Echinacoside ส่งเสริมการแพร่กระจายของเซลล์เยื่อบุผิวท่อไตของมนุษย์โดยการปิดกั้นเส้นทางการส่งสัญญาณ NF-κB ของ HBX / TREM2 ที่เป็นสื่อกลาง

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

YuFan ZHanG , QinFanG Wu , liMin ZHonG , donGWei GonG

เชิงนามธรรม.

โปรตีนไวรัสตับอักเสบบี X (HBX) จำเป็นสำหรับการจำลองแบบของ HBV และมีบทบาทในการลุกลามของโรคตับอักเสบในมนุษย์ อย่างไรก็ตาม ไม่ทราบถึงหน้าที่พื้นฐานของ HBX ระหว่างภาวะไตวายเรื้อรังที่เกิดจาก HBV (HBV-Gn) (echinacoside จาก cistanche)(ecH) เป็นฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์จากสกุล Cistanche ซึ่งมีการต่อต้านการตายของเซลล์และการทำงานของระบบประสาท ในการศึกษานี้ ได้สำรวจการทำงานของ HBX และความสัมพันธ์ระหว่าง HBX และ ecH ในเซลล์เยื่อบุผิวท่อไตของมนุษย์ (rTecs; HK-2 cell line) การวิเคราะห์ PCr เชิงปริมาณเชิงการถอดรหัสย้อนกลับและการวิเคราะห์แบบ Western blot ถูกใช้เพื่อหาปริมาณ mRNA และระดับการแสดงออกของโปรตีนของ HBX ในเซลล์ HK-2 ตามลำดับ ชุดตรวจนับเซลล์-8 ถูกดำเนินการเพื่อวิเคราะห์การเพิ่มจำนวนเซลล์ การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีถูกใช้เพื่อกำหนดอัตราการตายของเซลล์ HBX แสดงผลต้านการเพิ่มจำนวนและโปรอะพอพโทซิสในเซลล์ HK-2 และมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับรีเซพเตอร์ที่กระตุ้นซึ่งแสดงออกบนการแสดงออกของเซลล์มัยอีลอยด์ 2 (TreM2) นอกจากนี้ ECH ยังขัดขวางการทำงานของ HBX ในเซลล์ HK-2 ซึ่งทำหน้าที่เป็นตัวยับยั้ง HBX นอกจากนี้ มีการใช้สารยับยั้ง NF‑κB PdTc เพื่อตรวจสอบความสัมพันธ์ระหว่าง HBX และ nF-κB เพิ่มเติม ผลการวิจัยชี้ให้เห็นว่า nF-κB เกี่ยวข้องกับเส้นทางการส่งสัญญาณ HBX/TreM2 และควบคุมการแสดงออกของ TreM2 ใน RTECS การศึกษานี้ให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับหน้าที่ของ HBX และยังระบุค่าที่เป็นไปได้ของ ECH ในฐานะตัวแทนการรักษาสำหรับ HBV-Gn

บทนำ

ไวรัสตับอักเสบบี (HBV) เป็นไวรัส Hepadnaviridae ซึ่งนำไปสู่โรคตับอักเสบเฉียบพลันและเรื้อรังในมนุษย์ (1) HBV ไม่เพียงแต่ทำให้เกิดการติดเชื้อถาวรในตับเท่านั้น แต่ยังติดเชื้อในเนื้อเยื่อนอกตับ เช่น ตับอ่อน ท่อน้ำดี ระบบน้ำเหลือง และไต (2) นอกจากนี้ การติดเชื้อไวรัสตับอักเสบบีมีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับโรคไตวายเรื้อรัง (HBV-Gn); อย่างไรก็ตาม กลไกระดับโมเลกุลของ HBV ระหว่าง HBV-Gn ยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างสมบูรณ์ (3,4)

