การควบคุมระดับการแสดงออกของยีนที่ปรับแต่งได้โดยอาศัย CRISPRi ด้วย RNA แนวทางเดียวที่ได้รับการออกแบบทางวิศวกรรมใน Escherichia Coli
Oct 20, 2023
เชิงนามธรรม
Precise control of gene expression is essential for flux redistribution in metabolic pathways. Although the CRISPR interference (CRISPRi) system can effectively repress gene expression at the transcriptional level, it has still been difficult to precisely control the level without loss of specificity or an increase in cell toxicity. In this study, we developed a tunable CRISPRi system that performs transcriptional regulation at various levels. We constructed a single-guide RNA (sgRNA) library targeting repeat, tetraloop, and anti-repeat regions to modulate the binding affinity against dCas9. Each screened sgRNA could regulate the gene expression at a certain level between fully repressing and nonrepressing states (>45-พับ) sgRNA เหล่านี้ยังเปิดใช้งานการควบคุมแบบโมดูลาร์ด้วยลำดับ DNA เป้าหมายที่หลากหลาย เราใช้ระบบนี้เพื่อกระจายฟลักซ์การเผาผลาญเพื่อสร้างอนุพันธ์ไวโอลาซินในอัตราส่วนที่คาดการณ์ได้และเพิ่มประสิทธิภาพการผลิตไลโคปีน ระบบนี้จะช่วยเร่งกระบวนการเพิ่มประสิทธิภาพฟลักซ์ในวิศวกรรมเมตาบอลิซึมและชีววิทยาสังเคราะห์
cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน
คลิกที่นี่เพื่อดูผลิตภัณฑ์ Cistanche Enhance Immunity
【สอบถามเพิ่มเติม】 อีเมล:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
การแนะนำ
ระบบ Type II Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) เป็นระบบการแยกตัวของ DNA ที่มีการนำ RNA ซึ่งประกอบด้วย CRISPR RNA (crRNA), การเปิดใช้งานทรานส์ CRISPR RNA (tracrRNA) และโปรตีน Cas9 (1 ,2) Cas9 จาก Streptococcus pyogenes ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในวิศวกรรมจีโนมเนื่องจากคุณสมบัติที่โดดเด่น (3,4) สารเชิงซ้อนของโปรตีน spCas9, tracrRNA และ crRNA จับและแยก DNA โปรโตสเปเซอร์เป้าหมายที่เสริมกับลำดับตัวเว้นวรรค 20 นิวคลีโอไทด์ (nt) ของ crRNA เมื่อมีแม่ลายที่อยู่ติดกันของโปรโตสเปเซอร์ 5'-NGG-3' (PAM ) ลำดับ (5,6) เพื่อให้ระบบง่ายขึ้น สามารถใช้ RNA ไกด์เดี่ยวแบบไคเมอริก (sgRNA) โดยที่ crRNA และ tracrRNA เชื่อมต่อกันด้วยตัวเชื่อมโยงเทียมที่เรียกว่า tetraloop สามารถใช้ได้ (5) ช่วยให้สามารถแทนที่ RNA สองตัวที่แยกจากกันด้วยโมเลกุล RNA เดียว ทำให้ระบบสามารถจัดการได้ง่ายขึ้น หนึ่งในระบบที่ใช้ CRISPR นั่นคือการรบกวน CRISPR (CRISPRi) ใช้ Cas9 (dCas9) ที่ไม่เร่งปฏิกิริยาโดยการแทนที่กรดอะมิโนบางตัวจากแต่ละโดเมน endonuclease (7) การปรับเปลี่ยนนี้ทำให้เกิดคอมเพล็กซ์ไรโบนิวคลีโอโปรตีน (RNP) ที่สามารถควบคุมและผูกกับ DNA เป้าหมาย และรบกวนการทำงานของ RNA polymerase (RNAP) เพื่อยับยั้งการเริ่มต้นหรือการยืดตัวของการถอดรหัส (7) ตรงกันข้ามกับการทำให้ล้มลงโดยระบบ CRISPR / Cas9 CRISPR ช่วยให้ยีนล้มลงแบบย้อนกลับได้โดยการแสดง dCas9 หรือ sgRNA ภายใต้โปรโมเตอร์ที่เหนี่ยวนำไม่ได้ ทำให้มีความยืดหยุ่นมากขึ้นในการควบคุมยีน (7) ระบบ CRISPRi ได้ปิดเสียงยีนเป้าหมายอย่างมีประสิทธิภาพหลายร้อยเท่า (7,8) การปราบปรามของยีนเฉพาะเป้าหมายช่วยให้สามารถฟีโนไทป์ที่มีปริมาณงานสูงโดยใช้พูล sgRNA ทั่วทั้งจีโนม (9) หรือเปลี่ยนเส้นทางการไหลของคาร์บอนในแบคทีเรียที่ได้รับการออกแบบทางวิศวกรรมไปยังสารเคมีเป้าหมาย (10–12) นอกจากนี้ CRISPRi แบบมัลติเพล็กซ์ยังได้รับการสาธิตในโฮสต์ต่างๆ โดยใช้วิธีการที่หลากหลายในการแสดง sgRNA หลายรายการอย่างเสถียร รวมถึงอาร์เรย์ crRNA แบบยาว การรวมสวิตช์ toehold และอาร์เรย์ sgRNA แบบยาวพิเศษที่ไม่ซ้ำซ้อน (13–16) เทคนิคการยับยั้งยีนหลายตัวเหล่านี้พร้อมกันถูกนำมาใช้เพื่อทำงานที่ซับซ้อนมากขึ้น เช่น การลดตัวกลางที่เป็นพิษ หรือการปิดกั้นเส้นทางการแข่งขันในการหมักแบคทีเรีย (13,16–19) อย่างไรก็ตาม การปราบปรามอย่างสมบูรณ์นั้นไม่ได้เป็นที่ต้องการสำหรับวิศวกรรมเมตาบอลิซึมเสมอไป ระดับการแสดงออกของยีนควรได้รับการควบคุมอย่างแม่นยำเพื่อให้บรรลุการทำงานของเอนไซม์ที่เหมาะสมระหว่างเส้นทางการเจริญเติบโตและการผลิต ปรับสมดุลความเข้มข้นของสารตั้งต้นในเซลล์ และหลีกเลี่ยงการสะสมของสารตัวกลางที่เป็นพิษ (20–22) เทคนิคต่างๆ ได้รับการพัฒนาเพื่อออกแบบประสิทธิภาพการปราบปรามของ CRISPRi มีการปรับเปลี่ยนปัจจัยหลายอย่าง เช่น ปริมาณของโปรตีน sgRNA และ dCas9 หรือการเลือก sgRNA การควบคุมการแสดงออกของ dCas9 หรือทั้งการแสดงออกของ dCas9 และ sgRNA โดยใช้โปรโมเตอร์ที่ไม่สามารถเหนี่ยวนำได้ซึ่งควบคุมการแสดงออกของยีนเป้าหมายมากกว่า 30- เท่าหรือ 300- เท่าตามลำดับ (23,24) อย่างไรก็ตาม มีการสังเกตว่าการปรับความเข้มข้นของ dCas9 สามารถนำไปสู่ประสิทธิภาพการปราบปรามที่ไม่สอดคล้องกันในโปรโตสเปเซอร์ที่แตกต่างกัน (23) โปรโมเตอร์ที่เหนี่ยวนำที่มีอยู่จำนวนจำกัดยังสร้างความท้าทายด้านการออกแบบแม้จะมีความพยายามมากมาย (25) อีกกลยุทธ์หนึ่งคือการแทรก RNA aptamer เฉพาะลิแกนด์เข้าไปใน sgRNA โดยที่โมเลกุลที่มีสายเลือดขนาดเล็กสามารถเปิดเผยตัวเว้นวรรคได้ จึงทำให้สามารถควบคุม CRISPRi ที่ขึ้นกับปริมาณได้ (26) sgRNA เฉพาะลิแกนด์จะมีประโยชน์หากมีคู่ลิแกนด์และแอปทาเมอร์ที่เหมาะสม ระยะทางจากไซต์เริ่มต้นการถอดรหัสและการวางแนวของการเชื่อมโยง dCas9 ยังส่งผลต่อประสิทธิภาพของ CRISPRi (7) การปรับระยะห่างระหว่างไซต์ที่มีผลผูกพัน sgRNA และไซต์เริ่มต้นการถอดรหัสสามารถปรับเส้นทางในวิศวกรรมเมตาบอลิซึมให้เหมาะสม (17,27,28) ประสิทธิภาพการผสมข้ามระหว่างลำดับตัวเว้นวรรคและโปรโตสเปเซอร์ยังเปลี่ยนประสิทธิภาพการรวมที่ซับซ้อนของ RNP (29–31) ดังนั้นจึงมีการนำความไม่ตรงกันที่ออกแบบไว้นอกบริเวณเมล็ดพันธุ์เพื่อเปลี่ยนแปลงพลังงานอิสระมาใช้เพื่อกระจายประสิทธิภาพของ CRISPRi (31,32) อย่างไรก็ตาม การออกแบบ sgRNA นั้นจำเป็นสำหรับลำดับเป้าหมายใหม่แต่ละลำดับ และการบรรลุความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในพลังงานอิสระจากความไม่ตรงกันเพียงอย่างเดียวอาจเป็นเรื่องที่ท้าทาย นอกจากนี้ยังมีความเป็นไปได้ที่การรวมนอกเป้าหมายจะเพิ่มขึ้น (33) อย่างไรก็ตาม ยังคงจำกัดอยู่ที่การปราบปรามการแสดงออกของยีนหลายรายการอย่างแม่นยำในลักษณะโมดูลาร์ โดยไม่คำนึงถึงลำดับเป้าหมาย ในการศึกษานี้ เราได้พัฒนาระบบ CRISPRi ที่ปรับแต่งได้ซึ่งควบคุมการแสดงออกของยีนด้วยความแม่นยำและคาดเดาได้สูง โดยการเรียงลำดับเซลล์ตามการเรืองแสงซ้ำของไลบรารี sgRNA ที่กำหนดเป้าหมายไปที่เตตราลูปและบริเวณขนาบข้าง เราบรรลุประสิทธิภาพการปราบปรามการถอดเสียงได้ถึง 45- เท่าแม้ว่า DNA เป้าหมายจะเปลี่ยนไปก็ตาม ระบบนี้ช่วยให้สามารถกระจายฟลักซ์เมตาบอลิซึมที่คาดการณ์ได้ โดยไม่ต้องจัดการกับจีโนมของโฮสต์หรือวิถีการสังเคราะห์ ซึ่งเป็นเครื่องมือที่มีแนวโน้มในการปรับวิถีเมแทบอลิซึมให้เหมาะสม
วัสดุและวิธีการ
สายพันธุ์แบคทีเรีย พลาสมิด และรีเอเจนต์
สายพันธุ์ Escherichia coli และพลาสมิดที่ใช้ในการศึกษานี้แสดงอยู่ในตารางเสริม S1 ไพรเมอร์ที่ใช้ในการศึกษานี้แสดงอยู่ในตารางเสริม S2 ขั้นตอนการโคลนนิ่งอธิบายไว้ในวิธีการเสริม ยีนเป้าหมายและลำดับ DNA เป้าหมายสำหรับระบบ CRISPR แสดงอยู่ในตารางเสริม S3 มัค1-T1R ถูกใช้สำหรับการโคลนทั่วไป ห้องสมุดถูกสร้างขึ้นโดยใช้ NEB 5-alpha Electrocompetent E. coli (NEB) ทำการเพาะเลี้ยงตามปกติสำหรับการสร้างพลาสมิดและสายพันธุ์ที่อุณหภูมิ 37°C ในน้ำซุป Luria-Bertani (LB) หรือบนจานวุ้น LB ที่ประกอบด้วยยาปฏิชีวนะที่เหมาะสม (คลอแรมเฟนิคอล 34 กรัม/มิลลิลิตร, สเปคติโนมัยซิน 50 กรัม/มิลลิลิตร) PCR ดำเนินการโดยใช้ Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB) พลาสมิดและผลิตภัณฑ์ PCR ได้รับการทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ GeneAll® Exprep™ Plasmid SV Kit และ Gel SV Kit (GeneAll Biotechnology) ประสิทธิภาพการปราบปรามของพันธุ์กลาย sgRNA อาหารเลี้ยงเชื้อข้ามคืนได้รับการรีเฟรชเป็น OD600 จาก 0.05 และบ่มจนกระทั่งถึงค่าระหว่าง 0.6 ถึง 0.8 ต่อจากนั้น อาหารเลี้ยงเชื้อถูกเจือจางเป็น OD600 ที่ 0.05 ด้วย aTc 20 นาโนกรัม/มิลลิลิตร และบ่มเป็นเวลา 4 ชั่วโมง การเรืองแสงของโคโลนีเดี่ยวถูกวัดที่ 575 นาโนเมตร/616 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท Hidex Sense (Hidex) และค่า OD600 ถูกกำหนดโดยใช้เครื่องวัดสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ Jenway 7300 (Jenway) ค่าเรืองแสงสัมพัทธ์คำนวณเป็นหน่วยเรืองแสงต่อค่า OD600 โดยมีค่าสำหรับ PC ที่ตั้งไว้เป็น 100%
ผลของ Cistanche tubulosa-รักษาอาการท้องผูก
การคัดกรองห้องสมุด sgRNA
ใช้วิธีการทางวัฒนธรรมแบบเดียวกับที่อธิบายไว้ข้างต้น อาหารเลี้ยงเชื้อถูกเจือจางเป็น [เซลล์]<10−7 cells/ml in PBS buffer (pH 7.4). The fluorescence distribution was obtained from 100,000 cells from each sample using S3e Cell Sorter (Bio-Rad), and 5000 cells for each fluorescence range were sorted in each iteration. Cells were overnight cultured in fresh media for the next iteration. Samples were obtained after the final iteration and spread to the LB agar plate. Each colony was inoculated into 100 l of LB media and overnight cultured in 96-well microplate shaking at 900 rpm by Hidex Sense microplate reader (Hidex). Overnight culture media was refreshed by diluting 3 l culture media in 97 l fresh media and incubated for 2 h. Culture media was re-diluted by mixing 6 l culture media with 94 l fresh media, and aTc was added. The fluorescence of every single colony was obtained at 575 nm/616 nm by Hidex Sense microplate reader (Hidex) after 6 h of incubation. The OD600 value from the microplate reader was converted to the OD600 value from the spectrophotometer.
