การตอบสนองแบบแบ่งขั้วต่อภาวะขาดออกซิเจนของทารกในครรภ์เรื้อรังนำไปสู่ฟีโนไทป์ของการแก่ชราที่กำหนดไว้ล่วงหน้า Ⅰ

โดยย่อ

การใช้โปรตีโอมิกส์จากล่างขึ้นบนและไตเป็นกระบวนทัศน์ เรารายงานมุมมองเชิงบูรณาการของการตอบสนองของเซลล์ต่อภาวะขาดออกซิเจนของทารกในครรภ์เรื้อรัง เปิดเผยกลไกพื้นฐานของการเขียนโปรแกรมของทารกในครรภ์ของทฤษฎีโรคในผู้ใหญ่ที่บังคับใช้กับอวัยวะอื่น ๆ ทั้งหมดในร่างกายเป็นหลัก ลักษณะเฉพาะของเนื้อเยื่อและเซรั่มไบโอมาร์คเกอร์โปรฟิเลอจะส่งเสริมการพัฒนาวิธีการรักษาแบบใหม่เพื่อต่อต้านฟีโนไทป์ของการแก่ก่อนวัยที่ดูเหมือนว่าจะเกี่ยวข้องกับการเขียนโปรแกรมของทารกในครรภ์โรคเรื้อรัง.

รับสารสกัดจากถังเก็บน้ำออร์แกนิกธรรมชาติที่มีเอไคนาโคไซด์ 25% และแอคทีโอไซด์ 9% สำหรับการติดเชื้อในไต

ไฮไลท์

• ภาวะขาดออกซิเจนในทารกในครรภ์เรื้อรังทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงอย่างกว้างขวางในการแสดงออกของโปรตีน

• การจำลองแบบและการแปลแบบอดกลั้นจะจำกัดการก่อตัวของเนฟรอนใหม่

• ได้หลายเส้นทางกำหนดฟีโนไทป์ของการแก่ชราไว้ล่วงหน้าแล้วในระหว่างการพัฒนา

• การทำงานร่วมกันของอินชั้นความเสียหายของอวัยวะสืบพันธุ์ การซ่อมแซมที่ไม่ได้ผล และการเปลี่ยนแปลงการเผาผลาญ

• ลดปริมาณโปรตีนต่อต้านริ้วรอยklotho และ sirtuin 6 ในหนูและมนุษย์

การจำกัดการเจริญเติบโตของมดลูกที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจนจะเพิ่มความเสี่ยงหัวใจและหลอดเลือด, ไต, และอื่น ๆโรคเรื้อรังในผู้ใหญ่ซึ่งถือเป็นปัญหาสาธารณสุขที่สำคัญ ยังไม่ค่อยมีใครทราบเกี่ยวกับกลไกของทารกในครรภ์ที่จูงใจบุคคลเหล่านี้ให้เป็นโรค การใช้แบบจำลองเมาส์ที่ได้รับการตรวจสอบก่อนหน้านี้ของภาวะขาดออกซิเจนของทารกในครรภ์และโปรตีโอมิกส์จากล่างขึ้นบน เราแสดงลักษณะการตอบสนองของไตของทารกในครรภ์ต่อความเครียดจากการขาดออกซิเจนเรื้อรัง ไตของทารกในครรภ์แสดงการตอบสนองแบบแบ่งขั้วต่อภาวะขาดออกซิเจนเรื้อรัง ซึ่งประกอบด้วยการปรับตัวของเซลล์ในด้านหนึ่งซึ่งส่งเสริมการอยู่รอด (ไกลโคไลซิส การกินอัตโนมัติ และการสังเคราะห์ดีเอ็นเอและโปรตีนที่ลดลง) แต่ในกระบวนการอื่นที่ทำให้เกิดฟีโนไทป์ที่คล้ายการชราภาพ (การแทรกซึมของเซลล์ที่มีการอักเสบ) , ความเสียหายของ DNA และการแพร่กระจายลดลง) ที่สำคัญภาวะขาดออกซิเจนเรื้อรังยังช่วยลดการแสดงออกของโปรตีนต่อต้านริ้วรอย klotho และ Sirt6 ซึ่งเป็นกลไกที่ได้รับการอนุรักษ์เชิงวิวัฒนาการระหว่างหนูกับมนุษย์ เมื่อนำมารวมกัน เราพบว่าการสูงวัยที่กำหนดไว้ล่วงหน้าในระหว่างพัฒนาการของทารกในครรภ์เป็นเหตุการณ์สำคัญภาวะขาดออกซิเจนเรื้อรังซึ่งเป็นการสร้างรากฐานที่มั่นคงสำหรับสมมติฐานของ Barker ในเรื่องการเขียนโปรแกรมโรคในผู้ใหญ่ของทารกในครรภ์ ฟีโนไทป์นี้สัมพันธ์กับโปรไฟล์ตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่มีลักษณะเฉพาะในตัวอย่างเนื้อเยื่อและซีรั่ม ซึ่งสามารถนำไปใช้ประโยชน์ในการตรวจจับและกำหนดเป้าหมายการแก่ชราในโรคของมนุษย์ที่เป็นพิษเรื้อรัง.

