Dendrimer–tesaglitazar Conjugate ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงฟีโนไทป์ของ Microglia และช่วยเพิ่ม -amyloid Phagocytosis† ตอนที่ 2

การตรวจทางชีววิทยาภายนอกร่างกาย

การเพาะเลี้ยงเซลล์ ได้รับสายพันธุ์เซลล์ microglial ของหนู BV2 จากโรงพยาบาลเด็กของศูนย์เพาะเลี้ยงเซลล์มิชิแกน

ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา นักวิทยาศาสตร์พบว่าการเพาะเลี้ยงเซลล์มีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับความทรงจำของมนุษย์ การศึกษาพบว่าจากการศึกษาการเพาะเลี้ยงเซลล์ กลไกระดับโมเลกุลในหน่วยความจำและกระบวนการเรียนรู้สามารถถูกค้นพบได้ ซึ่งจะช่วยปรับปรุงความสามารถทางปัญญาและความจำของมนุษย์

การเพาะเลี้ยงเซลล์หมายถึงกระบวนการวางเซลล์ชีวภาพในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีสารอาหารที่จำเป็นเพื่อการเจริญเติบโตและสืบพันธุ์ภายใต้สภาวะในหลอดทดลอง เซลล์เป็นหน่วยพื้นฐานของชีวิต และการเพาะเลี้ยงเซลล์เป็นเวทีให้นักวิทยาศาสตร์ศึกษาพฤติกรรมของเซลล์และกิจกรรมในชีวิต จากการศึกษาเซลล์ นักวิทยาศาสตร์ได้ค้นพบข้อมูลมากมายเกี่ยวกับการเติบโตของเซลล์ประสาทและการเชื่อมต่อซินแนปติก การค้นพบนี้ไม่เพียงแต่ช่วยให้มนุษย์เข้าใจวิธีการทำงานของสมองได้ดีขึ้น แต่ยังช่วยพัฒนาวิธีการรักษาและยาใหม่ๆ อีกด้วย

การวิจัยในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมาแสดงให้เห็นว่าการเพาะเลี้ยงเซลล์มีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับความทรงจำของมนุษย์เช่นกัน นักวิทยาศาสตร์พบว่าการก่อตัวและการบำรุงรักษาความทรงจำของมนุษย์จำเป็นต้องมีการควบคุมระดับโมเลกุลและการส่งสัญญาณอย่างมาก กลไกการส่งสัญญาณและการควบคุมเหล่านี้มีความคล้ายคลึงกันหลายประการกับกลไกในการเพาะเลี้ยงเซลล์ ด้วยการศึกษากลไกการส่งสัญญาณและการควบคุมในการเพาะเลี้ยงเซลล์ นักวิทยาศาสตร์สามารถเข้าใจความทรงจำของมนุษย์และกลไกการเรียนรู้ได้ดีขึ้น

นอกจากนี้ การศึกษาบางชิ้นยังแสดงให้เห็นว่าการเพาะเลี้ยงเซลล์สามารถเพิ่มความจำของมนุษย์และความสามารถในการเรียนรู้ได้ในบางด้าน ตัวอย่างเช่น การใช้วิธีที่เรียกว่า "การกระตุ้นด้วยไฟฟ้า" สามารถกระตุ้นกิจกรรมของเซลล์และการเชื่อมต่อระหว่างเซลล์ประสาทได้ ซึ่งจะช่วยปรับปรุงความสามารถทางปัญญาของมนุษย์และผลการเรียนรู้ แม้ว่าวิธีนี้ยังอยู่ในขั้นตอนการวิจัยในห้องปฏิบัติการ แต่คาดว่าจะกลายเป็นวิธีฝึกความรู้ความเข้าใจแบบใหม่ในอนาคต

โดยสรุป มีความเชื่อมโยงอย่างใกล้ชิดระหว่างการเพาะเลี้ยงเซลล์และความทรงจำของมนุษย์ จากการศึกษาเซลล์ เราจะสามารถเข้าใจกลไกการรับรู้ของมนุษย์และกลไกความจำได้ดีขึ้น และยังช่วยพัฒนาวิธีการรักษาและวิธีการฝึกการรับรู้แบบใหม่อีกด้วย ขอให้เรารอคอยการมีส่วนร่วมของเทคโนโลยีการเพาะเลี้ยงเซลล์ต่อมนุษยชาติในอนาคต! จะเห็นได้ว่าเราต้องปรับปรุงความจำ และ Cistanche สามารถปรับปรุงความจำได้อย่างมีนัยสำคัญ เนื่องจาก Cistanche มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ และต่อต้านวัย ซึ่งสามารถช่วยลดปฏิกิริยาออกซิเดชันและการอักเสบในสมอง จึงช่วยปกป้องสุขภาพของ ระบบประสาท นอกจากนี้ Cistanche ยังสามารถส่งเสริมการเจริญเติบโตและการซ่อมแซมเซลล์ประสาท ซึ่งจะช่วยปรับปรุงการเชื่อมต่อและการทำงานของโครงข่ายประสาทเทียม ผลกระทบเหล่านี้สามารถช่วยปรับปรุงความจำ ความสามารถในการเรียนรู้ และความเร็วในการคิด และยังสามารถป้องกันการเกิดความผิดปกติทางสติปัญญาและโรคทางระบบประสาทได้อีกด้วย

