การแยกสาร Diglycosides ที่ถูกแทนที่ด้วย Phenylpropanoid ใหม่จาก Cistanche Salsa และกิจกรรมการยับยั้งการไม่ผลิตใน Macrophage

โปรดติดต่อoscar.xiao@wecistanche.comสำหรับข้อมูลเพิ่มเติม

เชิงนามธรรม:

การจำลองแบบซ้ำช่วยให้สามารถระบุสารประกอบที่รู้จักและไม่รู้จักในสารสกัดจากพืชได้อย่างรวดเร็ว ในการศึกษานี้ เราได้ทำการลบการจำลองแบบที่ใช้โครมาโตกราฟี-มวลของเหลว (LC-MS) โดยใช้ข้อมูลจาก ESI บวก QTOF-MS สำหรับการวิเคราะห์ไกลโคไซด์แทนฟีนิลโพรพานอยด์ซึ่งเป็นองค์ประกอบสำคัญของ Cistanche salsa (CA Mey.) Beck การใช้ TOF-MS เพียงอย่างเดียว โครงสร้างย่อยของสารประกอบเหล่านี้สามารถยืนยันได้อย่างชัดเจนตามรูปแบบการกระจายตัวของลักษณะเฉพาะของการผลิตต่างๆ การทำโปรไฟล์โดยใช้ HPLC-MS ของ C. salsa ยังอนุญาตให้ตรวจหาสิ่งใหม่ฟีนิลโพรพานอยด์-ทดแทนไกลโคไซด์จากโรงงานแห่งนี้ ฟีนิลโพรพานอยด์ใหม่ห้าชนิดถูกแทนที่ไดไกลโคไซด์ที่ชื่อ cistansalsides A–E (5, 6, 12, 17 และ 18) ถูกแยกออก โครงสร้างของพวกเขาได้รับการอธิบายอย่างละเอียดด้วยวิธีการทางสเปกโตรสโกปีรวมถึงการวิเคราะห์ NMR และ MS ไอโซเลตทั้งหมดได้รับการทดสอบสำหรับการออกฤทธิ์ในการยับยั้งของพวกมันที่ต่อต้านการผลิต NO ในเซลล์ RAW 264.7 ที่ถูกกระตุ้นโดย LPS ของสารประกอบที่ทดสอบ สารประกอบ 5, 11, 13 และ 18 แสดงฤทธิ์ยับยั้งในระดับปานกลางต่อ NO synthase ที่เหนี่ยวนำได้ สารประกอบ 11, 13 และ 18 ยังยับยั้งฟอสโฟรีเลชั่นของ NF-κBในมาโครฟาจ ไม่มีสารประกอบใดที่แสดงนัยสำคัญความเป็นพิษต่อเซลล์. 

คำสำคัญ:การจำลองแบบ; phenylpropanoid แทน diglycosides; ซัลซ่า Cistanche; ต้านการอักเสบ

กรุณาคลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

บทนำ

Cistanche salsa (CA Mey.) Beck ซึ่งอยู่ในวงศ์ Orobanchaceae เป็นพืชกาฝากที่ได้รับสารอาหารจากรากของ Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae) และพืชทะเลทรายอื่นๆ [1] พืชชนิดนี้ถูกนำมาใช้ในการแพทย์แผนโบราณในการรักษาโรคประสาทอ่อน ความผิดปกติทางเพศ และภาวะไตบกพร่อง [2,3] ในการศึกษาพฤกษเคมีครั้งก่อน มีรายงานว่าพืชทั้งต้นของ C. salsa มีสารประกอบประเภทต่างๆ รวมทั้ง phenylethanoid glycosides และ iridoid glycosides [4–7] Phenylethanoid glycosides เช่น acteoside และ echinacoside เป็นส่วนประกอบสำคัญของพืช [8] สารสกัดจาก C. salsa แสดงคุณสมบัติที่เป็นประโยชน์ รวมทั้งฤทธิ์กระตุ้นภูมิคุ้มกัน ต้านมะเร็ง และต้านการอักเสบ [9,10] การจำลองแบบเป็นกระบวนการโดยการทดสอบสารผสมของตัวอย่างเพื่อแยกความแตกต่างขององค์ประกอบที่ไม่รู้จักจากสารประกอบที่รู้จัก กลยุทธ์การจำลองแบบใช้เทคนิคการวิเคราะห์และการค้นหาฐานข้อมูลเพื่อระบุเมตาโบไลต์ทุติยภูมิในช่วงต้นของกระบวนการวิจัยพฤกษเคมี [11] จากเทคนิคการวิเคราะห์ ESI-QTOF-MS (อิเล็กโทรสเปรย์ไอออไนซ์-ควอดรูโพลไทม์ของสเปกโทรสโกปีมวลการบิน) สามารถให้ข้อมูลที่มีค่าเกี่ยวกับโครงสร้างทางเคมีของสารทุติยภูมิ การแยกส่วนที่นำการจำลองแบบตาม LC-MS ได้รับการสาธิตเพื่อให้สามารถสกัดและทำให้บริสุทธิ์ของเมตาโบไลต์เป้าหมายจากสารสกัดหยาบของพืชที่มีประสิทธิภาพสูง [12–15] การศึกษานี้ดำเนินการจำลองแบบตาม LC-MS โดยใช้ข้อมูลจาก ESI บวก TOF-MS สำหรับการวิเคราะห์ของไดไกลโคไซด์ที่ถูกแทนที่ด้วยฟีนิลโพรพานอยด์ ซึ่งเป็นองค์ประกอบสำคัญของ C. salsa ข้อมูล TOF-MS สามารถแนะนำโครงสร้างพื้นฐานของสารประกอบเหล่านี้ตามรูปแบบการกระจายตัวของไอออนผลิตภัณฑ์ต่างๆ บนพื้นฐานของการจำลองแบบนี้ โพรไฟล์ LC-MS ของเศษส่วนเอทิล อะซีเตต (EtOAc) และส่วนที่ละลายน้ำได้ถูกวิเคราะห์ เศษส่วนของ EtOAc อยู่ภายใต้กลยุทธ์การจำลองแบบสำหรับการแยกเพิ่มเติม ส่งผลให้เกิดการแยกไดไกลโคไซด์ที่ถูกแทนที่ด้วยฟีนิลโพรพานอยด์ใหม่ห้าห้าและสารประกอบที่รู้จัก 13 ชนิด (รูปที่ 1) ได้รับการยืนยันแล้วว่าโครงสร้างที่คาดการณ์ไว้เบื้องต้นของไดไกลโคไซด์ที่ถูกแทนที่ด้วยฟีนิลโพรพานอยด์นั้นถูกจับคู่อย่างถูกต้องกับโครงสร้างจริงของพวกมัน นอกจากนี้ ยังได้สำรวจฤทธิ์ต้านการอักเสบของไอโซเลต

