ศักยภาพด้านเวชสำอางของสารสกัดที่ได้จากกากอุตสาหกรรมประมง: ของเสียจากปลาซาร์ดีนและโครงปลาคอด ตอนที่ 1

เชิงนามธรรม: อุตสาหกรรมประมงสร้างของเสียจำนวนมาก (20–75 เปอร์เซ็นต์ (w/w) ของน้ำหนักปลาที่จับได้ทั้งหมด) การฟื้นตัวของสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพจากสิ่งตกค้างและการรวมตัวกันในเครื่องสำอางแสดงถึงโอกาสทางการตลาดที่สดใสและอาจนำไปสู่การเพิ่มมูลค่าอย่างยั่งยืนของภาคส่วนนี้ ในงานวิจัยนี้ สารสกัดที่อุดมด้วยโปรตีนที่ได้จากเทคโนโลยีความดันสูง (CO2 ที่วิกฤตยิ่งยวดและน้ำใต้วิกฤต) จากของเสียจากปลาซาร์ดีน (Sardina pilchardus) และปลาคอด (Gadus morhua) มีลักษณะเฉพาะเกี่ยวกับศักยภาพด้านเวชสำอาง กิจกรรมของสารต้านอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ และต้านแบคทีเรียได้รับการประเมินผ่านสารเคมี (การทดสอบ ORAC) เอนไซม์ (การยับยั้งอีลาสเทสและไทโรซิเนส) ความไวต่อยาต้านจุลชีพ (Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus และ Cutibacterium acnes) และการทดสอบตามเซลล์ (ใน keratinocytes-HaCaT) . สารสกัดจากปลาซาร์ดีนแสดงฤทธิ์ต้านแบคทีเรียสูงสุด และส่วนที่ได้รับโดยใช้อุณหภูมิการสกัดที่สูงขึ้น (250 ◦C) และไม่มีขั้นตอนการแยกไขมัน แสดงให้เห็นถึงค่าความเข้มข้นต่ำสุดในการยับยั้ง (MIC) ต่ำสุด (1.17; 4.6; {{24} }.59 มก./มล. สำหรับเชื้อ K. pneumoniae, S. aureus และ C. acnes ตามลำดับ) ตัวอย่างปลาคอดที่สกัดที่อุณหภูมิต่ำกว่า (90 ◦C) เป็นสารต้านการอักเสบที่มีประสิทธิภาพสูงสุด (ความเข้มข้น 0.75 มก./มล. ลดระดับ IL-8 และ IL-6 ลง 58 เปอร์เซ็นต์และ 47 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ เทียบกับกลุ่มควบคุมเชิงบวก) ธรีโอนีน วาลีน ลิวซีน อาร์จินีน และปริมาณโปรตีนทั้งหมดในสารสกัดถูกเน้นว่ามีความสัมพันธ์สูงกับฤทธิ์ทางชีวภาพที่รายงาน (R2 มากกว่าหรือเท่ากับ 0.7) ผลลัพธ์เหล่านี้สนับสนุนการประยุกต์ใช้สารสกัดจากของเสียจากอุตสาหกรรมประมงในผลิตภัณฑ์เวชสำอางที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพ

Glycoside ของ cistanche ยังสามารถเพิ่มกิจกรรมของ SOD ในเนื้อเยื่อหัวใจและตับ และลดปริมาณของ lipofuscin และ MDA ในแต่ละเนื้อเยื่อได้อย่างมีประสิทธิภาพ กำจัดอนุมูลออกซิเจนที่ทำปฏิกิริยาต่างๆ (OH-, H₂O₂ ฯลฯ) ได้อย่างมีประสิทธิภาพ และป้องกันความเสียหายของ DNA ที่เกิดขึ้น โดย OH-อนุมูล Cistanche phenylethanoid glycosides มีความสามารถในการกำจัดอนุมูลอิสระที่แข็งแกร่ง ความสามารถในการลดที่สูงกว่าวิตามินซี ปรับปรุงกิจกรรมของ SOD ในการระงับสเปิร์ม ลดปริมาณของ MDA และมีผลป้องกันบางอย่างต่อการทำงานของเยื่อหุ้มสเปิร์ม โพลีแซคคาไรด์ของ Cistanche สามารถเสริมการทำงานของ SOD และ GSH-Px ในเม็ดเลือดแดงและเนื้อเยื่อปอดของหนูทดลองที่ชราภาพซึ่งเกิดจาก D-galactose รวมทั้งลดปริมาณ MDA และคอลลาเจนในปอดและพลาสมา และเพิ่มเนื้อหาของอีลาสติน ส่งผลดีต่อ DPPH, ยืดเวลาการขาดออกซิเจนในหนูชรา, ปรับปรุงกิจกรรมของ SOD ในซีรั่ม, และชะลอการเสื่อมทางสรีรวิทยาของปอดในหนูชราทดลองที่มีความเสื่อมทางสัณฐานวิทยาของเซลล์, การทดลองแสดงให้เห็นว่า Cistanche มีความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระที่ดี และมีศักยภาพในการเป็นยาป้องกันและรักษาโรคชราทางผิวหนัง ในขณะเดียวกัน echinacoside ใน Cistanche มีความสามารถที่สำคัญในการกำจัดอนุมูลอิสระ DPPH และมีความสามารถในการกำจัดชนิดของออกซิเจนที่ทำปฏิกิริยาและป้องกันการเสื่อมสลายของคอลลาเจนที่เกิดจากอนุมูลอิสระ และยังมีผลการซ่อมแซมที่ดีต่อความเสียหายของแอนไอออนจากอนุมูลอิสระของไทมีน

คลิกที่อาหารเสริม Cistanche Tubulosa

【สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

คำหลัก: การประเมินคุณค่าของปลาในลำธาร; ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ ฤทธิ์ต้านการอักเสบ ฤทธิ์ต้านจุลชีพ ต่อต้านริ้วรอย; ต่อต้านรอยดำ; เวชสำอาง

