PART Ⅰ:SARS-CoV-2 การติดเชื้อส่งผลต่อเนื้อเยื่อรวมทั้งหัวใจและไต

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:ali.ma@wecistanche.com

PART Ⅰ:SARS-CoV-2 การติดเชื้อในหนูแฮมสเตอร์แบบซีเรียทำให้เกิดการอักเสบรวมทั้งความผิดปกติของอินเตอร์เฟอรอนชนิดที่ 1 ในเนื้อเยื่อทางเดินหายใจและทางเดินหายใจรวมทั้งหัวใจและไต

Magen Ellen Francis, Una Goncin และคณะ

บทนำ

โรคซาร์ส-CoV-2(เฉียบพลันรุนแรงทางเดินหายใจโคโรนาไวรัส 2) ซึ่งทำให้เกิดโรคโควิด-19 (โคโรนาไวรัส 2019) เกิดขึ้นในปลายปี พ.ศ. 2562 โดยส่งผลกระทบด้านสาธารณสุขและเศรษฐกิจอย่างมหาศาล[1,2]โรคซาร์ส-CoV-2เป็นไวรัสอาร์เอ็นเอสายเดี่ยวที่มีความรู้สึกเชิงบวกในตระกูล Coronoviridae สกุล Betacoronavirus[3] และนับตั้งแต่มีการเกิดขึ้นได้นำไปสู่ผู้ป่วยที่ได้รับการยืนยันแล้วกว่า 170 ล้านรายและผู้เสียชีวิต 3.5 ล้านรายทั่วโลก ณ วันที่ 1 มิถุนายน พ.ศ. 2564 [4] แม้ว่าก่อนหน้านี้เชื่อว่าการติดเชื้อ coronavirus ในมนุษย์ทำให้เกิดอาการไม่รุนแรงและคล้ายหวัด แต่ล่าสุด coronaviruses ที่จะเกิดขึ้นคือ SARS-CoV (เฉียบพลันรุนแรงทางเดินหายใจcoronavirus) และ MERS-CoV (ตะวันออกกลางทางเดินหายใจดาวน์ซินโดรม coronavirus) มีความเกี่ยวข้องกับทางเดินหายใจและอาการไม่หายใจ[5,6] ตั้งแต่เล็กน้อยจนถึงรุนแรง นำไปสู่ความล้มเหลวของอวัยวะและความตาย [Z. มีรายงานผู้ป่วยที่ไม่มีอาการ[8]. ด้วยภาระด้านสาธารณสุขตลอดจนช่วงความรุนแรงของโรค การพัฒนาแบบจำลองสัตว์เพื่อการศึกษาโรคซาร์ส-CoV-2การเกิดโรคและระบุมาตรการรับมือมีความสำคัญสูง การประเมินการตอบสนองของโฮสต์ต่อการติดเชื้อไวรัสในร่างกายเป็นสิ่งสำคัญในการระบุปัจจัยของโฮสต์ที่ควบคุมโรคร้ายแรงและไบโอมาร์คเกอร์ที่อาจช่วยแจ้งมาตรการการดูแลสนับสนุนผู้ป่วย

การประเมินการตอบสนองของโฮสต์ต่อโรคซาร์ส-CoV-2ได้นำไปสู่ข้อมูลเชิงลึกอันมีค่าเกี่ยวกับความก้าวหน้าของโรคและกลไกภูมิคุ้มกันที่เป็นไปได้ซึ่งนำไปสู่โรคร้ายแรง ปัจจุบันมีการแสดงอย่างกว้างขวางว่าผู้ป่วยโควิด-19 ขั้นรุนแรง-19ในมนุษย์มักมาพร้อมกับการแสดงออกของยีนอักเสบที่เพิ่มขึ้น รวมถึง Interleukin-6(IL-6), Interleukin-1 beta(IL-1beta) และ Tumor Necrosis Factor (TNF) [9-11] ก่อนหน้าโรคซาร์ส-CoV-2เป็นที่ทราบกันดีว่า coronaviruses สามารถควบคุมการตอบสนองของ interferon type I[12,13] จากการศึกษาหลายชิ้นพบว่าการตอบสนองของ interferon type I นั้นไม่ชัดเจนในระหว่างโรคซาร์ส-CoV-2การติดเชื้อซึ่งบ่งชี้ว่าสิ่งนี้อาจส่งผลต่อผลลัพธ์ของ COVID-19 ที่ไม่ดี[14,15] ข้อมูลทางคลินิกเหล่านี้ชี้ให้เห็นถึงตัวบ่งชี้ที่เป็นไปได้ของการเกิดโรคสำหรับการตรวจสอบการทดลองเพิ่มเติม