จำเป็นต้องมีโปรตีน X (HBX) ของไวรัสตับอักเสบบีตามกฎข้อบังคับ HBV สำหรับการจำลองแบบ HBV (5,6) จากการศึกษาจำนวนหนึ่งรายงานว่า HBX ส่งเสริมการเพิ่มจำนวนเซลล์ระหว่างมะเร็งตับที่เกี่ยวข้องกับการติดเชื้อ HBV (7-9) เซลล์เยื่อบุผิวท่อไตของมนุษย์ (rTecs) เป็นส่วนสำคัญของคั่นระหว่างหน้าของท่อไตและมีบทบาทอย่างแข็งขันในการอักเสบของไต (10) การตายของเซลล์ rTec มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับความผิดปกติของ interstitium แบบท่อ ซึ่งต่อมานำไปสู่ความก้าวหน้าของ HBV-Gn (10) HBX ส่วนใหญ่แสดงออกในเซลล์ rTec และทำให้เกิดการตายของเซลล์ rTec และรอยโรคของท่อไตในผู้ป่วยที่มี HBV-Gn (11,12) นอกจากนี้ HBX ยังได้รับรายงานเพื่อยับยั้งการแพร่กระจายของหนู rTecs (13) และการแสดงออกของ HBX มากเกินไปจะเร่งการลุกลามของวัฏจักรเซลล์จากระยะ G1 ถึง S ใน rTecs หลัก ซึ่งนำไปสู่การหยุดวงจรของเซลล์ในระยะ S (14) ดังนั้น การระบุตัวยับยั้ง HBX อาจจัดให้มีการรักษาแบบใหม่สำหรับ HBV-Gn อย่างไรก็ตาม เครือข่ายโมเลกุลที่แม่นยำของ HBX ใน rTecs ของมนุษย์ยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างสมบูรณ์(echinacoside จาก cistanche)(ecH) เป็นสารประกอบธรรมชาติที่สกัดจากCistancheพืชซึ่งแสดงผล antiapoptotic และต้านการอักเสบ (15,16) การศึกษาก่อนหน้านี้รายงานว่า ecH กระตุ้นการเพิ่มจำนวนและป้องกันการตายของเซลล์เยื่อบุผิวในลำไส้ (17) นอกจากนี้ยังมีรายงาน ecH เพื่อเร่งการสร้างกระดูกใหม่โดยการเพิ่มการเพิ่มจำนวนของเซลล์สร้างกระดูก (18) ecH ยังสามารถลดการจำลองแบบ HBV การแสดงออกของแอนติเจน และการอักเสบในเซลล์เยื่อบุผิวในลำไส้ของหนู (16,19) อย่างไรก็ตาม ผลกระทบทางชีวภาพของ ecH ต่อ rTecs ยังไม่ได้รับการอธิบายอย่างสมบูรณ์

การแสดงออกมากเกินไปของ TreM2 ส่งเสริมการเพิ่มจำนวนของเซลล์ glioma (22) ในทางตรงกันข้าม การล้มลงของ TreM2 จะลดการเคลื่อนย้ายของ nF-κB ไปยังนิวเคลียสในเซลล์เยื่อกระดาษนิวเคลียสของมนุษย์ที่มีความเสื่อม (23) นอกจากนี้ TreM2 ยังได้รับการระบุว่าเป็นเป้าหมายการรักษาแบบใหม่สำหรับการเสื่อมของหมอนรองกระดูกสันหลังของมนุษย์ (23) อย่างไรก็ตาม ยังไม่มีรายงานการทำงานทางชีวภาพของ TreM2 ใน rTecs ของมนุษย์ ในการศึกษานี้ HBX overexpression (oeHBX) ถูกเหนี่ยวนำในเซลล์ rTecs ของมนุษย์ (HK-2) ​​และต่อมาผลของ ecH(echinacoside จาก cistanche) บนเซลล์ oeHBX ที่ทรานส์เฟกถูกตรวจสอบ จุดมุ่งหมายของการศึกษาครั้งนี้คือเพื่อตรวจสอบหน้าที่ของ HBX และค่าที่เป็นไปได้ของ ecH ในฐานะตัวแทนการรักษาที่มีประสิทธิผลสำหรับ HBV-Gn

วัสดุ และ วิธีการ

เซลล์ วัฒนธรรม.สายเซลล์ rTec ของมนุษย์ HK-2 ถูกซื้อจาก Shanghai Yaji Biotechnology co., ltd. เซลล์ HK-2 เพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ DME/F12 (หมายเลขแมว SH30023.01B; Hyclone; cytiva) เสริมด้วยซีรัมวัวในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ (หมายเลขแมว 16000‑044; Gibco; Thermo Fisher Scientific, inc .), 2 mM l-glutamine และ 1 เปอร์เซ็นต์ penicillin/streptomycin (cat. no. P1400-100; Beijing Solarbio Science & Technology co., Ltd.) ที่อุณหภูมิ 37˚C โดยมี CO2 5 เปอร์เซ็นต์