การสกัดอาร์เอ็นเอ
RNA ทั้งหมดถูกสกัดโดยใช้ RNeasy Mini Kit (Qiagen) เฉพาะเมื่อ miRNeasy Mini Kit (Qiagen) สำหรับการหาปริมาณ sgRNA หลังการรักษาด้วย RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen) และการเก็บรักษาที่อุณหภูมิ –80°C การย่อย DNA บนคอลัมน์โดยใช้ชุด DNase ที่ปราศจาก RNase (Qiagen) ดำเนินการในระหว่างกระบวนการสกัด การปนเปื้อนของ DNA ได้รับการตรวจสอบผ่าน PCR โดยไม่มีการถอดรหัสแบบย้อนกลับ ความเข้มข้นและความบริสุทธิ์ของแต่ละตัวอย่างถูกกำหนดโดยใช้ NanoDrop One (Thermo Scientific) และประเมินคุณภาพโดยใช้ DNA 5K/RNA/CZE 24 LabChip (PerkinElmer) บน LabChip GX Touch 24 (PerkinElmer)
cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน
การวิเคราะห์ RT-qPCR
ไพรเมอร์สำหรับ RT-qPCR นั้นได้มาจากสต็อกในห้องปฏิบัติการหรือออกแบบโดยใช้เครื่องมือ Primer3Plus (34) และแสดงอยู่ในตารางเสริม S4 ยีน CysG ถูกใช้เป็นยีนอ้างอิง (35) สำหรับการทดลอง RT-qPCR ทั้งหมด เส้นโค้งมาตรฐานถูกสร้างขึ้นโดย 10-การเจือจางเทมเพลตจาก 107 ชุด/ลิตร ถึง 10−1 ชุด/ลิตร ขีดจำกัดของการหาปริมาณถูกกำหนดหาโดยการปรับหมายเลขสำเนาให้เหมาะสมและอัตราการขยายที่เป็นบวกกับฟังก์ชันซิกมอยด์ และการคำนวณค่าหมายเลขสำเนาที่เป็นบวก 95% ช่วงไดนามิกเชิงเส้นถูกกำหนดให้เป็นหมายเลขสำเนาต่ำสุดซึ่งการเปลี่ยนแปลง Cq ที่คำนวณย้อนหลังน้อยกว่า 35% ค่า Cq ที่สูงกว่า 30 หรือค่าที่ไม่ได้ขยายในตัวควบคุมที่ไม่ใช่เทมเพลตได้รับการตรวจสอบแล้ว ข้อมูลเส้นโค้งมาตรฐานมีอยู่ในตารางเสริม S5 และรูปที่ S1 เพิ่มเติม มีการใช้ RNA ทั้งหมด 2.5 ng ในปฏิกิริยา RT-qPCR 10 ลิตรกับ Luna® Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB) RT-PCR ดำเนินการเป็นสามเท่าบนระบบ PCR แบบเรียลไทม์ StepOnePlus™ (Applied Biosystems) ด้วยขั้นตอนต่อไปนี้: (i) การถอดรหัสแบบย้อนกลับที่ 55°C เป็นเวลา 10 นาที ตามด้วยการสูญเสียสภาพที่ 95°C เป็นเวลา 1 นาที; (ii) 40 รอบความร้อนที่ 95°C เป็นเวลา 10 วินาที และ 60°C เป็นเวลา 1 นาที (iii) การวิเคราะห์เส้นโค้งหลอมละลายที่ 95°C เป็นเวลา 15 วินาที และ 60°C เป็นเวลา 1 นาที ตามด้วยการลาดจาก 60°C ถึง 95°C ในอัตราอัตรา 0.3°C/นาที การหาปริมาณสัมพัทธ์ของ RNA ถูกกำหนดหาโดยใช้วิธี delta-deltaCt (36) และวิเคราะห์ด้วยซอฟต์แวร์ StepOnePlus™ (Applied Biosystems)
ลำดับ RNA (RNA-seq) และการวิเคราะห์ข้อมูล
1.5 in biological duplicate. Total RNA was extracted by the abovementioned method, and ribosomal RNA (rRNA) was depleted using Ribo-Zero plus rRNA Depletion Kit (Illumina). cDNA libraries were constructed using KAPA Stranded RNA-Seq Kits (Kapa Biosystems), with an additional size-selection step using AMPure XP (Beckman Coulter). Adapters and primers used in this study are listed in Supplementary Table S2. The concentration was measured using a Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Scientific), and the size distribution of the cDNA was measured using X-Mark LabChip (PerkinElmer) on the LabChip GX Touch 24 instrument. The average cDNA length ranged from 390 to 450 bps. RNA-Seq was performed as >19M reads of 41 bp paired-end using NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 Cycles) (Illumina) on NextSeq 550 (Illumina). Data analysis was performed using the reference genome of E. coli BL21(DE3) complete genome (Genbank CP001509.3) with FastQC (v0.11.9) (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) (37), Bowtie (v1.2.3) (38) with trim3 option value of 3, samtools (v1.10) (39), and cufflinks (v2.2.1) (40,41). All samples between replicates had R2 >{{0}}.92 ขึ้นอยู่กับ FPKM (แฟรกเมนต์ต่อกิโลเบสของการถอดเสียงต่อการอ่านแมปล้านครั้ง) ยีนที่แสดงออกอย่างแตกต่างได้มาจากเกณฑ์ 1.5 (ตามบันทึก2-) และ 0.01 (ค่า q)
การผลิตและการสุ่มตัวอย่างโพรวิโอลาซินและโพรดีออกซีวิโอลาซิน
สำหรับการผลิตไวโอลาซีนและโพรดีออกซีวิโอลาซิน มีการใช้องค์ประกอบตัวกลางต่อไปนี้: 10.7 g/l K2HPO4, 5.2 g/l KH2PO4,1g/l NaCl, 1 g/l NH4Cl, 1 g/l MgSO4, { สารสกัดจากยีสต์ {17}}.2 กรัม/ลิตร และกลูโคส 1{{20}} กรัม/ลิตร อาหารเลี้ยงเชื้อข้ามคืนถูกรีเฟรชเป็น OD600 จาก 0.1 และเพาะเลี้ยงจนถึง OD600 ถึงระหว่าง 0.6 และ 0.8 ต่อจากนั้น อาหารเลี้ยงเชื้อถูกเจือจางเป็น OD600 ที่ 0.1 และเสริมด้วย 500 ng/ml aTc, 0.05 มิลลิโมลาร์ IPTG และ 0.1 กรัม/ลิตร L-ทริปโตเฟนจนถึงปริมาตรสุดท้ายที่ 5 มิลลิลิตร อาหารเลี้ยงเชื้อ 300 ลิตรถูกสุ่มตัวอย่างและปั่นแยกที่ 14 000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาทีเพื่อให้ได้เซลล์เม็ดสำหรับการวิเคราะห์ HPLC และตัวกลางเพาะเลี้ยง 300 ลิตรถูกสุ่มตัวอย่างสำหรับการสกัด RNA
การวิเคราะห์ HPLC
สำหรับการวิเคราะห์วิถีการสังเคราะห์ทางชีวภาพของไวโอลาซิน เม็ดเซลล์ถูกแขวนลอยใหม่ในเมทานอลที่มีปริมาตร {{0}} เมทานอล จากนั้นถูกโซนิคเป็นเวลา 5 นาที ปั่นเหวี่ยง และกรองผ่านตัวกรองไนลอน {{22- ม. การวิเคราะห์ HPLC ทำตามวิธี (42) ด้วย Poroshell 120 EC-C18, 4.6 × 150 มม., คอลัมน์ 4 ม. (Agilent) เฟสเคลื่อนที่สองเฟส A ที่มีกรดฟอร์มิก 0.1% ใน DDW และ B ที่มีกรดฟอร์มิก 0.1% ในอะซีโตไนไตรล์ ถูกนำมาใช้ที่อัตราการไหล 0.6 มิลลิลิตร/นาที โดยมีโปรไฟล์เกรเดียนต์ต่อไปนี้: 95% A เป็นเวลา 1.5 นาที, การไล่ระดับ A จาก 95 % ถึง 2% เป็นเวลา 4 นาที คงระดับ 2% A เป็นเวลา 2 นาที การไล่ระดับ A จาก 2% ถึง 95% เป็นเวลา 30 วินาที และคงระดับ 95% A เป็นเวลา 10 นาที ตัวอย่างถูกตรวจพบโดยใช้ตัวตรวจวัด PDA และพื้นที่ HPLC ถูกกำหนดหาที่ 600 นาโนเมตรสำหรับไวโอลาซินและ 610 นาโนเมตรสำหรับโพรดีออกซีไวโอลาซิน
การผลิตและการเก็บตัวอย่างไลโคปีน
สำหรับการผลิตไลโคปีน มีการใช้องค์ประกอบตัวกลางต่อไปนี้: 13.56 g/l Na2HPO4,6g/l KH2PO4,2g NH4Cl, 1 g NaCl, 2 มล. ของ 1 M MgSO4, 0.1 มล. ของ 1 M CaCl2 และ 4 กรัม/ลิตรของกลูโคส (22) ใช้คลอแรมเฟนิคอล 27 กรัม/มิลลิลิตร และสเปคติโนมัยซิน 50 กรัม/มิลลิลิตร อาหารเลี้ยงเชื้อข้ามคืนถูกรีเฟรชเป็น OD600 จาก 0.1 จนถึงปริมาตรสุดท้ายที่ 5 มิลลิลิตร เมื่อ OD600 ถึงระหว่าง 0.5 ถึง 0.6 aTc จะถูกเติมไปยังความเข้มข้นสุดท้ายที่ 500 ng/ml และเมื่อ OD600 ถึงระหว่าง 0.9 ถึง 1 IPTG จะถูกเติมไปยังความเข้มข้นสุดท้ายที่ 0.02 มิลลิโมลาร์ ไลโคปีนถูกสกัดโดยใช้อะซิโตน ตามที่อธิบายไว้ในเอกสารอ้างอิง (22) ความเข้มข้นของไลโคปีนได้มาจากค่าการดูดกลืนแสงที่ 475 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ Jenway 7300 โดยใช้เส้นโค้งมาตรฐาน สุ่มตัวอย่างอาหารเลี้ยงเชื้อ 300 ลิตรสำหรับการสกัด RNA