1. บทนำ

ด้วยการค้นหานวัตกรรมอย่างต่อเนื่อง โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับส่วนผสมที่ออกฤทธิ์ อุตสาหกรรมเครื่องสำอางกำลังเติบโตและได้แสดงให้เห็นถึงความตั้งใจที่จะเปลี่ยนส่วนประกอบที่ได้จากปิโตรเลียมและก้าวไปสู่สารประกอบธรรมชาติ [1] คุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระของส่วนผสมที่ออกฤทธิ์ตามธรรมชาติสามารถช่วยป้องกันปัญหาผิวหลายอย่างที่เกิดจากความเครียดจากอนุมูลอิสระและความชรา [2,3] ความชราของผิวหนังสามารถเกิดขึ้นได้จากทั้งปัจจัยภายใน (เช่น การอักเสบหรือเทโลเมียร์สั้นลง) และปัจจัยภายนอก (สิ่งแวดล้อม) [4] ความชราของผิวหนังนำไปสู่การสูญเสียคอลลาเจนที่โตเต็มที่และการเปลี่ยนแปลงที่เมทริกซ์นอกเซลล์ (ECM) ซึ่งทำให้การทำงานของเกราะป้องกันลดลง ส่งผลให้มีลักษณะแห้งและไวต่อการรุกรานจากภายนอก เพิ่มความเสี่ยงต่อความผิดปกติของผิวหนัง [5] กระบวนการนี้สามารถเร่งได้โดยเอนไซม์หลายชนิด เช่น อีลาสเตส เมทริกซ์เมทัลโลโปรตีนเนส (MMPs) และไฮยาลูโรนิเดสที่สามารถกระตุ้นการย่อยสลาย ECM [6] หรือแม้กระทั่งโดยการสะสมของ cessive reactive oxygen species (ROS) ที่อาจส่งผลต่อการทำงานของเซลล์ปกติ [7]. ปัจจัยด้านสิ่งแวดล้อม เช่น การได้รับรังสียูวี นำไปสู่การสร้าง ROS ในปริมาณสูง ซึ่งกระตุ้นให้เกิดการตอบสนองของโมเลกุลและเซลล์แบบเดียวกับการแก่ชราที่แท้จริง แต่มีผลเพิ่มขึ้น ที่สำคัญ ROS สามารถเร่งการทำงานของเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการแก่ของผิวหรือกระบวนการสร้างเม็ดสีผิว [8,9] และทำให้การมีอยู่ของสารต้านอนุมูลอิสระ n มีบทบาทสำคัญในด้านเครื่องสำอาง

ในปี พ.ศ. 2561 การบริโภคปลาทั่วโลกประเมินโดย FAO ว่าอยู่ที่ 20.5 กิโลกรัมต่อพิตา [10] ซึ่งนำไปสู่ผลพลอยได้ในปริมาณมาก ซึ่งส่วนใหญ่เป็นผิวหนังและกระดูก ของเสียที่เกิดขึ้นคิดเป็นร้อยละ 20–75 (w/w) ของน้ำหนักปลาที่จับได้ทั้งหมด ซึ่งอาจนำไปสู่ปัญหาสิ่งแวดล้อม [11,12] อย่างไรก็ตาม สารตกค้างเหล่านี้ยังคงมีไขมัน โปรตีน และแร่ธาตุอยู่เป็นจำนวนมาก และควรได้รับปริมาณที่เหมาะสม ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา สารสกัดจากของเสียที่เกิดจากอุตสาหกรรมปลาได้แสดงคุณสมบัติที่ออกฤทธิ์ เช่น ลดความดันโลหิต ต้านอนุมูลอิสระ ต้านจุลชีพ ป้องกันระบบประสาท ลดน้ำตาลในเลือด ชะลอวัย และต้านการอักเสบ [13–19] ปลาคอดแอตแลนติก ( Gadus rhea ) และปลาซาร์ดีน ( Sardina pilchardus ) เป็นปลาที่มีการบริโภคมากที่สุดในโปรตุเกส และส่วนที่ได้มาจากสิ่งตกค้างนั้นแสดงให้เห็นถึงศักยภาพทางโภชนาการที่มีแนวโน้ม เช่น สารต้านอนุมูลอิสระ กิจกรรมต้านการเพิ่มจำนวน หรือต้านการอักเสบ [11,20–22] อย่างไรก็ตาม เนื่องจากการใช้ประโยชน์และการเพิ่มมูลค่าของเสียจากอุตสาหกรรมปลายังอยู่ในช่วงเริ่มต้น จึงมีพื้นที่มากมายในการสำรวจโอกาสสำหรับอุตสาหกรรมในการแปลงของเสียนี้ให้เป็นผลิตภัณฑ์ชีวภาพที่มีมูลค่าสูงในตลาด รวมถึงส่วนผสมของเครื่องสำอาง

ในงานก่อนหน้านี้ เราได้สำรวจการใช้เทคโนโลยีแรงดันสูง (CO2 ที่วิกฤตยิ่งยวดและน้ำใต้วิกฤต) เพื่อแยกเศษส่วนที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพออกจากของเสียจากปลาซาร์ดีนและโครงปลาคอดที่มีประโยชน์ต่อสุขภาพ [11,22] สำหรับของเสียจากปลาซาร์ดีน เราแสดงให้เห็นว่าโดยการใช้ขั้นตอนแรกกับคาร์บอนวิกฤตยิ่งยวด (ScCO2) (เพื่อกำจัดเศษไขมัน) ตามด้วยกระบวนการสกัดด้วยน้ำใต้วิกฤต (SW) เป็นไปได้ที่จะได้รับโปรตีนไฮโดรไลเสตที่มีศักยภาพในการต้านอนุมูลอิสระสูงและมีฤทธิ์ต้านการเพิ่มจำนวนใน เซลล์มะเร็งลำไส้ใหญ่ [22] นอกจากนี้เรายังใช้การสกัดน้ำ/การไฮโดรไลซิสในระดับวิกฤตเพื่อให้ได้โปรตีน เปปไทด์ และกรดอะมิโนที่อุดมด้วยสารสกัดจากโครงปลาคอด และเราแสดงให้เห็นว่าอุณหภูมิการประมวลผลที่ต่ำกว่า (90 ◦C) เอื้อต่อการสกัดสารประกอบที่มีศักยภาพต้านการอักเสบในเซลล์เยื่อบุผิวในลำไส้ของมนุษย์ รุ่น [11]. โปรตีนส่วนใหญ่ที่มีอยู่ในสารสกัดจากปลาคอดคือคอลลาเจนและชิ้นส่วนของคอลลาเจน สารประกอบอื่นๆ ได้แก่ ไขมัน เถ้า และน้ำตาลในปริมาณเล็กน้อย สารสกัดจากปลาซาร์ดีนอุดมไปด้วยเปปไทด์และกรดอะมิโน และยังมีไขมัน เถ้า และน้ำตาลอีกด้วย เนื่องจากโปรตีนและเปปไทด์ที่ได้จากปลาอาจกลายเป็นทรัพยากรที่สำคัญสำหรับอุตสาหกรรมเครื่องสำอาง การศึกษาในปัจจุบันจึงมีวัตถุประสงค์เพื่อประเมินเพิ่มเติมถึงศักยภาพเชิงรุกของสารสกัดเหล่านี้ที่ได้จากของเสียจากการแปรรูปปลาและผลพลอยได้ที่เกิดจากการประเมินศักยภาพด้านเวชสำอางของพวกมัน [23] . สำหรับจุดประสงค์นี้ มีการใช้ชุดทดสอบทางเคมี เอนไซม์ และเซลล์เพื่อสำรวจสารต้านอนุมูลอิสระ ต่อต้านริ้วรอย ต่อต้านรอยดำ ต้านการอักเสบ และต้านจุลชีพของตัวอย่างที่สกัด นอกจากนี้ยังทำการศึกษาความสัมพันธ์เพื่อระบุองค์ประกอบที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพหลักที่มีศักยภาพด้านเวชสำอาง