RNA การแยกตัว และ ย้อนกลับ การถอดความ-เชิงปริมาณ PCR (RT‑qPCR)อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดจากเซลล์ HK-2 โดยใช้ Trizol® (หมายเลขแมว 1596 -026; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, inc.) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต RNA ทั้งหมดถูกแปลงกลับเป็น cDNA โดยใช้ชุดสังเคราะห์ cDNA แบบ First-Strand ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต (cat. no. K1622; Thermo Fisher Scientific, Inc.) qPCR ดำเนินการโดยใช้พรีมิกซ์ SYBr-Green ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต (cat. no. K0223; Thermo Fisher Scientific, Inc.) บนเครื่องตรวจจับแบบเรียลไทม์ ABI‑7300 ​​(Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.) สภาวะของ PCR คือ: 95˚C เป็นเวลา 10 นาที ตามด้วย 40 รอบของ 95˚C เป็นเวลา 15 วินาที, 60˚C เป็นเวลา 45 วินาที จำเป็นต้องทำซ้ำสามครั้งสำหรับแต่ละปฏิกิริยา คู่ไพรเมอร์ต่อไปนี้ถูกใช้สำหรับ qPCR: HBX forward, 5'-GGcTGcTaGGTTGTacTG-3' and reverse, 5'-caGaGGTGaaGcGaaGTG -3'; TreM2 ไปข้างหน้า 5'-TGGcacTcTcaccaTTacG-3' และย้อนกลับ 5'-ccTccc aTcaTcTTccTTcac-3'; และ GaPdH ไปข้างหน้า 5'-AAT cccaTcaccaTcTTc-3' และย้อนกลับ 5'-aGGcTGTTG TcaTacTTc-3' ระดับ mRNA ถูกหาปริมาณโดยใช้วิธี2‑ΔΔCqและทำให้เป็นมาตรฐานสำหรับยีนอ้างอิงภายในGAPDH (24).

การแสดงออกมากเกินไป และ ล้มลงเพื่อกระตุ้นการแสดงออกที่มากเกินไปของ HBX และ TreM2 ลำดับ HBX หรือ TreM2 cDNA แบบเต็มความยาวถูกแทรกเข้าไปในเวคเตอร์ plVX-puro (ห้องปฏิบัติการคลีนเทค, inc.) โดยการย่อยแบบคู่ (ฮินดูiii และEcoRI). ต่อมา พลาสมิดที่ถูกรวมตัวใหม่ (1.5 ไมโครกรัม) ถูกทรานส์เฟกไปเป็นเซลล์ HK-2 (2x105) พลาสมิดจำลอง (เวกเตอร์เปล่า 1 ไมโครกรัม) ถูกทรานส์เฟกชั่วคราวไปเป็นเซลล์ HK-2 (2x105) เป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบ (oenc) โดยใช้ไลโปเฟคตามีน® 2000 (หมายเลขแมว 11668-027, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, inc.) ecH(echinacoside จาก cistanche)(cat. no. 82854-37-3; Biopurify Phytochemicals, ltd.) ถูกละลายใน DMSO (cat. no. d2650; Sigma-Aldrich; Merck KGaa) ที่ความเข้มข้น 1, 2.5, 5, 10, 20 และ

50 มก./ลิตร ตามลำดับ; และเพิ่มการเพาะเลี้ยงเซลล์ oeHBX หรือ oeTreM2 ที่ทรานส์เฟก การทดลองต่อมาเริ่มขึ้นใน 48 ชั่วโมงต่อมา

เพื่อลดการแสดงออกของ TreM2 สามสิ่งรบกวน (si)RNAs ขนาดเล็ก (siTreM2-1, siTreM2-2 และ siTreM2-3; 20 µM) ที่กำหนดเป้าหมาย TreM2 ถูกสังเคราะห์ขึ้น (บริษัท Shanghai Majorbio Bio-Pharm Technology co . ltd.) และต่อมาเปลี่ยนถ่ายเป็นเซลล์ HK-2 (2x105) โดยใช้ lipofectamine® 2000 ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) ลำดับ siRNA ที่มีการรบกวนแบบไม่จำเพาะ (5'uucuccGaacGuGucacGu3, 25 nM) si-negative control (nc) ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบ โลคัสที่เป็นเป้าหมายและลำดับของเซอร์นา TreM2 มีให้ในตาราง Si การทดลองต่อมาได้ดำเนินการ 48 ชั่วโมงต่อมา

