Echinacoside ชะลอการเสื่อมสภาพของเซลล์ของเซลล์ไฟโบรบลาสติกของมนุษย์ MRC-5

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

สารออกฤทธิ์ของ Cistanche: echinacoside ต่อต้านริ้วรอยอย่างไร?

Hong Xie 1, Hui Zhu1,2, Cong Cheng1, Yu Liang1, Zhao Wang1

ในการศึกษานี้ ได้ทำการศึกษาผลกระทบของเอไคนาโคไซด์ ซึ่งเป็นฟีนิลเลทานอยด์ตัวหนึ่งที่แยกได้จากลำต้นของซิสทานเชส ซัลซ่า ยาสมุนไพรแผนจีน ต่อเซลล์ MRC-5 ของปอดในปอดของมนุษย์ กิจกรรมของการเพิ่มจำนวนเซลล์ได้รับการประเมินด้วย Alamar Blue ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการรักษาด้วยอิชินาโคไซด์สามารถชะลอความชราได้ ผลลัพธ์ของโฟลไซโตเมทรีแสดงให้เห็นว่าอิชินาโคไซด์สามารถกระตุ้นเซลล์ในระยะ G1 เพื่อเข้าสู่เฟส S และเฟส G2 และสามารถปรับปรุงการย่อยสลาย ROS ได้ ผลจากการทดสอบดาวหางบ่งชี้ว่าอิไคนาโคไซด์สามารถปกป้องเซลล์จากความเสียหายของดีเอ็นเอได้ ซึ่งช่วยอธิบายกลไกของผลกระทบของมันได้บางส่วน จากผลการวิจัยทั้งหมดข้างต้นชี้ให้เห็นว่า echinacoside มีฤทธิ์ในการต่อต้านการชราภาพ

Cistanche deserticola มีเอฟเฟกต์มากมาย คลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

1. บทนำ

เซลล์ปกติที่เพาะเลี้ยงในหลอดทดลองจะเพิ่มจำนวนขึ้นสำหรับการเพิ่มจำนวนประชากรเป็นสองเท่าในจำนวนที่จำกัด ('ขีดจำกัด Hayflflick') และเข้าสู่ระยะของการชราภาพจำลอง เซลล์ชราภาพได้รับการหยุดการเจริญเติบโตของเซลล์ในระยะ G1 และการเปลี่ยนแปลงในสัณฐานวิทยาและเมแทบอลิซึม ซึ่งรวมถึงการขยายเซลล์ การเพิ่มการสร้างไบโอเจเนซิสของไลโซโซม และการแสดงออกของกิจกรรม -กาแลคโตซิเดสที่สูงขึ้นที่ pH 6 (กาแลคโตซิเดสที่เกี่ยวข้องกับการชราภาพ, SA- - -Gal ) (Hayflflick และ Moorhead 1961; Dimri 1995) การสะสมของเซลล์ในวัยชราทำนายการลดลงที่เกี่ยวข้องกับอายุในเนื้อเยื่อ/อวัยวะฟังก์ชั่น. ในการเข้าถึงวิธีการชะลอหรือย้อนวัย ความพยายามในการค้นหาสารต่อต้านวัยที่ออกฤทธิ์ได้ไม่เคยหยุดนิ่งเอ็กไคนาโคไซด์เป็นหนึ่งใน phenylethanoids ที่แยกได้จากลำต้นของCistanches ซัลซ่า, ยาสมุนไพรแผนโบราณของจีน ที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพที่มีศักยภาพ ทั้งในฐานะต้านซีรัมและantifatigueตัวแทน (Deng et al. 2004; Xiong et al. 1996) มีรายงานว่ามีพฤติกรรมในหลอดทดลองในฐานะผู้ที่มีศักยภาพฟรีหัวรุนแรงคนเก็บขยะ(Facino et al. 1995) และการจัดแสดงสารป้องกันประสาทกิจกรรมในหลอดทดลองและในร่างกาย (Koo et al. 2005; Geng et al. 2007) Echinacoside อาจเป็นตัวเลือกสำหรับสารต่อต้านริ้วรอย และกิจกรรมการต่อต้านริ้วรอยอาจเป็นคุณสมบัติทางชีววิทยาอย่างหนึ่งของ Echinacoside ดังนั้น เราจึงบำบัด MRC ของเอ็มบริโอในปอดของมนุษย์ที่ชราภาพแล้ว-5ด้วยเอไคนาโคไซด์ โดยคาดหวังว่าจะสามารถชะลอหรือย้อนความชราได้