คลิกรู้อาหารเสริมเพื่อเพิ่มความจำ

เพาะเลี้ยงเซลล์ BV2 ในอาหารเลี้ยงเชื้อ Modified EaglesMedium (DMEM) ของ Dulbecco พร้อมด้วยซีรั่มของทารกในครรภ์ที่ยับยั้งความร้อน 10% (HI FBS) และ 1% เพนิซิลลิน/สเตรปโตมัยซิน (P/S) ที่ 37 องศาและ 5% CO2

เมื่อเซลล์มาถึงจุดบรรจบกันในขวดเพาะเลี้ยง เซลล์จะถูกส่งผ่านไปยังขวดใหม่โดยใช้กรดทริปซิน–เอทิลีนไดเอมีน เตตระ-อะซิติก (EDTA) 0.05% สำหรับการทดลอง เซลล์ BV2 ถูกเพาะใน DMEM ด้วย 5% HIFBS และ 1% P/S 24–48 ชั่วโมงต่อมา เซลล์ถูกกระตุ้นด้วย LPS 100 ng ml − 1 (300 EU ml − 1) เป็นเวลา 3 ชั่วโมงเพื่อให้เซลล์เข้าสู่ฟีโนไทป์โปรอักเสบ (M1) เพื่อจำลองสภาพแวดล้อมทางระบบประสาทอักเสบที่มีอยู่ในโรคทางระบบประสาทหลายชนิด

จากนั้น เซลล์ได้รับการบำบัดร่วมกับ LPS และ Tesa หรือ D-Tesa อิสระที่ความเข้มข้นที่แตกต่างกันเป็นเวลา 48 มือ จากนั้นส่วนลอยเหนือตะกอนและเซลล์ถูกรวบรวมเพื่อการประมวลผล เซลล์ไม่เคยบำบัดด้วย LPS (ไม่มี LPS) และเซลล์ที่บำบัดด้วย LPS เท่านั้นตลอดเวลา (LPS เท่านั้น) ทำหน้าที่เป็นกลุ่มควบคุม สารละลายสต็อก Tesa และ D-Tesa อิสระได้รับการฆ่าเชื้อโดยใช้ตัวกรองโพลี (อีเทอร์ ซัลโฟน) 0.2 µm

D-Tesa สามารถละลายได้ในตัวกลางของเซลล์ Tesa ถูกละลายได้โดยใช้ไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO) ที่ความเข้มข้นสุดท้ายน้อยกว่า 0.1% (v/v) ความเป็นพิษต่อเซลล์ การทดสอบไนตริกออกไซด์ และ TNF- ELISA สำหรับการทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ เซลล์ได้รับการบำบัดตามที่อธิบายไว้ข้างต้นในจานหลุม96- จากนั้นจึงประเมินความเป็นพิษต่อเซลล์ของ Tesa และ D-Tesa อิสระโดยการทดสอบ MTT ตามคำแนะนำของผู้ผลิต

สำหรับการทดสอบไนตริกออกไซด์ เซลล์ได้รับการบำบัดตามที่อธิบายไว้ข้างต้นในเพลตของหลุม 12- จากนั้นส่วนลอยเหนือตะกอนจากเซลล์ที่ได้รับการบำบัดจะถูกรวบรวมและหาปริมาณระดับไนตริกออกไซด์ทันทีโดยปฏิบัติตามเกณฑ์วิธีของผู้ผลิตสำหรับรีเอเจนต์ Griess

สำหรับ TNF- ELISA เซลล์ได้รับการปฏิบัติตามที่อธิบายไว้ข้างต้นในเพลตหลุม 12- จากนั้นส่วนลอยเหนือตะกอนจากเซลล์ที่ได้รับการบำบัดจะถูกรวบรวมและเก็บไว้ที่ −80 องศา จนกระทั่งพร้อมสำหรับการประมวลผลต่อไป

จากนั้นตัวอย่างก็ถูกละลายบนน้ำแข็งและดำเนินการ TNF-ELISA โดยปฏิบัติตามระเบียบการของผู้ผลิต สำหรับการศึกษาเหล่านี้ ทั้ง D-Tesa และ Tesa อิสระถูกโซนิคและหมุนวนจนกว่าทั้งสองจะละลายได้อย่างสมบูรณ์ ในการละลาย Tesa ที่เป็นอิสระนั้น จะต้องละลายใน DMSO ก่อนจึงจะเจือจาง โดยที่ความเข้มข้นสุดท้ายของ DMSO ต่ำกว่า 0.1%(v/v) สำหรับตัวอย่าง Tesa ที่อิสระทั้งหมด