หนูแฮมสเตอร์ซีเรียเป็นหนึ่งในสัตว์ไม่กี่ชนิดที่ระบุได้ในช่วงต้นของการระบาดของโรคแพนเดมิกที่จะติดเชื้ออย่างมีประสิทธิผลโรคซาร์ส-CoV-2และศักยภาพการใช้งานสำหรับการพัฒนาพรีคลินิกและการวิเคราะห์ในร่างกาย[l6] เดิมทีแฮมสเตอร์ถูกกำหนดให้อ่อนแอต่อ SARS-CoV [17] และตั้งแต่นั้นมาก็แสดงให้เห็นว่าเป็นแบบอย่างสำหรับโรคซาร์ส-CoV-2[18]. หนูแฮมสเตอร์สามารถรองรับได้โรคซาร์ส-CoV-2การจำลองแบบภายในส่วนล่างทางเดินหายใจทางเดิน[18-20] ที่มีความคล้ายคลึงกันบางประการกับการเปลี่ยนแปลงของการติดเชื้อและโรคเช่นเดียวกับของมนุษย์ แม้ว่าระยะเวลาในการติดเชื้อดูเหมือนจะสั้นกว่าในแฮมสเตอร์[21] พังพอนไม่ได้แสดงให้เห็นว่าสนับสนุนการติดเชื้อภายในปอดเนื่องจากตรวจพบไวรัสที่ส่วนบนเท่านั้นทางเดินหายใจทางเดินที่แนะนำแบบจำลองนี้อาจเป็นประโยชน์สำหรับการศึกษาการส่งผ่าน[22] นอกจากนี้ ยังไม่พบว่าหนูมีความอ่อนไหวต่อหวู่ฮั่นดั้งเดิมโรคซาร์ส-CoV-2ไวรัส. หนูแฮมสเตอร์ยังแสดงให้เห็นว่ามีการตอบสนองของแอนติบอดีที่มีประสิทธิภาพและได้ถูกนำมาใช้สำหรับทั้งวัคซีนโควิด-19และการศึกษาการรักษา[19,20,23] เช่นเดียวกับสัตว์ที่ไม่ใช่แบบดั้งเดิมอื่น ๆ มีการขาดสารชีวภาพจำเพาะของหนูแฮมสเตอร์สำหรับการกำหนดลักษณะการตอบสนองของภูมิคุ้มกันและกลไกของการเกิดโรค[24]

เราตรวจสอบการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันและการเกิดโรคของโรคซาร์ส-CoV-2การติดเชื้อในแฮมสเตอร์เพื่อตรวจหากลไกการเกิดโรคและการมีส่วนร่วมของอวัยวะเฉพาะ เช่น ปอดหัวใจ, และไตเนื่องจาก COVID-19 เป็นโรคหลายระบบโรคซาร์ส-CoV-2แฮมสเตอร์ซีเรียที่เพาะเชื้อถูกสุ่มตัวอย่างในระยะเวลา15-วันสำหรับการวิเคราะห์ไวรัสและภูมิคุ้มกันโดย qRT-PCR, การวิเคราะห์การถอดรหัส, การสอบวิเคราะห์การไทเทรตไวรัส และอิมมูโนฮิสโตเคมี (IHC) ดิทางเดินหายใจทางเดินมีภาระสูงในการทำซ้ำของไวรัสทั้งในพื้นที่ด้านบนและด้านล่างโดยมีการตอบสนองของ interferon type I ทื่อ ในขณะที่เราพบหลักฐานเพียงเล็กน้อยของการติดเชื้อไวรัสภายนอกทางเดินหายใจทางเดินอาหาร RNA ของไวรัสมีอยู่ในอวัยวะต่าง ๆ รวมถึงไต, หัวใจ, ต่อมน้ำเหลือง และตับที่มีการแสดงออกร่วมกันของผู้ไกล่เกลี่ยการอักเสบ เช่น IL-6, TNF และ IL-1เบตา ปอดและอวัยวะนอกปอดแสดงสัญญาณของการแทรกซึมของเซลล์อักเสบซึ่งนำไปสู่ความเสียหายของเนื้อเยื่อ เมื่อนำมารวมกัน เราได้กำหนดแบบจำลองหนูแฮมสเตอร์ของการสร้างภูมิคุ้มกันในบริบทของโควิด-19 ซึ่งสามารถใช้เพื่อระบุความสัมพันธ์ของการป้องกันและโรค เพื่อประเมินมาตรการทางการแพทย์

คลิกเพื่อดูผลกระทบต่อโรคไต

ผลลัพธ์

โรคซาร์ส-CoV-2-แฮมสเตอร์ที่ฉีดวัคซีนจะลดน้ำหนักที่สัมพันธ์กับปริมาณไวรัส, ไวรัสที่ติดเชื้อในทางเดินหายใจทางเดินอาหารและ RNA ของไวรัสในเนื้อเยื่อไม่หายใจ

หนูแฮมสเตอร์ซีเรียไวต่อการติดเชื้อโรคซาร์ส-CoV-2บ่งชี้ว่าอาจเป็นประโยชน์สำหรับการตรวจสอบภูมิคุ้มกันและกลไกการเกิดโรค[20] หนูแฮมสเตอร์มีอายุ 6-8 สัปดาห์ได้รับการฉีดวัคซีนทางจมูกด้วยโรคซาร์ส-CoV-2 at 10° TCIDs0. The animals were monitored for temperature and weight throughout the course of the infection. As typical during viral infection in small animals, hamsters began showing a decrease in temperature by day 1 post-inoculation(pi)(S1A Fig)which returned to baseline between day 3 and 7 (S1B Fig). Inoculated hamsters began losing weight on day 2 pi, with weights being significantly different from baseline on days 3 to 7. Weight loss was most severe on day 6 pi where the average body weight of the inoculated animals was 88.26% of the original weight (Fig 1A). After day 6, there was a steady increase in weight over the remaining time course on average recovering to baseline by day 12. Individual animals showed two different trajectories of weight loss: mild (~4%weight loss) and severe(>น้ำหนักลดลง 15 เปอร์เซ็นต์)(รูปที่ 1B) ไม่มีสัตว์ตัวใดที่สูญเสียน้ำหนักเดิมมากกว่าร้อยละ 20 และยังบรรลุเกณฑ์อื่นๆ สำหรับจุดยุติที่มีมนุษยธรรมตามที่กำหนดไว้ในวิธีการต่างๆ ในระหว่างการศึกษา สัตว์ถูกกำจัดออกจากการศึกษาที่วันสิ้นสุดที่กำหนดไว้ล่วงหน้าสำหรับการรวบรวมตัวอย่าง ดังนั้นน้ำหนักแต่ละตัวสำหรับสัตว์ทั้งหมดจะไม่ถูกแสดง