CISTANCHE EXTRACT WITH 25% ECHINACOSIDE AND 9% ACTEOSIDE FOR KIDNEY INFECTION

ทฤษฎีของบาร์เกอร์ในการเขียนโปรแกรมโรคในผู้ใหญ่ของทารกในครรภ์ (1, 2) ระบุว่าเหตุการณ์ไม่พึงประสงค์ระหว่างการพัฒนาจะเพิ่มความเสี่ยงต่อโรคเรื้อรังหลายชนิดในวัยผู้ใหญ่ รวมทั้งความดันโลหิตสูง,โรคเบาหวาน,โรคปอดอุดกั้น, หรือโรคไตเรื้อรัง(ซีเคดี). ในสังคมสูงวัยของเราที่มีอย่างต่อเนื่อง ความผิดปกติเหล่านี้สร้างภาระทางเศรษฐกิจจำนวนมหาศาลที่เพิ่มมากขึ้นเรื่อยๆ เนื่องจากจำนวนผู้ป่วยที่ทุกข์ทรมานจากความผิดปกติเหล่านี้ตั้งแต่หนึ่งอย่างขึ้นไปมีจำนวนเพิ่มขึ้น กลุ่มคนเหล่านี้,โรคไตวายเรื้อรังและโรคไตวายระยะสุดท้าย(ESRD) ไม่เพียงแต่เป็นตัวแทนของปัจจัยเสี่ยงที่เป็นอิสระต่อโรคหลอดเลือดหัวใจและการเสียชีวิตเท่านั้น แต่ยังสร้างต้นทุนที่เพิ่มขึ้นสำหรับการบำบัดทดแทนไต ทำให้เป็นปัญหาสาธารณสุขที่สำคัญ ในบรรดากลยุทธ์ที่จะเผชิญกับแนวโน้มนี้ การชี้แจงกลไกที่เชื่อมโยงทฤษฎีของ Barker และการพัฒนาโรคไตวายเรื้อรังมีบทบาทสำคัญ คำอธิบายที่เป็นไปได้สำหรับการสูญเสียการทำงานของไตอย่างค่อยเป็นค่อยไปในลูกหลานที่มีน้ำหนักแรกเกิดน้อยตั้งสมมติฐานว่าจะเกิดวงจรอุบาทว์ที่หมุนระหว่างพื้นผิวการกรองไตที่ลดลง ปริมาณงานที่เพิ่มขึ้นในไตที่เหลือ และความเสียหายเพิ่มเติมนั้นอีกครั้งทำให้ความสามารถในการกรองลดลง(Brenner's hypothesis) (3). A common finding in intrauterine growth restriction (IUGR) babies is the reduced number of nephrons formed at the end of kidney development (4). Thus, a low nephron number at birth increases the risk for accelerated functional decline and irreversible renal tissue damage (5, 6). Among all possible intrauterine stress factors, chronic hypoxia due to placental insufficiency or pregnancy at high altitude (>ความสูง 2,500 เมตรเหนือระดับน้ำทะเล ซึ่งส่งผลกระทบมากกว่า 2% ของประชากรโลก (7, 8)) เป็นปัจจัยที่สำคัญที่สุดและมีความเกี่ยวข้องทางคลินิกมากที่สุดในการรบกวนโปรแกรมการพัฒนาของเอ็มบริโอ (9) อย่างไรก็ตาม กลไกระดับโมเลกุลที่ทำให้ภาวะขาดออกซิเจนนำไปสู่ IUGR และการพัฒนาของไตที่ถูกรบกวนยังคงเป็นที่เข้าใจไม่ครบถ้วนและรับประกันว่าจะต้องมีการตรวจสอบเพิ่มเติม ในการศึกษานี้ เราประเมินระดับโปรตีโอมของการเปลี่ยนแปลงระดับโมเลกุลในไตของทารกในครรภ์เมื่อได้รับตัวอ่อนของหนูที่กำลังพัฒนาไปสู่ความเครียดจากการขาดออกซิเจนเรื้อรัง และยืนยันการค้นพบที่สำคัญบางประการในตัวอย่างซีรั่มที่เป็นพิษของมนุษย์ เราจัดเตรียมหลักฐานที่สำคัญสำหรับกลไกการโต้ตอบต่างๆ ที่ในด้านหนึ่งช่วยให้เซลล์อยู่รอดได้ในสภาวะที่ไม่เอื้ออำนวย แต่ในทางกลับกัน ส่งเสริมจำนวนเนฟรอนที่ลดลง และฟีโนไทป์ที่คล้ายการชราภาพก่อนวัยอันควร เรายังแสดงให้เห็นอีกว่าDNA เฉพาะของยีนไฮเปอร์เมทิลเลชั่น แต่ยังรวมถึงดีเอ็นเอไฮโปเมทิลเลชั่นมีส่วนทำให้เกิดการตอบสนองแบบแบ่งขั้วต่อภาวะขาดออกซิเจนเรื้อรัง ดังนั้น การค้นพบของเราจึงเป็นรากฐานที่มั่นคงสำหรับสมมติฐานของ Barker ซึ่งเผยให้เห็นแนวทางต่างๆ ที่กำหนดไว้ล่วงหน้าฟีโนไทป์ของการแก่ชราแล้วในระหว่างการพัฒนา