ประโยชน์ของซิสตานช์สำหรับระบบภูมิคุ้มกันของผู้ชาย
ผลลัพธ์และการอภิปราย
ผลกระทบของการกลายพันธุ์ใน sgRNA ต่อประสิทธิภาพการปราบปรามของระบบ CRISPR
ระบบ CRISPRi สามารถระงับการแสดงออกของยีนได้เมื่อ dCas9–sgRNA–DNA ternary complex เชื่อมโยงกันอย่างแน่นหนา เราตั้งสมมติฐานว่าประสิทธิภาพการปราบปรามของระบบ CRISPRi สามารถเปลี่ยนแปลงได้ในระดับหนึ่งโดยการปรับรูปแบบที่ซับซ้อน RNP ในการหาปริมาณประสิทธิภาพการปราบปรามของระบบ CRISPR เราได้ออกแบบระบบการรายงานเรืองแสงตามวงจรพันธุกรรมที่ dCas9 จาก S. pyogenes ถูกกระตุ้นโดย anhydrotetracycline (aTc) และทั้งยีนของนักข่าว (mCherry) และตัวแปร sgRNA ถูกแสดงออกอย่างเป็นส่วนประกอบ (รูปที่ 1เอ) เมื่อเพิ่ม aTc ลงในตัวกลาง dCas9 – sgRNA – DNA ternary complex จะบล็อกการถอดรหัสของยีนนักข่าว และระดับเรืองแสงจะบ่งบอกถึงประสิทธิภาพการปราบปรามของระบบ CRISPR แบบผกผัน sgRNA มีนิวคลีโอไทด์ (nts) ทั้งหมด 96 ตัว บริเวณตัวเว้นระยะ (20 nts แรก) เชื่อมโยงกับลำดับ DNA เป้าหมาย และอีก 76 nts มีส่วนช่วยในการก่อตัวที่ซับซ้อนและความเสถียร เนื่องจากความไม่ตรงกันในภูมิภาคตัวเว้นวรรคอาจสูญเสียความจำเพาะและเพิ่มผลกระทบนอกเป้าหมายในระบบที่ใช้ CRISPR (33,43) ความยาวสูงสุดของ sgRNA ที่สามารถออกแบบได้คือ 76 nts ในกรณีนี้ ควรได้ห้องสมุดขนาด 476 (ประมาณ 1,045) แต่ใหญ่เกินกว่าจะสร้างได้ ดังนั้นจึงจำเป็นต้องลดขนาดของไลบรารีให้แคบลงโดยการกำหนดตำแหน่งเฉพาะบน sgRNA ก่อนอื่นเราตรวจสอบว่าการกลายพันธุ์ใน sgRNA ในแต่ละภูมิภาคส่งผลต่อการปราบปรามในระบบ CRISPR อย่างไร การศึกษาก่อนหน้านี้รายงานว่าการกลายพันธุ์ในลำต้น – ห่วง 1 (sg mut01 และ sg mut02) นำไปสู่การลดลงอย่างมีนัยสำคัญในกิจกรรมของนิวคลีเอสของ Cas9 ในขณะที่การกลายพันธุ์ในลำต้น – ห่วง 2 (sg mut03) หรือลำต้น – ห่วง 3 (sg mut04) ไม่ได้รับผลกระทบจากกิจกรรมของมัน (44) sgRNA ที่สร้างขึ้นใหม่ (sg mut05) ที่มีการกลายพันธุ์ในบริเวณลำต้น – ลูป 1 และการทำซ้ำ, เตตราลูป, ป้องกันการทำซ้ำและบริเวณต้นกำเนิด – ลูป 2 ก็ลดกิจกรรมของนิวคลีเอสด้วย (44) อย่างไรก็ตาม ในระบบ CRISPRi ตัวแปร sgRNA ทั้งห้ามีผลเพียงเล็กน้อยต่อประสิทธิภาพการปราบปรามเมื่อเปรียบเทียบกับ sgRNA ชนิดไวด์ (sg WT) โดยแต่ละตัวแปรแสดงระดับเรืองแสง 2–4% เมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุมเชิงบวกโดยไม่มีขอบเขตตัวเว้นวรรค ( sg PC) (รูปที่ 1B) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการก่อตัวของคอมเพล็กซ์ dCas9 – sgRNA มีความไวน้อยกว่าต่อการปรับเปลี่ยนลำดับในภูมิภาค Stem – loop 1 ในระบบ CRISPRi ตรงกันข้ามกับระบบ CRISPR / Cas9 เราตั้งสมมติฐานว่าการลบขอบเขตที่เกี่ยวข้องกับความเสถียรของคอมเพล็กซ์อาจเป็นจุดเริ่มต้นในการควบคุมการแสดงออกในหลายระดับเพิ่มเติม ด้วยเหตุนี้ เราจึงสร้าง sgRNA ที่ถูกตัดทอน (sg trcSL1) โดยไม่มีตัวเชื่อมโยง, Stem–loop 2 และ Stem–loop 3 sgRNA ที่ถูกตัดทอนนี้มีจำนวนส่วนประกอบน้อยที่สุด และแสดงให้เห็นว่าลดกิจกรรมของ nuclease ใน CRISPR/ ระบบ Cas9 (5,44) เมื่อทดสอบในระบบ CRISPRi สายพันธุ์กลายที่มีข้อบกพร่องนี้แสดงระดับเรืองแสง 8% เมื่อเทียบกับ sg PC ซึ่งบ่งบอกว่ามันยังสามารถจับกับ dCas9 และยับยั้งยีนที่สนใจในระดับหนึ่ง แม้ว่าจะมีความเสถียรเชิงซ้อนแบบไตรภาคลดลงก็ตาม (รูปที่ 1B) การวิเคราะห์โครงสร้างของคอมเพล็กซ์ RNP แสดงให้เห็นว่าส่วนตัวเชื่อมโยง, ต้นกำเนิด – ลูป 2 และต้นกำเนิด – ลูป 3 ของ sgRNA มีหน้าที่รับผิดชอบในการรักษาเสถียรภาพของคอมเพล็กซ์ผ่านการโต้ตอบกับโดเมน nuclease ของ dCas9 ซึ่งนำไปสู่การลดลงอย่างมีนัยสำคัญใน indel ประสิทธิภาพในระบบ CRISPR/Cas9 (44) ในทางตรงกันข้าม การทำซ้ำ: ภูมิภาคป้องกันการทำซ้ำและต้นกำเนิด – ลูป 1 ของ sgRNA ส่วนใหญ่จะโต้ตอบกับโดเมนการจดจำและโดเมนการโต้ตอบ PAM ของ dCas9 และไม่ส่งผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อประสิทธิภาพของ indel ในระบบ CRISPR / Cas9 (44) ผลลัพธ์นี้สนับสนุนการสังเกตว่า sg trcSL1 แสดงการลดลงอย่างมีนัยสำคัญในกิจกรรมของนิวคลีเอสในระบบ CRISPR/Cas9 ในขณะที่ส่งผลกระทบเพียงเล็กน้อยต่อความสัมพันธ์ในการจับในระบบ CRISPRi
รูปที่ 1 การสร้างระบบและผลกระทบต่อประสิทธิภาพการปราบปรามโดยการกลายพันธุ์ของ sgRNA ( A ) ระบบพลาสมิดสองระบบสำหรับการหาปริมาณประสิทธิภาพการปราบปราม พลาสมิดหนึ่งตัวที่มีต้นกำเนิด p15A ประกอบด้วยยีน dCas9 ภายใต้โปรโมเตอร์ที่เหนี่ยวนำให้เกิด aTc และยีน mCherry ภายใต้โปรโมเตอร์ที่เป็นส่วนประกอบ พลาสมิดอีกตัวที่มีต้นกำเนิด cloDF13 มี sgRNA ชนิดไวด์หรือกลายพันธุ์ภายใต้โปรโมเตอร์ที่เป็นส่วนประกอบ ( B ) การเรืองแสงสัมพัทธ์ของการกลายพันธุ์ sgRNA แต่ละตัว (sg mut01 ∼ sg mut05 และ sg trcSL1) และ sg WT เมื่อเปรียบเทียบกับ sg PC +1 ถึง + 20 คือลำดับตัวเว้นวรรคที่ผูกกับยีน mCherry sg PC: sgRNA ที่ไม่มีตัวเว้นวรรคเป็นตัวควบคุมเชิงบวก sg WT: sgRNA แบบไวด์ แถบข้อผิดพลาดบ่งชี้ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (n=3) ค่า P ถูกกำหนดโดยการทดสอบทีแบบไม่มีคู่ ns: ไม่มีนัยสำคัญ **ป< 0.01
การเปลี่ยนแปลงประสิทธิภาพการก่อตัวที่ซับซ้อนสำหรับการควบคุมการแสดงออกหลายระดับ
Tetraloop เป็นตัวเชื่อมโยงเทียมที่เชื่อมต่อ crRNA และ tracrRNA ในระบบ CRISPR-Cas9 (5) โครงสร้างผลึกของสารเชิงซ้อนแบบไตรภาคที่ประกอบด้วย dCas9, crRNA และ tracrRNA ได้แสดงให้เห็นว่า tetraloop และบริเวณขนาบข้างที่ 5 และ 3 มีการสัมผัสกับ dCas9 เพียงเล็กน้อย (44) ในเวลาเดียวกัน ให้ทำซ้ำ: ป้องกันการทำซ้ำและขอบเขต Stem – loop 1 มีความสำคัญต่อฟังก์ชันที่ซับซ้อน (44) เนื่องจากมันไม่ได้โต้ตอบโดยตรงกับ dCas9 tetraloop และบริเวณขนาบข้างจึงถูกสำรวจว่าเป็นพื้นที่ที่มีศักยภาพสำหรับวิศวกรรม sgRNA พร้อมส่วนประกอบเพิ่มเติม เช่น การรวมลำดับ aptamer เพื่อรับโปรตีนเพิ่มเติมไปยัง sgRNA (45,46) มีความเป็นไปได้ที่การกลายพันธุ์ในภูมิภาคนี้สามารถกระจายความสัมพันธ์ที่ผูกพันระหว่าง sgRNA และ dCas9 โดยไม่รบกวนความซับซ้อนโดยสิ้นเชิง ไลบรารีสุ่ม mer 12- เมอร์ (4 nt ของบริเวณ tetraloop และ 4 nt ของบริเวณขนาบข้าง 5 และ 3 ตามลำดับ) ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ sg trcSL1 เป็นเทมเพลตเพื่อลดประสิทธิภาพการก่อตัวที่ซับซ้อนระหว่าง sgRNA และ dCas9 เพิ่มเติม (รูปที่ 2A ). เราใช้กลยุทธ์การเรียงลำดับสองขั้นตอนเพื่อให้ได้การกลายพันธุ์ sgRNA ต่างๆ ที่ครอบคลุมประสิทธิภาพการปราบปรามระหว่าง sg WT (สถานะการปราบปรามอย่างเต็มที่) และ sg PC (สถานะที่ไม่อดกลั้น) เราแบ่งห้องสมุดดั้งเดิมออกเป็นห้องสมุดเล็กๆ ที่มีช่วงความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์ที่แตกต่างกัน