เนื่องจาก D-Tesa สามารถละลายได้ในตัวกลางการเพาะเลี้ยงเซลล์ จึงไม่เติม DMSO ลงในตัวอย่างเหล่านั้น สำหรับการศึกษาแบบอัลลิน ในหลอดทดลอง ปริมาณที่เท่ากันของยาอิสระหรือยาคอนจูเกตถูกนำไปใช้กับเซลล์ทั้งในกลุ่ม Tesa อิสระและ D-Tesa

PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ (qRT-PCR) เซลล์ได้รับการปฏิบัติตามที่อธิบายไว้ข้างต้นในเพลตหลุม 12- และหลังจากการรวบรวมส่วนลอยเหนือตะกอน เซลล์จะถูกรวบรวมในรีเอเจนต์ Invitrogen™ TRIzol™ (จาก Fisher Scientific) และ RNA ถูกสกัดโดยการปฏิบัติตามระเบียบการของผู้ผลิต วิเคราะห์ความเข้มข้นและความบริสุทธิ์ของ RNA ที่ได้โดยใช้นาโนดรอป

จำนวน RNA ที่เท่ากันจากแต่ละตัวอย่างถูกแปลงเป็น cDNA โดยปฏิบัติตามโปรโตคอลของผู้ผลิตสำหรับชุดการถอดรหัสแบบย้อนกลับ cDNA ที่มีความจุสูง (จาก Applied Biosystems โดย Thermo Fisher Scientific)

cDNA ที่เป็นผลลัพธ์ถูกนำมาใช้สำหรับการวิเคราะห์ qRT-PCR โดยใช้รีเอเจนต์สีเขียว FAST-SYBR และโดยปฏิบัติตามเกณฑ์วิธีของผู้ผลิต เครื่องจักรคำนวณค่า Ct และข้อมูลถูกวิเคราะห์โดยใช้วิธี 2−ΔΔCt

สำหรับเครื่องหมายแต่ละอันที่แตกต่างกัน ค่า ΔΔCt ถูกคำนวณโดยการลบ ΔCt สำหรับกลุ่ม No LPS จาก ΔCt สำหรับแต่ละตัวอย่าง ค่า ΔCt คือค่า Ct สำหรับยีนที่น่าสนใจ ลบด้วย Ct สำหรับ GAPDH สำหรับแต่ละตัวอย่างที่กำหนด

เมื่อคำนวณ 2−ΔΔCt สำหรับทุกกลุ่มแล้ว พวกเขาทั้งหมดจะถูกทำให้เป็นมาตรฐานเป็นกลุ่ม No LPS ดังนั้นจึงให้ระดับการแสดงออกสัมพันธ์ของกลุ่ม No LPS เป็น 1.0 สำหรับเครื่องหมายทั้งหมด ลำดับไพรเมอร์ไปข้างหน้าและข้างหลังที่ใช้ forqRT -PCR แสดงอยู่ในตารางด้านล่าง ลำดับทั้งหมดเขียนจาก 5′→3′

นอกจากนี้ ไพรเมอร์ที่มีวางจำหน่ายทั่วไปยังถูกซื้อจาก BIORAD สำหรับ iNOS/Nos2 (qmmuCID0023087), TLR4 (qmmuCID0023548), CD206/Mrc1 (qmmuCID0012670),TGF- 1 (qmmuCID0017320), IL-10 (qmmuCID0015452),SOCS1 (qmmuced0024846), CD36 (qmmuced0014852), Ide(qmmuced0049796), MMP9 (qmmucid0021296), CCL1(qmmuced0038249), TLR8 (qmmuced0039837), CD86(qmmucid0006086), STAT6 (qmmucid000 6404) และ PPAR (qmmucid0018821) การทดสอบฟาโกไซโตซิส

ผลกระทบของ Tesa และ D-Tesa อิสระในการทำลายเซลล์ของ -amyloid ถูกกำหนดโดยใช้วิธีการที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้47 โดยสรุป แป้ง HiLyte™ 488-ที่มีป้ายกำกับ -amyloid1–42 (จาก Anaspec Inc.) ถูกละลายใน DMSO (ความเข้มข้น DMSO สุดท้าย ต่ำกว่า 0.5% (v/v)) และเจือจางเป็น 5 µg ml−1 ใน PBS

หลังจากบำบัดเซลล์ด้วย Tesa และ D-Tesaตามแผนการรักษาที่สรุปไว้ข้างต้นแล้ว สารละลาย -อะไมลอยด์จะถูกนำไปใช้กับเซลล์เป็นเวลา 2 ชั่วโมง จากนั้น เซลล์ถูกล้างสามครั้งด้วยสารละลายเกลือสมดุลของแฮงค์ที่มีแคตไอออนไดเวเลนต์ (แคลเซียมและแมกนีเซียม) ถูกนำออกจากบ่อโดยใช้ทริปซิน และแขวนตะกอนอีกครั้งในบัฟเฟอร์ FACS (จากอินไวโตรเจน)