โควิด-19 ส่งผลกระทบต่อระบบอวัยวะหลายอย่างในมนุษย์ รวมถึงหัวใจ, ไต, ตับ, ม้าม และลำไส้ใหญ่[25,26]. ดังนั้นเราจึงสนใจที่จะกำหนดเขตร้อนของไวรัสและภูมิคุ้มกันที่เกี่ยวข้องทั่วร่างกายของแฮมสเตอร์ที่ติดเชื้อเพื่อให้เข้าใจถึงโรคนี้ สัตว์ถูกนำออกจากการศึกษาในวันที่ 0,2,5,8,12 และ 15pi เพื่อประเมินการตอบสนองที่จำเพาะต่อเนื้อเยื่อสำหรับการชันสูตรพลิกศพและการวิเคราะห์ทางภูมิคุ้มกันวิทยา เลือด น้ำยาล้างจมูก และเนื้อเยื่อ (ทางเดินหายใจและไม่หายใจ) ถูกเก็บรวบรวม Viral tropism ได้รับการประเมินโดย qRT-PCR สำหรับโรคซาร์ส-CoV-2ยีนซองจดหมาย(E)และการไทเทรตไวรัสด้วยการทดสอบปริมาณเชื้อเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ 50(TCIDs0) (รูปที่ 2) การวิเคราะห์การแสดงออกของยีน E แสดงด้วยวงกลมสีน้ำตาลบนกราฟ บทวิเคราะห์ของทางเดินหายใจทางเดินเผยให้เห็น vRNA อยู่ในจมูก turbinates หลอดลม และปอดที่ทดสอบทั้งสี่ (กะโหลกขวา กลางขวา หางขวา และอุปกรณ์เสริม) ในวันที่ 2,5 และ 8 pi ยังคงตรวจพบ RNA ของไวรัสในกลีบปอดตรงกลางด้านขวาและกลีบปอดส่วนเสริมของสัตว์ตัวหนึ่งในวันที่ 12 pi การวิเคราะห์ไทเทอร์ของไวรัสแบบสด แสดงโดยวงกลมสีเทา ระบุว่ามีไวรัสติดต่อในโพรงจมูกในวันที่ 2 (7.5 TCIDs0/mL(Logl0)) และ 5 (6 TCIDs{{ 11}}/mL(Logl0))pi ไวรัสติดเชื้อพุ่งสูงสุดในปอดในวันที่ 2 ที่ ~9 TCIDs/mL(Log10) ในปอดตรงกลางด้านขวาและมีจนถึงวันที่ 5 หลอดลมมีระดับไวรัสต่ำสุดของทั้งหมดทางเดินหายใจเนื้อเยื่อซึ่งมีอยู่เฉพาะในวันที่ 2(~3 TCIDso/mL(Logl0)).vRNA ยังถูกตรวจพบในเนื้อเยื่อที่ไม่เกี่ยวกับทางเดินหายใจซึ่งรวมถึงหัวใจ, ไต, ลำไส้ใหญ่ และต่อมน้ำเหลืองในช่องท้อง ในระดับต่ำถึงปานกลาง ต่อมน้ำเหลืองในช่องท้องมีระดับ vRNA สูงสุด ~5 TCIDs (Log10) และเป็นเนื้อเยื่อที่ไม่เกี่ยวกับระบบทางเดินหายใจเพียงชนิดเดียวที่มีผลบวกต่อไวรัสที่ติดเชื้อ

รูปที่ 1. การติดเชื้อ SARS-CoV-2 ในแฮมสเตอร์ในช่องปากทำให้น้ำหนักลดลงอย่างมากหนูแฮมสเตอร์ซีเรียได้รับการฉีดเชื้อเข้าจมูกแบบเฉียบพลันรุนแรงทางเดินหายใจซินโดรม coronavirus 2 (โรคซาร์ส-CoV-2) ที่ 105 TCID50 น้ำหนัก (A และ B) ถูกบันทึกเป็นเวลา 15 วันหลังการฉีดวัคซีน ผลลัพธ์เฉลี่ย (A) แสดงค่าเฉลี่ย ผลลัพธ์ส่วนบุคคลแสดงถึงสัตว์แต่ละตัว (B) ระบุ p-value<0.05 determined="" by="" anova="" comparing="" hamsters="" on="" the="" day's="" post-inoculation="" to="" baseline="" (day="" 0).="" error="" bars="" indicate="" +/-="" standard="" error="">