จากนั้นจึงระบุการเรืองแสงของตัวแปร sgRNA แต่ละตัวจากห้องสมุดขนาดเล็ก การกระจายตัวของฟลูออเรสเซนซ์ของไลบรารีดั้งเดิมที่ได้รับจาก flow cytometry เกือบจะเหมือนกับการกระจายตัวของ sg PC (รูปที่ 2B) อย่างไรก็ตาม หลังจากสามขั้นตอนการเรียงลำดับติดต่อกัน แต่ละไลบรารี (สูง กลาง และต่ำ) มีระดับการเรืองแสงเฉลี่ย 63%, 24% และ 14% เมื่อเปรียบเทียบกับ sg PC ตามลำดับ (รูปที่ 2B) โคโลนีแปดสิบสองแห่งถูกแยกออกจากห้องสมุดขนาดเล็กเหล่านี้ โดยมีระดับการเรืองแสงอยู่ระหว่าง 8% ถึง 104% (รูปที่ 2C) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการกลายพันธุ์ของ tetraloop และบริเวณขนาบข้างของ sgRNA สามารถปรับความสัมพันธ์ที่มีผลผูกพันระหว่าง dCas9 และ sgRNA เพื่อประสิทธิภาพการปราบปรามต่างๆ การวิเคราะห์ PCR เชิงปริมาณการถอดรหัสแบบย้อนกลับ (RT-qPCR) ของการกลายพันธุ์ 10 sgRNA (sg trcSL1c1 – sg trcSL1c10, ตารางเสริม S6) พร้อมสัญญาณเรืองแสงต่างๆระหว่าง sg WT และ sg PC ใน 82 อาณานิคม sgRNA แสดงให้เห็นว่าระดับการเรืองแสงเพิ่มขึ้นเชิงเส้นเมื่อเพิ่มการถอดเสียง mCherry ซึ่งบ่งชี้ว่าระบบ CRISPRi ของเราควบคุมการแสดงออกของยีนในระดับการถอดเสียง (รูปที่ S2 เพิ่มเติม) ระบบ CRISPRi ที่ปรับแต่งได้ของเราใช้ sgRNA ที่ได้รับการออกแบบทางวิศวกรรม ซึ่งสามารถบรรลุการควบคุมการปราบปรามได้สูงสุดถึง 45- เท่า ช่วยให้สามารถปรับประสิทธิภาพการปราบปรามได้อย่างละเอียดโดยไม่ต้องเปลี่ยนปริมาณ dCas9 หรือ sgRNA ข้อได้เปรียบที่โดดเด่นของระบบของเราคือสามารถปรับประสิทธิภาพการปราบปรามอย่างละเอียดผ่านตัวแปร sgRNA ที่เฉพาะเจาะจง โดยไม่ทำให้เกิดผลลัพธ์ที่ไม่ได้ตั้งใจ แม้ว่าจะต้องมีการโคลนเพิ่มเติมก็ตาม ยิ่งไปกว่านั้น กราฟการเติบโตแสดงให้เห็นว่าระบบของเราไม่ได้กำหนดภาระเซลล์ที่มีนัยสำคัญ (รูปที่ S3 เพิ่มเติม) นอกจากนี้ RNA-Seq ในตัวแปร sg trcSL1 สามตัวที่มีระดับประสิทธิภาพการปราบปรามที่แตกต่างกันแสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของยีน 51 ถึง 83 เปลี่ยนไป ตรงกันข้ามกับ 262 ยีนที่เปลี่ยนแปลงใน sg WT (รูปที่ S4 เสริม) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าตัวแปร sg trcSL1 มีผลกระทบนอกเป้าหมายต่ำกว่าระบบ CRISPRi ทั่วไปด้วยซ้ำ มีความเกี่ยวข้องอย่างยิ่งในการใช้งานด้านวิศวกรรมเมตาบอลิซึม โดยที่การปรับวิถีเมแทบอลิซึมให้เหมาะสมมักเกี่ยวข้องกับการยักย้ายของยีนหลายตัว ความสามารถในการปรับแต่งการแสดงออกของยีนโดยไม่ก่อให้เกิดผลข้างเคียงสามารถเร่งกระบวนการเพิ่มประสิทธิภาพได้อย่างมาก และปรับปรุงประสิทธิภาพและผลผลิตโดยรวมของระบบ
รูปที่ 2 โครงสร้างของห้องสมุด sgRNA และการคัดกรองห้องสมุด ( A ) โครง sgRNA ที่ใช้ในการศึกษานี้ 12-mer ที่มี tetraloop และลำดับขนาบข้างจะถูกกลายพันธุ์แบบสุ่มจาก sg trcSL1 เพื่อรับไลบรารี sgRNA (B) การกระจายตัวของฟลูออเรสเซนซ์ที่ได้จากโฟลไซโตเมทรีก่อน (ซ้าย) และหลังการเรียงลำดับ (ขวา) การกระจายแต่ละครั้งประกอบด้วย 100,000 เซลล์ (C) การเรืองแสงของโคโลนีเดี่ยวที่ได้จาก (B) แถบข้อผิดพลาดบ่งชี้ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (n=2)
ผลของปริมาณ dCas9 และ sgRNA ต่อประสิทธิภาพการปราบปราม
เนื่องจากการปรับปริมาณของ dCas9 หรือ sgRNA สามารถเปลี่ยนประสิทธิภาพการปราบปรามของระบบ CRISPRi (23,24) จึงจำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องตรวจสอบผลกระทบของปริมาณ dCas9 และ sgRNA ต่อประสิทธิภาพการปราบปราม เราทดสอบประสิทธิภาพของระบบของเราภายใต้เงื่อนไขที่แตกต่างกันโดยการเปลี่ยนปริมาณของ dCas9 และ sgRNA โดยใช้การกลายพันธุ์ sgRNA สิบตัว (sg trcSL1c1–sg trcSL1c10) ความเข้มข้นที่แตกต่างกันสามระดับ (20, 100 และ 500 ng/ml) ของตัวเหนี่ยวนำถูกนำมาใช้สำหรับการแสดงออกของ dCas9 เมื่อเปรียบเทียบกับระดับ dCas9 mRNA เมื่อใช้ตัวเหนี่ยวนำ 20 ng/ml มันเพิ่มขึ้นอีก 15- เท่า (100 ng/ml) และ 22- เท่า (500 ng/ml) (รูปที่เสริม S5A ). มีความกังวลเกี่ยวกับการแสดงออกมากเกินไป dCas9 เนื่องจาก dCas9 ในระดับสูงอาจเป็นพิษต่อเซลล์ (47,48) หรือบางครั้งก็ไม่ (49) อย่างไรก็ตาม อัตราการเติบโตลดลงน้อยกว่า 10% เมื่อใช้ aTc มากถึง 500 ng/ml ตามกราฟการเติบโตที่ความเข้มข้นของตัวเหนี่ยวนำต่างๆ (รูปที่ S6 เพิ่มเติม) นี่แสดงให้เห็นว่าปริมาณ dCas9 ไม่มีผลเป็นพิษต่อเชื้อ E. coli ภายใต้สภาวะที่ทดสอบ ประสิทธิภาพการปราบปรามมีการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยเมื่อแสดงปริมาณ dCas9 ที่แตกต่างกัน (รูปที่ 3A) ซึ่งสอดคล้องกับการศึกษาก่อนหน้านี้ว่าระบบ CRISPRi บรรลุประสิทธิภาพการปราบปรามสูงสุดที่ [aTc]< 5 ng/ml when the same replication origin and promoter were used for the expression of CRISPRi components (24). We set the inducer concentration to 500 ng/ml to sufficiently supply dCas9 for further applications such as multiple gene regulation. The property that our system is less sensitive to the amount of dCas9 has advantages over the strategy of adjusting inducer concentration, as the dose-dependent induction of dCas9 might be varied due to the promoters, plasmid copy numbers, or host strains (50–53). Additionally, using CRISPR-based systems allows for the simultaneous targeting of multiple genes for editing or repression, making it an effective tool for multiplexing gene regulation (54). Our tunable CRISPRi system allows for the precise modulation of repression efficiency through sgRNA variants. With this approach, it would be possible to target multiple genes with varying levels of repression simultaneously. The previous study reported that stronger promoters for sgRNA expression lead to higher repression efficiency (24). To investigate the effect of the amount of sgRNA on repression efficiency in our system, two different promoters having different strengths were used (BBa J23100; J23100 and BBa K2753055; UPJ23119). Promoter UPJ23119 contains a UP element that interacts with E. coli RNA polymerase and expresses 16-fold more transcript than J23100 (55). However, the exact fold change may vary depending on the plasmids, genes, and host strains used. Our results showed that UPJ23119 doubled sgRNA expression in our system and had higher repression efficiency (Figure 3B and Supplementary Figure S5B). These results suggest that adjusting the amount of sgRNA can further expand the dynamic range of multi-level expression and provide precise modulation of repression efficiency.