ตัวอย่างถูกเก็บไว้บนน้ำแข็ง และถูกเรียกใช้บนเครื่อง Sony Cell Sorter SH800 flow cytometrymachine ทันที และวิเคราะห์ข้อมูลด้วยซอฟต์แวร์ที่เกี่ยวข้อง

ประตูถูกตั้งค่าโดยใช้เซลล์ที่ไม่ได้รับการบำบัดด้วยฟลูออเรสเซนต์ - อะไมลอยด์ และผลลัพธ์ที่แสดงคือเปอร์เซ็นต์ของเซลล์จากแต่ละกลุ่มที่มีการเรืองแสงเหนือพื้นหลังเรืองแสง

ความเข้มเฉลี่ยของฟลูออเรสเซนต์ (MFA) ของ HiLyte™ 488-ที่มีป้ายกำกับ -อะไมลอยด์ ก็ถูกรายงานสำหรับแต่ละกลุ่มด้วย การทดสอบนี้ดำเนินการซ้ำกันทางสถิติ ข้อมูลทั้งหมดที่แสดงเป็นผลจากการทดลองสามรายการที่แยกจากกัน โดยแต่ละรายการดำเนินการเป็นสามเท่า เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น GraphPad Prism 5 และ Microsoft Excel ถูกนำมาใช้ในการดำเนินการทางสถิติ

ทำการทดสอบทีแบบจับคู่แบบสองด้านพร้อมการแก้ไข Bonferroni การทดสอบของกรับส์ใช้เพื่อระบุค่าผิดปกติ GraphPad Prism 5 สำหรับ Windows ใช้ในการลงจุดข้อมูล (ซานดิเอโก, แคลิฟอร์เนีย) ข้อมูลที่แสดงเป็นค่าเฉลี่ย + SEM

ผลลัพธ์และการอภิปราย

การสังเคราะห์และการศึกษาคุณลักษณะของ D-Tesa

เพื่อให้มีการนำส่งภายในเซลล์แบบกำหนดเป้าหมายไปยังเซลล์ไมโครเกลียที่กระตุ้นในสมอง Tesa จึงถูกควบคู่ด้วยโควาเลนต์บนพื้นผิวของ G4-PAMAM-OH ด้วยพันธะเอสเทอร์ที่แยกออกได้ระหว่างยาและเดนดริเมอร์-ลิงเกอร์ (รูปที่ 1)

ในขั้นตอนแรก Tesa (1) ถูกทำปฏิกิริยากับเตตราเมทิลีนไกลคอลเอไซด์ (TEG-azide)(2) เพื่อผลิต Tesa-TEG-azide (3) ซึ่งมีการเชื่อมโยงเอสเทอร์ระหว่างยาและตัวเชื่อมโยง (รูปที่ 1A)

HPLC ของสารประกอบ(3) แสดงเวลาคงอยู่ 13.4 นาที โดยมีความบริสุทธิ์มากกว่า 99% (รูปที่ S1B†) สเปกตรัมมวลของ (3) แสดงจุดสูงสุดที่ 610.13 [M + 1]+ ซึ่งสอดคล้องกับน้ำหนักโมเลกุลของ Tesa-TEG-azide ซึ่งยืนยันเพิ่มเติมถึงการก่อตัวของผลิตภัณฑ์ (รูปที่ S2†) โดยแยกจากกัน G4-PAMAM-OH dendrimer (4) ถูกทำปฏิกิริยากับกรดเฮกซีโนอิก 5- โดยใช้ปฏิกิริยาเอสเทอริฟิเคชันเพื่อสร้าง D-YNE (5) (รูปที่ 1B)

สุดท้าย Tesa-TEG-azide (3) และ D-YNE (5) ถูกทำปฏิกิริยาโดยปฏิกิริยาคลิกของคอปเปอร์-คะตะไลเซดาไซด์-อัลไคน์ (CuAAC) ที่มีประสิทธิภาพสูงเพื่อสร้าง D-Tesa (6) (รูปที่ 1B)48 1H NMR ยืนยันความสำเร็จในการสังเคราะห์ตัวกลางทั้งหมดและผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้าย D-Tesa (6) มีพีคที่เป็นลักษณะเฉพาะของเดนดริเมอร์และโปรตอนที่เป็นยาลิงค์เกอร์ ซึ่งแสดงให้เห็นถึงความสำเร็จในการสังเคราะห์ D-Tesa (รูปที่ 2A)

NMR ของคอนจูเกต D-Tesa สุดท้ายเผยให้เห็นว่ามีโมเลกุลของ Tesa โดยเฉลี่ย 10 โมเลกุลติดอยู่กับเดนดไรเมอร์แต่ละตัว HPLC ยืนยันการผันโควาเลนต์ที่ประสบความสำเร็จ เนื่องจาก D-Tesa แสดงการเปลี่ยนแปลงจากทั้ง D-YNE และ TesaTEG-azide (รูปที่ 2B และ S1†)