เพื่อตรวจสอบว่าการแก้ปัญหาไวรัสเกิดจากการกระตุ้นแอนติบอดีที่เป็นกลางหรือไม่ ต่อไปเราจะวัดปริมาณแอนติบอดีที่ปรับให้เป็นกลางในแฮมสเตอร์ที่ติดเชื้อตลอดระยะเวลา (Eig 3A) แยกพลาสมาออกจากเลือดที่เก็บจากการชันสูตรพลิกศพเพื่อใช้สำหรับการวิเคราะห์การทำให้เป็นกลางที่ 100 TCID ต่อปฏิกิริยาของโรคซาร์ส-CoV-2. แอนติบอดีทำให้เป็นกลางถูกตรวจพบเร็วเท่ากับวันที่ 8 pi ที่ระดับจุดสิ้นสุดที่ประมาณ 63 (ค่าเฉลี่ยทางเรขาคณิต) สิ่งนี้เพิ่มขึ้นเป็นค่าเฉลี่ยเรขาคณิตที่ 160 ในวันที่ 12 และสูงสุดในวันที่ 15 ที่ค่าเฉลี่ยเรขาคณิตที่ 587 การสังเกตเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าแฮมสเตอร์สามารถกระตุ้นแอนติบอดีที่เป็นกลางในระดับสูงหลังจากโรคซาร์ส-CoV-2การติดเชื้อ. การล้างจมูกถูกเก็บรวบรวมตลอดการศึกษาเพื่อตรวจหาการหลั่งของไวรัสจากส่วนบนทางเดินหายใจตรวจพบ tract.vRNA ในการล้างจมูกนานถึง 12 วันหลังจากการฉีดวัคซีนไวรัสที่มีชีวิตที่สังเกตพบในวันที่ 2 และ 5 สูงสุดในวันที่ 2 ที่มากกว่า 6 TCID5o/mL (Log10) เราเปรียบเทียบระดับไวรัสสดที่พบในการล้างจมูกของสัตว์ทั้งหมดในวันที่ 5 กับการลดน้ำหนักตามลำดับในวันนั้น (รูปที่ 3B) ความสัมพันธ์แบบเพียร์สันสำหรับข้อมูลที่กระจายตามปกติถูกนำมาใช้สำหรับการวิเคราะห์นี้เพื่อตรวจสอบว่ามีความสัมพันธ์เชิงเส้นตรงระหว่างน้ำหนักของสัตว์ที่ติดเชื้อและระดับไวรัสในการล้างจมูกในวันที่ 5 หลังการฉีดวัคซีนกับวันที่ 5 เป็นวันที่สัตว์บางตัวเริ่มล้าง ไวรัส. เราพบสหสัมพันธ์ของแพร์-ซันที่-0.68 เช่น เมื่อระดับไวรัสในการล้างจมูกเพิ่มขึ้น สัตว์มีแนวโน้มเพิ่มขึ้นที่จะลดน้ำหนักอย่างรุนแรงมากขึ้น(p-value =0}.00242) นอกจากนี้ เราประเมินความสัมพันธ์ระหว่างระดับไวรัสในปอดกับการลดน้ำหนักในวันที่ 5 pi เนื่องจากมีการเก็บรวบรวมสัตว์เพียง 3 ตัวในแต่ละวัน ชุดข้อมูลเพื่อประเมินความสัมพันธ์จึงถูกจำกัดด้วยขนาดตัวอย่างของเรา แม้ว่าชุดข้อมูลจำนวนนี้จะไม่ตรงกับจำนวนการวัดที่ต้องการ แต่เราได้แสดงความสัมพันธ์แบบเพียร์สันและพบว่ามีค่าเป็นลบ แม้ว่าความสัมพันธ์ที่ไม่มีนัยสำคัญระหว่างระดับไวรัสในปอดกับการลดน้ำหนักในวันที่ 5 หลังการฉีดวัคซีน ตามระดับไวรัสจากกลีบปอดตามลำดับที่ประเมินเมื่อเปรียบเทียบกับน้ำหนักของสัตว์ ปอดกะโหลกด้านขวามีค่า R เท่ากับ -0.91(p-value=0.27) ปอดส่วนกลางด้านขวา มีค่า R เท่ากับ-0.92(p-value=0.25) และปอดหางขวามีค่า R เท่ากับ -0.58 (p-value{{39 }}.61)(รูป S2) ควรทำการประเมินเพิ่มเติมเกี่ยวกับสัตว์มากขึ้นเพื่อให้เกิดความมั่นใจในความสัมพันธ์ระหว่างโรคซาร์ส-CoV-2titer ไวรัสปอดและการลดน้ำหนักของสัตว์ทั้งตัว

รูปที่ 2 ไวรัส SARS-CoV-2 ที่มีชีวิตถูกกักขังอยู่ในเนื้อเยื่อทางเดินหายใจและต่อมน้ำเหลืองในช่องท้อง ขณะที่ RNA ของไวรัสมีอยู่ในอวัยวะนอกปอดสัตว์ถูกกำจัดออกจากการศึกษาในวันที่ 0 ก่อนการติดเชื้อรวมทั้งวันที่ 2, 5 8, 12 และ 15 หลังการฉีดวัคซีนทางเดินหายใจเนื้อเยื่อที่เก็บรวบรวม ได้แก่ โพรงจมูก หลอดลม และปอด (กลีบสมองซีกขวา กลีบกลางด้านขวา กลีบหางด้านขวา กลีบเสริม) อวัยวะนอกปอดที่วิเคราะห์ ได้แก่ ต่อมน้ำเหลืองในช่องท้องหัวใจ, ไตตับม้ามและลำไส้ใหญ่ เนื้อเยื่อทั้งหมดถูกเก็บเกี่ยวเพื่อหาปริมาณไวรัสโดยการตรวจจับ qPCR ของโรคซาร์ส-CoV-2ยีน E เทียบเท่ากับ TCID50/มล. โดยอิงจากเส้นโค้งมาตรฐานของ RNA ไวรัสโดยใช้ RNA ที่สกัดจากสต็อคของโรคซาร์ส-CoV-2ด้วยความเข้มข้นที่ทราบ (TCID50/mL) (สีน้ำตาล) ไวรัสที่ติดเชื้อถูกหาปริมาณโดยการทดสอบปริมาณการติดเชื้อที่เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ และแสดงออกใน TCID50/มล. (สีเทา) TCID50/มล. คำนวณโดยใช้วิธีรีดและมึนช์ เส้นประแสดงถึงขีดจำกัดของการตรวจจับในการทดสอบปริมาณไวรัสที่มีชีวิต โดยอิงจากการเจือจางต่ำสุดของตัวอย่าง ขีดจำกัดของการตรวจหาสำหรับการตรวจหา qPCR ของยีน E คือ 101 TCID50/มล. จุดข้อมูลแสดงถึงสัตว์แต่ละตัวและเส้นแสดงถึงค่าเฉลี่ย