รูปที่ 3 ลักษณะเฉพาะและความเป็นโมดูลของระบบ CRISPRi ที่ปรับได้ (A) การเรืองแสงสัมพัทธ์ภายใต้ความเข้มข้นของ aTc ที่แตกต่างกัน (20, 100 และ 500 ng/ml) (B) การเรืองแสงสัมพัทธ์ภายใต้โปรโมเตอร์ที่แตกต่างกัน (J23100 และ UPJ23119) ( C ) การเรืองแสงสัมพัทธ์ภายใต้โปรโตสเปเซอร์ที่แตกต่างกัน แกน x บ่งชี้ถึงการเรืองแสงสัมพัทธ์ของ mCherry และแกน y บ่งชี้ถึงการเรืองแสงสัมพัทธ์ของ lacI33-mCherry (สีแดง) และ araC33-mCherry (สีน้ำเงิน) ลำดับเพิ่มเติม 33 bp จาก lacI และ araC ถูกเพิ่มไปที่ส่วนท้ายของ mCherry (56) (D) พลังงานอิสระของ 12-เมอร์และการเรืองแสงแบบสัมพัทธ์ เส้นประบ่งบอกถึงช่วงการคาดการณ์ 95% และเส้นทึบบ่งบอกถึงเส้นถดถอย ไม่สามารถรับค่า dG ของ sg trcSL1c2 ได้โดยใช้ mFold ดังนั้นจึงแยกออกจากการวิเคราะห์ (A–D) แถบข้อผิดพลาดทั้งหมดระบุค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (n=3)
ความเป็นโมดูลของระบบ CRISPRi ที่ปรับได้
วิธีการของเราโดยใช้ตัวแปร sgRNA เฉพาะเพื่อรักษาระดับการแสดงออกที่แน่นอนสำหรับ DNA เป้าหมายมีศักยภาพที่จะใช้เป็นระบบโมดูลาร์ เพื่อแสดงให้เห็นถึงความเป็นไปได้ของระบบ CRISPRi ที่ปรับได้สำหรับการกำหนดเป้าหมายโปรโตสเปเซอร์ที่แตกต่างกัน เราได้สร้างยีนฟิวชั่นสองยีน (lacI{{0}}mCherry และ araC33-mCherry) โดยการเพิ่มลำดับ 33 bps จาก lacI และ araC ไปที่ 5 - จุดสิ้นสุดของ mCherry (56) จีโนมของ E. coli BL21(DE3) (GenBank: CP001509.3) มีสำเนาสองชุดของลำดับโปรโตสเปเซอร์สำหรับ lacI33- mCherry และหนึ่งสำเนาสำหรับ araC33-mCherry อย่างไรก็ตาม ลำดับโครโมโซมเหล่านี้ไม่มีลำดับ PAM ดังนั้นจึงไม่สามารถกำหนดเป้าหมายโดย dCas9-sgRNA complex (43) ได้ เมื่อ siRNA ได้รับการออกแบบมาเพื่อกำหนดเป้าหมายโปรโตสเปเซอร์แต่ละตัว ประสิทธิภาพการปราบปรามได้รับการบำรุงรักษาอย่างสม่ำเสมอสำหรับโปรโตสเปเซอร์ทั้งหมดจาก lacI33, araC33 และ mCherry (รูปที่ 3C) การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าระบบ CRISPRi ที่ปรับแต่งได้ของเราสามารถควบคุมการแสดงออกของยีนได้อย่างมีประสิทธิภาพในระดับหนึ่งโดยไม่คำนึงถึงลำดับโปรโตสเปเซอร์ คำอธิบายที่เป็นไปได้ประการหนึ่งสำหรับความสัมพันธ์ที่สังเกตได้ระหว่างการก่อตัวที่ซับซ้อนของ RNP และประสิทธิภาพการปราบปรามคือการเปลี่ยนแปลงของพลังงานอิสระเมื่อมีการก่อตัวที่ซับซ้อน ตัวเชื่อมโยงเตตราลูปเทียมและบริเวณขนาบข้างประกอบด้วยคู่เบส A: U และ G: C วัตสัน-คริก 2 คู่ และคู่เบส A: G ที่ไม่ใช่วัตสัน-คริก (44) เนื่องจากการจับกันของ crRNA และ tracrRNA มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการก่อตัวที่ซับซ้อน การกลายพันธุ์ที่มุ่งเป้าไปที่ tetraloop จะส่งผลต่อความสัมพันธ์ในการจับกันระหว่าง dCas9 และ sgRNA ความสัมพันธ์นี้สามารถคำนวณได้จากความแตกต่างของพลังงานอิสระระหว่างสถานะที่มีขอบเขตและไม่มีขอบเขต อย่างไรก็ตาม การคำนวณพลังงานเสรีของรัฐที่มีขอบเขตเป็นสิ่งที่ท้าทาย (57) เราคาดว่าโครงสร้างโดยรวมและความเสถียรของสถานะที่ถูกผูกไว้จะไม่เปลี่ยนแปลงเนื่องจาก sgRNA ที่เรียงลำดับจากไลบรารีไม่ได้รบกวนการทำงานของมันโดยสิ้นเชิง ยิ่งไปกว่านั้น tetraloop และบริเวณขนาบข้างมีการสัมผัสกับ dCas9 เพียงเล็กน้อย (44) ดังนั้นความสัมพันธ์ที่ผูกพันระหว่าง dCas9 และ sgRNA จะได้รับผลกระทบส่วนใหญ่จากความเสถียรของโครงสร้างรองของ tetraloop และลำดับขนาบข้าง จากแนวคิดนี้ เราได้คำนวณพลังงานอิสระของเตตราลูปและลำดับขนาบข้างโดยใช้แม่พิมพ์ (58) ความแตกต่างของพลังงานอิสระของการพับเนื่องจากการกลายพันธุ์ถูกกำหนดให้เป็นความแตกต่างระหว่างพลังงานอิสระของลำดับกลายพันธุ์และลำดับแบบไวด์ สามารถคำนวณได้โดยตรงจากพลังงานอิสระของการพับของสายพันธุ์กลาย เนื่องจากพลังงานการพับของลำดับแบบไวด์มีค่าคงที่ที่ –4.3 กิโลแคลอรี/โมล เมื่อพลังงานอิสระของการพับเพิ่มขึ้น สัญญาณเรืองแสงก็เพิ่มขึ้น (รูปที่ 3 มิติ) ประสิทธิภาพการอัดจะสูงที่สุดเมื่อพลังงานการพับของบริเวณที่มีเตตราลูปอยู่ใกล้หรือต่ำกว่า 0 กิโลแคลอรี/โมล และลดลงเชิงเส้นเมื่อพลังงานการพับเกิน 0 กิโลแคลอรี/โมล การสังเกตนี้ชี้ให้เห็นว่าประสิทธิภาพของการก่อตัวที่ซับซ้อนระหว่าง dCas9 และ sgRNA นั้นถูกกำหนดโดยโครงสร้างรองของภูมิภาค tetraloop ซึ่งช่วยอธิบายความเป็นโมดูลของระบบของเรา ประสิทธิภาพการปราบปรามของ 85 sgRNA เพิ่มเติมที่มีลำดับ 12- เมอร์ที่ต่างกันจากไลบรารีถูกวัดเพื่อตรวจสอบความสัมพันธ์นี้เพิ่มเติม นอกจากนี้ยังแสดงให้เห็นความสัมพันธ์ที่สังเกตได้จากตัวแปร sg trcSL1 (รูปที่ 3 มิติและตารางเสริม S7) ซึ่งบ่งชี้ว่าตัวเชื่อมโยง tetraloop มีบทบาทสำคัญในการสร้าง RNP ที่ซับซ้อน และการกลายพันธุ์ในภูมิภาคนี้สามารถส่งผลกระทบต่อประสิทธิภาพของระบบ CRISPR นอกจากนี้ ความสัมพันธ์นี้แสดงให้เห็นถึงความเป็นไปได้ของการออกแบบตัวแปร sgRNA โดยใช้คอมพิวเตอร์พร้อมประสิทธิภาพการปราบปรามที่ต้องการ
การใช้ระบบ CRISPRi ที่ปรับได้สำหรับการกระจายฟลักซ์ในวิถีการสังเคราะห์ทางชีวภาพของไวโอเลซินใน E. coli
Redistributing the metabolic flux is an important process in metabolic engineering to maximize the yield of target products (59,60). Because our system could precisely control gene expression by targeting any protospacer, we chose the violacein biosynthetic pathway as a model system for pathway redistribution. Violacein is an indole derivative compound that exhibits a deep purple color, originally produced by Chromobacterium violaceum (Figure 4A) (61). This compound is synthesized from L-tryptophan by five enzymes encoded by vioA, vioB, vioE, vioD, and vioC (62). Along with violacein (V), other indole derivatives such as proviolacein (PV), deoxyviolacein (DV), and prodeoxyviolacein (PDV) with different colors can also be produced (Figure 4A) (62). The production of violacein and deoxy violacein is an enzymatic process mediated by vioC, while the production of PV and PDV is a non-enzymatic process. We expressed the violacein biosynthetic pathway under the IPTG inducible promoter (63), and different trcSL1 variants were designed to target vioD to redirect the flux. It could effectively modulate the expression of vioD at the transcriptional level (Figure 4B). vioC was repressed by sg WT and showed high variation (Supplementary Figure S7), but the absolute copy number was kept at low levels (>100-พับ) เมื่อเปรียบเทียบกับยีนอื่นๆ เมื่อคำนวณจากเส้นโค้งมาตรฐาน ในทางตรงกันข้าม การแสดงออกของเอนไซม์ที่ไม่ได้รับการควบคุมอื่นๆ ในวิถีทางไวโอลาซิน (vioA, vioB และ vioE) ยังคงไม่เปลี่ยนแปลง ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าระบบของเราสามารถกำหนดเป้าหมายและปรับเปลี่ยนการแสดงออกของยีนแต่ละตัวได้โดยเฉพาะ โดยไม่ส่งผลกระทบต่อยีนอื่น ๆ ในวิถีทาง ไม่สามารถหาปริมาณโดยตรงของ PV และ PDV ได้เนื่องจากขาดมาตรฐานที่มีวางจำหน่ายทั่วไปสำหรับการวิเคราะห์ HPLC ดังนั้นเราจึงวัดไทเทอร์ในหน่วยที่กำหนดเองโดยใช้พื้นที่พีคของ HPLC titer ของผลิตภัณฑ์ถึงสูงสุดที่ 8 ชั่วโมงหลังจากการเหนี่ยวนำแล้วค่อยๆลดลง (รูปที่ S8 เสริม) อาจเนื่องมาจากการเปลี่ยนผลิตภัณฑ์เป็นผลิตภัณฑ์ด้านอื่น ๆ เช่น chromoviridans โดยกลไกที่ไม่รู้จัก (42,64) พีครองที่สังเกตพบบนสเปกตรัม HPLC บ่งชี้การมีอยู่ของผลิตภัณฑ์ข้างเคียงรองเพิ่มเติม การวิจัยก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่าลอการิทึมของไทเทอร์ของแต่ละผลิตภัณฑ์ในหน่วยที่กำหนดเองสามารถทำนายได้โดยการรวมกันเชิงเส้นของความแข็งแกร่งของโปรโมเตอร์ของแต่ละยีนที่เกี่ยวข้องกับวิถีการสังเคราะห์ทางชีวภาพของไวโอเลซิน (42) แบบจำลองการถดถอยเชิงเส้นบันทึกนี้ยังใช้ได้ในระบบของเรา และการถอดเสียง vioD ที่เพิ่มขึ้นนั้นสัมพันธ์กับการผลิต PV ที่เพิ่มขึ้น (รูปที่ 4B) เป็นที่ทราบกันดีว่าวิศวกรรมโปรโมเตอร์หรือ 5 -UTR ของแต่ละยีนที่เกี่ยวข้องกับวิถีการสังเคราะห์ทางชีวภาพของไวโอลาซินทำให้สามารถกระจายฟลักซ์ใหม่และปรับวิถีให้เหมาะสม (65,66) ระบบของเราสามารถทำงานเป็นวิธีการทางเลือกที่แสดงให้เห็นการควบคุมการถอดรหัสโดยไม่ต้องจัดการกับโปรโมเตอร์ที่เกี่ยวข้องในวิถีทางโดยใช้ sgRNA สังเคราะห์ ซึ่งสั้นและสามารถประกอบได้ด้วยวิธีการขั้นตอนเดียว การคัดกรองผ่านระบบ CRISPRi ที่ปรับแต่งได้ทำให้สามารถเปลี่ยนเส้นทางทางเดินด้วยฟลักซ์ที่คาดเดาได้ ก่อนที่จะจัดการกับสายพันธุ์โฮสต์หรือเทปคาสเซ็ตของยีนโดยตรง ซึ่งอาจเร่งกระบวนการได้
