ผลของไกลโอไซด์ของซีสแตนเช่ต่อการรับรู้การเรียนรู้และพลาสติกซินแนปติกในหนูแบบจำลองการอดนอน

เชิงนามธรรม

วัตถุประสงค์: 'เพื่อสำรวจว่าไกลโคไซด์ของซิสตานเช่สามารถปรับปรุงการเรียนรู้และการทำงานของการรับรู้ของการอดนอนหนูโมเดลโดยควบคุมความเป็นพลาสติกแบบซินแนปติก- วิธีการ: หนูวิสตาร์เพศผู้จำนวน 50 ตัวถูกสุ่มแบ่งออกเป็นกลุ่มควบคุมเปล่า (กลุ่มควบคุม) กลุ่มควบคุมแพลตฟอร์ม (PC) กลุ่มแบบจำลอง (แบบจำลอง)ไกลโคไซด์ของกลุ่มซิสตานช์( GCs) และกลุ่มเอสตาโซแลม ( Est) แบบจำลองการอดนอนของหนูจัดทำโดยวิธีแก้ไขสภาพแวดล้อมทางน้ำแบบหลายแพลตฟอร์ม เขาวงกตน้ำมอร์ริสและการทดสอบภาคสนามถูกนำมาใช้เพื่อตรวจจับหนูฟังก์ชันการรับรู้เชิงพื้นที่และการเปลี่ยนแปลงทางอารมณ์ การย้อมสี Nissl ใช้เพื่อสังเกตการเปลี่ยนแปลงในสัณฐานวิทยาและปริมาณของเซลล์ประสาทในพื้นที่ hippocampal CAl ของหนู Western blot และ R'T - PCl ถูกใช้เพื่อตรวจจับระดับการแสดงออกของ synaptophysin (SYN), สารหนาแน่นของเยื่อโพสซินแนปติก 95 ( PSD - 95 ) และปัจจัย neurotrophic ที่ได้มาจากสมอง ( BDNF) ผลลัพธ์: ผลลัพธ์เขาวงกตน้ำของมอร์ริสแสดงให้เห็นว่าเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมการเรียนรู้และความสามารถทางปัญญาของหนูในกลุ่ม Model ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (P<0. 05 ), and theฟังก์ชั่นการเรียนรู้และความจำของหนูได้รับการปรับปรุงการรักษา GCs (P<0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05), the resting time increased ( P<0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T' - PCR showed that the protein and gene expression levels of BDNF, SYN, and PSD -95 in the Model group were significantly decreased ( P <0. 05), while after treatment with GCs, the expression levels of BDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05).

บทสรุป: ไกลโคไซด์ของ cistancheอาจส่งผลต่อความเป็นพลาสติกของซินแนปติกโดยการควบคุมการแสดงออกของเครื่องหมายที่เกี่ยวข้องกับซินแนปติก ซึ่งจะช่วยปรับปรุงการเรียนรู้และการทำงานของการรับรู้ของหนูแบบจำลองการอดนอน

คำสำคัญไกลโคไซด์ของ cistanche; ฮิปโปแคมปัส; การอดนอน; การเรียนรู้และความทรงจำ ความวิตกกังวล; ความเป็นพลาสติกแบบซินแนปติก