ทางทิศตะวันตก ซับสกัดโปรตีนทั้งหมดจากเซลล์ HK-2

ใช้บัฟเฟอร์สลาย RIPA (หมายเลขแมว BYl40825; Jrdun Biotech Co., Ltd.) หาปริมาณโปรตีนทั้งหมดโดยใช้ชุดทดสอบกรด Bicinchoninic (หมายเลขแมว PICPI23223; Thermo Fisher Scientific, inc.) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต และแยกโปรตีน/เลน 20 ไมโครกรัมผ่าน SDS-PaGe บนเจล 15 เปอร์เซ็นต์ การวัดความหนาแน่นของตัวอย่างถูกกำหนดโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท (dnM-9602, Pulangxin) ต่อจากนั้น โปรตีนที่แยกจากกันถูกถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF หลังจากการปิดกั้นด้วยนมแห้งที่ไม่มีไขมัน 5 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง เมมเบรนถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิ (Table SII) ที่ 4˚C ในชั่วข้ามคืนและบ่มอีกครั้งด้วยแอนติบอดี igG ของแอนติบอดีทุติยภูมิ (1:1, 000 แมวหมายเลข a0216 สถาบันเทคโนโลยีชีวภาพ Beyotime) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37˚C แถบโปรตีนอิมมูโนรีแอคทีฟถูกแสดงภาพโดยใช้ระบบ ecl (cytiva) Blots ถูกดำเนินการเป็นสามเท่าGAPDHและ H3 ถูกใช้เป็นตัวควบคุมการโหลดสำหรับโปรตีนไซโตพลาสซึมและนิวเคลียสตามลำดับ

ผลลัพธ์

ECH (echinacoside จาก cistanche)ปราบปราม ฟังก์ชั่น ของ HBX ใน HK-2 เซลล์.ในการประเมิน

การทำงานของ HBX, HBX แสดงออกมากเกินไปในเซลล์ HK-2 ระดับ mrna สัมพัทธ์และโปรตีนของ HBX ถูกควบคุมอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ oeHBX เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ oenc (รูปที่ 1a และ B) ต่อจากนั้น เซลล์ oeHBX ได้รับการเพาะเลี้ยงด้วยความเข้มข้นของ ecH ที่แตกต่างกัน (1, 2.5, 5, 10, 20 และ 50 มก./ล.; e1, e2.5, e5, e10, e20 และ e50 ตามลำดับ) การแสดงออกของ HBX มากเกินไปลดการเพิ่มจำนวนของเซลล์ HK-2 อย่างมีนัยสำคัญ และการลดลงนี้ถูกย้อนกลับโดย ecH ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยาที่ 24 และ 48 ชั่วโมง (รูปที่ 1c)

นอกจากนี้ อัตราการงอกของเซลล์ oeHBX ไม่แสดงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ที่บำบัดด้วย E1 (รูปที่ 1c) ในทางตรงกันข้าม การบำบัดด้วย e10 เพิ่มอัตราการงอกของเซลล์ oeHBX อย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับการรักษาด้วย E20 และ E50 ซึ่งไม่แสดงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญ (รูปที่ 1c) ดังนั้น ผลของ ecH ต่อการตายของเซลล์จึงถูกตรวจสอบในเซลล์ที่บำบัดด้วย e2.5, e5 และ e10- การแสดงออกมากเกินไปของ HBX เพิ่มการตายของเซลล์ HK-2 อย่างมีนัยสำคัญ และอัตราการตายของเซลล์ oeHBX ลดลงด้วยการบำบัดด้วย ecH ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา (รูปที่ 1d) โดยรวม ผลลัพธ์ชี้ให้เห็นว่า ecH ยับยั้งการทำงานของ HBX ในเซลล์ HK-2 ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา

TREM2 การแสดงออก เป็น ยับยั้ง โดย ECH(echinacoside จาก cistanche) ใน เปลี่ยนถ่าย oeHBX

เซลล์.rT-qPcr และ western blotting ถูกใช้เพื่อตรวจสอบระดับ mrna สัมพัทธ์และการแสดงออกของโปรตีนของ TreM2 ในเซลล์ oeHBX ตามลำดับ TreM2 mrna และระดับการแสดงออกของโปรตีนถูกปรับเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ oeHBX เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ oenc (รูปที่ 2a และ B) อย่างไรก็ตาม ecH ลดระดับการแสดงออกของ TreM2 ในเซลล์ oeHBX ที่ทรานส์เฟกในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา (รูปที่ 2a และ B) ดังนั้น ผลลัพธ์แนะนำว่าการแสดงออกของ HBX มีความสัมพันธ์เชิงบวกกับการแสดงออกของ TreM2 และบ่งชี้เพิ่มเติมถึงผลการปราบปรามของ ecH ต่อ HBX ในเซลล์ HK-2