การใช้ระบบ CRISPRi แบบปรับได้เพื่อสร้างสมดุลฟลักซ์คาร์บอนในเชื้อ E. coli ที่ผลิตไลโคปีน
การผลิตสารประกอบอันทรงคุณค่าที่มีประสิทธิภาพในวิศวกรรมเมตาบอลิซึมจำเป็นต้องสร้างสมดุลของฟลักซ์คาร์บอน วิถีเมทิลเลอริทริทอล 4-ฟอสเฟต (MEP) เป็นวิถีทางเมแทบอลิซึมที่ใช้สารตั้งต้นอย่างง่าย เช่น ไพรูเวตและกลีเซอรัลดีไฮด์ 3-ฟอสเฟต (GAP) เพื่อสร้างบล็อคการสร้างไอโซพรีนอยด์ ไดเมทิลลิล ไพโรฟอสเฟต และไอโซเพนทีนิล ไพโรฟอสเฟต (67,68) . โมเลกุลเหล่านี้สังเคราะห์เจอรานิล ไพโรฟอสเฟต ซึ่งถูกแปลงเป็นฟาร์เนซิล ไพโรฟอสเฟต (FPP) (67,68) ไลโคปีนซึ่งเป็นแคโรทีนอยด์ที่มีมูลค่าสูงพร้อมคุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระที่มีศักยภาพและการใช้งานที่หลากหลายในอุตสาหกรรมต่างๆ (69) ถูกสังเคราะห์จาก FPP ผ่านชุดปฏิกิริยาของเอนไซม์จาก crtE, crtB และ crtI (รูปที่ 4C) (22,70) สารตั้งต้นของ GAP มีความสำคัญไม่เพียงแต่สำหรับวิถี MEP เท่านั้น แต่ยังรวมถึงวิถีไกลโคไลซิสด้วย (22) การแสดงออกที่ลดลงของยีน gapA ซึ่งเข้ารหัสกลีเซอรัลดีไฮด์-3-ฟอสเฟตดีไฮโดรจีเนส (GAPDH) ในวิถีไกลโคไลซิส ได้รับการแสดงให้เห็นว่าช่วยเพิ่มการผลิตไลโคปีนโดยการเพิ่มแหล่งรวม GAP (22) ดังนั้นเราจึงกำหนดเป้าหมาย gapA ด้วยห้าสายพันธุ์ รวมถึงสามสายพันธุ์ sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5 และ sg trcSL1c6) ที่แสดงประสิทธิภาพการปราบปรามที่หลากหลาย sg PC และ sg WT อย่างไรก็ตาม gapA เป็นยีนสำคัญที่ไม่สามารถทำให้ล้มลงได้อย่างสมบูรณ์ (71,72) ความพยายามที่จะระงับ gapA ด้วย CRISPRi แบบเดิมโดยใช้ sg WT ไม่ประสบความสำเร็จแม้ว่าจะมีการรั่วไหลของ dcas9 ต่ำภายใต้โปรโมเตอร์ tet (73) ในทางกลับกัน การปราบปรามการแสดงออกของยีน gapA หลายระดับโดยใช้ระบบ CRISPRi ที่ปรับได้นั้นเกิดขึ้นได้โดยไม่มีข้อบกพร่องในการเติบโต และส่งผลให้เพิ่มขึ้น 2.7- เท่าด้วย sg trcSL1c6 ในการผลิตไลโคปีน เมื่อเทียบกับสายพันธุ์ที่แสดงออกยีน gapA อย่างเต็มที่ หลังจากการเพาะปลูกเป็นเวลา 15 ชั่วโมง (รูปที่ 4D และรูปที่ S9 เพิ่มเติม) มีรายงานว่าเพียง 10% ของการแสดงออกตามธรรมชาติของยีน gapA นำไปสู่กลุ่ม GAP ที่เพิ่มขึ้นโดยไม่มีการเปลี่ยนแปลงที่มีนัยสำคัญในสารเมตาบอไลต์ขั้นปลายในวิถีไกลโคไลซิส เช่น 2-ฟอสโฟกลีเซอเรตและ 3-ฟอสโฟกลีเซอเรต ( 22) โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า CRISPRi ที่ปรับแต่งได้สามารถยับยั้งการแสดงออกของยีนในหลายระดับได้อย่างแม่นยำ โดยไม่ต้องมีวิศวกรรมโครโมโซม
รูปที่ 4 การใช้ระบบ CRISPRi แบบปรับได้สำหรับวิถีการสังเคราะห์ทางชีวภาพของไวโอลาซิน ( A ) วิถีการสังเคราะห์ทางชีวภาพของ Violacein และการสร้างพลาสมิด ยีนห้ายีน (vioA, vioB, vioC, vioD และ vioE) ที่รับผิดชอบในการผลิตไวโอลาซินถูกโคลนเข้าไปใน dCas9- ซึ่งแสดงออกถึงพลาสมิด มีการผลิตผลิตภัณฑ์หลักสี่ชนิด (violacein, proviolacein, deoxyviolacein และ prodeoxyviolacein) sg WT สำหรับ vioC และห้าสายพันธุ์ sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6, sg trcSL1c8 และ sg trcSL1c9) สำหรับ vioD ซึ่งแสดงประสิทธิภาพการปราบปรามที่แตกต่างกัน ถูกโคลนเข้าไปในพลาสมิดอื่น Trp: แอล-ทริปโตเฟน, V: วิโอลาซิน, PV: โพรวิโอลาซิน, PDV: โพรดีออกซีไวโอเลซิน, DV: ดีออกซีวิโอลาซิน, PDVA: กรดโปรโทดีออกซีวิโอลาซินิก, PVA: กรดโปรโตวิโอลาซินิก (B) ความสัมพันธ์ระหว่างการถอดเสียง vioD, mCherry fluorescence และ titer ของ PDV และ PV แกน x บ่งชี้ vioD RNA สัมพัทธ์ที่ได้รับจาก RT-qPCR แกน y ทางด้านซ้ายบ่งบอกถึงการเรืองแสง mCherry สัมพัทธ์จากรูปที่ 3 และแกน y ทางด้านขวาบ่งบอกถึงอัตราส่วนของพื้นที่ HPLC ตัวอย่างที่มีค่า vioD RNA สูงสุดถูกตั้งค่าเป็น 100% สำหรับการทำให้เป็นมาตรฐาน (C) วิถีการสังเคราะห์ทางชีวภาพของไลโคปีนและการสร้างพลาสมิด ยีนสามตัว (crtE, crtB, crtI) ที่รับผิดชอบในการผลิตไลโคปีนถูกโคลนเป็น dCas9-ซึ่งแสดงพลาสมิด gapA ถูกกำหนดเป้าหมายด้วยตัวแปร sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6) และ sg PC ถูกโคลนเข้าไปในพลาสมิดอื่น Glc: กลูโคส, GAP: ไกลเซอรัลดีไฮด์ 3-ฟอสเฟต, 1,3-BPG: 1,3-บิสฟอสโฟกลีเซอเรต, DMAPP: ไดเมทิลอัลลิล ไพโรฟอสเฟต, IPP: ไอโซเพนทีนิล ไพโรฟอสเฟต, FPP: ฟาร์เนซิล ไพโรฟอสเฟต (D) ความสัมพันธ์ระหว่างการถอดเสียง gapA, การเรืองแสงของ mCherry และการผลิตไลโคปีน แกน x บ่งบอกถึงช่องว่างสัมพัทธ์ RNA ที่ได้รับจาก RT-qPCR แกน y ทางด้านซ้ายบ่งบอกถึงการเรืองแสง mCherry สัมพัทธ์จากรูปที่ 3 และแกน y ทางด้านขวาบ่งบอกถึงไทเทอร์ของไลโคปีน (B, D) แถบค่าคลาดเคลื่อนทั้งหมดระบุค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (n=3)
บทสรุป
เราได้ออกแบบระบบ CRISPRi ที่ปรับแต่งได้ซึ่งสามารถควบคุมการแสดงออกของยีนในระดับที่ต้องการได้อย่างแม่นยำ ด้วยการกลายพันธุ์ของ tetraloop และบริเวณขนาบข้าง sgRNA สังเคราะห์ที่กำหนดเป้าหมายลำดับโปรโตสเปเซอร์ต่างๆ สามารถควบคุมยีนได้ในระดับหนึ่ง เราประสบความสำเร็จในการใช้ระบบนี้เพื่อเปลี่ยนเส้นทางฟลักซ์เมตาบอลิซึมที่น่าสนใจในวิถีการสังเคราะห์ทางชีวภาพของไวโอลาซินเพื่อผลิตอนุพันธ์อินโดลในอัตราส่วนที่คาดเดาได้ นอกจากนี้ เราได้แสดงให้เห็นว่าการใช้ CRISPRi แบบปรับได้ทำให้การผลิตไลโคปีนเพิ่มขึ้น 2.7- เท่า โดยเน้นถึงความอเนกประสงค์ของระบบของเราในการปรับปรุงการผลิตสารประกอบที่มีคุณค่าอื่นๆ ระบบนี้จะเร่งกระบวนการปรับให้เหมาะสมของฟลักซ์ก่อนที่จะจัดการข้อมูลทางพันธุกรรมของโฮสต์อย่างถาวร เช่น การแทนที่โปรโมเตอร์หรือลำดับ 5-UTR
cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน
ข้อมูลอ้างอิง
1. Sapranauskas,R., Gasiunas,G., Fremaux,C., Barrangou,R., Horvath,P. และ Siksnys, V. (2011) ระบบ Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas ให้ภูมิคุ้มกันในเชื้อ Escherichia coli กรดนิวคลีอิก Res., 39, 9275–9282
2. Gasiunas,G., Barrangou,R., Horvath,P. และ Siksnys, V. (2012) Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex เป็นสื่อกลางในการแตกแยก DNA ที่จำเพาะสำหรับภูมิคุ้มกันแบบปรับตัวในแบคทีเรีย โปรค Natl. อคาด. วิทยาศาสตร์ สหรัฐอเมริกา 109 E2579–E2586
3. Cong, L., Ran,FA, Cox, D., Lin,S., Barretto, R., Habib,N., Hsu, PD, Wu,X., Jiang, W., Marraffini, LA และคณะ . (2013) วิศวกรรมจีโนมมัลติเพล็กซ์โดยใช้ระบบ CRISPR/Cas วิทยาศาสตร์, 339, 819–823.
4. Ran, FA, Hsu, PD, Wright, J., Agarwala, V., Scott, DA และ Zhang, F. (2013) วิศวกรรมจีโนมโดยใช้ระบบ CRISPR-Cas9 แนท. โพรทอก., 8, 2281–2308.
5. Jinek,M., Chylinski,K., Fonfara,I., Hauer,M., Doudna,JA และ Charpentier,E. (2012) DNA endonuclease แบบ dual-RNA ที่สามารถตั้งโปรแกรมได้ในภูมิคุ้มกันของแบคทีเรียที่ปรับตัวได้ วิทยาศาสตร์, 337, 816–821.
6. Anders,C., Niewoehner,O., Duerst,A. และ Jinek, M. (2014) พื้นฐานโครงสร้างของการรับรู้ DNA เป้าหมายที่ขึ้นกับ PAM โดย Cas9 endonuclease ธรรมชาติ, 513, 569–573.
7. Qi, LS, Larson, MH, Gilbert, LA, Doudna, JA, Weissman, JS, Arkin, AP และ Lim, WA (2013) การนำ CRISPR มาใช้ใหม่เป็นแพลตฟอร์มนำทาง RNA สำหรับการควบคุมการแสดงออกของยีนเฉพาะลำดับ เซลล์ 152, 1173–1183
8. Larson, MH, Gilbert, LA, Wang, X., Lim, WA, Weissman, JS และ Qi, LS (2013) การรบกวน CRISPR (CRISPRi) สำหรับการควบคุมการแสดงออกของยีนเฉพาะลำดับ แนท. โปรโตคอล, 8, 2180–2196.
9. McGlincy,NJ, Meacham,ZA, Reynaud,KK, Muller,R., Baum,R. และ Ingolia, NT (2021) ห้องสมุดแนะนำการแทรกแซง CRISPR ระดับจีโนมช่วยให้สามารถจัดทำโปรไฟล์ฟีโนไทป์ในยีสต์ได้อย่างครอบคลุม บีเอ็มซี จีโนมิกส์, 22, 205.
10. ยุน เจ. และ Woo, HM (2018) วิศวกรรมเมแทบอลิซึมที่ใช้สื่อกลางโดย CRISPR ของ Corynebacterium glutamicum สำหรับการผลิตโฮโม-บิวเทรต เทคโนโลยีชีวภาพ ไบโออิง, 115, 2067–2074.
11. Cleto,S., Jensen,JV, Wendisch,VF และ Lu,TK (2016) Corynebacterium glutamicum วิศวกรรมการเผาผลาญพร้อมสัญญาณรบกวน CRISPR (CRISPRi) เอซีเอส ซินธ์. ไบโอล., 5, 375–385.