Tesa มีความสามารถในการละลายน้ำได้ต่ำ ประมาณว่าอยู่ที่ 0.0035 mg mL−1.49 การผันของ Tesa onhydroxyl dendrimer ช่วยปรับปรุงความสามารถในการละลายน้ำได้หลายระดับจากการประมาณการนี้ D-Tesa มีความสามารถในการละลายในน้ำที่ 22 มก. มล.−1 และเนื่องจาก Tesa ประกอบด้วย ∼19% ของมวลของ D-Tesa ดังนั้น 4.2 มก. ml−1 เทียบเท่ากับ Tesa จึงถูกละลายได้ (รูปที่ 3A)

ความสามารถในการละลายที่เพิ่มขึ้นที่ได้จากเดนดริเมอร์เพิ่มความง่ายในการกำหนดสูตร และขจัดความจำเป็นสำหรับสารปรุงแต่งที่เป็นพิษออกไป50 คุณประโยชน์เหล่านี้ล้วนเป็นส่วนเสริมจากความสามารถที่เหนือกว่าของเดนดริเมอร์ในการส่งยาฟรีทั่ว BBB ไปยังไมโครเกลีย ในร่างกาย และอาจลด จำเป็นต้องได้รับยาเพื่อให้บรรลุผลการรักษา18–28 สุดท้าย D-Tesa มีขนาดเฉลี่ย 7.75 ± 0.29 nm (รูปที่ S3†) และมีศักย์ซีตาที่ 286 ± 0.38 mV (การวัด N=5 และ N=3 ตามลำดับ)

การปล่อยยา

เราออกแบบ D-Tesa เพื่อปล่อย Tesa ภายในเซลล์ภายใน pH ต่ำและสภาพแวดล้อมที่มีความเข้มข้นของเอสเทอเรสสูงในเอนโดโซม/ไลโซโซมของแอคติเวตไมโครเกลีย ก่อนหน้านี้เราได้รายงานแล้วว่า PAMAM dendrimers ส่วนใหญ่เข้าสู่เซลล์ผ่านทาง endocytosis ของของเหลวและถุงที่มีคอนจูเกตจะเปลี่ยนเป็นไลโซโซม

เราบ่ม D-Tesa ที่ 37 องศาในบัฟเฟอร์โซเดียมซิเตรต (pH 5.5) โดยมีเอสเทอเรสเพื่อเลียนแบบสภาวะของไลโซโซมดังที่ดำเนินการก่อนหน้านี้ 52–54 เรายังตรวจสอบการปลดปล่อยภายใต้เงื่อนไขที่เลียนแบบสภาวะของพลาสมา (น้ำเกลือที่มีบัฟเฟอร์ฟอสเฟต [PBS ] บัฟเฟอร์, pH 7.4)

ภายใต้สภาวะของพลาสมา เพียงประมาณ 1.5% ของ Tesa จะถูกปล่อยออกมาหลังจาก 48 ชั่วโมง และน้อยกว่า 20% ของ Tesa จะถูกปล่อยออกมาภายในวันที่ 25 ซึ่งบ่งบอกถึงความคงตัวของพลาสมาของคอนจูเกต (รูปที่ 3B)

ภายใต้สภาวะไลโซโซมอล ประมาณ 60% ของ Tesa จะถูกปล่อยออกมาจาก D-Tesa ภายใน 48 ชั่วโมงแรก และภายใน 19 วัน เกือบ 100% ของ Tesa จะถูกปล่อยออกมา ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า D-Tesa ให้การปลดปล่อยยาฟรีอย่างต่อเนื่องและกระตุ้นในช่วงสองสัปดาห์แรกที่ได้รับการบ่มภายใต้สภาวะไลโซโซมที่เกี่ยวข้องกับทางสรีรวิทยา

นอกจากนี้ การปล่อย Tesa ขั้นต่ำในสภาวะพลาสมาจำลอง (กลุ่ม pH 7.4) ในช่วง 48 ชั่วโมงแรกมีความสำคัญ เนื่องจากนี่คือเวลาการไหลเวียนของ G4-PAMAM-OH โดยทั่วไปก่อนการล้างไต ดังนั้น Tesa ในปริมาณเล็กน้อยจึงมีแนวโน้มที่จะถูกปล่อยออกมาจาก คอนจูเกตก่อนที่จะไปถึงไมโครเกลีย24

D-Tesa ลดการแสดงออกของเครื่องหมาย M1 และเครื่องหมาย M2 ที่เพิ่มขึ้น

เพื่อประเมินความสามารถของ D-Tesa ในการกระตุ้นการเปลี่ยนแปลงฟีโนไทป์ M1 ถึง M2 เราได้ประเมินความสามารถของ D-Tesa ในการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของเครื่องหมาย M1 และ M2 ในหลอดทดลอง โดยใช้เซลล์ไมโครเกลียของหนู (BV2)