โรคปอดบวมและพยาธิสภาพของปอดมักเป็นลักษณะเฉพาะของทางเดินหายใจการติดเชื้อไวรัส ส่งผลให้มีการเจ็บป่วยและเสียชีวิตอย่างมีนัยสำคัญ เพื่อตรวจสอบขอบเขตของความเสียหายต่อปอดในโรคซาร์ส-CoV-2หนูแฮมสเตอร์ที่ติดเชื้อ และความสามารถของหนูแฮมสเตอร์ในการสรุปอาการรุนแรงทางเดินหายใจการมีส่วนร่วมในผู้ป่วยโควิดในมนุษย์-19 เราตรวจสอบการเกิดโรคภายในปอดด้านซ้ายของแฮมสเตอร์ตลอดช่วงการติดเชื้อ (รูปที่ 4) การวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ของการย้อมสี H&E บ่งชี้ถึงความเสียหายที่เพิ่มขึ้นในปอดในระหว่างการติดเชื้อ โดยพยาธิวิทยาที่รุนแรงที่สุดระบุไว้ในวันที่ 8 pi ซึ่งแก้ไขได้บางส่วนในวันที่ 15 (Eig 4A) หนูแฮมสเตอร์ที่ไม่ติดเชื้อจะมีช่องถุงใสสะอาดโดยไม่มีหลักฐานว่าเซลล์อักเสบแทรกซึมหรือมีเลือดออก ในวันที่ 2 pi การแทรกซึมของเซลล์ที่มีนิวเคลียสเดียวมีอยู่ในช่องว่างของถุงลมและรอบหลอดลม (ลูกศรสีเหลือง) การแทรกซึมของเซลล์ดำเนินต่อไปในวันที่ 5 โดยมีการแทรกซึมเพิ่มขึ้น ในวันที่ 8 ช่องว่างรอบหลอดลมมีลักษณะเฉพาะด้วยการมีอยู่ของเซลล์นิวเคลียร์เดี่ยวที่มีการอักเสบ สังเกตพบการลอกของเซลล์เยื่อบุผิวในหลอดลม (ลูกศรสีดำ) และสามารถสังเกตการตกเลือดได้ทั่วเนื้อเยื่อ (ลูกศรสีแดง) อาการตกเลือดได้รับการแก้ไขในวันที่ 12 แม้ว่าภาวะ hyperplasia จะเห็นได้ชัด (ลูกศรสีเขียว) ภายในวันที่ 15 การก่อตัวของเยื่อไฮยาลีน(ลูกศรสีน้ำเงิน) ถูกสังเกตด้วยการลดลงพร้อมกันของการแทรกซึมของเซลล์อักเสบ

รูปที่ 3 การหลั่งของไวรัส SARS-CoV-2 เพิ่มขึ้นตามความรุนแรงของผลลัพธ์ทางคลินิก แต่จะลดน้อยลงเมื่อตรวจพบแอนติบอดีที่เป็นกลางในพลาสมาของสัตว์เก็บล้างจมูกเพื่อวัดปริมาณไวรัสโดยการตรวจจับ qPCR ของโรคซาร์ส-CoV-2ยีนอี (สีน้ำตาล) และแสดงออกในเทียบเท่า TCID50/มล. การทดสอบปริมาณไวรัสแบบสด (สีเทา) ถูกดำเนินการเพื่อหาปริมาณไวรัสที่ติดเชื้อ ไทเทรตการติดเชื้อของน้ำยาล้างจมูกถูกกำหนดโดยการสอบวิเคราะห์ปริมาณขนาดยาที่ติดเชื้อจากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ และผลลัพธ์ TCID50/มล. ถูกคำนวณโดยใช้วิธีรีดและมูนช์ LOD=ขีดจำกัดการตรวจจับสำหรับการทดสอบปริมาณไวรัสแบบสด ไทเทอร์การทำให้เป็นกลางของไวรัสถูกกำหนดโดยการสอบวิเคราะห์การทำให้เป็นกลางมาตรฐานโดยใช้พลาสมาที่เก็บรวบรวมตลอดระยะเวลา (สีดำ) (A) ระดับไวรัสในน้ำยาล้างจมูกมีความสัมพันธ์เชิงลบกับการลดน้ำหนักในวันที่ 5 หลังการติดเชื้อ ค่า R=-0.68 (ค่า p=0.00242) (B)

เพื่อตรวจสอบผลลัพธ์ของปริมาณไวรัสในปอด รวมทั้งแสดงภาพตำแหน่งของไวรัส เราทำ IHCstaining ของกลีบปอดด้านซ้ายเพื่อตรวจจับโรคซาร์ส-CoV-2โปรตีนขัดขวาง ไม่พบโปรตีนจากไวรัสในแฮมสเตอร์ที่ไม่ติดเชื้อซึ่งบ่งบอกถึงความจำเพาะของแอนติบอดีที่ใช้ ในวันที่ 2 pi ปอดซ้ายมีรอยเปื้อนอย่างมีนัยสำคัญ (ลูกศรสีดำ) บ่งบอกถึงการสะสมของโรคซาร์ส-CoV-2สไปค์แอนติเจน (Eig 4B) การย้อมสีมีความโดดเด่นที่สุดในเซลล์เยื่อบุผิวของหลอดลมโดยมีการย้อมสีแบบกระจายไปทั่วเซลล์เยื่อบุผิวของผนังถุง ในวันที่ 5 มีคราบแสง (ลูกศรสีน้ำเงิน) ผ่านทางเดินหายใจและเซลล์ถุงลม ไม่พบการย้อมสีในวันที่ 8 pi โดยที่ภาพดูเหมือนกับภาพของหลอดลมที่ไม่ติดเชื้อ

