การหาปริมาณเอ็กไคนาโคไซด์ในสารสกัดน้ำของ Cistanche Herba โดย HPLC

เชิงนามธรรม:

วัตถุประสงค์ วิธีการ HPLC ถูกสร้างขึ้นสำหรับการกำหนดเอไคนาโคไซด์ในสารสกัดจากน้ำ Cistancheเฮอร์บา

วิธี Echinacoside ถูกกำหนดโดย HPLC ทำการแยกบนคอลัมน์ Inertsil ODS-SP C18 ด้วยเฟสเคลื่อนที่ซึ่งประกอบด้วยอะซิโตไนไตรล์ (A) และสารละลายกรดฟอสฟอริก 0.4% (B) โดยการชะล้างแบบไล่ระดับ ความยาวคลื่นการตรวจจับตั้งไว้ที่ 333 นาโนเมตร และอุณหภูมิคอลัมน์อยู่ที่ 30 องศา อัตราการไหลคือ 1.0 มิลลิลิตร·นาที-1 และปริมาตรการฉีดคือ 10 ไมโครลิตร ผลลัพธ์ ความสัมพันธ์เชิงเส้นของเอชินาโคไซด์ภายในช่วงความเข้มข้นที่ 44.939 7-539.276 4 ug ·mL- 1 อยู่ในเกณฑ์ดี(r=0.999 8) การฟื้นตัวอยู่ที่ 94.59%-105.31% (RSD= 2.93%,n=9) ปริมาณเอไคนาโคไซด์ในสารสกัดน้ำของ Cistanche herba อยู่ที่ 15.527,7.347,12.267 มก.·กรัม-1 สรุป วิธีการ HPLC ที่กำหนดไว้ซึ่งมีความสามารถในการทำซ้ำได้ดีนั้นมีความแม่นยำ เรียบง่าย และเป็นไปได้ เหมาะสำหรับการตรวจหาเอไคนาโคไซด์ในสารสกัดน้ำของ Cistanche herba

คำสำคัญ:HPLC;สารสกัดน้ำจาก Cistanche herba; เอชินาโคไซด์- การกำหนดเนื้อหา

Cistanche Deserticola เป็นยาชูกำลังจีนโบราณที่ใช้กันทั่วไปในทางคลินิก และเป็นที่รู้จักในชื่อ "โสมทะเลทราย" [1] Cistanche Deserticola ที่บันทึกไว้ในเภสัชตำรับจีนฉบับปี 2015 คือก้านเนื้อแห้งที่มีใบเป็นสะเก็ดของ Cistanche Deserticola YC Ma หรือ Cistanche tubulosa (Schenk) Wight มีรสอุ่น หวาน และเค็ม ส่งกลับไปยังไตและเส้นลมปราณลำไส้ใหญ่ มีฤทธิ์ในการบำรุงไตหยาง เติมสาระสำคัญและเลือด และทำให้ลำไส้และยาระบายชุ่มชื้น [2] "Materia Medica ของเสินหนง" กล่าวว่าสามารถ "บำรุงส่วนกลาง บำรุงอวัยวะภายในทั้งห้า เสริมสร้างหยิน และบำรุงแก่นแท้" Cistanche Deserticola ส่วนใหญ่ประกอบด้วย phenylethanoid glycosides, iridoids และ glycosides, lignans และ glycosides, polysaccharides, สารประกอบเอสเทอร์และอัลคาลอยด์ [3] Phenylthanol glycosides เป็นส่วนผสมหลักของ Cistanche Deserticola ในหมู่พวกเขา echinacoside และ verbascoside มีอยู่ใน Cistanche Deserticola ในเภสัชตำรับจีน

ส่วนประกอบบ่งชี้สำหรับการระบุและการกำหนดเนื้อหา การศึกษาทางเภสัชวิทยา [4] แสดงให้เห็นว่า Cistanche Deserticola มีฤทธิ์ทางเภสัชวิทยาหลายอย่าง เช่น ยาระบาย การป้องกันตับ การป้องกันโรคกระดูกพรุน สารต้านอนุมูลอิสระ การต่อต้านวัย และการป้องกันความเหนื่อยล้า สารสกัดน้ำ Cistanche Deserticola สามารถส่งเสริมการแสดงออกของยีน morphogenetic โปรตีน 2 ของกระดูกในเซลล์สร้างกระดูกของหนู, ฟอสฟาเตสกรดที่ทนต่อทาร์เตรต, ออสตีโอแคลซินในซีรัมของหนูที่ตัดรังไข่ออก และยีน Smad1, ยีน mad5, เปลี่ยนปัจจัยการเจริญเติบโต ฯลฯ ในไขกระดูก มีฤทธิ์ต้านโรคกระดูกพรุน [5-6]