2. การสอบสวนและผลลัพธ์

ประการแรก เราเพิ่มอิไคนาโคไซด์ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อตรวจสอบอิทธิพลที่มีต่อการเจริญเติบโตของเซลล์และวัฏจักรของเซลล์ พบว่าความมีชีวิตของเซลล์ที่ได้รับ echinacoside เป็นเวลา 48 ชั่วโมงเพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม เมื่อความเข้มข้นเพิ่มขึ้น (รูปที่ 1A) ซึ่งบ่งชี้ว่า echinacoside ช่วยให้เซลล์ชราภาพเจริญพันธุ์ ผลการย้อมสี SA- Gal แสดงให้เห็นว่าระดับของ SA- -Gal ลดลงอย่างเห็นได้ชัดหลังการรักษาด้วย echinacoside (ไม่แสดงข้อมูล) ซึ่งบ่งชี้ว่าส่วนหนึ่งของเซลล์ชราภาพกลับจากการชราภาพ เพื่อยืนยันว่าเซลล์ในวัยชราถูกกระตุ้นโดยเอไคนาโคไซด์จริงๆ หรือไม่ ไซโตเมตรีเพื่อนจึงถูกนำมาใช้เพื่อตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงเฟสของวัฏจักรเซลล์ของเซลล์ MRC-5 ที่ชราภาพหลังการรักษาด้วยอิชินาโคไซด์ ในการศึกษาของเรา เราสังเกตว่าด้วยความเข้มข้นของ Echinacoside ที่เพิ่มขึ้น อัตราส่วนของเซลล์ในช่วง G1 ค่อยๆ ลดลง ในทางตรงกันข้าม เซลล์จำนวนมากขึ้นถูกผลักดันให้เข้าสู่เฟส S และเฟส G2 (รูปที่ 1B) การสะสมของ heterochromatin foci ที่เกี่ยวข้องกับการชราภาพ (SAHF) เป็นอีกหนึ่งตัวบ่งชี้ทางชีวภาพจำเพาะของเซลล์ชราภาพ (Shay and Wright 2001) เซลล์ชราภาพแสดงจุดโฟกัสของ DNA แบบเว้นวรรคซึ่งมองเห็นได้จากการย้อมสี Hoechst (รูปที่ 1C) ในทางตรงกันข้าม เซลล์ MRC-5 ที่บำบัดด้วยอิชินาโคไซด์ดูเหมือนจะมี SAHF น้อยกว่า

ระดับของชนิดออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา (ROS) เพิ่มขึ้นเมื่อเซลล์เข้าใกล้ขีดจำกัดของ Hayflflick (Hutter et al. 2002) การรักษาเซลล์ที่มีระดับ ROS ที่ย่อยตายได้อย่างต่อเนื่องไม่เพียงแต่เพิ่มระดับของผลิตภัณฑ์ที่สร้างความเสียหายจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน เช่น ไลโปฟุสซิน (Sitte et al. 2001) แต่ยังทำให้เกิดการหยุดการเจริญเติบโตถาวรพร้อมกับการกระตุ้น p53-การยับยั้งการเจริญเติบโต ทางเดิน (Toussaint et al. 2000) ดังนั้น ในระดับเซลล์ ROS จึงมีบทบาทสำคัญในการกระตุ้นความชราภาพ DCFH-DA สีย้อมเรืองแสง FL ถูกใช้เพื่อวัดปริมาณ ROS ด้วยไซโตเมตรีเพื่อน แสดงให้เห็นว่าเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม ปริมาณ ROS ลดลงอย่างเห็นได้ชัดในเซลล์ที่ถูกบ่มด้วยอิชินาโคไซด์ (รูปที่ 2A) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าเอ็กไคนาโคไซด์อาจทำหน้าที่เป็นสารต่อต้านอนุมูลอิสระ ลดการผลิต ROS หรือเร่งการกำจัด ROS