รูปที่ 4 หนูแฮมสเตอร์ที่ฉีดวัคซีนแล้วมีการอักเสบที่สำคัญในปอดซึ่งเกิดขึ้นพร้อมกับการย้อมแบบสไปค์แอนติเจนของ SARS-CoV-2ปอดด้านซ้ายถูกรวบรวมจากสัตว์แต่ละตัวในการชันสูตรพลิกศพและผสมด้วยฟอร์มาลิน 10 เปอร์เซ็นต์ก่อนการฝังบล็อกพาราฟินและการย้อมสี H&E ลูกศรสีแดงแสดงถึงการตกเลือด ลูกศรสีเขียวบ่งชี้ว่า hyperplasia; ลูกศรสีเหลืองบ่งบอกถึงการแทรกซึมของเซลล์นิวเคลียร์เดี่ยว ลูกศรสีดำแสดงถึงการหลุดลอกของเซลล์ ลูกศรสีน้ำเงินแสดงถึงการก่อตัวของเยื่อไฮยาลิน (A) ปอดเปื้อนเพราะการปรากฏตัวของโรคซาร์ส-CoV-2โปรตีนขัดขวางโดย IHC โดยใช้โมโนโคลนัลแอนติบอดีของกระต่ายที่ต้านการสไปค์ ลูกศรสีดำแสดงถึงการย้อมสีแอนติเจนของไวรัสในปริมาณสูงและลูกศรสีน้ำเงินบ่งชี้ว่ามีคราบแอนติเจนของไวรัส (B) ในปริมาณต่ำ ชั่งน้ำหนักปอดทั้งหมดด้วยการชันสูตรพลิกศพและพยาธิวิทยารวมของปอดแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของน้ำหนักตัวสัตว์ทั้งหมด (C) วิเคราะห์สัตว์อย่างน้อย 3 ตัวต่อจุดเวลา บ่งชี้ค่า p น้อยกว่า<0.05 determined="" by="" anova="" comparing="" hamsters="" on="" the="" day's="" post-inoculation="" to="" baseline="" (day="" 0).="" error="" bars="" indicate="" +/-="" se.="" slides="" were="" visualized="" and="" imaged="" using="" the="" leica="" dmi100="" brightfield="" microscope="" and="" dmc5400="" 20="" mp="" color="" cmos="" camera.="" images="" were="" captured="" and="" 10x="" and="" 40x.="" the="" images="" shown="" are="" representative="" of="" 3="" animals="" per="" group,="" per="" time="">

เพื่อหาปริมาณการอักเสบและการแทรกซึมของเซลล์อักเสบตลอดจนอาการบวมน้ำในปอด วิเคราะห์น้ำหนักของปอดในการชันสูตรพลิกศพ ชั่งน้ำหนักปอดทั้งหมดด้วยการชันสูตรพลิกศพและคำนวณอัตราส่วนต่อน้ำหนักตัวของสัตว์แล้วแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ (รูปที่ 4C)ในวันที่ 0 และ 2 pi ปอดมีน้ำหนักตัวของหนูแฮมสเตอร์น้อยกว่าหนึ่งเปอร์เซ็นต์ . สิ่งนี้เพิ่มขึ้นสู่จุดสูงสุดอย่างมีนัยสำคัญในวันที่ 5 โดยโดยเฉลี่ยเพียงไม่ถึง 4 เปอร์เซ็นต์ของน้ำหนักตัว น้ำหนักปอดลดลงเหลือ 1 เปอร์เซ็นต์ และยังคงมีนัยสำคัญทางสถิติจากการตรวจวัดพื้นฐานตลอดระยะเวลาที่เหลือ

การแสดงออกของยีนของโฮสต์และการสร้างโปรไฟล์ทางภูมิคุ้มกันบ่งชี้ถึงการตอบสนองการอักเสบที่เด่นชัดด้วยการส่งสัญญาณอินเตอร์เฟอรอนแบบทูโทนในทางเดินหายใจทางเดิน

เนื่องจากข้อมูลของมนุษย์ตรวจสอบระดับไซโตไคน์ในเลือด เราจึงสนใจที่จะพิจารณาการตอบสนองของภูมิคุ้มกันที่บริเวณที่ติดเชื้อ ตลอดจนอวัยวะอื่นๆ ที่ได้รับผลกระทบ เราตรวจสอบระดับของประเภท I ที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองของ interferon (IFN (Interferon) -beta, STAT (ตัวแปลงสัญญาณและตัวกระตุ้นการถอดรหัส)2,IRF (ปัจจัยควบคุม interferon)1, IRF3 และ TLR (ตัวรับที่เหมือนโทร)3) ,ประเภท II ที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองของอินเตอร์เฟอรอน (IFN-gamma,IRF2, STAT1, CXCL10) และตัวทำเครื่องหมายและตัวกลางไกล่เกลี่ยโดยกำเนิด/ดัดแปลง (CD3, CD4,CD8A, CD19,IL-2, TGF (ปัจจัยการเจริญเติบโตที่เปลี่ยนแปลง)-เบต้า ,IL-21,IL-10,IL-4,IL-5,IL-5R,IL-13,อิลลินอยส์-12 ,CD14,PKR, CCR3, CCL20, CCL22,IL-1เบต้า, IL-6, TNF)