ล้มลง และ การแสดงออกมากเกินไป ของ TREM2 ใน HK-2 เซลล์.เพื่อประเมินการทำงานของ TreM2 เพิ่มเติม การล้มลงของ TreM2 และการแสดงออกที่มากเกินไปถูกเหนี่ยวนำในเซลล์ HK-2 โดยใช้การรบกวนของอาร์เอ็นเอและเวกเตอร์เลนติไวรัส ตามลำดับ สำหรับการทดสอบแบบน็อคดาวน์ siRNA สามตัวที่มุ่งเป้าไปที่ยีนมนุษย์TREM2(siTreM2-1, siTreM2-2 และ siTreM2-3) ถูกทรานส์เฟกไปเป็นเซลล์ HK‑2 และ siRNA ที่ไม่จำเพาะถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบ (sinc) TreM2 sirnas ทั้งสามตัวสามารถล้มการแสดงออกภายนอกของ TreM2 ในเซลล์ HK-2 ได้สำเร็จ (รูปที่ 3a และ B) อย่างไรก็ตาม TreM2 mrna สัมพัทธ์ต่ำสุดและระดับการแสดงออกของโปรตีนถูกสังเกตพบในเซลล์ที่ทรานส์เฟก siTreM2-1 และ siTreM2-2- (รูปที่ 3a และ B) ดังนั้น siTreM2-1 และ siTreM{{13 }}เซลล์ที่ทรานส์เฟกถูกเลือกสำหรับการทดลองในภายหลัง สำหรับการทดลองการแสดงออกที่มากเกินไป พลาสมิดที่มีลำดับ TreM2cdna ของมนุษย์ที่มีความยาวสมบูรณ์ถูกสร้างขึ้นและต่อมาถูกทรานส์เฟกไปในเซลล์ HK-2 (oeTreM2) เอ

พลาสมิดจำลองทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมเชิงลบ (oec) ระดับของการแสดงออก TREM2 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ oeTREM2 เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ oenc (รูปที่ 3c และ d) ดังนั้น เซลล์ oeTreM2 จึงถูกใช้สำหรับการทดลองในภายหลัง

TREM2 เงียบ ลดลง ที่ อะพอพโทซิส ของ oeHBX เซลล์.โปรไฟล์การตายของเซลล์ oeHBX ที่ทรานส์เฟกด้วย siTREM2 หรือ sinc ถูกประเมิน อัตราการตายของเซลล์ oeHBX plus sinc สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับเซลล์เปิด อย่างไรก็ตาม อัตราการตายของเซลล์ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ oeHBX บวก siTreM2-1 หรือ siTreM2-2 เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ oeHBX บวก Sinc (รูปที่ 4a) ผลการวิจัยชี้ให้เห็นว่าการล้มลงของ TreM2 ยับยั้งการทำงานของ HBX ระหว่างการตายของเซลล์ HK-2

Survivin อยู่ในตัวยับยั้งของตระกูลโปรตีน apoptosis ซึ่งยับยั้งการทำงานของ apoptotic และยับยั้งการตายของเซลล์ (25) Survivin การกำหนดเป้าหมายได้รับการระบุว่าเป็นแนวทางใหม่ในการรักษามะเร็งเซลล์ไต (26) nF-κBยังเป็นตัวยับยั้งการตายของเซลล์ที่มีบทบาทในกระบวนการเนื้องอกต้านมะเร็ง (27) นอกจากนี้ การกระตุ้น caspase3 ยังสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการตายของเซลล์ (28) ในการศึกษานี้ ปริมาณโปรตีนของ TreM2, Survivin และ caspase3 แยกในเซลล์ HK-2 ถูกหาปริมาณ ระดับของการแสดงออก TREM2 ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ oeHBX บวก siTreM2-1/2 เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ oeHBX บวก sinc (รูปที่ 4B) ระดับการแสดงออกของ Survivin เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ oeHBX บวก siTreM2-1/2 เซลล์เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ oeHBX นอกจากนี้ ระดับของการแสดงออกของ caspase3 แบบแยกส่วนลดลงอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ oeHBX บวก siTreM2-1/2 เมื่อเทียบกับเซลล์ oeHBX บวก sinc (รูปที่ 4B) นอกจากนี้ oeHBX ยังลดการเคลื่อนย้ายของ NF-κB ไปยังนิวเคลียสได้อย่างมีนัยสำคัญ และการถ่ายเท siTREM2‑1/2 ได้เพิ่มการเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ nF-κB อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 4B) เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์ชี้ให้เห็นว่า TreM2 เป็นปัจจัยปลายน้ำของ HBX ในเซลล์ HK-2 ดังนั้น HBX อาจส่งเสริมการตายของเซลล์โดยควบคุมการแสดงออกของ TreM2 ใน rTecs ของมนุษย์