ผลลัพธ์และการอภิปราย

ไดไกลโคไซด์ที่ถูกแทนที่ด้วยฟีนิลโพรพานอยด์ที่แยกได้จาก C. salsa มักจะมีโครงสร้างที่ยึดตามไดแซ็กคาไรด์ไกลโคไซด์ ซึ่งประกอบด้วยกลูโคสและ rhamnose ที่มีการเชื่อมโยง Rha (1 → 3) Glc และสารทดแทนซินนาโมอิลหนึ่งตัว เช่น กรดคูมาริก (Cou), คาเฟอีน กรด (Caf) และกรดเฟรูโลอิล (Fer) ที่ตำแหน่ง C-4 หรือ C-6 ของกลูโคส โดยทั่วไปแล้ว aglycone จะติดอยู่ที่ตำแหน่ง C-1 ของกลูโคส โครงสร้างของไดไกลโคไซด์ที่ถูกแทนที่ด้วยฟีนิลโพรพานอยด์กับกลุ่มอะเซทิลที่ระดับ C-2 ของกลูโคสได้รับการรายงานบ่อยครั้ง [6,12,16] เพื่อทำการจำลองแบบ รูปแบบการกระจายตัวของ MS ของสารประกอบเหล่านี้ถูกวิเคราะห์โดยโหมดบวก ESI-QTOF-MS ใน MS spectra ไดไกลโคไซด์ที่ถูกแทนที่ด้วยฟีนิลโพรพานอยด์ทั้งหมดสร้างพีคอิออนแอดดักต์ที่ [M บวก NH4] บวก , [M บวก K] บวก และ [M บวก Na] บวก ซึ่งให้น้ำหนักโมเลกุลและสูตร รูปแบบของแฟรกเมนต์ไอออนสามารถพบได้โดยการสูญเสียต่อเนื่องของ aglycone และไกลโคไซด์ตกค้าง ([M บวก H − Aglycone] บวก , [M บวก H − Aglycone − Rha] บวก และ [M บวก H − Aglycone - รูปที่ 1 โครงสร้างของสารประกอบ 1–18. 2. ผลลัพธ์และการอภิปราย diglycosides ที่ถูกแทนที่ด้วยฟีนิลโพรพานอยด์ที่แยกได้จาก C. salsa มักจะมีโครงสร้างที่ยึดตามไดแซ็กคาไรด์ไกลโคไซด์ซึ่งประกอบด้วยกลูโคสและ rhamnose ที่มีการเชื่อมโยง Rha (1→3) Glc และสารทดแทนซินนาโมอิลหนึ่งตัว เช่น กรดคูมาริก (Cou) กรดคาเฟอีน (Caf) และกรดเฟรูโลอิล (Fer) ที่ตำแหน่ง C-4 หรือ C-6 ของกลูโคส มักติด aglycone ที่ C{{24 }} ตำแหน่งของกลูโคส โครงสร้างของ diglycosides ที่ถูกแทนที่ด้วยฟีนิลโพรพานอยด์กับกลุ่มอะเซทิลที่ระดับ C-2 ของกลูโคสได้รับการรายงานบ่อยครั้ง [6,12,16] เพื่อทำการจำลองแบบซ้ำ รูปแบบการกระจายตัวของ MS ของสารเหล่านี้ วิเคราะห์โดยโหมดบวก ESI-QTOF-MS ใน MS spectra ไดไกลโคที่ถูกแทนที่ด้วยฟีนิลโพรพานอยด์ทั้งหมด ด้านสร้างยอดไอออนบวกที่ [M บวก NH4] บวก , [M บวก K] บวก และ [M บวก Na] บวก ซึ่งให้น้ำหนักโมเลกุลและสูตร รูปแบบของแฟรกเมนต์ไอออนสามารถพบได้โดยการสูญเสียต่อเนื่องของ aglycone และไกลโคไซด์ตกค้าง ([M บวก H − Aglycone] บวก , [M บวก H − Aglycone − Rha] บวก และ [M บวก H − Aglycone - Rha − Glc (หรือ Acetyl -Glc)] plus ) ซึ่งมีประโยชน์สำหรับการทำนายชนิดของสารแทนที่ซินนาโมอิลและน้ำตาล แฟรกเมนต์ไอออนที่ m/z 163 ของกลุ่ม caffeoyl, m/z 147 ของกลุ่ม coumaroyl หรือ m/z 177 ของกลุ่ม feruloyl ให้สัญญาณคุณลักษณะของหมู่แทนที่ cinnamoyl ใน diglycosides ที่ถูกแทนที่ด้วยฟีนิลโพรพานอยด์ [4,15] ( รูปที่ 2). การวิเคราะห์ชิ้นส่วนไอออนจะให้ข้อมูลที่เป็นประโยชน์สำหรับการระบุโครงสร้างของไดไกลโคไซด์ที่ถูกแทนที่ด้วยฟีนิลโพรพานอยด์ อย่างไรก็ตาม ไอโซเมอร์ของพวกมันไม่สามารถแยกความแตกต่างได้ด้วย MS spectrometry เพียงอย่างเดียว เพื่อระบุโครงสร้างที่สมบูรณ์ได้อย่างแม่นยำ ต้องใช้สเปกตรัม NMR