ขายไกลโคไซด์ระดับสูงของ CISTANCHE

ความผิดปกติของการนอนหลับ (SD)คือความผิดปกติของการนอนหลับเกิดจากปัจจัยที่ซับซ้อนหลายอย่าง เช่น การนอนไม่หลับ ฝันบ่อย และการตื่นง่าย อุบัติการณ์ของ SD ค่อยๆ เพิ่มขึ้นในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา การศึกษาที่เกี่ยวข้องรายงานว่า SD สามารถทำให้เกิดได้โรคหลอดเลือดหัวใจ, ความผิดปกติของการเผาผลาญ, โรคภูมิคุ้มกันและโรคความเสื่อมของระบบประสาทส่วนกลาง เช่น โรคอัลไซเมอร์ [1] SD อาจทำให้เกิดความเสียหายจากออกซิเดชันต่อเซลล์ประสาทฮิปโปแคมปัส ทำให้เกิดความผิดปกติทางสติปัญญา และทำให้อารมณ์เปลี่ยนแปลง เช่น ความวิตกกังวลและภาวะซึมเศร้า [2] Cistanche Deserticola เป็นยาจีนอันล้ำค่าที่สามารถใช้เป็นยาและอาหารได้ มีฤทธิ์ในการปรับสภาพไตและเติมพลังชี่ ทำให้ลำไส้ชุ่มชื้น ส่งเสริมการขับถ่าย และเสริมพลังหยาง สารสกัดหลักของ Cistanche Deserticola, glycosides of cistanche (GCs) มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ ต้านการตายของเซลล์ ปกป้องตับ และปกป้องระบบประสาท [3] การวิจัยก่อนหน้านี้ของเราพบว่า GC สามารถปรับปรุงการเรียนรู้และการทำงานของการรับรู้ของหนู SAMP8 ได้โดยมีบทบาทเป็นสารต้านอนุมูลอิสระและต่อต้านการตายของเซลล์ [4] การศึกษาที่เกี่ยวข้องแสดงให้เห็นว่าความผิดปกติทางความรู้ความเข้าใจที่เกิดจาก SD มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับความเป็นพลาสติกของซินแนปติก [5] อย่างไรก็ตาม มีรายงานไม่กี่ฉบับเกี่ยวกับกลไกที่ GCs ควบคุมความเป็นพลาสติกของซินแนปติก และปรับปรุงการเรียนรู้และความจำเสื่อม และการรับรู้ลดลงในหนูที่เกิดจากการอดนอน ดังนั้น การศึกษานี้จึงมีจุดมุ่งหมายเพื่อสำรวจว่า GC ส่งผลต่อความเป็นพลาสติกแบบซินแนปติกหรือไม่ โดยการควบคุมการแสดงออกของเครื่องหมายที่เกี่ยวข้องกับไซแนปติก ซึ่งจะช่วยปรับปรุงฟังก์ชันการเรียนรู้และการรับรู้ของหนูในรูปแบบการอดนอน และให้แนวคิดและแผนการรักษาใหม่ๆ สำหรับการบำบัดการเรียนรู้และ ความบกพร่องทางสติปัญญาที่เกิดจากความผิดปกติของการนอนหลับกับ GCs

1 วัสดุและวิธีการ

1. สัตว์ทดลอง 1 ตัว

หนูวิสตาร์เพศผู้อายุ 6 ถึง 8 สัปดาห์ น้ำหนัก 280 ถึง 300 กรัม ซื้อจาก Beijing Sibeifu โดยมีใบอนุญาตการผลิตสัตว์ [SCXK (ปักกิ่ง) 2019-0010] สัตว์ทุกตัวถูกเก็บไว้ในศูนย์ทดลองสัตว์ของวิทยาลัยการแพทย์เป่าโถวภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้: อุณหภูมิ (24 ± 1) องศา ความชื้น 50% ถึง 55% แสงสว่าง 12 ชั่วโมง และความมืด 12 ชั่วโมง และไม่มีข้อจำกัดด้านอาหารและน้ำ การทดลองนี้ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมของโรงเรียน [Baoyi Lunshen 2022 ฉบับที่ (63)]

1. 2 รีเอเจนต์และเครื่องมือหลัก

ไกลโคไซด์ทั้งหมดของ Cistanche Deserticola ถูกซื้อจาก Shaanxi Baoji Cosmeceuticals Development Co., Ltd. (หมายเลขแบทช์: KSM20220609011); ซื้อแท็บเล็ต Estazolam จาก CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (หมายเลขแบทช์: 044220343); บัฟเฟอร์การโหลดโปรตีน (P1015), บัฟเฟอร์ RIPA lysis (R0010), สารละลายเคมีเรืองแสง (PE0010) ฯลฯ ล้วนซื้อจาก Beijing Solebao สารความหนาแน่นโพสต์ซินแนปติก 95 (PSD -95) แอนติบอดี (AB192757), แอนติบอดีซินแนปโตฟิซิน (SYN) (ab32127) ซื้อจาก Abcam สหรัฐอเมริกา; ปัจจัย neurotrophic ที่ได้มาจากสมอง (BDNF) (48503-2), -actin (52901) ซื้อจาก SAB สหรัฐอเมริกา; แอนติบอดีรอง IgG ต่อต้านกระต่ายแพะ (SA00001-20) ซื้อจาก Proteintech สหรัฐอเมริกา; เมลาโทนินของหนู (MT), ชุด ELISA (MM-0657R1) ซื้อจาก Jiangsu Enzyme Immunity Industry Co., Ltd. เครื่องแบ่งพาราฟิน (ไลก้า ประเทศเยอรมนี); กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง (Leica, เยอรมนี); เขาวงกตน้ำมอร์ริส กล่องทดสอบสนามเปิด (เซี่ยงไฮ้ซินร่วน); เครื่องมืออิเล็กโทรโฟรีซิสแนวตั้ง