เซลล์ BV2 ถูกสร้างขึ้นโดยการทำให้เซลล์ microglial ของ murine เป็นอมตะ และแสดงให้เห็นว่าเป็นทางเลือกที่เหมาะสมสำหรับเซลล์ microglia หลักเพื่อศึกษาการตอบสนองต่อการอักเสบของ microglial55,56 ในการทดลองของเรา เพื่อเลียนแบบสภาพแวดล้อมของการอักเสบของระบบประสาทที่มีอยู่ในโรคทางระบบประสาทหลายชนิด เราได้ทำการรักษา microglia ไว้ล่วงหน้าด้วย 100 ng ml−1 (300 หน่วยเอนโดท็อกซิน (EU) ต่อมิลลิลิตร) LPS เป็นเวลา 3 ชั่วโมง

จากนั้น เราทำการรักษาเซลล์ร่วมกับ LPS และปล่อย Tesa หรือ D-Tesa เป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้นจึงเก็บตัวอย่าง เราบำบัดเซลล์ที่ความเข้มข้นของ Tesa หรือ D-Tesa อิสระ 1.5, 15 และ 150 µM บนพื้นฐานยาที่เทียบเท่ากัน

การทดสอบ MTT แสดงให้เห็นว่า Tesaor D-Tesa อิสระที่ความเข้มข้นเหล่านี้ไม่ก่อให้เกิดพิษต่อเซลล์ (รูปที่ S4†) การศึกษาการหาขนาดยาเบื้องต้นได้ดำเนินการกับ Tesaand D-Tesa เพื่อกำหนดขนาดยาที่มีประสิทธิภาพสูงสุดของ Tesa และD-Tesa

การบำบัดด้วย Tesa และ D-Tesadid อิสระ 1.5 และ 15 µM จะไม่เปลี่ยนแปลงการหลั่งของไนตริกออกไซด์หรือ TNF- ตามที่กำหนดโดย Griess Reagent และ TNF- ELISA ตามลำดับ (รูปที่ S5†) จากผลลัพธ์เหล่านี้ เราไม่ได้วิเคราะห์ความเข้มข้นที่ต่ำกว่าเหล่านี้ในการตรวจวิเคราะห์ qRT-PCR ของเรา

ในโรคที่เกิดจากความเสื่อมของระบบประสาทหลายชนิด ซึ่งเป็นพิษต่อระบบประสาทที่สำคัญอย่างหนึ่งของการอักเสบ M1 microglia คือการหลั่งของออกซิเจนชนิดปฏิกิริยา (เช่น ไนตริกออกไซด์) ที่ฆ่าเซลล์ประสาทโดยตรง57,58 ต่อมา มีการตั้งสมมติฐานว่ากลยุทธ์การรักษาที่มีศักยภาพอย่างหนึ่งคือลดการหลั่งของโมเลกุลเหล่านี้

เราประเมินความสามารถของ D-Tesa ในการบรรลุผลนี้ หลังจากการกระตุ้น LPS, D-Tesa ลดระดับไนตริกออกไซด์ที่ถูกหลั่งออกมาและไนตริกออกไซด์ซินเทสที่เหนี่ยวนำไม่ได้ (iNOS)mRNA ระดับ 3.7-เท่า (p < 0.0001) และ 2-เท่า (p {{ 7}}.011) ตามลำดับ เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ที่บำบัดด้วย LPS เท่านั้น (LPS เท่านั้น) (รูปที่ 4A และ B)

ในทางกลับกัน Tesa ที่เป็นอิสระจะลดซีเครตไนตริกออกไซด์ลงในระดับปานกลางมากขึ้น (1.4-พับ, p=0.004) และไม่ได้ทำให้การแสดงออกของ iNOS mRNA ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 4A และ B ).

D-Tesa มีประสิทธิภาพมากกว่า Tesain อิสระในการยับยั้งการหลั่งไนตริกออกไซด์ ถัดไป ขึ้นอยู่กับว่า microglia อยู่ในฟีโนไทป์ M1 หรือ M2 หรือไม่ microglia จะควบคุม iNOS หรือ Arginase 1 (Arg1) เพื่อเผาผลาญ L-arginine เพื่อผลิตไนตริกออกไซด์สำหรับการตอบสนองในการฆ่าเชื้อโรค M1, orornithine และยูเรียสำหรับการตอบสนองการรักษาบาดแผลของ M2 ตามลำดับ 59

สอดคล้องกับการปรับลด iNOS, D-Tesa เพิ่มระดับ Arg1 mRNA 2- เท่า (p=0.011) เมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุมเฉพาะ LPS ในขณะที่ Tesa แบบอิสระไม่ได้เพิ่มการแสดงออกอย่างมีนัยสำคัญ (p=0 .40) (รูปที่ 4C)

D-Tesa และ Tesa ที่ไม่มีขอบเขตน้อยกว่าได้เปลี่ยน microglia จากการปล่อยไนตริกออกไซด์ที่เป็นพิษต่อเซลล์ไปเป็นการเผาผลาญ L-arginine สำหรับการรักษาบาดแผล ซึ่งมีผลกระทบในการลดและอาจย้อนกลับได้ ความเป็นพิษต่อระบบประสาทที่เกิดจาก microglia ในการเสื่อมของระบบประสาท5–7,10