ไอโซเลตทั้งหมดได้รับการทดสอบสำหรับผลการยับยั้งของพวกมันต่อการผลิต NO ที่เหนี่ยวนำโดย LPS ในเซลล์ RAW 264.7 เด็กซาเมทาโซนถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก และ IC50 ของมันคือ 7.0 ไมโครโมลาร์ ของสารประกอบที่ทดสอบ สารประกอบ 5 (IC50 42.7 ± 6.6 µM), 11 (IC50 37.3 ± 2.2 µM), 13 (IC50 40.{{2{{ 24}}}} ± 40 µM) และ 18 (IC50 27.9 ± 0.8 µM) แสดงฤทธิ์การยับยั้งปานกลางต่อการสังเคราะห์ NO ที่เหนี่ยวนำได้ ในขณะที่สารประกอบอื่นๆ ไม่ออกฤทธิ์ในการสอบวิเคราะห์นี้ (IC50 ค่า > 100 ไมโครโมลาร์) เพื่อตรวจสอบว่าสารประกอบเหล่านี้มีความเป็นพิษต่อเซลล์หรือไม่ วัดความมีชีวิตของเซลล์โดยใช้การสอบวิเคราะห์ MTT ด้วยเหตุนี้ จึงไม่มีสิ่งใดแสดงความเป็นพิษต่อเซลล์ที่มีนัยสำคัญ (รูปที่เสริม S6-1) สารประกอบทั้งสี่นี้ได้รับการคัดเลือกเพื่อประเมินการมีฤทธิ์ในการยับยั้งของพวกมันกับวิถี NF-κB ในเซลล์ RAW 264.7 ที่กระตุ้นด้วย LPS การกระตุ้นเซลล์ RAW 264.7 ด้วย LPS ทำให้เกิดฟอสโฟรีเลชั่นของ IκB และ NF-κB (p65) หลังจากการฟักตัว 0.5 ชั่วโมง ฟอสโฟรีเลชั่นของ NF-κB (p65) ลดลงอย่างมีนัยสำคัญโดยการปรับสภาพด้วยสารประกอบ 11, 13 และ 18 ดังที่แสดงโดยการวิเคราะห์แบบตะวันตก (รูปที่ 5) ดังนั้นสารประกอบ 11, 13 และ 18 อาจมีฤทธิ์ต้านการอักเสบผ่านการยับยั้ง NF-κBในแมคโครฟาจ

วัสดุและวิธีการ

การหมุนด้วยแสงถูกวัดด้วยโพลาริมิเตอร์ดิจิตอล Jasco P-2000 (แจสโก โตเกียว ญี่ปุ่น) สเปกตรัมยูวีถูกบันทึกบนสเปกโตรมิเตอร์ Chirascan บวกเซอร์คูลาร์ไดโครอิม (Chirascan, APL, UK) สเปกตรัมอินฟราเรดบันทึกโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ Jasco FT/IR-4200 สเปรย์มวลสารอิออไนเซชันแบบควอดรูโพลความละเอียดสูง (HR-ESI-qTOF-MS) ที่มีความละเอียดสูง ดำเนินการบน Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS ที่ติดตั้ง Agilent 1260 Infinity series (Agilent Technologies, Inc. , Palo Alto, CA, USA) และคอลัมน์ที่ใช้คือคอลัมน์ Jasco SFCpak Crest C18T-5 (id150 ×4.6 mm,5 um) MassHunter Workstation Software ใช้สำหรับเก็บข้อมูล

1D (H และ 13C) และ 2D('H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) NMR สเปกตรัมได้รับด้วย Jeol LA 300 (Jeol, Tokyo, Japan), Bruker AVANCE-400, Bruker AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 และ Bruker AVANCE 800 HDspectrometers ร่วมกับ cryoprobe (Bruker, Ettlingen, Germany) DMSO-d6 (Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Andover, MA, USA) ถูกใช้เป็นตัวทำละลาย NMR และพีคอ้างอิง (6H 2.50 และ δc 39.5) โครมาโตกราฟีแบบคอลัมน์ (CC) ดำเนินการโดยใช้ Sephadex LH-20(25-100 um; Pharmacia, Uppsala, Sweden) หรือ Kieselgel 60 silica gel(40-63 um,230-400 mesh, Art . 9385; เมอร์ค, ดาร์มสตัดท์, เยอรมนี). โครมาโตกราฟีแบบชั้นบาง (TLC) ถูกดำเนินการบนเพลท Kieselgel 60 ซิลิกาเจล F254 ที่เคลือบไว้ล่วงหน้า (Art.5715;เมอร์ค) ตรวจพบจุดบน TLC โดยใช้หลอด UV ที่ 254 นาโนเมตร และ 365 นาโนเมตร (VL-4.LC, 365 /254;วิลเบอร์ ลูร์มัต, ทอร์ซี, ฝรั่งเศส). โครมาโตกราฟีของเหลวแรงดันปานกลาง (MPLC) ดำเนินการบนคอลัมน์ซิลิกาแฟลช RediSep 120g (lsco, Lincoln, NE, USA) และ Kiesegel 60 ซิลิกาเจล (40-63 um,230-400 mesh, Art.9385; Merck )โดยใช้ตัวช่วย Combiflash (Isco) ระบบโครมาโตกราฟีของเหลวแรงดันสูง (HPLC) คือ Gilson HPLC ที่ติดตั้งปั๊ม Gilson 321 และเครื่องตรวจจับ UV.VIS 151 (Gilson, Middleton, WI, USA) โดยใช้คอลัมน์ ODS กึ่งเตรียมการ (Luna 5 um C18 (2) 100 Å, id 250×10 mm, 5 µm, Phenomenex Inc, Torrance, CA, USA; Hypersil GOLDrM aQ 175A,id250×10mm,5 um, Thermo ScientificTM, Hennigsdorf,Germany;Inno C18column 120 A,id250× 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Korea) การวิเคราะห์ RP- ระบบ HPLC เป็นระบบพันธมิตร Waters 2695 พร้อมเครื่องตรวจจับ 996 Photodiode Array (PDA) (Waters Corp, Milford, MA, USA) และคอลัมน์ที่ใช้คือคอลัมน์ HypersilTM BDS C18 (130 A,id150×4.6 mm, 5 μm, Thermo วิทยาศาสตร์TM）. ซื้อกรดฟอร์มิกจาก Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (โซล ประเทศเกาหลี) ซื้อตัวทำละลายเกรด HPLC จาก Fisher Scientific Korea Ltd. (โซล ประเทศเกาหลี) ซื้อ HSOA, Na,CO และตัวทำละลายระดับแรกสำหรับการสกัด การแยกส่วน และการแยกจาก Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (โซล ประเทศเกาหลี) ซื้อ L- และ D-cysteine ​​methyl ester hydrochloride และ o-tolylisothiocvanate จาก Tokyo Chemical Industry (โตเกียว ประเทศญี่ปุ่น)

