์ได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ประจำสถาบัน มหาวิทยาลัยจอร์เจีย (รหัสพิธีสาร: A2014 10-014-Y2-A1)

คลิกเพื่อแก้ไขบ้านสำหรับอาการท้องผูก

2.2. การสกัดเมตาโบไลต์

การสกัดสารเมตาบอไลท์ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [25] โดยสรุป 20 ไมโครลิตรของแต่ละตัวอย่างซีรัมถูกสกัดด้วยเมทานอล 225 ไมโครลิตร ตัวอย่างถูกหมุนวนเป็นเวลา 10 วินาที จากนั้น เติมเมทิล เติร์ต-บิวทิล อีเทอร์ (MTBE) 750 ไมโครลิตร และน้ำ 188 ไมโครลิตร ไปยังตัวอย่างข้างต้นเพื่อกระตุ้นการแยกเฟส ตัวอย่างถูกเขย่าที่ 4 ◦C เป็นเวลา 6 นาที ตามด้วยการปั่นแยกที่ 14,000× g เป็นเวลา 2 นาที ตัวทำละลายในการสกัดถูกไล่ก๊าซและทำให้เย็นล่วงหน้าที่ -20 ◦C เฟสไม่มีขั้วด้านบน (350 ไมโครลิตร) ถูกรวบรวมและระเหยเพื่อทำให้แห้งโดยสมบูรณ์โดยใช้หัวจับความเย็น Labconco Centrivap (Labconco, แคนซัส, มิสซูรี, สหรัฐอเมริกา) สำหรับตัวอย่างตับและอุจจาระ เมทานอล 225 µL และ 750 µLMTBE ถูกเติมไปยัง 10 มก. ของแต่ละตัวอย่าง ตัวอย่างถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันโดยใช้ aGenoGrinder 2010 (SPEX SamplePrep, Metuchen, NJ, USA) ที่ความเร็ว 1500 รอบต่อนาทีสำหรับทราย 30 เม็ด จากนั้นจึงหมุนวนและเขย่าที่ 4 ◦C เป็นเวลา 6 นาที จากนั้น เติมน้ำ 188 ไมโครลิตรลงในตัวอย่าง ตามด้วยการปั่นเหวี่ยงที่ 14,000× กรัม เป็นเวลา 2 นาที เฟสไม่มีขั้วตอนบน (350 ไมโครลิตร) ถูกรวบรวมและระเหยเพื่อทำให้แห้งสนิท จากนั้นตัวอย่างที่แห้งถูกแขวนลอยใหม่ในอะซีโตไนไตรล์ 60 ไมโครลิตร 4:1 และน้ำ (ปริมาตร/ปริมาตร) ด้วยมาตรฐานภายใน ตัวอย่างถูกหมุนวน ตามด้วยโซนิเคชันเป็นเวลา 5 นาที และการหมุนเหวี่ยงที่ 14,000× กรัม เป็นเวลา 2 นาที ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกรวบรวมสำหรับการวิเคราะห์ LC-MS