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. รีเอเจนต์

3,4-ไดไฮดรอกซี-แอล-ฟีนิลอะลานีน (L-DOPA), เห็ดไทโรซิเนส, พอร์ซีนตับอ่อนอีลาสเตส (PPE) ประเภท III, N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (AAAPVN), ทริส ({ {11}}อะมิโน- 2-ไฮดรอกซีเมทิล-โพรเพน-1,3-ไดออล), 2,20 -อะโซบิส (2-เมทิลโพรพิโอนามิดีน)ไดไฮโดรคลอไรด์ (AAPH) และ 20 ,70 -dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) ซื้อจาก Sigma-Aldrich (เซนต์หลุยส์ มิสซูรี่ สหรัฐอเมริกา) Mueller Hinton broth (CAMHB) ที่ปรับแคลเซียมแล้วซื้อจาก BD (Sparks, MD, USA) ซื้อ Brain-heart infusion (BHI) จาก Avantor (Radnor, PA, USA) ซื้อซอง AnaeroGen™ Compact จาก Oxoid (แฮมป์เชียร์ สหราชอาณาจักร) PrestoBlue™, Modified Eagle Medium (DMEM) ของ Dulbecco, Fetal Bovine Serum (FBS) ที่ไม่ผ่านความร้อน และ Penicillin-Streptomycin ได้รับจาก Invitrogen (ซานดิเอโก แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) สายเซลล์ keratinocyte ที่ไม่ใช่เนื้องอกที่ทำให้เป็นอมตะของมนุษย์ HaCaT ได้มาจาก Cell Line Service (Eppelheim ประเทศเยอรมนี) Human IL-8 และ IL-6 Mini TMB ELISA Development Kits ได้มาจาก Peprotech (ลอนดอน สหราชอาณาจักร) รีเอเจนต์และตัวทำละลายอื่นๆ ทั้งหมดที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้เป็นเกรดวิเคราะห์และซื้อจากซัพพลายเออร์ที่มีอยู่

2.2. ตัวอย่าง

สารสกัดที่ใช้ในงานนี้เป็นสารสกัดที่พัฒนาขึ้นในการศึกษาก่อนหน้าของเราซึ่งมุ่งเน้นที่การปรับกระบวนการให้เหมาะสมที่สุด [11,22] โดยสังเขป โครงปลาคอดจัดหาโดย Pascoal และ Filhos SA (Gafanha da Nazaré, โปรตุเกส) และประกอบด้วยส่วนหลังของปลาและกล้ามเนื้อยึดเกาะ เศษปลาซาร์ดีนที่ทำจากหัว เงี่ยง และอวัยวะภายใน จัดหาโดย Conservas A Poveira SA (Póvoa de Varzim, Portugal) องค์ประกอบใกล้เคียงของวัตถุดิบที่ใช้ได้ถูกนำเสนอในงานก่อนหน้าของเรา [11,22] โปรตีน (47 เปอร์เซ็นต์โดยน้ำหนัก ) และเถ้า (39 เปอร์เซ็นต์โดยน้ำหนัก ) เป็นส่วนประกอบหลักของโครงปลาคอด โดยมีไขมันและคาร์โบไฮเดรตในปริมาณเล็กน้อย (2 เปอร์เซ็นต์โดยน้ำหนัก และ 0.3 เปอร์เซ็นต์โดยน้ำหนัก ตามลำดับ) คอลลาเจนพบว่าเป็นโปรตีนหลักในโครงปลาคอด และในกรณีนี้ คอลลาเจนมีสัดส่วนประมาณ ร้อยละ 65 ของปริมาณโปรตีนทั้งหมดของขยะดั้งเดิม ในทางตรงกันข้าม ปลาซาร์ดีนเป็นปลาที่มีน้ำมันมาก ดังนั้นของเสียของมันจึงอุดมไปด้วยไขมันมากกว่าปลาคอดกรอบ ของเสียจากปลาซาร์ดีนมีปริมาณไขมัน 26 เปอร์เซ็นต์โดยน้ำหนัก และปริมาณโปรตีน 52 เปอร์เซ็นต์โดยน้ำหนัก ส่วนที่เหลือเป็นเถ้า (17 เปอร์เซ็นต์โดยน้ำหนัก) และคาร์โบไฮเดรต (3 เปอร์เซ็นต์โดยน้ำหนัก )