TREM2 การแสดงออกมากเกินไป ปราบปราม ที่ การโยกย้าย ของNF-κB ถึง ที่ นิวเคลียส ใน HK-2 เซลล์.ผลกระทบของ ecH(echinacoside จาก cistanche)บน oeTreM2-เซลล์ที่ทรานส์เฟกถูกวิเคราะห์ การแสดงออกมากเกินไปของ TreM2 ส่งเสริมการตายของเซลล์ HK-2 (รูปที่ 5a) การตายของเซลล์ oeTREM2 ลดลงอย่างมีนัยสำคัญโดยการบำบัดด้วย ECH (E10; รูปที่ 5A) นอกจากนี้ ECH ยังลดการแสดงออกของ TreM2 ในเซลล์ oeTreM2 ลงอย่างมีนัยสำคัญ การแสดงออกมากเกินไปของ TREM2 ทำให้ระดับการแสดงออกของ Survivin ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ อย่างไรก็ตาม การแสดงออกที่ลดลงนี้ถูกย้อนกลับโดย ecH นอกจากนี้ ระดับการแสดงออกของโปรตีนของ caspase3 แบบแยกส่วนนั้นเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ oeTreM2 เมื่อเทียบกับเซลล์ oenc ผลกระทบที่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญโดยการรักษาด้วย ECH นอกจากนี้ ecH ยังส่งเสริมการโยกย้ายของ nF-κB ไปยังนิวเคลียสในเซลล์ oeTreM2 (รูปที่ 5B) เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์ระบุว่า ecH ยังยับยั้งการทำงานของ TreM2 ในเซลล์ rTec ของมนุษย์

ฟังก์ชัน HBX เป็น ถูกกดขี่ โดย ที่ NF-κB ตัวยับยั้ง PDTCใน มนุษย์ RTECเพื่อประเมินความสัมพันธ์ระหว่าง

HBX และ nF-κB, เซลล์ HK‑2 ถูกเพาะเลี้ยงด้วยตัวยับยั้ง nF-κB จำเพาะ, PdTc (10 µmol/l; P10) อัตราการตายของเซลล์ของเซลล์ oeHBX เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ OENC (รูปที่ 6a) อย่างไรก็ตาม เซลล์ oeHBX บวก PdTc แสดงอัตราการการตายของเซลล์ที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ oeHBX นอกจากนี้ mRNA สัมพัทธ์และระดับการแสดงออกของโปรตีนของ TreM2 ได้ลดลงในเซลล์ oeHBX บวก PdTc เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ oeHBX (รูปที่ 6B) ดังนั้นผลลัพธ์

แนะนำว่า nF-κBควบคุมการแสดงออกของ TreM2 ในเชิงลบในเซลล์ที่ถ่ายด้วย oeHBX

NF-κB ตัวยับยั้ง PDTC ปราบปราม TREM2 โปรโมเตอร์ กิจกรรม ใน oeHBX เซลล์.ตัวรายงาน luciferase (pGl3-enhancer-luc2) ที่มีลำดับโปรโมเตอร์ชนิดไวด์ของ TreM2 (pGl3-enhancer-luc2-pTreM2) ถูกสร้างและต่อมาทรานส์เฟกเป็น oenc , oeHBX และ oeHBX plus P10 เพาะเลี้ยงเซลล์

กิจกรรมของลูซิเฟอเรสของ Reporter vector ที่มีโปรโมเตอร์ TREM2 ชนิดพันธุ์ป่าเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ oeHBX เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ oenc อย่างไรก็ตาม PdTc ยับยั้งการออกฤทธิ์ของลูซิเฟอเรสของผู้รายงานในเซลล์ oeHBX อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 7) โดยรวม ผลลัพธ์ระบุว่า PdTc ยับยั้งการถอดรหัสของ TreM2 โดยการยับยั้งกิจกรรมโปรโมเตอร์ของ TreM2 ในเซลล์ oeHBX

การอภิปราย

HBX ส่วนใหญ่แสดงออกใน rTecs ของผู้ป่วยที่มี HBV-Gn และทำหน้าที่เป็นตัวกำหนดการเกิดโรคของไวรัส (11,29) ดังนั้นการเพิ่มความรู้เกี่ยวกับหน้าที่ของเครือข่ายโมเลกุล HBX จึงเป็นขั้นตอนสำคัญในการพัฒนาแนวทางใหม่ในการรักษา HBV-Gn จุดมุ่งหมายของการศึกษาครั้งนี้คือเพื่อตรวจสอบการทำงานของ HBX และสำรวจเครือข่ายโมเลกุลที่มีศักยภาพใน rTecs ของมนุษย์

HBX ยับยั้งการแพร่กระจายของ rTecs (11) ในการศึกษานี้ มีการระบุฟังก์ชันการต้านการแพร่กระจายและโปรอะพอพโทซิสของ HBX ใน RTEC ของมนุษย์ ซึ่งบ่งชี้ว่า HBX ยับยั้งการพัฒนาของ rTecs ของมนุษย์ การศึกษาก่อนหน้านี้ระบุว่า ecH(echinacoside จาก cistanche)ยับยั้งการจำลองแบบ HBV และการแสดงออกของแอนติเจน (19) ในการศึกษาปัจจุบัน ecH(echinacoside จาก cistanche)การบำบัดขัดขวางการทำงานของ HBX ในเซลล์ HK-2 ดังนั้น HBX อาจได้รับผลกระทบจาก ecH ในเซลล์ HK-2