12. จาง,GQ, Ren,XN, เหลียง,XH, วัง,YQ, ฮ,DX, จาง,YJ, ซีอาน,M. และ Zou,HB (2021) การปรับปรุงการผลิตกรดอะมิโนของจุลินทรีย์: จากแนวทางทั่วไปไปจนถึงแนวโน้มล่าสุด เทคโนโลยีชีวภาพ ไบโอโพรค อ. 26, 708–727.
13 Kim, SK, Seong, W. , Han, GH, Lee, DH และ Lee, SG (2017) การปราบปรามมัลติเพล็กซ์แบบ CRISPR ที่ได้รับการแนะนำโดยการแทรกแซงของยีนทางเดินที่แข่งขันกันภายนอกสำหรับการเปลี่ยนเส้นทางการเผาผลาญฟลักซ์ใน Escherichia coli ไมโครบ. ข้อเท็จจริงของเซลล์, 16, 188.
14. เอลลิส,นา,คิม,บี.,ตุง,เจ. และ Machner, MP (2021) เครื่องมือรบกวน CRISPR แบบมัลติเพล็กซ์สำหรับการซักถามยีนที่มีความรุนแรงใน Legionella pneumophila ชุมชน ไบโอล., 4, 157.
15. Siu,KH และ Chen,W. (2019) gRNA แบบมีการควบคุมนิ้วเท้าแบบ Ribo สำหรับฟังก์ชัน CRISPR-Cas9 ที่ตั้งโปรแกรมได้ แนท. เคมี. ไบโอล., 15, 217–220.
16 Reis,AC, Halper,SM, Vezeau,GE, Cetnar,DP, Hossain,A., Clauer,PR และ Salis,HM (2019) การปราบปรามยีนแบคทีเรียหลายตัวพร้อมกันโดยใช้อาร์เรย์ sgRNA ที่ยาวพิเศษแบบไม่ซ้ำซ้อน แนท. เทคโนโลยีชีวภาพ, 37, 1294–1301.
17. เทียน ต. คัง เจดับบลิว คัง อ. และ Lee, TS (2019) การเปลี่ยนเส้นทางการเผาผลาญฟลักซ์ผ่านการปราบปรามแบบอาศัยสื่อกลาง CRISPRi แบบมัลติเพล็กซ์แบบผสมผสานสำหรับการผลิตไอโซเพนทีนอลใน Escherichia coli เอซีเอส ซินธ์. ไบโอล., 8, 391–402.
18. กอตตัม,อาร์., ไซโบลด์, จีเอ็ม, มุลเลอร์, พี., ไวล์, ที., ไวสส์, ที., แฮดริก, อาร์. และ Eikmanns, BJ (2019) ระบบรบกวน CRISPR ที่เหนี่ยวนำคู่อย่างง่ายสำหรับการกำหนดเป้าหมายยีนหลายตัวใน Corynebacterium glutamicum พลาสมิด, 103, 25–35
19. เหยา, แอล., เซนกิก, ไอ., แอนเฟลท์, เจ. และ Hudson, EP (2016) การปราบปรามของยีนหลายตัวในไซยาโนแบคทีเรียโดยใช้ CRISPRi เอซีเอส ซินธ์. ไบโอล., 5, 207–212.
20. ลิม,HG,โนห์,MH,จอง,JH,ปาร์ค,เอส. และ Jung,GY (2016) การปรับสมดุลที่เหมาะสมของ 3-วิถีการผลิตกรดไฮดรอกซีโพรพิโอนิกจากกลีเซอรอลใน Escherichia coli เอซีเอส ซินธ์. ไบโอล., 5, 1247–1255.
21. Yang,Y., Lin,Y., Li,L., Linhardt,RJ และ Yan,Y. (2015) ควบคุมการเผาผลาญ malonyl-CoA ผ่าน RNA แอนติเจนสังเคราะห์เพื่อการสังเคราะห์ทางชีวภาพของผลิตภัณฑ์ธรรมชาติที่ดีขึ้น เมตาบ. อังกฤษ, 29, 217–226.
22. Jung,J., Lim,JH, Kim,SY, Im,DK, Seok,JY, Lee,SV, Oh,MK และ Jung,GY (2016) การปรับสมดุลของสารตั้งต้นที่แม่นยำสำหรับการผลิตไอโซพรีนอยด์โดยการควบคุมการแสดงออกของ gapA ใน เอสเชอริเคีย โคไล. เมตาบ. อังกฤษ, 38, 401–408.
23. Li,XT, Jun,Y., Erickstad,MJ, Brown,SD, Parks,A., Court,DL และ Jun,S. (2016) tCRISPRi: การควบคุมการแสดงออกของยีนในขั้นตอนเดียวที่ปรับได้และย้อนกลับได้ วิทยาศาสตร์ ตัวแทน 6, 39076.
24. Fontana,J., Dong,C., Ham,JY, Zalatan,JG และ Carothers,JM (2018) การแสดงออกที่ได้รับการควบคุมของ sgRNAs ปรับ CRISPRi ใน E. coli เทคโนโลยีชีวภาพ เจ., 13, e1800069.
25. Kim, NM, Sinnott, RW และ Sandoval, NR (2020) ไบโอเซนเซอร์แบบอิงปัจจัยการถอดรหัสและระบบที่เหนี่ยวนำไม่ได้ในแบคทีเรียที่ไม่ใช่แบบจำลอง: ความคืบหน้าในปัจจุบันและทิศทางในอนาคต สกุลเงิน ความคิดเห็น. เทคโนโลยีชีวภาพ, 64, 39–46.
26. คุนเดอร์ต,เค., ลูคัส, JE, วัตเตอร์ส, KE, เฟลมันน์, ซี., อึ้ง, AH, ไฮเนเก้น, BM, ฟิตซ์ซิมมอนส์, CM, โอ๊คส์, BL, คู, เจ, ปราซาด, เอ็น. และคณะ (2019) การควบคุม CRISPR-Cas9 ด้วย sgRNAs ที่กระตุ้นลิแกนด์และ sgRNA ที่ปิดใช้งานลิแกนด์ แนท. คมนาคม 10, 2127.
27. เฟอร์ไรรา,ร., สเครคัส,ซี., เฮดิน,เอ., ซานเชซ,บีเจ, ซิเวอร์ส,วี., นีลเซ่น,เจ. และเดวิด เอฟ. (2019) การปรับแต่งอย่างละเอียดโดยใช้แบบจำลองช่วยของการเผาผลาญคาร์บอนส่วนกลางในยีสต์ผ่านการควบคุมตาม dCas{4}} เอซีเอส ซินธ์. ไบโอล., 8, 2457–2463.
28. Su,T., Guo,Q., Zheng,Y., Liang,Q., Wang,Q. และ Qi,Q. (2019) การปรับแต่ง hemB อย่างละเอียดโดยใช้ CRISPRi เพื่อเพิ่ม 5-การผลิตกรดอะมิโนเลวูลินิกใน Escherichia coli ด้านหน้า. ไมโครไบโอล., 10, 1731.
29. เจิ้ง,T., Hou,Y., Zhang,P., Zhang,Z., Xu,Y., Zhang,L., Niu,L., Yang,Y., Liang,D., Yi,F . และคณะ (2017) การทำโปรไฟล์ความจำเพาะของ RNA แนวทางเดียวเผยให้เห็นลำดับแกนกลางที่มีความละเอียดอ่อนที่ไม่ตรงกัน วิทยาศาสตร์ ตัวแทน 7, 40638.
30. เจียง ว. ว. บิการ์ด ดี. ค็อกซ์ ดี. จาง เอฟ. และ Marraffini, LA (2013) การแก้ไขจีโนมของแบคทีเรียโดยใช้ RNA โดยใช้ระบบ CRISPR-Cas แนท. เทคโนโลยีชีวภาพ.,
31, 233–239. 31. ฟาน เกสเตล,เจ., ฮอว์กินส์,JS, โทดอร์,เอช. และ Gross, CA (2021) ไปป์ไลน์การคำนวณสำหรับการออกแบบ RNA ที่แนะนำสำหรับ CRISPRi ที่ไม่ตรงกัน สตาร์โพรต็อก, 2, 100521.
32. ฮอว์กินส์,JS, ซิลวิส,MR, Koo,BM, Peters,JM, Osadnik,H., Jost,M., Hearne,CC, Weissman,JS, Todor,H. และ Gross, CA (2020) Mismatch-CRISPRi เผยให้เห็นความสัมพันธ์ระหว่างการแสดงออกและการออกกำลังกายที่แปรผันร่วมกันของยีนที่จำเป็นใน Escherichia coli และ Bacillus subtilis ระบบเซลล์, 11, 523–535
33. Fortin,J.-P., Tan,J., Gascoigne,KE, Haverty,PM, Forrest,WF, Costa,MR และ Martin,SE (2019) การกำหนดเป้าหมายหลายยีนและความอดทนที่ไม่ตรงกันอาจทำให้การวิเคราะห์จีโนมสับสน หน้าจอ CRISPR แบบรวมกลุ่มกว้าง จีโนมไบโอล, 20, 21.
34. โรเซน ส. และ Skaletsky, H. (2000) Primer3 บน WWW สำหรับผู้ใช้ทั่วไปและสำหรับโปรแกรมเมอร์นักชีววิทยา วิธีการ ตล. ไบโอล., 132, 365–386.
35. Zhou,K., Zhou,L., Lim,Q., Zou,R., Stephanopoulos,G. และ Too, HP (2011) ยีนอ้างอิงนวนิยายสำหรับการวัดปริมาณการตอบสนองของการถอดรหัสของ Escherichia coli ต่อการแสดงออกของโปรตีนมากเกินไปโดย PCR เชิงปริมาณ บีเอ็มซี โมล ไบโอล., 12, 18.
36. Livak, KJ และ Schmittgen, TD (2001) การวิเคราะห์ข้อมูลการแสดงออกของยีนสัมพัทธ์โดยใช้ PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์และวิธี 2(-Delta Delta C(T)) วิธีการ, 25, 402–408.
37. แอนดรูว์ เอส. (2010) FastQC: เครื่องมือควบคุมคุณภาพสำหรับข้อมูลลำดับปริมาณงานสูง v0.11.9 เอ็ด
38. แลงมีด บี., แทรปเนลล์, ซี., ป๊อป, เอ็ม. และ Salzberg, SL (2009) การจัดลำดับลำดับดีเอ็นเอสั้น ๆ อย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพในการจดจำกับจีโนมมนุษย์ จีโนมไบโอล., 10, R25.
39. Danecek,P., Bonfield,JK, Liddle,J., Marshall,J., Ohan,V., Pollard,MO, Whitwham,A., Keane,T., McCarthy,SA, Davies,RM และคณะ (2021) 12 ปีของ SAMtools และ BCFtools Gigascience, 10, giab008.
40. แทรปเนลล์,ซี., วิลเลียมส์,บริติชแอร์เวย์, เพอร์ที,จี., มอร์ตาซาวี,เอ., ควาน,จี., ฟาน บาเรน,เอ็มเจ, ซัลซ์เบิร์ก,เอสแอล, โวลด์,บีเจ และแพชเตอร์,แอล. (2010) การประกอบการถอดเสียงและการหาปริมาณโดย RNA-Seq เผยให้เห็นการถอดเสียงที่ไม่ได้ใส่คำอธิบายประกอบและการสลับไอโซฟอร์มระหว่างการแยกเซลล์ แนท. เทคโนโลยีชีวภาพ, 28, 511–515.
41. แทรปเนลล์,ซี., เฮนดริกสัน, ดีจี, โซโววาโก, เอ็ม., กอฟฟ์, แอล., รินน์, เจแอล และ แพชเตอร์, แอล. (2013) การวิเคราะห์ความแตกต่างของการควบคุมยีนที่ความละเอียดของการถอดเสียงด้วย RNA-seq แนท. เทคโนโลยีชีวภาพ, 31, 46–53.