สารสกัดจากโครงปลาคอด (Cf1, Cf2, Cf3 และ Cf4) และของเสียจากปลาซาร์ดีน (S1, S2 และ S3) ที่เลือกสำหรับงานนี้ได้มาจากเทคโนโลยีแรงดันสูงในเครื่องมือระดับห้องปฏิบัติการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [11,22 ,24] โดยใช้เงื่อนไขที่สรุปไว้ในตารางที่ 1 กล่าวโดยสังเขป คือ 60 กรัมของโครงปลาคอดบดหรือของเสียจากซาร์ดีน (แยกไขมันออกหรือไม่แยกไขมันออก) ถูกโหลดเข้าไปในเครื่องปฏิกรณ์ความดันสูงที่ใส่ไว้ในเตาอบ ปั๊มน้ำถูกเปิดที่อัตราการไหลที่ต้องการ (ประมาณ 10 มล./นาที) และตั้งค่าแรงดันไว้ที่ 100 บาร์ ทันทีที่ความดันถึงค่านั้น เตาอบไฟฟ้าก็เปิดขึ้น และการทดลองก็เริ่มต้นขึ้น เก็บสารสกัดต่างๆ เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิต่างกัน (90–250 ◦C) ได้รับสารสกัด S1 และ S3 หลังจากผ่านกระบวนการกำจัดไขมันของของเสียจากปลาซาร์ดีนด้วย ScCO2 ก่อนการสกัดด้วย SW การทดลองสกัดน้ำใต้วิกฤตซ้ำซ้อน สำหรับตัวอย่างที่สกัดแต่ละตัวอย่าง 25 มล. ถูกนำไปสามเท่า ไลโอฟิไลซ์ และชั่งน้ำหนักเพื่อคำนวณผลผลิตการสกัดที่สอดคล้องกัน ข้อมูลเชิงวิเคราะห์—ปริมาณโปรตีน—แสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) ของสามเท่า ข้อมูลเกี่ยวกับลักษณะของสารสกัดเหล่านี้ในแง่ของปริมาณโปรตีน รายละเอียดของกรดอะมิโน สารประกอบแร่ธาตุหลัก หรือสารพิษและโลหะหนักได้อธิบายไว้ในผลงานก่อนหน้าของเรา [11,22]

สารละลายสต็อกของ Cf1, Cf2, Cf3, Cf4 และ S2 ถูกเตรียมใน Milli-Q H2O ที่ความเข้มข้น 100 มก./มล. ตัวอย่างอื่นๆ ได้แก่ S1 และ S3 ถูกละลายใน DMSO (300 และ 550 มก./มล. ตามลำดับ) เนื่องจากความสามารถในการละลายในน้ำต่ำกว่า ตัวอย่างถูกแช่แข็งและเก็บไว้ที่ −20 ◦C จนกว่าจะใช้งานต่อไป สำหรับการตรวจวิเคราะห์ระดับเซลล์ ก่อนหน้านี้ ตัวอย่างถูกฆ่าเชื้อด้วยความร้อน (121 ◦C, 15 นาที) ในหม้อนึ่งฆ่าเชื้อ (Tuttnauer 3870 el, Breda, Netherlands)

2.3. การทดสอบความสามารถในการดูดซับอนุมูลอิสระของออกซิเจน (ORAC)

การทดสอบ ORAC ดำเนินการเพื่อประเมินความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระของตัวอย่างต่ออนุมูลเปอร์ออกซิล (ROO• ) ตามวิธีการที่พัฒนาโดย Huang et al [25] โดยมีการปรับเปลี่ยนบางอย่างตามที่รายงานก่อนหน้านี้ [26] โดยสังเขป ในไมโครเพลทหลุม 96-สีดำ ไดโซเดียมฟลูออเรสซีน 150 µL (0.3 µM) ถูกเติมลงในตัวอย่างเจือจาง 25 µL และบ่มเป็นเวลา 10 นาทีที่ 37 ◦ซ หลังจากนั้น ปฏิกิริยาเริ่มต้นโดยการเติม 25 µL ของ 2,20 - Azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH, 153 mM) และการเรืองแสง (Ex/Em 485 ± 20/528 ± 20 นาโนเมตร) ถูกวัดเป็นเวลา 40 นาทีที่ 37 ◦C ในเครื่องอ่านไมโครเพลทฟลูออเรสเซนซ์ FLx800 (FL800 Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA) เส้นโค้งมาตรฐานถูกเตรียมโดยใช้ 5, 10, 20, 30 และ 40 ไมโครโมลาร์ของ (6-ไฮดรอกซี-2,5,7,8-เตตระเมทิลโครแมน-2- คาร์บอกซิลิกแอซิด (Trolox )). สารละลายทั้งหมดถูกเตรียมในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS), 75 มิลลิโมลาร์, pH 7.4 ผลลัพธ์จะแสดงเป็นไมโครโมลของความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระที่เทียบเท่ากับ Trolox ต่อกรัมของสารสกัด (µ mol TEAC/กรัมของสารสกัด)

2.4. การตรวจเอนไซม์

2.4.1. การทดสอบการยับยั้ง Elastase

การทดสอบนี้มีพื้นฐานมาจากผลงานของ Wittenauer และคณะ [27] พร้อมการแก้ไขบางอย่างตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [6] กิจกรรมการยับยั้งอีลาสเตสถูกกำหนดโดยวิธีสเปกโตรโฟโตเมตริกโดยใช้อีลาสเตสตับอ่อนของหมู (PPE) และ N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (AAAPVN) เป็นสารตั้งต้นของเอนไซม์ โดยติดตามการปล่อย p-nitroaniline ที่ 41{ {19}} นาโนเมตร PPE ถูกละลายใน 100 mM Tris (2-amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol)-HCl buffer (pH=8}.0) ให้มีความเข้มข้น 1 มก./มล. และเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 20 ◦C ในส่วนย่อย ในวันที่ทำการวิเคราะห์ ส่วนลงตัวถูกนำมาและเจือจางในบัฟเฟอร์ไปที่ความเข้มข้น 0.03 U/mL, 10 µL ถูกบรรจุในหลุมของไมโครไทเทอร์เพลตร่วมกับ 100 µL ของบัฟเฟอร์ Tris-HCl และ 30 µL ของแต่ละตัวอย่าง หลังจากการบ่มล่วงหน้า 20 นาทีที่ 25 ◦ซ ปฏิกิริยาถูกเริ่มต้นโดยการเติม 40 µL ของสารตั้งต้น AAAPVN (0.55 มิลลิโมลาร์) วัดการดูดซับเป็นเวลา 20 นาทีหลังจากเติม AAAPVN ที่เครื่องอ่านไมโครเพลท BioTek Instruments EPOCH 2 สเปกโตรโฟโตมิเตอร์ การคำนวณทำขึ้นตามที่อธิบายไว้ในสมการ (1) โดยที่ A control และ Asample แสดงค่าการดูดกลืนแสงที่ 410 นาโนเมตรในกรณีที่ไม่มีหรือมีตัวอย่าง ตามลำดับ เนื่องจากมีการใช้ DMSO เพื่อละลายตัวอย่าง S1 และ S3 ตัวทำละลายนี้จึงได้รับการทดสอบและใช้เป็นตัวควบคุมสำหรับตัวอย่างเหล่านี้ด้วย ศักยภาพของสารสกัดในการยับยั้งอีลาสเตสได้รับการประเมินด้วยความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้น เพื่อหาความสัมพันธ์ที่ขึ้นกับขนาดยาและสร้างค่าความเข้มข้นในการยับยั้งครึ่งหนึ่งสูงสุด (IC50) ซึ่งบ่งชี้ความสามารถของแต่ละตัวอย่างในการยับยั้งกิจกรรมของเอนไซม์ในระดับ 50 เปอร์เซ็นต์