การลดการควบคุม iNOS และระดับไนตริกออกไซด์ที่หลั่งออกมาด้วยการบำบัดด้วย D-Tesa เกิดขึ้นจากงานก่อนหน้านี้ที่แสดงให้เห็นว่าลิแกนด์ธรรมชาติของ PPAR (15-deoxy-Δ12,14-พรอสตาแกลนดิน J2) ลดการแสดงออกและการหลั่งของ iNOS และไนตริกออกไซด์ใน LPS microglia.60 หลัก

IL-10, IL-4 และ TGF- 1 ล้วนเป็นไซโตไคน์ที่ถูกหลั่งออกมาโดย M2 microglia ที่ถูกกระตุ้นอีกทางหนึ่ง ซึ่งสามารถกระตุ้นสภาพแวดล้อมที่ป้องกันระบบประสาทและต้านการอักเสบในสมอง58,61,62มุ่งหน้าสู่ ในส่วนนี้ D-Tesa เพิ่มการแสดงออกของ IL-105.5-fold (p=0.011) และ IL-4 8.2-fold (p { {15}}.013) เมื่อเปรียบเทียบกับส่วนควบคุม LPS เท่านั้น (รูปที่ 4D และ E)

Free Tesa ไม่ได้เพิ่มระดับ IL-10 หรือ IL-4 อย่างมีนัยสำคัญ แม้ว่าค่าเฉลี่ยจะอยู่ที่ 1.7- เท่า (p=0.066) และ 2.{{7} } พับ (p=0.11) สูงขึ้นตามลำดับสำหรับ microglia ที่ได้รับ Tesa เมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุมแบบ LPS เท่านั้น (รูปที่ 4D และ E) นอกจากนี้ D-Tesaa ยังเพิ่มการแสดงออกของ TGF- 1 2.3-fold (p=0.015) และ Tesa ที่อิสระไม่ได้เปลี่ยนการแสดงออกอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 4F)

ดังนั้น D-Tesa ทำให้เกิดการหลั่งของไซโตไคน์ต้านการอักเสบหลังจากการรักษา LPS ของ microglia ซึ่งสามารถบรรเทาสภาพแวดล้อมที่เป็นพิษต่อระบบประสาทและการอักเสบในโรคทางระบบประสาทได้ 5–7,10

การแสดงออกที่เกิดจาก D-Tesa ของเครื่องหมายชนิดย่อย M2-

CD206, Ccl1 และ TLR8 เป็นเครื่องหมายเฉพาะสำหรับชนิดย่อย M2a, M2b และ M2c microglia ตามลำดับ58 D-Tesa อัปการควบคุมCD206 นิพจน์ 4.{{10 }}พับ (p < 0.001), Ccl1 3.5-พับ (p < 0.005) และ TLR8 5-พับ (p < 0.01) ในขณะที่ Tesa แบบอิสระไม่ได้เพิ่มการแสดงออกของ เครื่องหมายใด ๆ ในทั้งสามนี้ (รูปที่ 5A – C)

ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่า microglia ที่ได้รับ D-Tesa แสดงให้เห็นถึงการควบคุมเครื่องหมายของชนิดย่อย M2 ทั้งสามชนิดอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งเห็นด้วยกับความเข้าใจที่ว่า microglia phenotypeis เป็นพลาสติก ไม่ใช่ไบนารี 63–65

ระบบการตั้งชื่อ M1/M2 ช่วยลดความซับซ้อนที่ microglia สามารถมีอยู่ในสเปกตรัมของสถานะการเปิดใช้งาน; ตลอดความต่อเนื่องนี้ มีฟีโนไทป์ M2 ที่แตกต่างกันสามแบบ (M2a, M2b และ M2c) ได้รับการจำแนกลักษณะ และ D-Tesa ชักนำให้เกิดการแสดงออกของเครื่องหมายที่สอดคล้องกับแต่ละสถานะเหล่านี้58,61,63,66,67 M2a microglia มีส่วนเกี่ยวข้องกับการเพิ่มฟาโกไซโตซิสของเชื้อโรคที่ทำให้เกิดโรค โปรตีนโดยการควบคุมตัวรับขยะ การซ่อมแซมเนื้อเยื่อ และฤทธิ์ต้านการอักเสบ

M2b microglia ก็เหมือนกับ M1 microglia ตรงที่พวกมันแสดงออกถึง IL-1 , TNF- และ IL-6; อย่างไรก็ตาม M2b นั้นแตกต่างจาก M1 microglia ตรงที่พวกมันแสดง IL -10 ในระดับสูงและลดการแสดงออกของ iNOS M2b macrophages และ microglia กระตุ้น Th2 T-cells ซึ่งบ่งชี้ถึงบทบาทหนึ่งของ M2b ในการกระตุ้นการตอบสนองต้านการอักเสบ