เอ็กไคนาเซียสามารถส่งเสริมการแพร่กระจายของเซลล์สร้างกระดูกและส่งเสริมการสร้างความแตกต่างของเซลล์ต้นกำเนิดมีเซนไคม์จากไขกระดูกที่เพาะเลี้ยงในหลอดทดลองไปเป็นเซลล์สร้างกระดูก [7-9] ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา มีรายงานการวิจัยมากมายเกี่ยวกับการกำหนดปริมาณของเอไคนาโคไซด์และเวอร์บาสโคไซด์ในสารสกัดเอทานอลของ Cistanche Deserticola และการเตรียมสารประกอบ [10-12] แต่มีรายงานเพียงเล็กน้อยเกี่ยวกับการกำหนดเนื้อหาของส่วนประกอบดัชนีใน Cistanche Deserticola สารสกัดที่เป็นน้ำ ในการศึกษานี้ โครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง (HPLC) ถูกนำมาใช้เพื่อกำหนดปริมาณของเอ็กไคนาซีไซด์ในสารสกัดที่เป็นน้ำของ Cistanche Deserticola

1 วัสดุ

1.1 เครื่องมือ

LC-20AT โครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง, SPD-20เครื่องตรวจจับ, SIL-20เครื่องเก็บตัวอย่างอัตโนมัติ, CTO-10เตาอบคอลัมน์ ASvp, เวิร์กสเตชันโครมาโตกราฟีของเหลวโซลูชัน LC, Shimadzu Corporation of ญี่ปุ่น; เครื่องชั่งเชิงวิเคราะห์อิเล็กทรอนิกส์ MES125P-OCE-DU บริษัท Sartorius ประเทศเยอรมนี SHZ-D (Ⅲ) ปั๊มสุญญากาศอเนกประสงค์หมุนเวียนน้ำ, Henan Yuhua Instrument Co., Ltd.; RC2B SO25 ระบบหมุนเวียนความเย็นแบบระเหยแบบหมุน, RV 10 D S96 เครื่องระเหยแบบหมุน, บริษัท IKA, เยอรมนี; ดีเค-S26

อ่างน้ำอุณหภูมิคงที่แบบไฟฟ้า Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.; เครื่องทำน้ำบริสุทธิ์พิเศษซีรีส์ UPR, Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.

1.2 วัสดุยาและรีเอเจนต์

วัสดุยา Cistanche Deserticola ถูกซื้อจาก Guangzhou Lingnan Traditional Chinese Medicine Pieces Co., Ltd. หมายเลขชุด: 1801001, 1806001, 181001 Tu Xingming หัวหน้าเภสัชกรแผนจีนแผนโบราณของ Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine ระบุชื่อดังกล่าว เป็นลำต้นเนื้อแห้งและมีใบเป็นสะเก็ดของ Cistanche Deserticola YCMa ตัวอย่างจะถูกเก็บไว้ในห้องทดสอบยาของโรงพยาบาลในเครือแห่งที่สามของมหาวิทยาลัยการแพทย์แผนจีนกวางโจว สารอ้างอิงเอ็กไคนาเซียไกลโคไซด์ ปริมาณ 89.7% สถาบันควบคุมอาหารและยาแห่งประเทศจีน หมายเลขชุด: 111670-

201706; acetonitrile มีความบริสุทธิ์ทางโครมาโตกราฟี (เมอร์ค, เยอรมนี); เมทานอลและกรดฟอสฟอริกมีความบริสุทธิ์ในการวิเคราะห์ (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); น้ำเป็นน้ำบริสุทธิ์พิเศษ

2 วิธีการและผลลัพธ์

2.1 การเตรียมน้ำสกัดจาก Cistanche Deserticola

นำผงหยาบของวัสดุยา Cistanche Deserticola เติมน้ำกลั่น 10 เท่าของปริมาณน้ำกลั่น ความร้อน และกรดไหลย้อนเพื่อการสกัดสองครั้ง ครั้งละ 1 ชั่วโมง กรอง ผสมสารกรอง และทำให้ของเหลวที่กรองเข้มข้นด้วยเครื่องระเหยแบบหมุน จนถึงปริมาณยาดิบ 0.100 กรัม·มิลลิลิตร-1 และเก็บไว้ที่ 4 องศาเพื่อใช้ในภายหลัง