CISTANCHE EXTRACT WITH 25% ECHINACOSIDE AND 9% ACTEOSIDE FOR KIDNEY INFECTION

ขั้นตอนการทดลอง

การออกแบบการทดลองและเหตุผลทางสถิติ วัตถุประสงค์ของการศึกษาเชิงสำรวจนี้คือเพื่อเปิดเผยการเปลี่ยนแปลงในโปรตีโอมของไตของทารกในครรภ์ทั้งตัวที่ได้มาจากทารกในครรภ์ IUGR เพื่อเพิ่มพูนความรู้เกี่ยวกับกลไกของทารกในครรภ์ที่โน้มนำเด็กเล็กในวัยตั้งครรภ์ไปสู่โรคเรื้อรังในวัยผู้ใหญ่ การศึกษานี้อิงจากการทำโปรไฟล์โปรตีโอมิกจากล่างขึ้นบนโดยใช้ระบบนาโน-LC ควบคู่กับแมสสเปกโตรมิเตอร์ที่มีความละเอียดสูง ด้วยเหตุนี้ ไตที่เป็นพิษ E18.5 จำนวน 6 ไตและไตที่เป็นพิษตามปกติ E18.5 จำนวน 6 ไตจากเพศชายจึงถูกนำมาใช้และวิเคราะห์ซ้ำกันในการทดลองที่มีการควบคุมในลักษณะที่ปกปิด การจำลองทั้งหมดประสบความสำเร็จ ไม่มีการค้นพบเชิงทดลองใดที่ไม่สามารถจำลองแบบได้ ข้อมูลโปรตีโอมิกส์ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ MaxQuant 1.5.2.8 (รวมถึงเครื่องมือค้นหา Andromeda และแพ็คเกจการวิเคราะห์ทางสถิติ Perseus) และการจัดกลุ่มคำอธิบายประกอบเชิงฟังก์ชัน สำหรับผลที่ตามมาในระยะยาวของภาวะขาดออกซิเจนของทารกในครรภ์เรื้อรังต่อการทำงานของไต สุ่มเลือกลูกหลานชายที่ขาดออกซิเจน 5 รายและทารกที่เป็นพิษตามปกติ 5 รายและวิเคราะห์ที่ 8 เดือน (สัตว์ 5 ตัวจะต้องตรวจพบการลดลง 30% ใน GFR ในสัตว์ที่ขาดออกซิเจนของทารกในครรภ์ โดยขึ้นอยู่กับความแปรปรวน ของ 15%, อัลฟ่า=0.05, กำลัง=0.9) การทดลองภายในร่างกายได้ข้อสรุปด้วยการประเมินการเกิดพังผืดของไตและเครื่องหมายในซีรั่มหลังจากผ่านไป 15 เดือน เพื่อตรวจสอบความถูกต้องของการค้นพบที่สำคัญบางประการจากการทดลองในสัตว์ จึงมีการวิเคราะห์ตัวอย่างซีรั่มของมนุษย์ ซึ่งรวบรวมในการศึกษาวิจัยที่มีการควบคุมก่อนหน้านี้ของอาสาสมัครที่มีสุขภาพดี (10) การทดลองในหลอดทดลองทั้งหมดได้รับการประเมินและปกปิดด้วยกลุ่มควบคุมที่เหมาะสม การทดสอบทางสถิติและรายละเอียดการทดลองมีอยู่ในคำอธิบายแผนภูมิแต่ละรูป ข้อมูลทั้งหมดจะถูกนำเสนอและรวมถึงค่าผิดปกติทั้งหมด

สัตว์

หนู C57BL/6N ซื้อมาจากห้องปฏิบัติการ Janvier ประเทศฝรั่งเศส และเลี้ยงที่อุณหภูมิ 23 ◦C และความชื้น 50 ถึง 60% ในกรง IVC พร้อมสิทธิ์เข้าถึงอาหารและน้ำได้ฟรี และวงจรกลางวัน/กลางคืน 12 ชั่วโมง การทดลองกับสัตว์ทั้งหมดดำเนินการตามกฎหมายสวิสเพื่อสวัสดิภาพของสัตว์ และได้รับการอนุมัติจากหน่วยงานท้องถิ่น (รัฐเบิร์น พ.ศ. 96/11, พ.ศ. 105/14 และ พ.ศ. 105/17) สำหรับการผสมพันธุ์แบบกำหนดเวลา หญิงในการผสมพันธุ์จะได้รับการตรวจปลั๊กในช่องคลอดทุกเช้า และหากมี จุดเวลาจะถูกตั้งเป็นวันตั้งครรภ์ (E) 0.5 เขื่อน Gravid ได้รับการสุ่มให้กับกลุ่มควบคุมภาวะปกติ (N=11) หรือเผชิญกับภาวะขาดออกซิเจนอย่างต่อเนื่อง (N=11) เป็นเวลา 7 วัน สำหรับการเหนี่ยวนำให้เกิดภาวะขาดออกซิเจน เขื่อนในวันที่ตั้งครรภ์ E11.5 จะถูกถ่ายโอนไปยังกล่องถุงมือที่เป็นพิษ (Coy Laboratory Products) และปริมาณออกซิเจนจะค่อยๆ ลดลงเหลือ 10% ภายใน 3 ถึง 4 ชั่วโมง พัดลมไฟฟ้าภายในห้องทำให้การไหลเวียนของอากาศเพียงพอ ระดับ CO2 ถูกรักษาให้ต่ำโดยการคีเลต CO2 ส่วนเกินในหลอดบรรจุโซดาไลม์ (Sigma, 72073) ที่เชื่อมต่อกับระบบหมุนเวียนอากาศ ความชื้นส่วนเกินถูกดูดซับโดยเม็ดส้มซิลิกาเจล (Sigma, 1.01969) ซึ่งเปลี่ยนแปลงทุกวัน เขื่อนเก้าแห่งจากแต่ละกลุ่มถูกการุณยฆาตที่ E18.5 และรวบรวม ชั่งน้ำหนัก และเตรียมทารกในครรภ์และรกสำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติม เก็บเลือดของทารกในครรภ์จากลำตัวของทารกในครรภ์ E18.5 ที่ถูกตัดหัว ไตของทารกในครรภ์ถูกผ่าใน PBS โดยใช้กล้องสเตอริโอ Leica M80 สำหรับการวิเคราะห์ระยะยาว เขื่อนสองแห่งจะถูกลบออกจากภาวะขาดออกซิเจนสองสามชั่วโมงก่อนเกิด และใช้ลูกหลานชายเพื่อประเมินการทำงานของไต (อัตราการกรองไต— GFR) ที่ 8 เดือนตามที่อธิบายไว้ (11) และสำหรับการประเมิน ของการเกิดพังผืดในไตและระดับซีรั่มของ klotho และ sirtuin 6 ที่ 15 เดือน