ชนิดของออกซิเจนปฏิกิริยาสะสม (ROS) ทำให้เกิดการด้อยค่าของโมเลกุลขนาดใหญ่ในเซลล์ รวมทั้งโปรตีน ดีเอ็นเอ และเทโลเมียร์ (Kovtun et al. 2007) ความเสียหายของ DNA ออกซิเดชันจะกระตุ้น p53-การหยุดการเจริญเติบโตของ G1 ขึ้นอยู่กับการแสดงออกของ p21Waf-1/SDI-1/Cip1 (Chen et al. 1998) และการเสื่อมสภาพของเซลล์ในไฟโบรบลาสต์ของมนุษย์ปกติ เราใช้การทดสอบดาวหางเพื่อวัดความเสียหายของดีเอ็นเอและการซ่อมแซม ขนาดของชิ้นส่วนดีเอ็นเอและจำนวนช่วงแตกเป็นตัวกำหนดการย้ายถิ่นและรูปแบบของดาวหางที่เห็น ปริมาณ DNA หาง (ผลิตภัณฑ์จากความยาวหางและปริมาณ DNA ของหาง) เพิ่มขึ้นตามความเสียหาย ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าการปรับสภาพด้วยอิชินาโคไซด์สามารถส่งเสริมการซ่อมแซมความเสียหายของดีเอ็นเอได้บางส่วน อย่างน้อยก็ปกป้องเซลล์จากรอยโรคของดีเอ็นเอที่เกิดจาก H2O2 (รูปที่ 2B) จากข้อเท็จจริงเหล่านี้ เราสรุปได้ว่าอิไคนาโคไซด์มีฤทธิ์ต้านการชราภาพอย่างน้อยในเซลล์ MRC-5 ผลการศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าอิไคนาโคไซด์สามารถลดการสะสมของ ROS ปกป้องเซลล์จากความเสียหายของดีเอ็นเอ ส่งเสริมเซลล์ MRC-5 จากเฟส G1 ไปสู่เฟส S และ G2 และทำให้การงอกขยายของเซลล์ดีขึ้น โดยทั่วไป ผลกระทบของอิไคนาโคไซด์ต่อเซลล์ MRC-5 สามารถแบ่งออกเป็นสองลักษณะ: เพื่อส่งเสริมการเพิ่มจำนวนเซลล์และเพื่อลดการสะสม ROS แม้ว่ากลไกที่แม่นยำของการเสื่อมของเซลล์ยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด และเครือข่ายของการควบคุมวัฏจักรเซลล์ยังคงเป็นที่ถกเถียงกันอยู่ แต่เราได้แสดงให้เห็นว่าอิไคนาโคไซด์สามารถปกป้องเซลล์จากความเสียหายจากปฏิกิริยาออกซิเดชันได้ เราจึงสันนิษฐานว่าเอ็กไคนาโคไซด์อาจเป็นตัวเลือกที่ดีสำหรับการควบคุมความชรา แม้ว่ากลไกพื้นฐานที่แม่นยำยังคงเป็นคำถามเปิดและการศึกษาเพิ่มเติมกำลังอยู่ในระหว่างดำเนินการ