2.3. การทำโปรไฟล์เมตาโบโลมิกส์ที่ไม่ตรงเป้าหมาย

การทำโปรไฟล์เมแทบอลิซึมที่ไม่ตรงเป้าหมายได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [25] ระบบ Vanquish UHPLC (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) ใช้สำหรับการแยกสารด้วยคอลัมน์ Acquity UPLC BEH Amide (15 0 มม. × 2.1 มม. × 1.7 µm) ซึ่งควบคู่กับ Acquity VanGuard BEH Amide ก่อน คอลัมน์ (5 มม. × 2.1 มม. × 1.7 µm, วอเตอร์, มิลฟอร์ด, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา) น้ำเกรด LC-MS (100%) ที่มีรูปแบบแอมโมเนียม 10 มิลลิโมลาร์ และกรดฟอร์มิก 0.125% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO , USA) ถูกใช้เป็นเฟสเคลื่อนที่ A ในขณะเดียวกัน 95:5 อะซีโตไนไตรล์: น้ำ (ปริมาตร/ปริมาตร) ที่มีแอมโมเนียมฟอร์เมต 10 มิลลิโมลาร์ และกรดฟอร์มิก 0.125% ถูกใช้เป็นเฟสเคลื่อนที่ B การไล่ระดับเริ่มต้นด้วย 100% B ที่ 0– 2 นาที 70% ค้างคาว 7.7 นาที 40% B ที่ 9.5 นาที และ 30% B ที่ 10.25 นาที ตามด้วย 100% B ที่ 12.75–16.75 นาที อัตราการไหลถูกคงไว้ที่ 0.4 มล./นาที รวบรวมสเปกตรัมในโหมดบวกด้วยอิเล็กโทรสเปรย์ไอออไนเซชัน (ESI) โดยใช้ Q-Exactive HF (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) ช่วงมวลถูกตั้งค่าจาก m/z 60 ถึง 900 พร้อมด้วยโหมดที่ขึ้นกับข้อมูลสำหรับการได้มาซึ่งสเปกตรัม MS/MS ข้อมูลดิบด้านเมตาโบโลมิกส์ที่ไม่ได้กำหนดเป้าหมายถูกแปลงเป็นไฟล์ ABF เป็นครั้งแรกโดยใช้ตัวแปลง ABF (https://www.reifycs.com/AbfConverter/ (เข้าถึงเมื่อวันที่ 6 กรกฎาคม 2022)) MSDIAL เวอร์ชัน 5.1.0.1 ใช้สำหรับการระบุและการหาปริมาณของสารเมตาบอไลต์ [26] เครื่องมือเพิ่มประสิทธิภาพรายการคุณลักษณะสเปกตรัม (MS-FLO) ถูกนำมาใช้เพื่อปรับปรุงรายการคุณลักษณะด้านคุณภาพโดยการตั้งค่าสถานะคุณลักษณะสำหรับการดูแลข้อมูลเพิ่มเติม [27] เวลาการเก็บรักษา m/z ไลบรารีและฐานข้อมูลสเปกตรัม Fiehn HILIC MS/MS ใน MassBank แห่งอเมริกาเหนือถูกนำมาใช้เพื่อระบุสารเมตาบอไลต์

2.4. การจัดลำดับยีน 16S rRNA

DNA ทั้งหมดถูกสกัดจากตัวอย่างอุจจาระโดยใช้ชุดแยก PowerSoil® DNA (MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ไพรเมอร์ 515F และ 806R ถูกนำมาใช้เพื่อขยายขอบเขต V4 ของยีน 16S rRNA ตามด้วย โดยการทำให้เป็นมาตรฐานและบาร์โค้ด DNA ถูกจัดลำดับบนชุด IlluminaMiSeq v2 ด้วย 500 รอบ ข้อมูลการจัดลำดับยีน 16S rRNA ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ข้อมูลเชิงลึกเชิงปริมาณในระบบนิเวศน์ของจุลินทรีย์ (QIIME) II [28] โดยสรุป ข้อมูลลำดับดิบถูก denoise ผ่าน DADA2 ตามด้วยการเลือกหน่วยอนุกรมวิธานปฏิบัติการ (OTU) SILVA (เวอร์ชัน 138) ซึ่งได้รับการฝึกฝนโดยตัวแยกประเภทที่ใช้ scikit-learn Naïve-Bayes ถูกนำมาใช้เป็นฐานข้อมูล asa

2.5. การวิเคราะห์ทางสถิติ

ขนาดผลการวิเคราะห์จำแนกเชิงเส้น (LEfSe) ถูกนำมาใช้เพื่อกำหนดประเภทของแบคทีเรียที่มีแนวโน้มที่จะอธิบายความแตกต่างระหว่าง PFOA และกลุ่มควบคุมมากที่สุด [29] สำหรับการเปรียบเทียบสารเมตาบอไลต์ การทดสอบ Mann−Whitney U ใช้เพื่อคำนวณค่า p ระหว่าง PFOA และกลุ่มควบคุม อัตราการค้นพบที่ผิดพลาดถูกนำมาใช้เพื่อแก้ไขการเปรียบเทียบหลายรายการ เมตาบอไลต์ที่มีค่า p < 0.05 ได้รับการพิจารณาว่ามีนัยสำคัญ การวิเคราะห์จำแนกกำลังสองน้อยที่สุดบางส่วน (PLS-DA) และการวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าของวิถีได้ดำเนินการโดยใช้ MetaboAnalyst 5.0 [30] MixOmics ใช้สำหรับการวิเคราะห์เชิงบูรณาการของจุลินทรีย์ในลำไส้และสารเมตาโบไลต์ในอุจจาระ ซึ่งเป็นกรอบการทำงานเชิงบูรณาการสำหรับการวิเคราะห์ข้อมูล omics หลายตัวแปร [31]