บทสรุป

ในการศึกษานี้ เราแยกและอธิบายโครงสร้างของไดไกลโคไซด์ที่ถูกแทนที่ด้วยฟีนิลโพรพานอยด์ใหม่ห้าชนิด ซึ่งมีชื่อว่าซิสแทนซัลไซด์ AE (5,6, 12, 17 และ 18) นอกเหนือจากการแยกและการระบุสารประกอบที่รู้จัก 13 ชนิด โดยใช้กลยุทธ์การจำลองแบบ สารประกอบที่รู้จักถูกกำหนดให้เป็น lipedoside AI(1)[21], 2'-acetylacteoside (2)[22], isocistanoside C(3)[15], osmanthuside B (4)[21], epimeridinoside A(7) [15], ซิสตาโนไซด์ D(8)[23], ซัลซาไซด์ B(9) [6l, ทูบูโลไซด์ E (10) [16]ซิสตาโนไซด์ M(11)[15],ไอโซมาร์ไทโนไซด์(13) [24], ซัลซาไซด์ C(14 )[6], จิโอโนไซด์ C(15)[25] และซัลซาไซด์ F (16)[6] โครงสร้างของพวกเขาถูกกำหนดขึ้นโดยการวิเคราะห์ข้อมูลทางสเปกโตรสโกปีที่ครอบคลุมและโดยการเปรียบเทียบกับข้อมูลที่รายงานในวรรณคดี ได้รับการยืนยันแล้วว่าโครงสร้างที่คาดการณ์ไว้เบื้องต้นของไดไกลโคไซด์ที่ถูกแทนที่ด้วยฟีนิลโพรพานอยด์นั้นถูกจับคู่อย่างถูกต้องกับโครงสร้างจริงของพวกมัน

ในการสอบวิเคราะห์การยับยั้ง NO สารประกอบ 5 （IC50 42.7±6.6 μM）, 11（IC50 37.3±2.2 μM）,13 （IC50 40.0 ±4.0 ไมโครโมลาร์) และ 18（ไอซี0 27.9±0.8uM แสดงฤทธิ์การยับยั้งปานกลาง จากสารประกอบเหล่านี้ พบว่าสารประกอบ 11,13 และ 18 ยับยั้งฟอสโฟรีเลชั่นของ NF-kB ในมาโครฟาจ และอาจมีฤทธิ์ต้านการอักเสบซึ่งจะต้องได้รับการพิสูจน์ในการทดลองต่อไป

ดึงข้อมูลจาก: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ("ใบอนุญาต") โดยไม่คำนึงถึงข้อกำหนดและเงื่อนไขของ ProQuest คุณสามารถใช้เนื้อหานี้ตามข้อกำหนดของใบอนุญาต