2.2 สภาวะทางโครมาโตกราฟีและความเหมาะสมของระบบ

คอลัมน์โครมาโตกราฟี: คอลัมน์ Inertsil ODS SP C18 (15 0 มม. × 4.6 มม., 5 μm); เฟสเคลื่อนที่: อะซีโตไนไตรล์ (A)-0.4% สารละลายกรดฟอสฟอริก (B), การชะแบบเกรเดียนต์: 0 ~ 5 นาที, 17%

ก; 5 ~ 25 นาที, 20% เอ; 25 ~ 30 นาที 17% ก; ความยาวคลื่นการตรวจจับ: 333 นาโนเมตร; อุณหภูมิคอลัมน์: 30 องศา; อัตราการไหล: 1.0 มล.·นาที-1;

ปริมาตรการฉีด: 10 ไมโครลิตร ภายใต้สภาวะโครมาโทกราฟีเหล่านี้ การแยกระหว่างพีคของเอไคนาโคไซด์และส่วนประกอบที่อยู่ติดกันจะมากกว่า 1.5 และจำนวนเพลททางทฤษฎีที่อิงจากพีคของเอ็กไคนาโคไซด์ไม่ควรน้อยกว่า 4,000 โครมาโตกราฟีแสดงในรูปที่ 1

2.3 การเตรียมสารละลาย

2.3.1 สารละลายสารอ้างอิง ชั่งน้ำหนักสารอ้างอิงเอไคนาโคไซด์ในปริมาณที่เหมาะสม ชั่งน้ำหนักอย่างแม่นยำ ใส่ลงในขวดวัดปริมาตรขนาด 10 มล. เติมเมทานอลเพื่อละลาย และเตรียมสารละลายสารอ้างอิงที่มีเอ็กไคนาโคไซด์ 898.794 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร 4 องศา บันทึกไว้เพื่อใช้ในภายหลัง

2.3.2 สารละลายทดสอบ

ตวงสารสกัดน้ำ Cistanche Deserticola 2.0 มิลลิลิตรอย่างแม่นยำ ระเหยจนแห้งในอ่างน้ำ เติมเมทานอลเพื่อละลาย เจือจางให้ได้ปริมาตรในขวดวัดปริมาตร 10 มิลลิลิตร เขย่าให้เข้ากัน และกรองด้วย เพื่อให้ได้เมมเบรนที่มีรูพรุนขนาด 0.22 ไมโครเมตร

2.4 การตรวจสอบความสัมพันธ์เชิงเส้น

วัดได้อย่างแม่นยำ {{0}}.25, 0.50, 1.00, 2.00, 2.50, 3.00 มิลลิลิตรของสารละลายอ้างอิงภายใต้รายการ 2.3.1 ใส่ลงในขวดวัดปริมาตรขนาด 5 มิลลิลิตร เติมเมทานอลเพื่อให้ได้ปริมาตร และเขย่าให้เข้ากันเพื่อให้ได้ความเข้มข้นของเกรเดียนต์ที่ 44{{17} }, 89.879 4 179.758 8, 359.517 6, 449.397 0, 539.276 4 ug·mL-1 สารละลายอ้างอิง กรองผ่านเมมเบรนที่มีรูพรุนขนาดเล็ก 0.22 μm วัดตามเงื่อนไขโครมาโตกราฟีตามข้อ 2.2 และบันทึกพื้นที่พีค ทำการถดถอยเชิงเส้นโดยใช้ความเข้มข้นของมวลของสารอ้างอิงเป็นแอบซิสซา (X, ug·mL-1) และพื้นที่พีคเป็นพิกัด (Y) และได้สมการการถดถอย: Y=13 185 .0X-32 273.0, r=0.999 8 ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าเอ็กไคนาเซียมีความสัมพันธ์เชิงเส้นที่ดีภายในช่วงความเข้มข้นที่ 44.939 7 ~ 539.276 4 ug·mL-1