การนับไต

สำหรับการย้อมอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ทั้งเมานต์ของไต E18.5 จะใช้โปรโตคอลการย้อมสี iDisco (12) (//idisco.info/idisco-protocol/) พร้อมการปรับสภาพเมทานอลโดยใช้แอนติบอดี antinephrin (R&D AF3159) ใช้เวลาฟักตัว n=1 วันและปริมาตรของสารละลาย 1.6 มิลลิลิตรถูกนำมาใช้สำหรับขั้นตอนที่เกี่ยวข้อง ไตถูกติดตั้งใน 8-สไลด์ห้องกระจกอย่างดี (เทอร์โม ฟิชเชอร์ 154534) และถ่ายภาพทันทีโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ดิจิตอล IMIC (FEI ประเภท 4001) ด้วยแสง Polychrome V แหล่งที่มา ตัวควบคุมกล้อง Orca-R2 จาก Hamamatsu (C10600) และซอฟต์แวร์ Live Acquisition (FEI เวอร์ชัน 2.6.0.14) ภาพ Z-stack หลายร้อยไมโครเมตรของไต E18.5 ภูเขาที่ย้อมสีทั้งตัวได้รับการวิเคราะห์ด้วยซอฟต์แวร์ประมวลผลภาพแบบโอเพ่นซอร์สในฟิจิ (ImageJ, เวอร์ชัน 2.0.0-rc69/1.52i, https:// imagej.net/ ฟิจิ) ในปลั๊กอิน TrackMate v3.8.0 ตัวตรวจจับ Downsample LoG ถูกตั้งค่าเป็น 80.0 พิกเซลสำหรับเส้นผ่านศูนย์กลางหยดโดยประมาณด้วยค่าเกณฑ์พิกเซล 16- และปัจจัยการสุ่มตัวอย่างต่ำ 2 จำนวนจุดต่อเฟรมถูกเพิ่มเพื่อคำนวณจำนวนกลูเมอลี ต่อไต เลือกระยะห่าง 100 ไมโครเมตรระหว่างเฟรมเพื่อหลีกเลี่ยงการนับโกลเมอรูลีที่เหมือนกันซ้ำซ้อนในภาพที่ต่อเนื่องกัน โดยให้เส้นผ่านศูนย์กลางของไตเฉลี่ย 80 ไมโครเมตร

การประเมินการกรองผ่านผิวหนังของไต GFR ถูกกำหนดในสัตว์ที่มีสติตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (11) โดยสรุป การกวาดล้างพลาสมาของ FITC-sinistrin (Fresenius-Kabi, LI9830076) ถูกวัดทั่วผิวหนังโดยใช้ไดโอดเปล่งแสงที่มีการปล่อยสูงสุดสำหรับ FITC ที่ 470 นาโนเมตร และโฟโตไดโอดตรวจจับแสงฟลูออเรสเซนต์ที่มีความไวสูงสุดที่ 525 นาโนเมตร ความเข้มของแสงฟลูออเรสเซนซ์ที่ลดลงเมื่อเวลาผ่านไปจะถูกแปลงเป็น GFR

RT-qPCR Total RNA ถูกแยกได้โดยใช้รีเอเจนต์ TRIzol (Invitrogen 15596026) ตามระเบียบวิธีของผู้ผลิต ความเข้มข้นและคุณภาพของ RNA ถูกกำหนดด้วยเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ Nanodrop 1,000 (Thermo Fisher Scientific) และ 1,000 ng ถูกคัดลอกลงใน cDNA โดยใช้ PrimeScript RT Reagent Kit (Takara, RR037A) cDNA ถูกเจือจางเป็น 2 ng/ul และดำเนินการ qPCR ด้วยโพรบ UPL (Roche) ที่มีป้ายกำกับ FAM บวกกับไพรเมอร์เฉพาะยีนที่สอดคล้องกันและ TaqMan Fast Universal PCR Master mix (Applied Biosystems, 4352042) บนระบบ PCR แบบเรียลไทม์ที่รวดเร็ว 7500 (ประยุกต์ไบโอซิสเต็มส์). การวิเคราะห์ข้อมูลดำเนินการด้วย Microsoft Excel ใช้วิธี 2 (−ΔCt) เพื่อคำนวณระดับการแสดงออกสัมพัทธ์สำหรับ RT-qPCR ลำดับของโพรบและไพรเมอร์แสดงอยู่ในตารางเสริม S1