M2cmicroglia เกี่ยวข้องกับการสมานแผล การเปลี่ยนแปลงเนื้อเยื่อ การกักเก็บธาตุเหล็ก และการกระตุ้น STAT3 ซึ่งลดการส่งสัญญาณการอักเสบ58,61,63,66กิจกรรม PPAR ของ Tesa ช่วยกระตุ้นลูปป้อนไปข้างหน้าซึ่งส่งผลให้การแสดงออกของ PPAR และโปรตีนต้นทางสัญญาณเพิ่มขึ้น (STAT6) ซึ่งเป็นทั้ง M2a markers.58D-Tesa เพิ่มการแสดงออกของ PPAR 2.3-fold (p=0.0036)และ STAT6 3.4- พับ (p < 0.001) ในขณะที่ Tesa ฟรีเพิ่มขึ้นSTAT6 1.8-พับ (p=0.011) โดยไม่มีการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในนิพจน์ PPAR (1.58-พับเพิ่มขึ้น p=0.17) (รูปที่ 5D และ E)

การแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของ STAT6 และ PPAR ส่งผลให้เกิดการผลิตยีนต้านการอักเสบและการยับยั้งสัญญาณการอักเสบโดยการยับยั้งกิจกรรม NF-κB เนื่องจาก M2a microglia สามารถถูกกระตุ้นได้โดยการรักษา microglia ด้วย IL-4 ซึ่งส่งสัญญาณผ่าน STAT6 และ PPAR การควบคุมโปรตีนส่งสัญญาณขั้นปลายทั้งสองนี้อาจส่งผลให้เกิดโพลาไรซ์ M2a ที่ป้อนไปข้างหน้า68

ในการทดสอบของเรา การเปิดใช้งาน LPS เพิ่มระดับ IL-6, TNF- และ IL-1 และการรักษาด้วย D-Tesa ควบคุมการแสดงออกของไซโตไคน์เหล่านี้เพิ่มเติม (รูปที่ S6A–D†) ซึ่งมีแนวโน้มว่า เนื่องจาก D-Tesa กระตุ้นฟีโนไทป์ M2b (รูปที่ 5B)

ฟรี Tesa เพิ่มการแสดงออกของ IL -6 และไม่เปลี่ยนการแสดงออกของ TNF- และ IL -1 อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ S6A – D †) ในขณะที่ไซโตไคน์เหล่านี้ถูกหลั่งโดย M1 microglia, M2b microglia ยังได้แสดงออกถึงไซโตไคน์เหล่านี้ด้วย 58,61 CD86 เป็นเครื่องหมายของทั้ง M1 และM2b microglia และเพิ่มขึ้นด้วยการรักษาด้วย D-Tesa (รูปที่ S6E†)

นอกจากนี้ ตัวยับยั้งการส่งสัญญาณไซโตไคน์ (SOCS) เป็นกลุ่มโปรตีนในเซลล์ที่ควบคุมโพลาไรเซชันของฟีโนไทป์ของ microglia โดยการยับยั้งเส้นทางการส่งสัญญาณหลายวิถีที่กระตุ้นโดยไซโตไคน์ 69 SOCS1 เป็นสมาชิกคนหนึ่งของกลุ่มนี้ และแสดงให้เห็นว่ายับยั้ง LPS/TLR4 การส่งสัญญาณ NF-κBและ JAK2 ที่เป็นสื่อกลาง ซึ่งจะช่วยลดปริมาณของ TNF- , IL -1 และ IL -6 ที่ปล่อยออกมาโดย M1 microglia ผ่านเส้นทาง LPS/TLR4

D-Tesa ควบคุมการแสดงออกของ SOCS1 เมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุม LPS อย่างเดียว (รูปที่ S6F†) โดยแนะนำว่าการเพิ่มขึ้นของ IL-6, TNF- และ IL-1 ที่แสดงโดย D-Tesac อาจเกิดจากการเหนี่ยวนำของ ฟีโนไทป์ M2b และไม่ผ่านการเพิ่มประสิทธิภาพของ LPS/TLR4, ฟีโนไทป์ที่เหนี่ยวนำ M1-

ยิ่งไปกว่านั้น LPS ส่งสัญญาณผ่าน TLR4 และเพื่อป้องกันการเปิดใช้งานของเซลล์มากเกินไป microglia มีกลไกการตอบรับเชิงลบโดยที่การเปิดใช้งาน TLR4 นำไปสู่การแสดงออกที่ลดลงของ TLR4.70

การบำบัดด้วย Free Tesa และ D-Tesa เพิ่ม TLR4ระดับ 3.6-เท่า (p < 0.001) และ 3.7-เท่า (p < 0.001) ตามลำดับ (รูปที่ 5F) ซึ่งบอกเป็นนัยว่า Tesa และ D-Tesa เปลี่ยนแปลงวิถีการส่งสัญญาณตอบรับเชิงลบโดยทั่วไปของLPS/TRL4

For more information:1950477648nn@gmail.com