(บริษัทปักกิ่ง หลิวอี้); เครื่องปั่นลดสี (บริษัท Beijing Liuyi); ระบบวิเคราะห์ภาพโปรตีน (Shanghai Tanon Technology) เครื่องมือ PCR เชิงปริมาณเรืองแสง (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.)

1. 3 วิธีการทดลอง

1.3.1 การจัดกลุ่มสัตว์และการให้ยา

หนูวิสตาร์เพศผู้ 50 ตัวถูกสุ่มแบ่งออกเป็นกลุ่มควบคุมเปล่า (กลุ่มควบคุม) กลุ่มควบคุมแพลตฟอร์ม (กลุ่มควบคุมแบบแพลตฟอร์ม กลุ่ม PC) กลุ่มแบบจำลอง (กลุ่มแบบจำลอง) ไกลโคไซด์รวมของกลุ่ม Cistanche Deserticola (กลุ่ม GCs , 50 มก./กก.) และกลุ่มเอสตาโซลา (กลุ่มเอสต์ 0.54 มก./กก.) โดยมีหนู 10 ตัวในแต่ละกลุ่ม กลุ่มควบคุมและกลุ่ม PC ได้รับน้ำเกลือ 0.9% โดยสายยาง ทุกกลุ่มได้รับการดูแลบ่อน้ำในเวลา 7.00 น. ทุกวันหลังจากการสร้างแบบจำลองเริ่มขึ้น และระบบระบายน้ำทิ้งจะคงอยู่เป็นเวลา 21 วัน

1. 3. 2. การจัดทำแบบจำลองสัตว์อดนอน

แบบจำลองการกีดกันการนอนหลับถูกสร้างขึ้นโดยใช้วิธีสภาพแวดล้อมทางน้ำหลายแพลตฟอร์มที่ได้รับการดัดแปลง [6] อุปกรณ์ทดลองคือถังเก็บน้ำโพลีเอทิลีนเรซินทรงสี่เหลี่ยมขนาด 130 ซม. × 50 ซม. × 45 ซม. วางแท่นขนาดเล็กที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 5 ซม. และสูง 20 ซม. ไว้ในถังเก็บน้ำ แท่นของกลุ่มพีซีมีเส้นผ่านศูนย์กลาง 10 ซม. และสูง 20 ซม. ถังเก็บน้ำเต็มไปด้วยน้ำที่ระดับความลึกประมาณ 18 ซม. และรักษาอุณหภูมิของน้ำไว้ที่ (20 ± 1) องศา หนึ่งสัปดาห์ก่อนเริ่มการทดลอง หนูจะถูกวางในกล่องป้องกันการอดนอนทุกวันเป็นเวลา 60 นาทีเพื่อทำความคุ้นเคยกับสภาพแวดล้อม หลังจากสร้างแบบจำลองแล้ว ยกเว้นกลุ่มควบคุม หนูของแต่ละกลุ่มจะถูกวางบนแท่นขนาดเล็กตรงเวลาตั้งแต่ 8.00 น. ถึง 20.00 น. ทุกวัน เพื่อการอดนอนเป็นเวลา 21 วันติดต่อกัน หนูทุกตัวได้รับอนุญาตให้กินและดื่มได้อย่างอิสระ และเคลื่อนไหวได้อย่างอิสระบนแท่น โดยจะมีการสลับแสงและความมืดเป็นเวลา 12 ชั่วโมงทุกวัน