รายงานทางคลินิกของมนุษย์ระบุว่าโรคซาร์ส-CoV-2การติดเชื้อนำไปสู่ความผิดปกติของการตอบสนองของอินเตอร์เฟอรอน[14] เราตรวจสอบการตอบสนองของ IFN ประเภท I และ I โดยการประเมินการแสดงออกของ IFN-beta, STAT2, IRF1, IRF3 และ TLR3 สำหรับการตอบสนองประเภท I และ IFN-gamma, IRF2, STAT1 และ CXCL10 สำหรับการตอบสนองประเภท II (รูปที่ 5) . IFN-beta ถูกปรับลดลงอย่างมีนัยสำคัญทั้งในโพรงจมูกและปอดในกะโหลกศีรษะด้านขวา โดยมีการยับยั้งมากที่สุดในวันที่ 2 ตัวควบคุมดาวน์สตรีมของการตอบสนอง IFN ชนิดที่ 1 ก็ลดลงเช่นกัน รวมถึง STAT2 และ IRF1 ซึ่งถึงระดับการยับยั้งสูงสุดในเวลาต่อมา เช่น รวมทั้ง IRF3 และ TLR3 ซึ่งไม่แสดงการแสดงออกของยีนเพิ่มขึ้น เรายังตรวจสอบการตอบสนองของ IFN ประเภท II เช่นเดียวกับยีนที่มีโปรตีนที่สอดคล้องกันทำหน้าที่ในวิถีทาง IFN ทั้งสองทาง IFN-แกมมา ซึ่งเป็น IFN ชนิดที่ 2 แสดงการเพิ่มขึ้นในโพรงจมูก และเด่นชัดที่สุดในปอด (รูปที่ 5) ในเนื้อเยื่อทั้งสอง มีการเพิ่มขึ้นจนถึงจุดสูงสุดตามด้วยความละเอียด 15 pi ระดับความปั่นป่วนทางจมูกของ IFN-gamma สูงสุดในวันที่ 8 ที่การเปลี่ยนแปลงเท่า 12 ในขณะที่ระดับในปอดสูงสุดในวันที่ 5 ที่การเปลี่ยนแปลงเท่า 17 ในทางเดินหายใจเนื้อเยื่อชนิด IFN ที่เป็นปฏิปักษ์ IRF2 แสดงให้เห็นการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ โดยมีจุดสูงสุดในวันที่ 8 ในโพรงจมูกและวันที่ 2 ในปอดกะโหลกด้านขวา ที่การเปลี่ยนแปลงเท่า 24 และ 25 ตามลำดับ โมเลกุลการตอบสนองของ IFN ทั่วไปแสดงการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเช่นกัน STAT1 แสดงการปรับเพิ่มขึ้นอย่างแข็งแกร่งในเนื้อเยื่อทั้งสองในวันที่ 2 และ 5 ในขณะที่ CXCL10 พุ่งสูงสุดในวันที่ 2 ในโพรงจมูกที่การเปลี่ยนแปลงเท่าใกล้ถึง 70 ในปอด CXCL10 พุ่งสูงสุดบน วันที่ 8 ที่การเปลี่ยนแปลงเท่า 30 แต่ไม่สามารถกลับไปสู่การตรวจวัดพื้นฐาน และยังคงเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับสัตว์ไร้เดียงสาในวันที่ 12 และ 15 pi จากข้อมูลนี้ ปรากฏว่าในขณะที่การตอบสนองของ IFN ประเภท II ยังคงไม่บุบสลาย แต่แฮมสเตอร์ก็ฉีดวัคซีนด้วยโรคซาร์ส-CoV-2แสดงการตอบสนอง IIFN ที่ผิดปกติในทางเดินหายใจเนื้อเยื่อ

รูปที่ 5 การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนในเนื้อเยื่อทางเดินหายใจของหนูแฮมสเตอร์ที่ติดเชื้อ SARS-Cov-2 เผยให้เห็นความผิดปกติของอินเตอร์เฟอรอนที่มีนัยสำคัญพร้อมกับการเพิ่มขึ้นของสารไกล่เกลี่ยการอักเสบและภูมิคุ้มกันร่วมด้วยทำ qRT-PCR กับ RNA ที่สกัดจากโพรงจมูกและเนื้อเยื่อปอดกะโหลกขวาของโรคซาร์ส-CoV-2หนูแฮมสเตอร์ที่เพาะเชื้อ ตัวอย่างได้รับการประเมินสำหรับประเภท I ที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองของ interferon (IFN-beta, STAT2, IRF1, IRF3, TLR3), type II interferon response-related (IFN-gamma, IRF2, STAT1, CXCL10) และโดยกำเนิด/ ตัวไกล่เกลี่ยแบบปรับตัว (CD3, CD4, CD8, CD19, IL-2, TGF-beta, IL-21, IL- 10, IL-4, IL-5, IL-5R, IL-13, IL-12, CD14, CCR3, PKR, CCL20, CCL22, IL-1เบต้า, IL-6, TNF) โดยใช้ ไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อยีนของหนูแฮมสเตอร์ (ตารางที่ 1) การเปลี่ยนแปลงการพับคำนวณโดยใช้ ΔΔCt เทียบกับค่าพื้นฐาน (วันที่ 0) โดยมี BACT เป็นยีนการดูแลทำความสะอาด วิเคราะห์สัตว์อย่างน้อยสามตัวสำหรับแต่ละจุดเวลา