CISTANCHE EXTRACT WITH 25% ECHINACOSIDE AND 9% ACTEOSIDE FOR KIDNEY INFECTION

การเตรียมตัวอย่างสำหรับการวิเคราะห์ LC-MS/MS ไตของทารกในครรภ์ชายที่แยกเดี่ยว (n=3 สำหรับแต่ละกลุ่ม) ถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในบัฟเฟอร์ตัวอย่าง (7.5 โมลาร์ยูเรีย, 1.5 โมลาร์ไทโอยูเรีย, 4% CHAPS, 0.{{ 18}}5% SDS, 100 มิลลิโมลาร์ ไดไทโอไตรทอล (DTT)) โดยใช้แท่งอัลตราโซนิก ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดโดยวิธีการทดสอบแบรดฟอร์ด (ห้องปฏิบัติการ Bio Rad) ใช้โปรโตคอลการย่อยแบบเจลตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (13, 14) โดยสรุป แต่ละตัวอย่างปริมาณ 80 ไมโครกรัมถูกโหลดบน SDS-PAGE ซึ่งช่วยให้เราสามารถแยกส่วนตัวอย่างล่วงหน้าเพื่อลดความซับซ้อนของตัวอย่างได้ หลังจากการตรึงด้วยเมทานอล 50%/กรดอะซิติก 10% เจลจะถูกล้างและทำให้ไวต่อ Na2S2O3 0.02% จากนั้นจึงย้อมเจลด้วย AgNO3 0.1% เป็นเวลา 10 นาที ล้างและพัฒนาด้วย Na2CO3 3%/ฟอร์มาลดีไฮด์ 0.05% จากนั้นโปรตีนแต่ละแถบก็ถูกตัดออกเป็นสี่ชิ้นแล้วนำไปนึ่ง เมื่อรีดิวซ์ด้วย DTT และอัลคิเลชั่นด้วยไอโอโดอะเซทาไมด์ (IAA) โปรตีนจะถูกย่อยด้วยเอนไซม์โดยใช้ทริปซิน / Lys-C (เกรด MS; Promega Corporation) หลังจากการย่อย เปปไทด์จะถูกชะ ทำให้แห้ง และเก็บไว้ที่ −20 ◦C จนกระทั่งวิเคราะห์ด้วย LC-MS/MS

การวิเคราะห์ LC-MS/MS

ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (13) ตัวอย่างเปปไทด์ถูกสร้างขึ้นใหม่ในกรดฟอร์มิก (FA) 5 ul 30% ซึ่งมี 10 fmol แต่ละตัวจากเปปไทด์มาตรฐานสังเคราะห์สี่ตัวและเจือจางด้วย 40 ul ระยะเคลื่อนที่ A (97.9% H2O, 2% ACN, 0.1% FA) เปปไทด์สังเคราะห์ [Glu1-ไฟบริโนเปปไทด์ B – EGVNDNEEGFFSAR; M28 – TTPAVLDSDGSYFLYSK; HK0 – VLETKSLYVR; HK1 – VLETK(ε-AC)SLYVR] ถูกเพิ่มอย่างรวดเร็วในแต่ละตัวอย่างในฐานะการควบคุมคุณภาพภายในสำหรับการเฝ้าติดตามความเสถียรของระบบ LC-MS จากนั้นฉีดสารละลายนี้สิบไมโครลิตรเข้าไปในระบบ Dionex Ultimate 3000 nano LC ควบคู่กับแมสสเปกโตรมิเตอร์ QExactive orbitrap ที่ติดตั้งแหล่งกำเนิดไอออนสเปรย์นาโน (Thermo Fisher Scientific) ในขั้นตอนการเตรียมความเข้มข้นล่วงหน้า เปปไทด์ถูกโหลดบนพรีคอลัมน์ C18 Pepmap100 ขนาด 2 ซม. × 75 μm (เทอร์โมฟิชเชอร์วิทยาศาสตร์) ที่อัตราการไหล 10 ul / นาทีโดยใช้เฟสเคลื่อนที่ A การชะล้างเปปไทด์จากพรีคอลัมน์ถึง Pepmap100 ขนาด 50 ซม. × 75 μm คอลัมน์การวิเคราะห์ (เทอร์โม ฟิชเชอร์ ไซแอนทิฟิค) และการแยกในเวลาต่อมาบรรลุผลที่อัตราการไหล 300 นาโนลิตร/นาทีโดยใช้เกรเดียนต์ของเฟส B แบบเคลื่อนที่ 8% ถึง 40% (80% ACN, 19.9% H2O, 0.1% FA) ตลอด 235 นาที การตรวจจับแมสสเปกโตรเมทรีทำได้สำเร็จ โดยทำการสแกน MS ในช่วงตั้งแต่ m/z 400 ถึง 1400 ที่ความละเอียด 70,000 (ที่ m/z =200) การสแกน MS/MS ของไอออนที่มีมากที่สุด 12 ตัวทำได้สำเร็จโดยการแยกส่วน HCD ที่พลังงานการชนที่ทำให้เป็นมาตรฐาน 30% และวิเคราะห์ในวงโคจรที่ความละเอียด 17,500 (ที่ m/z =200) ตัวอย่างทั้งหมดได้รับการวิเคราะห์ซ้ำกัน ข้อมูลโปรตีโอมิกส์แมสสเปกโตรมิเตอร์ได้ถูกฝากไว้ที่ ProteomeXchange Consortium (// proteomecentral.proteomexchange.org) ผ่านทางพื้นที่เก็บข้อมูลพันธมิตร PRIDE (15) พร้อมตัวระบุชุดข้อมูล PXD018999 และ 10.6019/ PXD018999