ผลลัพธ์ทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย IC50 โดยมีขีดจำกัดล่างและบนของช่วงความเชื่อมั่น 95 เปอร์เซ็นต์ ซึ่งได้จากการทดลองอิสระอย่างน้อยสามครั้ง

2.4.2. การทดสอบการยับยั้งไทโรซิเนส

ศักยภาพในการยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนสของสารสกัดได้รับการประเมินทางสเปกโตรโฟโตเมตริกโดยใช้เห็ดไทโรซิเนสและ L-DOPA เป็นสารตั้งต้น [28] ไทโรซิเนสเปลี่ยน L-DOPA เป็นโดปาควิโนน ซึ่งจะหมุนเวียนตามลำดับเพื่อสร้างโดปาโครม สามารถสังเกตการก่อตัวของโดปาโครมได้โดยการวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 475 นาโนเมตร สารตั้งต้นถูกเติมลงในเอนไซม์ต่อหน้าการเจือจางตัวอย่าง จนได้ความเข้มข้นสุดท้ายที่ 30 U/mL tyrosinase และ 2.5 mM L-DOPA เนื่องจากมีการใช้ DMSO เพื่อละลายตัวอย่าง S1 และ S3 ตัวทำละลายนี้จึงได้รับการทดสอบและใช้เป็นตัวควบคุมสำหรับตัวอย่างเหล่านี้ด้วย หลังจากการบ่มที่อุณหภูมิ 37 ◦C เป็นเวลา 30 นาที วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 475 นาโนเมตรบนเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ไมโครเพลท BioTek Instruments EPOCH 2 รีเอเจนต์ทั้งหมดถูกเตรียมในโซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (SPB; 0.1 M, pH 6.8) ซึ่งเตรียมโดยการผสมโซเดียมฟอสเฟตไดเบสิกไดไฮเดรตและโซเดียมฟอสเฟตโมโนเบสิกโมโนไฮเดรต และทำการคำนวณตามที่อธิบายไว้ในสมการ (1) ผลลัพธ์ทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย IC50 โดยมีขีดจำกัดล่างและบนของช่วงความเชื่อมั่น 95 เปอร์เซ็นต์ ซึ่งได้จากการทดลองอิสระอย่างน้อยสามครั้ง

2.5. การทดสอบความไวต่อยาต้านจุลชีพ

จุลินทรีย์เป้าหมายที่เลือกสำหรับการทดสอบฤทธิ์ต้านแบคทีเรีย ได้แก่ แบคทีเรียแกรมลบ Klebsiella pneumoniae CECT 8453 และแบคทีเรียแกรมบวก Staphylococcus aureus ATCC 6538 และ Cutibacterium acnes ATCC 6919T สำหรับเชื้อ K. pneumoniae CECT 8453 และ S. aureus ATCC 6538 การตรวจวิเคราะห์ดำเนินการตามวิธีการเจือจางขนาดเล็กของน้ำซุปของหลักเกณฑ์ CLSI M07-A10 ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดย Rodrigues และคณะ [29]. กล่าวโดยย่อ สารละลายสต็อคสารสกัดถูกแจกจ่ายในไมโครไทเทอร์ก้นกลม 96-จานหลุม และ 2-พับแบบอนุกรมที่เจือจางในน้ำซุป Mueller Hinton ที่ปรับแคลเซียม (CAMHB; BD, Sparks, MD, USA) เพื่อให้ได้ ช่วงความเข้มข้นของสารละลาย หัวเชื้อเตรียมโดยใช้วิธีการเจริญเพื่อให้ได้สารแขวนลอยที่เป็นเนื้อเดียวกันในสารละลายน้ำเกลือ หัวเชื้อที่ปรับปรุงแล้วถูกเจือจางเพิ่มเติมใน CAMHB เพื่อรับประกันว่าหลังจากการฉีดวัคซีน แต่ละหลุมจะมี CFU ประมาณ 5 × 104 เพลตถูกบ่มภายใต้สภาวะแอโรบิกที่ 37 ◦ซ เป็นเวลา 16 ถึง 20 ชม. สำหรับ C. acnes การทดสอบดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยใช้น้ำซุปสมองและหัวใจ (BHI) (Avantor, Radnor, PA, USA) แทน CAMHB และโดยการบ่มแผ่นไมโครไทเทอร์เป็นเวลา 70–74 ชั่วโมงที่ 37 ◦ C ในขวดไร้อากาศที่มีระบบสร้างบรรยากาศ AnaeroGen™ Compact (Oxoid, Hampshire, UK)

สำหรับสารละลายสต็อคแต่ละรายการที่วิเคราะห์ การควบคุมเชิงบวก (CAMHB หรือ BHI และหัวเชื้อที่เจือจาง) การควบคุมการทำให้ปราศจากเชื้อปานกลาง (CAMHB หรือ BHI ที่ไม่ได้รับเชื้อ) และการควบคุมการทำให้ปราศจากเชื้อของสารสกัด (2-สารละลายสต็อคสารสกัดที่ไม่มีการเพาะเชื้อ 2-แบบพับใน CAMHB หรือ BHI) ได้ดำเนินการตามนั้น ค่าความเข้มข้นต่ำสุดในการยับยั้ง (MIC) คือค่าความเข้มข้นต่ำสุดของตัวอย่างที่ยับยั้งการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์อย่างเห็นได้ชัดหลังการบ่ม เมื่อจำเป็น ค่า MIC จะได้รับการยืนยันโดยใช้รีเอเจนต์การมีชีวิตของเซลล์ PrestoBlue™ (Invitrogen, San Diego, CA USA) ตามแนวทางของผู้ผลิต นอกจากนี้ ค่า MIC เพิ่มเติมที่กำหนดโดย MIC* ยังถูกกำหนดขึ้นและกำหนดให้เป็นความเข้มข้นต่ำสุดของตัวอย่างที่การเจริญเติบโตของแบคทีเรียได้รับผลกระทบทางสายตาและแตกต่างเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมที่เป็นบวก ค่าความเข้มข้นในการฆ่าเชื้อแบคทีเรียขั้นต่ำ (MBC) ถูกรายงานเป็นความเข้มข้นต่ำสุดของตัวอย่างที่นำไปสู่การลดจำนวนแบคทีเรียที่มีชีวิตได้อย่างน้อย 99.9 เปอร์เซ็นต์ เมื่อเปรียบเทียบกับหัวเชื้อเริ่มต้นและเวลาฟักตัวเท่ากัน ผลลัพธ์ถูกแสดงเป็นค่ามัธยฐานของค่าที่ได้รับหลังจากการจำลองแบบทางชีวภาพสามครั้ง เนื่องจากใช้ DMSO เพื่อละลายตัวอย่าง S1 และ S3 ตัวทำละลายนี้จึงได้รับการทดสอบด้วยเพื่อให้แน่ใจว่าความเข้มข้นสุดท้ายที่ใช้ไม่รบกวนจุลินทรีย์เป้าหมาย ดังนั้นการทดสอบ