1.3.3 การทดลองเขาวงกตน้ำมอร์ริส

เขาวงกตน้ำมอร์ริสถูกแบ่งออกเป็น 4 พื้นที่ ซึ่งเต็มไปด้วยน้ำ และแท่นนั้นถูกวางไว้ในจตุภาคที่ 4 ผิวน้ำอยู่เหนือแท่นประมาณ 2 ซม. เติมเมลานินที่กินได้เกรดอาหารลงในน้ำ และรักษาอุณหภูมิของน้ำไว้ที่ (25 ± 1) องศา (1) การทดลองการนำทางด้วยตำแหน่ง: เลือกจุดศูนย์กลางของแต่ละพื้นที่และวางหนูลงในน้ำอย่างนุ่มนวล พวกเขาได้รับอนุญาตให้สำรวจได้อย่างอิสระ บันทึกเวลาที่หนูใช้ในการค้นหาแพลตฟอร์มเป้าหมายภายใน 60 วินาที หนูที่ไม่พบแท่นจะถูกนำทางไปยังแท่นและคงอยู่เป็นเวลา 20 วินาที การฝึกอบรมดำเนินไปเป็นเวลา 5 วัน (2) การทดสอบการสำรวจเชิงพื้นที่: ในวันที่ 6 แท่นถูกถอดออกและวางหนูไว้ในน้ำจากศูนย์กลางของจตุภาคที่ 2 กับผนัง จำนวนครั้งที่หนูผ่านแท่นภายใน 120 วินาที และเวลาที่พวกมันอยู่ในจตุภาคที่ 4 ได้รับการบันทึก

1.3. 4 การทดลองภาคสนามแบบเปิด

มีการใช้กล่องทดลองขนาด 100 ซม. × 100 ซม. × 50 ซม. และด้านล่างของกล่องแบ่งออกเป็น 9 ตาราง หนูแต่ละกลุ่มถูกวางไว้ในห้องทดลองทุ่งโล่งล่วงหน้าเพื่อปรับให้เข้ากับสภาพแวดล้อมภายในอาคารเป็นเวลา 60 นาที ในช่วงเริ่มต้นของการทดลอง วางหนูทดสอบไว้ที่มุมคงที่ของกล่องทดลองแบบเปิด และจำนวนเวลายืน ระยะการเคลื่อนไหว และเวลาคงที่ของหนูภายใน 5 นาที ได้รับการบันทึกโดยใช้ซอฟต์แวร์วิเคราะห์พฤติกรรม . สภาพแวดล้อมจำเป็นต้องเงียบในระหว่างการทดลอง และอุปกรณ์ทดลองถูกเช็ดด้วยน้ำสะอาดและแอลกอฮอล์ตามลำดับระหว่างการทดลองสองครั้ง เพื่อหลีกเลี่ยงกลิ่นของหนูตัวก่อนหน้าที่ส่งผลต่อการตัดสินพฤติกรรมของหนูตัวถัดไป

1. 3. 5 การทดสอบเอนไซม์ที่เชื่อมโยงกับอิมมูโนซอร์เบนท์ (ELISA)

การตรวจหาระดับ MT ในซีรั่มในหนู หนูได้รับการดมยาสลบโดยการฉีดเข้าช่องท้อง และเก็บเลือด 5 มล. จากหลอดเลือดเอออร์ตาในช่องท้อง หลังจากรอเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง เลือดถูกปั่นแยกเพื่อให้ได้ซีรั่ม เติมสารเจือจางตัวอย่าง 40 ไมโครลิตรลงในแต่ละหลุม และจากนั้นตัวอย่าง 10 ไมโครลิตรที่จะทดสอบถูกเติม หลังจากปิดผนึกด้วยฟิล์มปิดผนึกแล้ว ให้บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศา เป็นเวลา 30 นาที ล้าง 5 ครั้ง เติมสารละลายฉลากเอนไซม์ 50 ไมโครลิตร และบ่มที่ 37 องศา เป็นเวลา 30 นาที หลังจากปิดผนึกด้วยฟิล์มปิดผนึก ล้าง 5 ครั้ง จากนั้นเติมสารละลายเร่งสีและสารละลายหยุดปฏิกิริยาตามลำดับ ค่า OD ของแต่ละหลุมวัดโดยเครื่องมือติดฉลากเอนไซม์ที่ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตร

１ ３. ６ การย้อมสี Nissl

แต่ละกลุ่มนำหนูสามตัวออกมา และเนื้อเยื่อสมองถูกเอาออกโดยการตัดหัว เนื้อเยื่อสมองได้รับการแก้ไขด้วยสารละลายโพลีเมทิลเมทาคริเลต 4% และเนื้อเยื่อถูกทำให้ขาดน้ำ แช่ในสารละลายขี้ผึ้ง และฝังไว้ และเนื้อเยื่อถูกหั่นด้วยวิธีธรรมดา ชิ้นถูกเก็บไว้ที่ความหนา 5 ไมโครเมตร ล้างด้วย PBS ย้อมด้วย 0 โทลูอิดีน บลู 1% สำหรับ 0 5 ชั่วโมง แยกความแตกต่างด้วยแอลกอฮอล์ 95% ทำให้แห้งด้วยแอลกอฮอล์ 100% ทำให้โปร่งใสด้วยไซลีน และผนึกด้วยเหงือกที่เป็นกลาง การเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาและจำนวนเซลล์ประสาทในภูมิภาค CA1 ของหนูฮิปโปแคมปัสถูกสังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์และรวบรวมภาพ

１ ３. 7 การทดลองแบบ Western blot

มีการคัดเลือกหนูสี่ตัวจากแต่ละกลุ่ม และฮิบโปแคมปัสถูกแยกโดยการตัดหัว เนื้อเยื่อฮิบโปผสมกับบัฟเฟอร์ RIP A lysis ในสภาพแวดล้อมอ่างน้ำแข็งและปั่นแยกเพื่อให้ได้ส่วนลอยเหนือตะกอน ตรวจพบความเข้มข้นของโปรตีนโดยวิธี BCA เติมโปรตีน 20 ไมโครกรัมด้วยบัฟเฟอร์การโหลดโปรตีนสำหรับอิเล็กโตรโฟรีซิส หลังจากโปรตีนอิเล็กโตรโฟเรซิสเสร็จสมบูรณ์ เมมเบรนถูกถ่ายโอนที่การไหลคงที่ 300 mA ซึ่งปิดกั้นด้วยนมผงพร่องมันเนย 5% แอนติบอดีปฐมภูมิถูกบ่มที่ 4 องศาข้ามคืน และแอนติบอดีทุติยภูมิถูกบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 ชั่วโมง หลังจากใช้สารละลายการพัฒนาสีแล้ว ระบบการวิเคราะห์ด้วยภาพเคมีเรืองแสงถูกนำมาใช้สำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติของแถบโปรตีน

1. 3. การทดลอง RT-PCR 8 ครั้ง

หนูสามตัวถูกเลือกจากแต่ละกลุ่มเพื่อเตรียมเนื้อเยื่อฮิบโปแคมปัสให้เป็นเนื้อเดียวกัน RNA ทั้งหมดในของเหลวในเนื้อเยื่อถูกสกัดโดยวิธี Trizol และวัดความเข้มข้น ชุดการสังเคราะห์ cDNA ขณะอดอาหารถูกใช้สำหรับการถอดรหัสแบบย้อนกลับ และใช้ปฏิกิริยาการขยายเชิงปริมาณเรืองแสงเพื่อตรวจจับระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ของ mRNA โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับซินแนปติกโดยใช้ชุดตรวจเชิงปริมาณฟลูออเรสเซนซ์ ผลลัพธ์ถูกวิเคราะห์โดยใช้ 2-ΔΔCt และลำดับไพรเมอร์ถูกแสดงไว้ในตารางที่ 1

1.4 วิธีการทางสถิติ

ผลลัพธ์ข้อมูลที่สอดคล้องกับการแจกแจงแบบปกติแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (x ± s) และทำการวิเคราะห์ทางสถิติโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism 9.5 การวิเคราะห์ความแปรปรวนด้วยปัจจัยเดียวใช้เพื่อการเปรียบเทียบระหว่างตัวอย่างหลายตัวอย่าง และ P < 0.05 บ่งชี้ว่าความแตกต่างมีนัยสำคัญทางสถิติ