การจำแนกโปรตีนและปราศจากฉลาก

การหาปริมาณ (LFQ) การระบุโปรตีน การหาปริมาณที่ไม่มีฉลาก (LFQ) รวมถึงการวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ MaxQuant 1.5.2.8 รวมถึงเครื่องมือค้นหา Andromeda และแพ็คเกจการวิเคราะห์ทางสถิติ Perseus (16, 17) ซึ่งเป็นขั้นตอนการทำงานที่ใช้กันทั่วไป สำหรับการประมวลผลและการประเมินทางสถิติของข้อมูลโปรตีโอมิกส์ของปืนลูกซอง โปรตีนถูกระบุโดยใช้ฐานข้อมูล UniProt สำหรับโปรตีนมัส มัสคูลัส (เวอร์ชัน 170428 ที่มี 16,854 รายการ จำกัดเฉพาะรายการที่ได้รับการตรวจสอบเท่านั้น) ความทนทานต่อมวลเปปไทด์ 25 ppm ความทนทานต่อการจับคู่ MS/MS ที่ 2{{21 }} ppm และขาดการตัดแยกสูงสุดสองรายการโดยมีทริปซินเป็นโปรตีเอส เกณฑ์การค้นหายังรวมถึงคาร์บามิโดเมทิลเลชั่นของซิสเทอีนเป็นการดัดแปลงแบบคงที่ การออกซิเดชันของเมไทโอนีนและอะซิติเลชั่นโปรตีนที่ปลาย N เป็นการปรับเปลี่ยนตัวแปร และการระบุเปปไทด์อย่างน้อยสองตัวต่อโปรตีน โดยอย่างน้อยหนึ่งรายการมีเอกลักษณ์เฉพาะ นอกจากนี้ การจับคู่ระหว่างการวิ่งจะดำเนินการโดยใช้กรอบเวลาการแข่งขัน 5 นาทีและกรอบเวลาการจัดแนว 15- นาที สำหรับทั้งคู่ เปปไทด์และโปรตีน ใช้อัตราการค้นพบที่ผิดพลาด (FDR) ที่น้อยกว่า 0.01 สำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติ ได้ทำการเปรียบเทียบร่วมกันระหว่างตัวอย่างไตที่มีภาวะปกติและภาวะขาดออกซิเจนเพื่อกำหนดกลุ่มโปรตีน ซึ่งมีการควบคุมขึ้นหรือลงอย่างมีนัยสำคัญตามภาวะขาดออกซิเจน ด้วยเหตุนี้ โดยใช้แพ็คเกจการวิเคราะห์ทางสถิติ Perseus จึงคำนวณความแตกต่างของค่า LFQ การเปลี่ยนแปลงของค่าความอุดมสมบูรณ์ของโปรตีนระหว่างตัวอย่างไตที่เป็นพิษและเป็นพิษถูกกำหนดโดยการทดสอบแบบสองด้านด้วย p <0.05 และความแตกต่างขั้นต่ำของความอุดมสมบูรณ์สองเท่า โปรตีนทั้งหมดที่ตรงตามเกณฑ์เหล่านี้ได้รับการพิจารณาในการศึกษานี้ นอกจากนี้ เพื่อเน้นย้ำถึงผลกระทบด้านกฎระเบียบที่แข็งแกร่งที่สุดต่อภาวะขาดออกซิเจน โปรตีนที่ได้รับการควบคุมอย่างมีนัยสำคัญด้วย FDR ทั่วโลก<0.05 as determined by a permutation-based method were analyzed.

คำอธิบายประกอบการทำงานและการจัดกลุ่ม

การจัดกลุ่มคำอธิบายประกอบเชิงฟังก์ชันดำเนินการโดยใช้ฐานข้อมูลทรัพยากรอภิปรัชญาของยีน (18–20) และแพลตฟอร์ม DAVID (21) (https://david.ncifcrf.gov) เครือข่ายโปรตีนถูกสร้างขึ้นโดยใช้ฐานข้อมูล STRING (22) ค่าการแสดงออกที่แตกต่างกันระหว่างกลุ่มควบคุม normoxic และ hypoxic ไต E18.5 ถูกแมปด้วย Heatmapper (23) (//www.heatmapper.ca)