2.6. การทดสอบตามเซลล์

2.6.1. การเพาะเลี้ยงเซลล์

สายเซลล์เคอราติโนไซต์ของมนุษย์ HaCaT (CLS ประเทศเยอรมนี) เลี้ยงใน Modified Eagle Medium (DMEM) ของ Dulbecco ที่เสริมด้วย 10 เปอร์เซ็นต์ (v/v) fetal bovine serum (FBS) และ 1 เปอร์เซ็นต์ (v/v) penicillin-streptomycin เซลล์ได้รับการดูแลเป็นประจำเป็นชั้นเดียวในขวดเพาะเลี้ยงขนาด 75 ซม. และบ่มที่อุณหภูมิ 37 ◦ซ โดยมี CO2 5 เปอร์เซ็นต์ในบรรยากาศที่มีความชื้น

2.6.2. ความเป็นพิษต่อเซลล์ในหลอดทดลอง

การทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ได้ดำเนินการตามผลงานก่อนหน้านี้ [6] โดยสังเขป เซลล์ HaCaT ถูกเพาะที่ความหนาแน่น 1.4 × 105 เซลล์/ซม.2 ในเพลต 96 หลุม หลังจาก 3 วัน เซลล์ถูกบ่มด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของแต่ละตัวอย่าง (Cf1; Cf2; Cf3; Cf4; S2—50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56, {{30} }.78, 0.39; S1—3, 1.5, 0.75, 0.38, {{40}}.19, {{51 }}.09, 0.05, 0.02; S3—5.5, 2.75, 1.38, 0.69, 0.34, 0.17, 0.09, 0.04 มก./มล.) เจือจางในอาหารเลี้ยงเชื้อ (อาหารเลี้ยงเชื้อ DMEM ที่มี FBS 0.5 เปอร์เซ็นต์) หลุมที่มีเซลล์ที่บ่มด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อที่เสริมด้วย 0.5 เปอร์เซ็นต์ (v/v) ของ FBS ถูกใช้เป็นตัวควบคุม การควบคุมตัวทำละลายด้วยน้ำ 50 เปอร์เซ็นต์หรือ 1 เปอร์เซ็นต์ DMSO ในอาหารเลี้ยงเชื้อยังดำเนินการเพื่อไม่รวมความเป็นพิษของตัวทำละลาย หลังจากการบ่ม 24 ชั่วโมง ความมีชีวิตของเซลล์ได้รับการประเมินโดยใช้ PrestoBlue® (5 เปอร์เซ็นต์ v/v ในอาหารเลี้ยงเชื้อ) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 37 ◦C, 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 ตามคำแนะนำของผู้ผลิต หลังจากนั้น วัดค่าการเรืองแสงของแต่ละหลุม (เช่น/Em. 560 ± 20/590 ± 20 nm) ในเครื่องอ่านไมโครเพลทเรืองแสง FLx800 (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) ความมีชีวิตของเซลล์แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของเซลล์ที่มีชีวิตเทียบกับกลุ่มควบคุม ทำการทดลองอิสระสามครั้งเป็นสามเท่า

2.6.3. กิจกรรมต้านอนุมูลอิสระระดับเซลล์

กิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระของเซลล์ได้รับการประเมินตามวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [6,30] โดยมีการดัดแปลงบางอย่าง โดยสังเขป เซลล์ HaCaT ถูกเพาะที่ความหนาแน่น 1.4 × 105 เซลล์/ซม.2 ในเพลต 96 หลุม และการก่อตัวของ ROS ภายในเซลล์ถูกติดตามโดยใช้ 20,70 -ไดคลอโรฟลูออเรสซีน ไดอะซีเตต ( DCFH-DA) เป็นโพรบเรืองแสง 72 ชั่วโมงหลังจากการเพาะ เซลล์ถูกล้างด้วย PBS และบ่มด้วยความเข้มข้นที่ไม่เป็นพิษของตัวอย่าง (0.1875 มก./มล.; 0.375 มก./มล.; 0.75 มก./มล.) บวก 25 µM DCFH-DA ใน PBS เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ต่อจากนั้น เซลล์ถูกล้างอีกครั้งด้วย PBS และบ่มด้วยตัวเหนี่ยวนำความเครียด (600 µM AAPH ใน PBS) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจากนั้น วัดการเรืองแสงในเครื่องอ่านฟลูออเรสเซนซ์ไมโครเพลท FL800 (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA) (Ex/Em 485 ± 20/528 ± 20 nm) ผลลัพธ์แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ ROS ที่สัมพันธ์กับกลุ่มควบคุมที่ไม่ถูกบำบัด (เซลล์ที่บำบัดด้วย DCFH-DA และ AAPH) ทำการทดลองอิสระสามครั้งเป็นสามเท่า