ยาสมุนไพรธรรมชาติบรรเทาอาการท้องผูก-Cistanche

Cistanche เป็นพืชสกุลกาฝากที่อยู่ในวงศ์ Orobanchaceae พืชเหล่านี้ขึ้นชื่อในด้านคุณสมบัติทางยาและมีการใช้ในการแพทย์แผนจีน (TCM) มานานหลายศตวรรษ พันธุ์ Cistanche มักพบในพื้นที่แห้งแล้งและทะเลทรายของจีน มองโกเลีย และส่วนอื่นๆ ของเอเชียกลาง พืช Cistanche มีลักษณะลำต้นที่มีเนื้อสีเหลือง และมีคุณค่าสูงในด้านประโยชน์ต่อสุขภาพ ใน TCM เชื่อกันว่า Cistanche มีคุณสมบัติในการบำรุง และมักใช้ในการบำรุงไต เพิ่มความมีชีวิตชีวา และสนับสนุนการทำงานทางเพศ นอกจากนี้ยังใช้เพื่อแก้ไขปัญหาที่เกี่ยวข้องกับความชรา ความเหนื่อยล้า และความเป็นอยู่โดยรวม แม้ว่า Cistanche จะมีประวัติการใช้มายาวนานในการแพทย์แผนโบราณ แต่การวิจัยทางวิทยาศาสตร์เกี่ยวกับประสิทธิภาพและความปลอดภัยของยายังคงดำเนินต่อไปและจำกัด อย่างไรก็ตาม เป็นที่ทราบกันดีว่ามีสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพหลายชนิด เช่น ฟีนิลลีธานอยด์ไกลโคไซด์ ไอริดอยด์ ลิกแนน และโพลีแซ็กคาไรด์ ซึ่งอาจมีส่วนทำให้เกิดผลทางยาได้

เวซิสตานช์ผงซิสแทนช์, เม็ดซิสแทนช์, แคปซูลซิสแทนเช่และผลิตภัณฑ์อื่นๆได้รับการพัฒนาโดยใช้ทะเลทรายถังน้ำเป็นวัตถุดิบซึ่งล้วนมีผลดีต่อการบรรเทาอาการท้องผูก กลไกเฉพาะมีดังนี้: เชื่อกันว่า Cistanche อาจมีประโยชน์ในการบรรเทาอาการท้องผูกโดยพิจารณาจากการใช้แบบดั้งเดิมและสารประกอบบางชนิดที่มีอยู่ แม้ว่าการวิจัยทางวิทยาศาสตร์โดยเฉพาะเกี่ยวกับผลกระทบของ Cistanche ต่ออาการท้องผูกนั้นมีจำกัด แต่เชื่อกันว่ามีกลไกหลายอย่างที่อาจมีส่วนช่วยในการบรรเทาอาการท้องผูกได้ ผลยาระบาย:ซิสแทนเช่มีการใช้กันมานานในการแพทย์แผนจีนเพื่อแก้อาการท้องผูก เชื่อกันว่ามีฤทธิ์เป็นยาระบายอ่อนๆ ซึ่งสามารถช่วยส่งเสริมการเคลื่อนไหวของลำไส้และทำให้ท้องผูกได้ ผลกระทบนี้อาจเกิดจากสารประกอบต่างๆ ใน ​​Cistanche เช่น ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์และโพลีแซ็กคาไรด์ การทำให้ลำไส้ชุ่มชื้น: จากการใช้แบบดั้งเดิม Cistanche ถือว่ามีคุณสมบัติในการให้ความชุ่มชื้น โดยเฉพาะสำหรับลำไส้ การส่งเสริมความชุ่มชื้นและการหล่อลื่นของลำไส้อาจช่วยให้เครื่องมือนิ่มลงและช่วยให้ขับผ่านได้ง่ายขึ้น ซึ่งช่วยบรรเทาอาการท้องผูกได้ ผลต้านการอักเสบ: บางครั้งอาการท้องผูกอาจเกี่ยวข้องกับการอักเสบในระบบทางเดินอาหาร Cistanche มีสารประกอบบางชนิด รวมถึงฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์และลิกแนน ซึ่งเชื่อกันว่ามีคุณสมบัติต้านการอักเสบ การลดการอักเสบในลำไส้อาจช่วยให้การเคลื่อนไหวของลำไส้สม่ำเสมอและบรรเทาอาการท้องผูกได้