อิมมูโนวิทยา

ส่วนเนื้อเยื่อที่ฝังพาราฟินที่ตรึงด้วย PFA ได้รับการคืนน้ำ และเปอร์ออกซิเดสภายนอกถูกขัดขวางโดยการบ่มสไลด์ในสารละลาย H2O2 1.5% (0.0กรดซิตริก 2 โมลาร์, 0.{ {40}}6 M Na2HPO4) ที่อุณหภูมิ RT เป็นเวลา 15 นาทีในความมืด การดึงแอนติเจนถูกดำเนินการโดยการต้มใน Tris-EDTA (pH 9) หรือบัฟเฟอร์กรดซิตริกเป็นเวลา 20 นาที ตามด้วยการทำให้เย็นลงจนถึง RT หลังจากการปิดกั้น BSA 2% ใน PBS ที่ RT เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ส่วนต่างๆ จะถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิในสารละลายการปิดกั้น o/n ที่ 4 ◦C (MPO, ab208670; CAV1, ab32577; Abam ทั้งสอง) หลังจากการล้างสามขั้นตอนการล้างใน PBS ส่วนต่างๆ ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีต้านกระต่ายทุติยภูมิที่คอนจูเกต HRP (K4003, Dako EnVision+ System จาก Agilent) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ RT หลังจากการซักสามขั้นตอนใน PBS สัญญาณได้รับการพัฒนาด้วย DAB (Agilent, K3468) ส่วนต่างๆ ถูกย้อมสี ทำให้แห้ง และติดโดยใช้ตัวกลางยูกิตต์ (Sigma, 03989) สำหรับการตรวจหา 8-OHdG (MOG-100P, JaICA) มีการใช้ชุดตรวจภูมิคุ้มกัน Vector MOM (BMK-2202) ตามที่ผู้ผลิตระบุ ภาพที่มีความสว่างได้มาจากกล้องจุลทรรศน์ Nikon E600 (วัตถุประสงค์ Plan Fluor ELWD 20 × / 0.45) พร้อมด้วยตัวควบคุมกล้อง Digital Sight DS-UE และกล้อง DS-Ri1 (ทั้ง Nikon) โดยใช้ซอฟต์แวร์ Nikon NIS Elements 4.0

เอนไซม์

ปริมาณของระดับแลคเตต แลคเตตในไต E18.5 ถูกกำหนดหลังจากการลดโปรตีนของตัวอย่างที่มีคอลัมน์หมุนโดยใช้ชุดเอนไซม์ MAK064- 1KT (Sigma) ตามที่ผู้ผลิตระบุ

การศึกษาของมนุษย์

การศึกษาในวิชาในมนุษย์ได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมของสถาบันเทคโนโลยีแห่งสหพันธรัฐสวิส (EK 2011-N-51) และดำเนินการตามปฏิญญาเฮลซิงกิ โดยสรุป ได้รับความยินยอมจากชาวราบลุ่มที่มีสุขภาพดีและไม่สูบบุหรี่จำนวน 9 คน (ชาย 8 คน และผู้หญิง 1 คน) อาสาสมัครเหล่านี้ได้รับการประเมินตามลำดับสำหรับพารามิเตอร์ทางสรีรวิทยาหลายตัวก่อน ระหว่าง และหลัง 4-สัปดาห์ที่ต้องพักแรมบนที่สูงอย่างต่อเนื่อง ตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ (10)

การเพาะเลี้ยงเซลล์

เซลล์ tubular หลักปฐมภูมิ (pPTCs) ถูกแยกได้จากไตชาย C57BL/6N อายุ {{0}} สัปดาห์อายุ 4- สัปดาห์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า (24) โดยสรุป ชิ้นส่วนท่อใกล้เคียงได้มาจากการย่อยเนื้อเยื่อไตในเยื่อหุ้มสมองด้วยคอลลาจีเนสและการกรองที่ตามมาผ่านเมมเบรนขนาดรูพรุน 250 μm และ 80 μm PTC ได้รับการเพาะเลี้ยงใน DMEM/F12 (Gibco, 21041-025) เสริมด้วย HEPES 15 มิลลิโมลาร์, NaPyruvate 0.55 มิลลิโมลาร์, 1% NEAA และอาหารเสริมสื่อการเจริญเติบโตของเซลล์เยื่อบุไต (REGM) (Lonza, CC-4127) . เมื่อมาบรรจบกัน pPTC จะถูกแบ่งหนึ่งครั้งโดยใช้สารละลาย Accutase (Sigma, A6964) และทำซ้ำ สำหรับภาวะขาดออกซิเจน ทำการเพาะเลี้ยงเซลล์ที่ออกซิเจน 1% เป็นเวลา 48 ชั่วโมง; เพาะเลี้ยงกลุ่มควบคุมที่เป็นพิษมาตรฐานที่ออกซิเจน 19%

เอลิซา

ระดับซีรั่มของ Klotho หรือ Sirt6 ถูกกำหนดโดยใช้ชุดอุปกรณ์ต่อไปนี้สำหรับตัวอย่างเมาส์ (CSB-E14362m, เทคโนโลยี Cusabio และ OKCD02892, Aviva Systems Biology) และตัวอย่างของมนุษย์ (CSB E17018h และ CSB-E13235h; ทั้งเทคโนโลยี Cusabio) ตามโปรโตคอลที่ให้ไว้ เก็บเลือดของทารกในครรภ์ของหนูเมาส์จากลำตัวของทารกในครรภ์ E18.5 ที่ถูกตัดหัว เก็บตัวอย่างเลือดหนูจากสัตว์ที่โตเต็มวัยจากวีนา ซาฟีนา ตัวอย่างซีรั่มของมนุษย์ได้มาจากการศึกษาก่อนหน้า (10)