2.6.4. การประเมิน IL-6 และ IL-8 การหลั่ง

ทำการทดลองตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [31] โดยมีการปรับเปลี่ยนหลายอย่าง โดยสังเขป เซลล์ HaCaT ถูกเพาะที่ความหนาแน่น 1 × 105 เซลล์/ซม.2 ในเพลต 12 หลุม หลังจาก 3 วัน เซลล์ถูกกระตุ้นด้วยลิโพโพลีแซคคาไรด์ (LPS) 15 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรจาก Escherichia coli และบ่มร่วมกันด้วยสารสกัดแต่ละชนิดที่มีความเข้มข้นแตกต่างกันสามชนิด ({{10}}}.1875 มก./มล.; {{ 14}}.375 มก./มล.; 0.75 มก./มล.) เจือจางในอาหารเลี้ยงเชื้อ (อาหารเลี้ยงเชื้อ DMEM ที่มี FBS 0.5 เปอร์เซ็นต์) เซลล์ที่ถูกบ่มด้วย LPS เท่านั้น และเซลล์ที่ถูกบ่มด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อเท่านั้นถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวกและเชิงลบ ตามลำดับ หลังจาก 24 ชั่วโมง สารลอยเหนือตะกอนถูกรวบรวม หมุนเหวี่ยงเป็นเวลา 10 นาทีที่ 2,000 กรัม และเก็บไว้ที่ −80 ◦C จนกว่าจะวิเคราะห์เพิ่มเติม ระดับ IL-6 และ IL-8 ได้รับการประเมินโดยการทดสอบอิมมูโนซอร์เบนต์ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ELISA) โดยใช้ชุดอุปกรณ์ที่มีจำหน่ายทั่วไป (PeproTech ในลอนดอน สหราชอาณาจักร) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตร ด้วยการแก้ไขความยาวคลื่นที่ 620 นาโนเมตรในไมโครเพลทสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ (EPOCH 2, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) ผลลัพธ์แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ IL-6 หรือ IL{27}} เทียบกับกลุ่มควบคุมเชิงบวก (เซลล์ที่กระตุ้นด้วย LPS) ทำการทดลองอิสระสามครั้งเป็นสามเท่า

2.7. การวิเคราะห์ทางสถิติ

ORAC และผลลัพธ์การทดสอบตามเซลล์จะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SD ซึ่งได้มาจากการทดลองอิสระอย่างน้อยสามครั้ง สำหรับการทดสอบเอนไซม์และความเป็นพิษต่อเซลล์ ค่า IC50 ถูกกำหนดจากเส้นโค้งการตอบสนองต่อปริมาณรังสีผ่านกราฟ log10 โดยใช้ GraphPad Prism 8.4.3 ซอฟต์แวร์ (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) ผลลัพธ์จะแสดงเป็น IC50 โดยมีช่วงความเชื่อมั่น 95 เปอร์เซ็นต์ การวิเคราะห์ทางสถิติของผลลัพธ์ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์เดิม เมื่อตรวจสอบความแปรปรวนแบบเอกพันธ์และการแจกแจงแบบปกติของข้อมูลแล้ว ผลลัพธ์จะถูกวิเคราะห์โดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียว (ANOVA) ตามด้วยการทดสอบ Tukey สำหรับการเปรียบเทียบหลายรายการ ในกรณีของความแปรปรวนต่างกันหรือหากข้อมูลไม่ได้รับการแจกแจงแบบปกติ การทดสอบ t-test ของนักเรียนที่ไม่จับคู่ที่เหมาะสมได้ดำเนินการเพื่อตรวจสอบว่าค่าเฉลี่ยแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญหรือไม่ ค่า p น้อยกว่าหรือเท่ากับ 0.05 ได้รับการยอมรับว่ามีนัยสำคัญทางสถิติในทุกกรณี ผลการทดสอบความไวต่อยาต้านจุลชีพจะแสดงเป็นค่ามัธยฐาน ซึ่งได้จากการทดลองอิสระอย่างน้อยสามครั้ง

3. ผลลัพธ์และการอภิปราย

This study aims to investigate the cosmeceutical potential of protein-rich extracts that were produced by high-pressure technologies from fishery industry wastes, namely sardine wastes and codfish frames [11,22]. The selection of extracts was based on previous results regarding their characterization and process conditions. For codfish, all extracts were selected aiming at evaluating the impact of the extraction temperature on the recovery of compounds with promising bioactive effects on the skin. For sardine extracts, only three extracts derived from both defatted and non-defatted raw materials, processed at higher temperatures (190  and 250 ◦C) and with the highest extraction yield (>45.7 ก./100 ก.) ถูกเลือก ผลลัพธ์เกี่ยวกับปริมาณโปรตีนทั้งหมดของสารสกัดแต่ละชนิดแสดงไว้ในตารางที่ 1

3.1. กิจกรรมต้านอนุมูลอิสระ ต่อต้านวัย และต่อต้านรอยดำ

ผลกระทบด้านเวชสำอางที่เป็นไปได้ของสารสกัดได้รับการคัดกรองเบื้องต้นโดยใช้การทดสอบทางเคมีและเอนไซม์เพื่อประเมินฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ การต่อต้านริ้วรอย และการลดรอยดำ สำหรับความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระ การทดสอบ ORAC ได้รับเลือกเนื่องจากวัดความสามารถของตัวอย่างในการกำจัด ROS ที่เกี่ยวข้องทางชีวภาพ ซึ่งก็คืออนุมูลเปอร์ออกซิล ซึ่งถือเป็นหนึ่งในตัวกระตุ้นหลักของความชราของผิวหนัง [2,32] ผลการต่อต้านริ้วรอยได้รับการประเมินผ่านการยับยั้งอีลาสเทส เนื่องจากมีรายงานว่าเอนไซม์นี้มีหน้าที่รับผิดชอบในการย่อยสลายอีลาสตินและโปรตีน ECM อื่นๆ [6] สำหรับผลการต่อต้านรอยดำนั้น การทดสอบไทโรซิเนสใช้เพื่อประเมินความสามารถของตัวอย่างในการยับยั้งการผลิตเมลานิน ตารางที่ 2 สรุปค่า ORAC และ IC50 ของสารสกัดทั้งหมด

ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าสารสกัดจากปลาซาร์ดีนและปลาคอดนำเสนอฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและฤทธิ์ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์อีลาสเตสและไทโรซิเนส ในบรรดาตัวอย่างปลาซาร์ดีน S1 แสดงค่า ORAC สูงสุด (1.94 ± 0.08 µmol TEAC/mg extract) ตามด้วย S3 และ S2 ผลลัพธ์เหล่านี้มาจากการประเมินสารต้านอนุมูลอิสระก่อนหน้านี้ด้วยวิธีทางเลือก (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl-DPPH assay) โดยที่สารสกัด S1 แสดงค่า IC50 ต่ำสุด [22] ความสามารถในการกำจัดอนุมูลเปอร์ออกซิลที่สูงขึ้นของตัวอย่าง S1 อาจได้มาจากเปปไทด์ที่มีลำดับกรดอะมิโนต่างกันอยู่ในสารสกัด เนื่องจากอันตรกิริยาระหว่างเปปไทด์สามารถมีอิทธิพลต่อความสามารถในการกำจัดอนุมูล [33] นอกจากนี้ สารประกอบที่สร้างขึ้นใน Maillard หรือปฏิกิริยาเทอร์โมออกซิเดชันอื่นๆ อาจมีอิทธิพลต่อกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระของตัวอย่าง [34] แม้จะมีค่า ORAC ต่ำที่สุด แต่ตัวอย่าง S2 และ S3 ก็เป็นค่าที่มีความสามารถในการยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ไทโรซิเนสและอีลาสเทสสูงที่สุดตามลำดับ