นอกจากนี้ เรายังประเมินการควบคุมยีนโดยกำเนิดและดัดแปลงพันธุกรรมอีกด้วย โดยรวมแล้ว ยีนเหล่านี้ได้รับการควบคุมทั้งในโพรงจมูกและปอดในกะโหลกศีรษะด้านขวา โดยปกติกังหันน้ำทางจมูกจะแสดงการแสดงออกที่สูงกว่า (รูปที่ 5) จมูกกังหันมีการแสดงออกของยีนสูงสุดของ IL-2, TGF-beta, IL-21, IL-4, IL-5R, IL-13 และ CCR3 ในวันที่ 5 pi โดยมีการแสดงออกสูงสุดมาจาก TGF-betal ที่การเปลี่ยนแปลงเท่า 97 และ IL-13 ที่ 45.IL-10 นิพจน์สูงสุดในวันที่ 2 ที่การเปลี่ยนแปลงเท่า 38 แต่ ยังคงเพิ่มขึ้นตลอดเวลาหลักสูตร อย่างมีนัยสำคัญในวันที่ 5 และ 10.IL-5 การแสดงออกสูงสุดในวันที่ 12 ที่การเปลี่ยนแปลงเท่า 21 ภายในปอด การแสดงออกสูงสุดต่อยีนแปรผัน: TGF-betal, IL{ {25}} และ IL-13 แสดงการปรับเพิ่มขึ้นสูงสุดในวันที่ 5 IL-10, IL-4 และ IL-5 ในวันที่ 8; และ IL-2 ในวันที่ 12.IL-4 และ IL-13 แสดงการปรับเพิ่มสูงสุดที่ 25 และ 18 ในวันพีคตามลำดับ เครื่องหมายจำเพาะของทีเซลล์สูงที่สุดในโพรงจมูก โดยมีการแสดงออกของยีนสูงสุดในวันที่ 12 และยังคงสูงในวันที่ 15 ซึ่งชี้ให้เห็นถึงการตอบสนองของทีเซลล์ที่เกี่ยวข้องซึ่งได้รับการสนับสนุนเพิ่มเติมโดยการเพิ่มการควบคุมของ Th2 cytokines(IL-4 , IL-5, และ IL-13), ไซโตไคน์(แสดงไว้ก่อนหน้านี้ IL-12 และ IFN-แกมมา) รวมทั้งกฎข้อบังคับของ T และ Th17 ไซโตไคน์ (IL-10 และ TGF-betal) ซึ่งชี้ไปที่การตอบสนองของทีเซลล์โดยรวมต่อโรคซาร์ส-CoV-2การติดเชื้อ. ดังนั้นเราจึงดำเนินการ IHC เพื่อระบุการมีอยู่ของเซลล์ CD3 plus และ CD20 plus ภายในทางเดินหายใจทางเดิน (รูปที่ S3) CD3 บวกการย้อมสีถูกทำให้เข้มข้นไปที่หลอดเลือด (ลูกศรสีแดง) ในเนื้อเยื่อปอดที่ไม่ติดเชื้อโดยไม่มีการย้อมสีภายในช่องว่างของถุงลม การปรากฏตัวของเซลล์ CD3 plus (รูป S3A, ลูกศรสีดำ) เพิ่มขึ้นในพื้นที่ถุงตลอดระยะเวลาจนถึงการย้อมสีสูงสุดในวันที่ 8 หลังการฉีดวัคซีน และจากนั้นความเข้มจะลดลงในวันนี้ 15. ไม่พบการย้อมสี CD20 ในเนื้อเยื่อที่ไม่ติดเชื้อ ตรวจพบเซลล์ CD20 บวกจำนวนเล็กน้อยในวันที่ 2,5 และการฉีดวัคซีน 8 หลัง (รูปที่ S3B แสดงด้วยลูกศรสีดำ) ซึ่งลดลงในวันที่ 12 และ 15 ตามที่ระบุโดยลูกศรสีเทา

การวิเคราะห์ตัวบ่งชี้การอักเสบภายในโพรงจมูกบ่งชี้การเพิ่มขึ้นชั่วคราวอย่างมีนัยสำคัญของเป้าหมายการอักเสบทั้งหมดที่ได้รับการแก้ไขโดยวันที่ 12 และ 15.IL-1เบต้าถึงระดับสูงสุดในวันที่ 2 pi ที่การเปลี่ยนแปลงเท่า 4{{7 }} ญาติในวันนี้ 0 สัตว์ที่ไม่ติดเชื้อ (รูปที่ 5)IL-6, IL-12 และ TNF ถึงยอดวันที่ 5 pi (การเปลี่ยนแปลงเท่า 66,20 และ 26 ตามลำดับ) ความสำคัญที่สอดคล้องกันสามารถพบได้ในตาราง S1 ในทางตรงกันข้าม การถอดเสียงเหล่านี้ถึงจุดสูงสุดระหว่างวันที่ 2 ถึง 5 แต่มีการเปลี่ยนแปลงพับที่ต่ำกว่าเมื่อเทียบกับปอด ทั้งในโพรงจมูกและในปอด ไซโตไคน์ที่มีการอักเสบหลายตัวยังคงสูงขึ้นเมื่อเทียบกับการตรวจวัดพื้นฐานจนถึงวันที่ 12 pi เมื่อนำมารวมกัน บริเวณที่เกิดการติดเชื้อแสดงให้เห็นสัญญาณการอักเสบที่เพิ่มขึ้นอย่างชัดเจน โดยเฉพาะ IL-6 ในโพรงจมูกและ TNF ในปอด

คลิกที่นี่เพื่อเป็นส่วนหนึ่ง Ⅱ