ไบซัลไฟต์ PCR

DNA จากสัตว์ที่ได้รับภาวะขาดออกซิเจน E18.5 หรือสัตว์ที่ได้รับนอร์ม็อกเซียถูกสกัดโดยชุดเลือดและเนื้อเยื่อของ Qiagen และแปลงไบซัลไฟต์โดยใช้ EpiTect Bisulfite Kit จาก Qiagen ตามคำแนะนำของผู้ผลิต DNA ที่ถูกแปลงจำนวน 20 นาโนกรัมถูกใช้เป็นเทมเพลตในปฏิกิริยา PCR ด้วย AmpliTaq Gold (Invitrogen) ไพรเมอร์ต่อไปนี้ได้รับการออกแบบโดยใช้ MethPrimer 2.0: Klotho, 248 bpแฟรกเมนต์ (−234/+14 ของ TSS), Kl_BS_F (TAG TTT TAG GAA GGT AAA GGG AGT G) และ Kl_BS_R (AAC AAT AAT TAT CCA AAA CAA AC) (25); Mki67, 497 bp แฟรกเมนต์ (~1 kb อัพสตรีมของ TSS), Mki67_BS_F (TTG GAA GAA TAT TGA TTT AGG AA) และ Mki67_BS{{20} }R (ACC TAT AAA CTC CCT CTC CAA AAA T) ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกรวมเข้ากับ pCR4-TOPO-Vector โดยใช้ชุด TOPO TA Cloning Kit สำหรับการหาลำดับ (Invitrogen) และเปลี่ยนสภาพเป็นแบคทีเรีย DH10 โคลนถูกส่งสำหรับการหาลำดับ (Microsyth Seqlab GmbH) การตรวจสอบ การจัดตำแหน่ง การสร้างภาพ และสถิติดำเนินการด้วยเครื่องมือหาปริมาณ QUMA สำหรับการวิเคราะห์เมทิเลชัน (26)

สถิติ

ทำการวิเคราะห์ทางสถิติและสร้างกราฟด้วย GraphPad Prism เวอร์ชัน 8 (https://www.graphpad.com) สองกลุ่มได้รับการทดสอบหานัยสำคัญโดยการทดสอบทีแบบสองด้านแบบ unpaired โดยมีหรือไม่มีการแก้ไขของ Welch (การแก้ไขของ Welch มีไว้สำหรับข้อมูลที่กระจายแบบไม่ปกติ การทดสอบ F ของความแปรปรวนมีนัยสำคัญทางสถิติ p < 0.05) ทดสอบหลายกลุ่มโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว RM พร้อมการแก้ไข Geisser – Greenhouse และการทดสอบการเปรียบเทียบหลายรายการของ Dunnett ค่าพี<0.05 were assumed significant. Means with standard deviation (SD) are shown.

แหล่งข้อมูล

ข้อมูลดิบสำหรับการทดลองทั้งหมดที่ไม่ได้เป็นผลมาจากการวิเคราะห์แมสสเปกโตรเมตรีสามารถพบได้ในไฟล์ข้อมูลต้นฉบับสเปรดชีต S1 ในชุดข้อมูลเสริม ซึ่งรวมถึงข้อมูลที่อยู่ในรูปที่ 1A และ D–H, รูปที่ 3E และ F, รูปที่ 5B, รูปที่ 7D–I, รูปที่ 8 และรูปที่เสริม S1 และรูปที่ S6

ผลลัพธ์

เรื้อรัง

ภาวะขาดออกซิเจนของทารกในครรภ์ส่งผลให้เอ็มบริโอถูกจำกัดการเจริญเติบโตและการทำงานของไตลดลงในลูกหลานที่โตเต็มวัย เพื่อให้เขื่อนที่ผสมพันธุ์ตามกำหนดเวลาได้รับภาวะขาดออกซิเจนอย่างต่อเนื่อง (ออกซิเจน 10%) เป็นเวลา 7 วัน (รูปที่ 1A) ห้องปลอดออกซิเจนจึงถูกนำมาใช้ เช่นเดียวกับงานก่อนหน้าของเรา (27) เขื่อนปรับให้เข้ากับสภาพแวดล้อมที่เป็นพิษอย่างรวดเร็ว และขนาดครอกแรกเกิดและมวลรกมีความคล้ายคลึงกับการควบคุมการตั้งครรภ์แบบปกติ (รูปที่เสริม S1, A – C) อย่างไรก็ตาม ทารกในครรภ์ที่มีภาวะขาดออกซิเจน E18.5 มีน้ำหนักตัวลดลงเมื่อเทียบกับการควบคุมแบบนอร์มอซิก ซึ่งเป็นไปตามเกณฑ์ IUGR (28) (รูปที่ 1 แบนด์เสริมรูปที่ S1D) และจำนวนเนฟรอนลดลง 40% (รูปที่ 1, C และ D) การลดลงนี้ไม่ได้เกิดจากการเสื่อมของไต (เนื้อร้ายหรือการตายของเซลล์) ในระหว่างการพัฒนาของมดลูกภายใต้สภาวะที่เป็นพิษตามที่รายงานก่อนหน้านี้ (27) นอกจากนี้ แม้จะมีระยะเวลาการเติบโตอย่างมากใน 3 สัปดาห์หลังคลอด ซึ่งเรารายงานก่อน (27) แต่ลูกหลานที่ขาดออกซิเจนในวัยผู้ใหญ่แสดงการทำงานของไตลดลงอย่างรุนแรงที่ 8 เดือน (รูปที่ 1E) และการแสดงออกของเครื่องหมายไฟโบรติกเพิ่มขึ้นที่ 15 เดือน (รูปที่ 1E) 1, F–H) จึงยืนยันความถูกต้องของวิธีการของเราในฐานะแบบจำลอง IUGR ที่แข็งแกร่งและภาพประกอบของทฤษฎีของ Barker ในการเขียนโปรแกรมโรคของทารกในครรภ์ในผู้ใหญ่