รายงานการแพทย์ระดับโมเลกุล 22: 1137-1144, 2020 1143

นอกจากนี้ ผลการวิจัยยังชี้ให้เห็นว่า ecH(echinacoside จาก cistanche)อาจทำหน้าที่เป็นยารักษาที่มีศักยภาพสำหรับ HBV-Gn

TreM2 เป็นตัวรับภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติที่มีบทบาทในการตอบสนองต่อการอักเสบ (30) ในการศึกษานี้ การแสดงออกของ HBX มีความสัมพันธ์เชิงบวกกับการแสดงออกของ TreM2 ใน RTECS ของมนุษย์ นอกจากนี้ การล้มลงของ TREM2 ยังลดอัตราการตายของเซลล์ oeHBX และ ecH . ลงอย่างมีนัยสำคัญ(echinacoside จาก cistanche)การรักษาลดผลกระทบของ oeTreM2 ต่อการตายของเซลล์ เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า TreM2 ถูกกำหนดเป้าหมายโดย HBX ในเซลล์ HK-2 ดังนั้น ecH(echinacoside จาก cistanche)อาจยับยั้งการตายของเซลล์ rTecs ของมนุษย์โดยการปิดกั้นการทำงานของเส้นทางการส่งสัญญาณ HBX/TreM2

รายงานก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่า nF-κB ไม่เพียงแต่มีบทบาทในการตายของเซลล์ แต่ยังเกี่ยวข้องกับการควบคุมการตอบสนองของภูมิคุ้มกันและการอักเสบ (31) นอกจากนี้ TreM2 ยังทำหน้าที่เป็นสื่อกลางโดย microRNA ที่ไวต่อ nF-κB-34a ในระหว่างโรคอัลไซเมอร์และการเสื่อมสภาพของจอประสาทตา (32,33) ในการศึกษานี้ อัตราการตายของเซลล์ oeHBX เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อมี PdTc จากความรู้ที่ดีที่สุดของเรา การศึกษาในปัจจุบันได้เสนอแนะเป็นครั้งแรกว่าตัวยับยั้ง NF‑κB PdTc ยับยั้งกิจกรรมโปรโมเตอร์ของ TreM2 นอกจากนี้ ผลการวิจัยยังชี้ให้เห็นว่า TreM2 ควบคุมการเคลื่อนย้ายของ nF-κB ไปยังนิวเคลียสในเซลล์ HK-2 ในเชิงลบ แต่มีความสัมพันธ์เชิงบวกกับระดับการแสดงออกของ caspase3 ที่แยกออก TreM2 มีบทบาทตรงกันข้ามในเซลล์ HK-2 กับบทบาทในนิวเคลียสพัลโซซัสที่เสื่อมทรามของมนุษย์และเซลล์กลิโอมา (22,23) ดังนั้น การศึกษาในปัจจุบันจึงแนะนำว่า TreM2 อาจมีหน้าที่ต่างกันในเซลล์มนุษย์ประเภทต่างๆ

จากการศึกษาครั้งนี้ร่วมกัน ไม่เพียงแต่บ่งชี้ว่า nF-κB เป็นองค์ประกอบใหม่ของเส้นทางการส่งสัญญาณ HBX/TreM2 แต่ยังแนะนำว่า nF-κB ควบคุมการแสดงออกของ TreM2 ใน rTecs ของมนุษย์ในทางลบ อย่างไรก็ตาม ข้อจำกัดที่สำคัญของการศึกษาในปัจจุบันคือการขาดใน ร่างกายการทดลองและข้อมูลทางคลินิก ดังนั้นต่อไปใน ร่างกายและจำเป็นต้องมีการศึกษาทางคลินิกเพื่อยืนยันผลการศึกษาในปัจจุบัน

ในการศึกษาปัจจุบัน หน้าที่ของ ecH(echinacoside จาก cistanche)ถูกตรวจสอบและผลการวิจัยชี้ให้เห็นถึงผลกระทบที่อาจเกิดขึ้นจาก ecH(echinacoside จาก cistanche)บนเส้นทางการส่งสัญญาณใน rTecs ของมนุษย์ นอกจากนี้ การศึกษาในปัจจุบันยังได้เพิ่มความรู้ที่มีอยู่เกี่ยวกับการทำงานทางชีววิทยาของ ecH ในเซลล์ rTec ของมนุษย์ และยังชี้ให้เห็นถึงศักยภาพของมันในฐานะตัวแทนการรักษาแบบใหม่สำหรับ HBV-Gn

อ้างอิง

1. Karayiannis P: ไวรัสตับอักเสบบี: ไวรัสวิทยา อณูชีววิทยา วงจรชีวิต และการแพร่กระจายภายในตับ ตับวิทยานานาชาติ 11: 1-9, 2017.