2.5 การทดสอบความแม่นยำ

ใช้สารละลายอ้างอิง 539.276 4 ug ·mL- 1 ฉีดและวัดอย่างต่อเนื่อง 6 ครั้งตามเงื่อนไขโครมาโตกราฟีภายใต้ 2.2 และบันทึกพื้นที่พีค ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่า RSD ของพื้นที่พีคของเอคินาโคไซด์อยู่ที่ 1.81% ซึ่งบ่งชี้ถึงความแม่นยำของเครื่องมือที่ดี

2.6 การทดสอบความเสถียร

ตวงสารสกัดน้ำ Cistanche Deserticola อย่างแม่นยำ 2.0 มล. ระเหยจนแห้งในอ่างน้ำ เติมเมทานอลเพื่อละลาย เจือจางลงในขวดวัดปริมาตร 10 มล. เขย่าให้เข้ากัน กรองด้วย {{ 7}}.22 μm เมมเบรนพรุนขนาดเล็ก ปฏิบัติตามเงื่อนไขโครมาโตกราฟีภายใต้ข้อ 2.2 และวางไว้ที่ 0 และ 2 ตามลำดับ การวัดการฉีด , 4, 8, 12, 24 ชม. บันทึกบริเวณจุดสูงสุด ผลการทดลองพบว่า RSD ของพื้นที่พีคของเอคินาโคไซด์อยู่ที่ 1.16% ซึ่งบ่งชี้ว่าสารละลายทดสอบมีเสถียรภาพที่ดีภายใน 24 ชั่วโมง

2.7 การทดสอบความสามารถในการทำซ้ำ

วัดสารสกัดน้ำ Cistanche Deserticola ได้อย่างแม่นยำ 2.0 มล. และเตรียมสารละลายทดสอบ 6 รายการพร้อมกันตามวิธีการภายใต้ 2.3.2 ฉีดตัวอย่างเพื่อตรวจวัดตามเงื่อนไขโครมาโตกราฟีตามข้อ 2.2 และบันทึกพื้นที่พีค ผลการวิจัยพบว่า RSD ของเอชินาโคไซด์ความเข้มข้นของมวลอยู่ที่ 1.28% ซึ่งบ่งชี้ถึงความสามารถในการทำซ้ำที่ดีของวิธีการ

2.8 การทดสอบการกู้คืนตัวอย่าง

วัด 9 ส่วนของสารสกัดน้ำ Cistanche Deserticola 1.0 มล. ได้อย่างแม่นยำ เติม 0.8, 1.0 และสารละลายอ้างอิง 1.2 มล. (1.552 มก.·มล.{{11 }}) ตามลำดับ ระเหยจนแห้งในอ่างน้ำ เติมเมทานอลเพื่อละลาย และปรับเป็นขวดวัดปริมาตรขนาด 10 มิลลิลิตร เขย่าขวดให้เข้ากันแล้วกรองผ่านเมมเบรนที่มีรูพรุนขนาดเล็ก 0.22 μm เพื่อเตรียมสารละลายทดสอบที่มีความเข้มข้นสูง ปานกลาง และต่ำ เตรียมความเข้มข้นแต่ละอย่างพร้อมกัน 3 ชุด วัดตามเงื่อนไขโครมาโทกราฟีตามข้อ 2.2 บันทึกพื้นที่พีคและคำนวณการกู้คืนตัวอย่าง ประเมิน. ผลลัพธ์แสดงไว้ในตารางที่ 1

2.9 การกำหนดเนื้อหาตัวอย่าง

วัด 3 ส่วนของสารสกัดน้ำ Cistanche Deserticola อย่างแม่นยำ 2.0 มิลลิลิตร ระเหยจนแห้งในอ่างน้ำ เติมเมทานอลเพื่อละลาย เจือจางลงในขวดวัดปริมาตร 10 มิลลิลิตร เขย่าให้เข้ากัน กรองด้วย เมมเบรนพรุนขนาดเล็ก 0.22 ไมโครเมตร และวัดตามเงื่อนไขโครมาโทกราฟีภายใต้ข้อ 2.2 บันทึกพื้นที่พีคและคำนวณปริมาณเอ็กไคนาซีไซด์ ผลลัพธ์แสดงไว้ในตารางที่ 2

ตารางที่ 1 ผลการทดสอบการฟื้นตัวของเอชินาโคไซด์

ตารางที่ 2 ผลการตรวจวัดปริมาณเอไคนาโคไซด์ในสารสกัดน้ำของ Cistanche herba