3. ทดลอง

3.1. การเพาะเลี้ยงเซลล์และการรักษา

MRC{0}} ของเอ็มบริโอในปอดของมนุษย์ (Institute of Biochemistry and Cell Biology, SIBS, CAS) ถูกคงรักษาไว้ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่จำเป็นขั้นต่ำที่ดัดแปลง (Gibco/BRL) และเสริมด้วยซีรัมของทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ เซลล์ MRC-5 เกิดภาวะชราภาพจำลองหลังจากผ่านหลายเซลล์ ประเมินโดยการเผาผลาญที่ช้าลงและการหยุดการแบ่งตัวภายใน 7 วัน วัฒนธรรมทั้งหมดถูกเพาะที่ความหนาแน่นของเซลล์ที่ 104/ซม2 เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่นและได้รับอนุญาตให้เพิ่มจำนวน, ไม่ถูกรบกวน, เป็นเวลา 7 วัน ความเข้มข้นต่างๆ ของอิชินาโคไซด์ถูกเติม 48 ชั่วโมงก่อนการตรวจสอบด้วยตัวทำละลายเป็นตัวควบคุม เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น ความเข้มข้นของ DMSO ในวัฒนธรรมน้อยกว่า 0.3 เปอร์เซ็นต์ (v/v) สำหรับการบำบัดด้วย H2O2 เซลล์ถูกเหนี่ยวนำด้วย 250 โมลาร์ H2O2 เป็นเวลา 12 ชั่วโมง

3.2. การทดสอบอัตราการรอดชีวิต

เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงและบำบัดด้วยอิชินาโคไซด์บนเพลต 96 หลุม ก่อนการตรวจจับ เติม Alamar BlueTM 10 เปอร์เซ็นต์ลงในสื่อและฟักเป็นเวลา 4 ชั่วโมง วัดค่าการดูดกลืนด้วยสเปกโตรโฟโตมิเตอร์

3.3. การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรี

Flow cytometry ถูกนำมาใช้เพื่อวัดปริมาณ DNA และระดับ ROS ภายในเซลล์โดยใช้โพรพิเดียมไอโอไดด์และ DCFH-DA ตามลำดับ เซลล์ถูกเคลือบที่ความหนาแน่น 105 เซลล์/10 มล. สารละลายเซลล์ในจานขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 100 มม. และเสริมด้วยอิชินาโคไซด์เป็นเวลา 48 ชั่วโมงหลังจากการเพาะเซลล์ หลังการบำบัด 48 ชั่วโมง เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวและล้างใน PBS หลังจากการปั่นแยก จากนั้นแขวนลอยใหม่ในสารละลาย PBS ด้วย RNase 0.1 เปอร์เซ็นต์และโพรพิเดียม ไอโอไดด์ 50 ก./มล. หรืออาหารเลี้ยงเชื้อที่มี DCFH-DA 10 โมลาร์เป็นเวลา 30 นาที จากนั้นเนื้อหาของ DNA หรือ ROS ถูกกำหนดโดยการคัดแยกเซลล์ที่กระตุ้นด้วยฟลูออเรสเซนซ์ FL บนระบบ Beckman Coulter Flow Cytometry วิเคราะห์ข้อมูลด้วยซอฟต์แวร์ MultiCycle

3.4. การย้อมสี Hoechst

เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงและบำบัดด้วยอิชินาโคไซด์เป็นเวลา 48 ชั่วโมงบนจาน 96 หลุม นำสื่อออก ล้างเซลล์ด้วย PBS จากนั้นตรึงด้วยฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์ใน PBS เป็นเวลา 20 นาที ตามด้วยการล้างด้วย PBS หนึ่งครั้ง และย้อมด้วยสีย้อม Hoechst เป็นเวลา 10 นาที รูปภาพถูกจับภาพ

3.5. อิเล็กโตรโฟรีซิสเจลเซลล์เดียว (การทดสอบดาวหาง)

การทดสอบดาวหางดำเนินการตามรายงาน (Olive and Banath 2006) ภาพดาวหางแต่ละภาพได้รับการวิเคราะห์ด้วยซอฟต์แวร์ CometScore รับทราบ: งานนี้ได้รับการสนับสนุนทางการเงินจากโครงการวิจัยขั้นพื้นฐานแห่งชาติ (โครงการ 973) ของจีน (หมายเลข 2007CB507406) มูลนิธิวิทยาศาสตร์ธรรมชาติแห่งชาติของจีน (หมายเลข 30572341) และกองทุนวิทยาศาสตร์การแพทย์ Tsinghua-Yue-Yuen (THYY20070008) ).