ในบรรดาสารสกัดจากปลาคอด พบว่า Cf4 มีสารต้านอนุมูลอิสระและกิจกรรมลดรอยดำสูงสุด การวิเคราะห์ SEC-GPC ของสารสกัดแสดงให้เห็นว่าได้รับเปปไทด์ของน้ำหนักโมเลกุลที่ลดลงเมื่อเพิ่มอุณหภูมิการสกัดสูงถึง 250 ◦C [11] ความสามารถในการยับยั้งอีลาสเตสของตัวอย่างนี้อยู่ในช่วงของค่าที่พบสำหรับสารสกัด Cf อื่นๆ ได้แก่ Cf1 และ Cf3 อย่างไรก็ตาม สำหรับความเข้มข้นที่ทดสอบ สารสกัดทั้งสองนี้ไม่มีฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนส

ในเอกสารรายงานบางฉบับแสดงให้เห็นว่าสารสกัดจากผลพลอยได้จากทะเลแสดงฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่เกี่ยวข้องและการยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนส ตัวอย่างเช่น สารสกัดที่ได้จากผลพลอยได้จากทะเล (Scophthalmus maximus) โดยการไฮโดรไลซิสด้วยอัลคาไลน์ ได้แสดงฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่เข้าถึงได้โดยการทดสอบทางเคมีต่างๆ: 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) ความสามารถในการกำจัดอนุมูลอิสระ ( 36.12 เปอร์เซ็นต์เกี่ยวกับการควบคุม), ABTS (2,20 -azinobis-(3-ethyl-benzothiazoline-6-sulphonic acid) method) (12.81 µg BHT/mL) และ crocin bleaching assay (8.{ {28}}3 µg Trolox/mL) [35] ในการศึกษาอื่น การสกัดด้วยเอนไซม์ของแมงกะพรุนที่ใส่เกลือด้วยสารส้ม (Lobonema smithii) แสดงให้เห็นถึงการผลิตไฮโดรไลเสตที่มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระสูง (IC{{20}} 9 มก./มล. สำหรับการตรวจวิเคราะห์ ABTS e DPPH) และศักยภาพในการยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนส โดยมีค่า IC50 อยู่ระหว่าง 14.1 และ 24.5 มก./มล. [36] ซึ่งอยู่ในลำดับความสำคัญเดียวกันกับค่าที่ได้จากงานนี้ นอกจากนี้ สารสกัดที่มีค่าสารต้านอนุมูลอิสระใกล้เคียงกัน (ค่า ORAC – 0.4 ถึง 3.5 µmol TEAC/mg extract) ได้มาจากกากอุตสาหกรรมอาหารประเภทอื่น ได้แก่ ของเสียจากการผลิตไวน์ [6] อย่างไรก็ตาม สารสกัดจากกากไวน์จากโรงบ่มไวน์เหล่านี้แสดงความสามารถในการยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนส (IC50 จาก 4.0 ถึง 0.14 มก./มล.) และอีลาสเตส (IC50 จาก 3.4 ถึง 0.1 มก./มล.) สูงกว่าที่ได้จากงานวิจัยนี้ อาจเป็นเพราะมีสารประกอบฟีนอล ที่ได้รับการยอมรับว่ามีฤทธิ์ทางชีวภาพหลายอย่าง สิ่งสำคัญคือต้องกล่าวถึงว่าในการศึกษาของเรา เราใช้ไทโรซิเนสจากเห็ดเพื่อคัดกรองฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีที่มากเกินไปของสารสกัด เนื่องจากเอนไซม์นี้ถูกใช้อย่างกว้างขวางในการทดสอบปริมาณงานสูง [37] อย่างไรก็ตาม เนื่องจากมีข้อโต้แย้งบางประการเกี่ยวกับความคล้ายคลึงกันและความเหมือนกันของเอนไซม์นี้กับเอนไซม์ไทโรซิเนสของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม/ของมนุษย์ [38–40] การศึกษาในอนาคตเกี่ยวกับเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมควรได้รับการพิจารณาเพื่อประเมินผลการต่อต้านรอยดำของสารสกัดจากปลาซาร์ดีนและปลาคอด

ในการระบุว่าสารประกอบใดสามารถรับผิดชอบต่อการตอบสนองทางชีวภาพของสารสกัด การศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างข้อมูลการออกฤทธิ์ทางชีวภาพและองค์ประกอบของกรดอะมิโนของสารสกัดที่รายงานก่อนหน้านี้ [11,22] ได้ดำเนินการ (ตารางที่ S1) สำหรับฤทธิ์ในการต้านอนุมูลอิสระ ความสัมพันธ์สูงสุด (R2 มากกว่าหรือเท่ากับ 0.7) ได้รับระหว่างค่า ORAC และธรีโอนีนทั้งหมด วาลีนอิสระ รวมทั้งลิวซีนอิสระและลิวซีนทั้งหมดสำหรับสารสกัดทั้งหมด ในกรณีของตัวอย่างปลาซาร์ดีน ยังได้รับค่าสหสัมพันธ์สูง (R2 มากกว่าหรือเท่ากับ 0.94) สำหรับปริมาณทริปโตเฟนฟรีและทั้งหมด ดังนั้น ก่อนหน้านี้มีรายงานว่ากรดอะมิโนทั้งหมดเหล่านี้มีคุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระในระบบแบบจำลองหลายระบบ [41–43] สำหรับกิจกรรมการยับยั้งอีลาสเตสและไทโรซิเนส ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์สูงสุด (R2 มากกว่าหรือเท่ากับ 0.8) ได้รับสำหรับปริมาณโปรตีนทั้งหมดและอาร์จินีนอิสระ ตามลำดับ ซึ่งบ่งชี้ว่าสารประกอบเหล่านี้อาจมีบทบาทสำคัญในศักยภาพ ฤทธิ์ต่อต้านริ้วรอยและต่อต้านรอยดำของสารสกัดจากลำธารของเสียจากอุตสาหกรรมปลา

【สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】