42 Lee, ME, Aswani, A., Han, AS, Tomlin, CJ และ Dueber, JE (2013) การเพิ่มประสิทธิภาพระดับการแสดงออกของทางเดินหลายเอนไซม์ในกรณีที่ไม่มีการทดสอบปริมาณงานสูง กรดนิวคลีอิก Res., 41, 10668–10678
43. Hsu,PD, Scott,DA, Weinstein,JA, Ran,FA, Konermann,S., Agarwala,V., Li,Y., Fine,EJ, Wu,X., Shalem,O. และคณะ (2013) DNA กำหนดเป้าหมายความจำเพาะของนิวคลีเอส Cas9 ที่ได้รับคำแนะนำจาก RNA แนท. เทคโนโลยีชีวภาพ, 31, 827–832.
44. Nishimasu,H., Ran,F., Hsu,P., Konermann,S., Shehata,S., Dohmae,N., Ishitani,R., Zhang,F. และนูเรกิ โอ. (2014) โครงสร้างผลึกของ Cas9 ที่ซับซ้อนด้วย Guide RNA และ DNA เป้าหมาย เซลล์, 156, 935–949.
45. Fu,Y., Rocha,PP, Luo,VM, Raviram,R., Deng,Y., Mazzoni,EO และ Skok,JA (2016) โครงสร้าง CRISPR-dCas9 และ sgRNA ช่วยให้สามารถถ่ายภาพลำดับดาวเทียมแบบสดสองสีได้ และตำแหน่งส่วนบุคคลที่ได้รับการเสริมประสิทธิภาพซ้ำแล้วซ้ำเล่า แนท. ชุมชน, 7, 11707.
46. Khosravi,S., Schindele,P., Gladilin,E., Dunemann,F., Rutten,T., Puchta,H. และฮูเบน เอ. (2020) การใช้ Aptamers ปรับปรุงการถ่ายภาพสดของ Telomeres ของพืชโดยใช้ CRISPR ด้านหน้า. วิทยาพืช, 11, 1254.
47. Nielsen, AA และ Voigt, CA (2014) วงจรพันธุกรรม CRISPR/Cas หลายอินพุตที่เชื่อมต่อเครือข่ายกำกับดูแลโฮสต์ โมล ระบบ ไบโอล., 10, 763.
48 Lee, YJ, Hoynes-O'Connor, A., Leong, MC และ Moon, TS (2016) การควบคุมการแสดงออกของยีนของแบคทีเรียที่ตั้งโปรแกรมได้ด้วย 44, 2462–2473
49. Vigouroux,A., Oldewurtel,E., Cui,L., Bikard,D. และฟาน ตีฟเฟเลน,เอส. (2018) การปรับความสามารถของ dCas9 ในการบล็อกการถอดรหัสช่วยให้ยีนแบคทีเรียล้มลงได้อย่างแข็งแกร่งและไร้เสียงรบกวน โมล ระบบ ไบโอล., 14, e7899.
50. Zhang,Y., Shang,X., Lai,S., Zhang,G., Liang,Y. และเหวินต. (2012) การพัฒนาและการประยุกต์ใช้ระบบการแสดงออกแบบอะราบิโนสที่เหนี่ยวนำโดยอำนวยความสะดวกในการดูดซึมตัวเหนี่ยวนำใน Corynebacterium glutamicum ใบสมัคร สภาพแวดล้อม ไมโครไบโอล., 78, 5831–5838.
51. Thompson,MG, Sedaghatian,N., Barajas,JF, Wehrs,M., Bailey,CB, Kaplan,N., Hillson,NJ, Mukhopadhyay,A. และ Keasling, JD (2018) การแยกและจำแนกลักษณะของการกลายพันธุ์ใหม่ในต้นกำเนิด pSC101 ที่เพิ่มจำนวนสำเนา ตัวแทนวิทยาศาสตร์แห่งสหราชอาณาจักร, 8, 1590 52. Fricke, PM, Link, T., Gatgens, J., Sonntag, C., Otto, M., Bott, M. และโพเลน, ที. (2020) พลาสมิดการแสดงออกที่กระตุ้นด้วย L-arabinose ที่ปรับได้สำหรับแบคทีเรียกรดอะซิติก Gluconobacter oxydans ใบสมัคร ไมโครไบโอล เทคโนโลยีชีวภาพ, 104, 9267–9282.
53. Nguyen,TT, Nguyen,NH, Kim,Y., Kim,JR และ Park,S. (2021) การแสดงคุณลักษณะภายในร่างกายของระบบโปรโมเตอร์ที่เหนี่ยวนำไม่ได้ของ 3-ไฮดรอกซีโพรพิโอนิก ดีไฮโดรจีเนสใน Pseudomonas denitrificans เทคโนโลยีชีวภาพ Bioproc E, 26, 612–620
54. แม็กคาร์ตี้,NS, เกรแฮม,AE, สตูเดน่า,แอล. และเลเดสมา-อามาโร, อาร์. (2020) เทคโนโลยี Multiplexed CRISPR สำหรับการแก้ไขยีนและการควบคุมการถอดเสียง แนท. คมนาคม 11, 1281.
55. หยาน คิว. และ Fong, SS (2017) การศึกษาผลกระทบจากการถอดเสียงและเสียงในหลอดทดลองโดยใช้โปรโมเตอร์ที่เป็นส่วนประกอบรวมกับลำดับองค์ประกอบ UP ใน Escherichia coli เจ. ไบโอล. อังกฤษ, 11, 33.
56. Seo,SW, Yang,JS, Kim,I., Yang,J., Min,BE, Kim,S. และ Jung,GY (2013) การออกแบบเชิงทำนายของขอบเขตการเริ่มต้นการแปล mRNA เพื่อควบคุมประสิทธิภาพการแปลโปรคาริโอต เมตาบ. อังกฤษ, 15, 67–74. 57. Kappel,K., Jarmoskaite,I., Vaidyanathan,PP, Greenleaf,WJ, Herschlag,D. และดาส อาร์. (2019) การทดสอบแบบตาบอดของการทำนายความสัมพันธ์ที่มีผลผูกพันกับโปรตีน RNA โปรค Natl. อคาด. วิทยาศาสตร์ สหรัฐอเมริกา 116 8336–8341
58. ซูเกอร์,เอ็ม. (2003) เว็บเซิร์ฟเวอร์ Mfold สำหรับการพับกรดนิวคลีอิกและการทำนายการผสมพันธุ์ กรดนิวคลีอิก Res., 31, 3406–3415
59. Xiong,B., Zhu,Y., Tian,D., Jiang,S., Fan,X., Ma,Q., Wu,H. และ Xie, X (2021) การกระจายฟลักซ์ของการเผาผลาญคาร์บอนส่วนกลางเพื่อการผลิตแอล-ทริปโตเฟนอย่างมีประสิทธิภาพใน Escherichia coli เทคโนโลยีชีวภาพ ไบโออิง, 118, 1393–1404.
60. ยาว,R.,Li,J.,Feng,L.,Zhang,X. และ Hu, H. (2019) (13) วิศวกรรมเมตาบอลิซึมที่แนะนำโดยการวิเคราะห์ฟลักซ์เมตาบอลิซึมของ Escherichia coli เพื่อปรับปรุงการผลิตอะซิทอลจากกลีเซอรอล เทคโนโลยีชีวภาพ เชื้อเพลิงชีวภาพ, 12, 29.
61. ดูรัน, น. และ Menck, CF (2001) Chromobacterium violaceum: การทบทวนมุมมองทางเภสัชวิทยาและอุตสาหกรรม คริติคอล รายได้ ไมโครไบโอล, 27, 201–222.
62. Balibar, CJ และ Walsh, CT (2006) การสังเคราะห์ทางชีวภาพในหลอดทดลองของ violacein จาก L-tryptophan โดยเอนไซม์ VioA-E จาก Chromobacterium violaceum ชีวเคมี, 45, 15444–15457.
63 Gwon, DA, Seok, JY, Jung, GY และ Lee, JW (2021) วิวัฒนาการในห้องปฏิบัติการแบบปรับตัวที่ได้รับความช่วยเหลือจากไบโอเซนเซอร์สำหรับการผลิตไวโอเลซิน นานาชาติ เจ. โมล. วิทย์, 22, 6594.
64. ซานเชซ,ซี., บรานา,เอเอฟ, เมนเดส,ซี. และ Salas, JA (2006) การประเมินใหม่ของวิถีการสังเคราะห์ทางชีวภาพของไวโอลาซินและความสัมพันธ์กับการสังเคราะห์ทางชีวภาพของอินโดโลคาร์บาโซล เคมี. ไบโอ เคม., 7, 1231–1240.
65. Jones,JA, Vernacchio,VR, Lachance,DM, Lebovich,M., Fu,L., Shirke,AN, Schultz,VL, Cress,B., Linhardt,RJ และ Koffas,MA (2015) ePathOptimize: a วิธีการผสมผสานสำหรับการปรับสมดุลการถอดเสียงของวิถีเมแทบอลิซึม วิทยาศาสตร์ ตัวแทน 5, 11301.
66. Zhang,Y., Chen,H., Zhang,Y., Yin,H., Zhou,C. และวังวาย (2021) วิศวกรรม RBS โดยตรงของกลุ่มยีนสังเคราะห์ทางชีวภาพเพื่อประสิทธิภาพการผลิตไวโอลาซินใน E. coli ไมโครบ. ข้อเท็จจริงของเซลล์, 20, 38.
67 Hunter, WN (2007) วิถีทางที่ไม่ใช่ mevalonate ของการสังเคราะห์สารตั้งต้นของ isoprenoid เจ. ไบโอล. เคมี, 282, 21573–21577.
68. โรห์เมอร์, เอ็ม. (1999) การค้นพบวิถีทางที่ไม่ขึ้นกับ mevalonate สำหรับการสังเคราะห์ไอโซพรีนอยด์ในแบคทีเรีย สาหร่าย และพืชชั้นสูง แนท. แยง. ตัวแทน, 16, 565–574.
69. มุลเลอร์,แอล., คาริส-เวย์รัต,ซี., โลว์,จี. และโบห์ม,วี. (2016) ไลโคปีนและบทบาทของสารต้านอนุมูลอิสระในการป้องกันโรคหัวใจและหลอดเลือด––การทบทวนที่สำคัญ คริติคอล อาจารย์ วิทย์อาหาร. นูตร, 56, 1868–1879.
70. มิอุระ,ย.,คอนโด,เค.,ไซโตะ,ต.,ชิมาดะ,เอช., เฟรเซอร์,PD และมิซาวะ,เอ็น. (2541) การผลิตแคโรทีนอยด์ไลโคปีน เบต้าแคโรทีน และแอสตาแซนธินในยีสต์อาหาร Candida utilis ใบสมัคร สภาพแวดล้อม ไมโครไบโอล, 64, 1226–1229.
71. Goodall,ECA, Robinson,A., Johnston,IG, Jabbari,S., Turner,KA, Cunningham,AF, Lund,PA, Cole,JA และ Henderson,IR (2018) จีโนมที่สำคัญของ Escherichia coli K{ {2}} เอ็มบิโอ, 9, อี02096-17
72. บาบา,ต., อาระ,ต., ฮาเซกาวะ,ม., ทาคาอิ,ย., โอคุมุระ,ย., บาบา,ม., ดัทเซนโก,KA, โทมิตะ,ม., วันเนอร์,BL และโมริ,เอช. (2006) การสร้าง Escherichia coli K-12 สายพันธุ์กลายพันธุ์ที่น่าพิศวงด้วยยีนเดี่ยวในเฟรม: คอลเลกชัน Keio โมล ระบบ ไบโอล., 2, 2006.0008.
73. เบอร์แทรม ร. และฮิลเลน ดับเบิลยู. (2551) การใช้เครื่องอัดอากาศแบบเทตในการควบคุมและการแสดงออกของยีนโปรคาริโอต ไมโครบ. เทคโนโลยีชีวภาพ, 1, 2–16.