2. Seeger c และ Mason WS: ชีววิทยาไวรัสตับอักเสบบี Microbiol Mol Biol rev 64: 51-68, 2000.

3. Usama e , ana Maria S, W ray K และ Fervenza Fc: การรักษาโรคไตที่เกี่ยวข้องกับไวรัสตับอักเสบบี nephron clin Pract 119: c41-c49, 2011.

4. Zhang Y, li J, Peng W, Yu G, Wang l , chen J และ Zheng F: Glomerulonephritis เฉียบพลันที่เกี่ยวข้องกับ HBV: รายงาน 10 ราย PloS หนึ่ง 11: e0160626, 2016

5. Slagle Bl และ Bouchard MJ: ไวรัสตับอักเสบบี X และการควบคุมการแสดงออกของยีนไวรัส มุมมองของฤดูใบไม้ผลิ Harb เย็น Med 6: a021402, 2016

6. Guerrieri F, Belloni l , d'andrea d, Pediconi n, le Pera l , Testoni B, Scisciani c, Floriot o, Zoulim F, Tramontano a,et อัล: การระบุทั้งจีโนมของเป้าหมายจีโนม HBx โดยตรง BMc จีโนม 18:184, 2017.

7. Shi T, Hua Q, Ma Z และ lv Q: การปรับลด mir-200a-3p ที่เกิดจากโปรตีนไวรัสตับอักเสบบี X (HBx) ส่งเสริมการเพิ่มจำนวนเซลล์และการบุกรุกในที่เกี่ยวข้องกับการติดเชื้อ HBV ตับ- มะเร็ง. Pathol res Pract 213: 1464-1469, 2017.

8. Tian Y, Xiao X, Gong X, Peng F, Xu Y, Jiang Y และ Gong G: HBx ส่งเสริมการเพิ่มจำนวนเซลล์โดยรบกวนการพูดคุยระหว่าง mir-181a และ PTen ตัวแทนวิทย์ 7: 40089, 2017.

9. Idris Me, Hachem H, Koering c , Merle P, Thénoz M, Montreux F และ Wattel e: HBx กระตุ้นความชราของเซลล์หรือการเพิ่มจำนวนเซลล์ขึ้นอยู่กับฟีโนไทป์ของเซลล์ เจ Viral Hepat 23: 130-138, 2016.

10. Wang X, Wang l , Zhu n, Zhou Y, Gu lJ และ Yuan WJ: โปรตีนไวรัสตับอักเสบบี X ปรับการตอบสนองของ T-cell และ macrophage ที่เกิดจากเซลล์เยื่อบุผิวในท่อไต อิมมูนอลเซลล์ Biol 94: 266-273, 2016.

11. He P, Zhang d, li H, Yang X, li d, Zhai Y, Ma l และ Feng G: โปรตีนไวรัสตับอักเสบบี X ปรับการตายของเซลล์ในเซลล์เยื่อบุผิวท่อใกล้เคียงไตของมนุษย์โดยเปิดใช้งานเส้นทางการส่งสัญญาณ JaK2 / STaT3 int J Mol Med 31: 1017-1029, 2013.

12. Yang Y, Wang X, Zhang Y และ Yuan W: โปรตีน X ไวรัสตับอักเสบบีและไซโตไคน์โปรอักเสบประสานกันเพื่อเพิ่มการตายของเซลล์ท่อไตที่เกิดจากเส้นทางโดยการเพิ่มการควบคุมของ dr4 int J Biochem เซลล์ Biol 97: 62-72, 2018.

13. He P, Zhou G, Qu d, Zhang B, Wang Y และ li d: HBx ยับยั้งการแพร่กระจายและกระตุ้นการตายของเซลล์ผ่าน Fas/Fasl upregulation ในเซลล์เยื่อบุผิวท่อไตของหนู เจเนฟรอล 26: 1033, 2013.

14. Han W, luo M, He M, Zhu Y, Zhong Y, ding H, Hu G, liu l , chen Q และ lu Y: การถ่ายยีน HBx ส่งผลต่อวัฏจักรของเซลล์เยื่อบุผิวท่อไตปฐมภูมิผ่านการควบคุมการแสดงออกของไซคลิน Mol Med ตัวแทน 18: 1947-1954, 2018.