Cistanche Tubulosa ปกป้องเซลล์ประสาทโดปามิเนอร์จิคผ่านการควบคุมการตายของเซลล์และปัจจัยนิวโรโทรฟิกที่ได้มาจากเซลล์ Glial: ในร่างกายและในหลอดทดลอง-Ⅰ

การแนะนำ

โรคพาร์กินสัน (PD) เป็นโรคที่เกิดจากความเสื่อมของระบบประสาทที่พบบ่อยในผู้สูงอายุโดยมีอาการทางพยาธิวิทยาของการสูญเสียเซลล์ประสาทโดปามิเนอร์จิกใน substantia nigra (SN) เนื่องจากการเสื่อม ความรุนแรงของโรคมีความสัมพันธ์กับการสูญเสียเซลล์ประสาทโดปามีน (DA) ใน SN ซึ่งสอดคล้องกับมุมมองที่ว่าการเสื่อมของระบบประสาทกระบวนการดำเนินไปเป็นเวลาหลายปีก่อนที่อาการใดๆ จะเกิดขึ้น (ซอว์ลและไมเยอร์ส, 1993- ธรรมชาติที่ก้าวหน้าของโรคแสดงให้เห็นความเป็นไปได้ที่น่าสนใจสำหรับการแทรกแซงการรักษาโดยการปิดกั้นกระบวนการทางระบบประสาทที่อยู่เบื้องหลัง การค้นหาการกระทำที่มีศักยภาพและจำเพาะต่อการบำบัดของปัจจัยทางระบบประสาทต่อการอยู่รอดของเซลล์ประสาท DA จึงเป็นที่สนใจอย่างมาก

CISTANCHE TUBULOSA ธรรมชาติสำหรับปกป้องนิวรอนโดพามิเนอร์จิก PHGS75% ECH 30% ACT 12%

ปัจจัยทางระบบประสาทคือโปรตีนที่จำเป็น รวมถึงปัจจัยการเจริญเติบโตของเส้นประสาท (NGF) ปัจจัยทางระบบประสาทที่ได้มาจากสมอง (BDNF) และปัจจัยทางระบบประสาทที่ได้มาจากเซลล์ glial (GDNF) ซึ่งส่งเสริมการเจริญเติบโตของเส้นประสาท การพัฒนาทางระบบประสาท การชี้นำตามแนวแอกซอน และการทำงานของเส้นประสาท ในบรรดาปัจจัยทางระบบประสาททั้งหมดที่ปกป้องและส่งเสริมการซ่อมแซมเซลล์ประสาทโดปามีนนั้น GDNF มีผลกระทบที่รุนแรงที่สุด (Hong et al., 2008; Rangasamy et al., 2010; Allen et al., 2013) GDNF ได้รับการแสดงให้เห็นว่ามีผลกระทบต่อระบบประสาทที่มีศักยภาพต่อเซลล์ประสาท DA ในหลอดทดลอง (Lin et al., 1993) และออกฤทธิ์ป้องกันระบบประสาท ในร่างกาย GDNF ได้รับการแสดงเพื่อช่วยเซลล์ประสาท nigral DA จากการตายของเซลล์ที่เกิดจากรอยโรคหลังจากการผ่าตัด axotomy ที่เกิดจากการผ่าตัดหรือสารพิษในหนู (Beck et al., 1995; Kearns and Gash, 1995; Sauer et al., 1995) และบางส่วนหลังจากนั้น การบริหารระบบของเอ็น-เมทิล-4-ฟีนิล-1,2,3,6-เตตระไฮโดรไพริดีน (MPTP)ในหนู (Tomac et al., 1995) อุบัติการณ์ที่เพิ่มขึ้นของการตายของเซลล์เซลล์ประสาทและลดผลการป้องกันของปัจจัยทางระบบประสาทซึ่งอาจถูกกระตุ้นโดยปัจจัยทางพยาธิวิทยาต่างๆ ทำให้เกิดความเสื่อมของเซลล์ประสาทโดปามีน (Holden et al., 2006)

C. tubulosa เป็นยาสมุนไพรที่มีต้นกำเนิดจากพืชหลายชนิดในสกุล Cistanche เป็นทางเลือกหลักในการรักษาโรคไตบกพร่องซึ่งเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับฮอร์โมนแอนโดรเจนในการแพทย์แผนจีน (TCM) จนถึงปัจจุบัน การวิจัยทางคลินิกและพื้นฐานจำนวนมากเกี่ยวกับ C. tubulosa ได้แสดงให้เห็นกิจกรรมของโรคเกี่ยวกับความเสื่อมของระบบประสาท การระบุใบสั่งยาเสริมไตโดย TCM ในการรักษา PD อาจเป็นทางเลือกในการรักษาทางคลินิกสำหรับ PDเอชินาโคไซด์ (ECH)เป็นส่วนประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่สำคัญที่พบในสมุนไพร C. tubulosa การศึกษาแสดงให้เห็นผลการรักษาของไกลโคไซด์ของ Cistanche และ ECHเวอร์บาสโคไซด์(VER) และอิคาริอิน (ICA) ต่อโรคอัลไซเมอร์ (AD), PD และผู้ป่วยโรคหลอดเลือดสมองเสื่อมอื่นๆ (Urano และ Tohda, 2010; Wang et al., 2013; Wu et al., 2014) วู และคณะ (2014) แนะนำว่าสารสกัด C. tubulosa ที่มี ECH และแอคทีโอไซด์เพียงพอช่วยแก้ไขความผิดปกติทางการรับรู้ที่เกิดจาก A -42 ผ่านการปิดกั้นการสะสมของอะไมลอยด์และการย้อนกลับการทำงานของเซลล์ประสาทโดปามิเนอร์จิคของ cholinergic และ hippocampal เต่าและคณะ (2558) พบว่าฟีนิลธานอยด์ไกลโคไซด์จาก C. tubulosa (Ph Gs-Ct) ป้องกันภาวะสมองบวมในที่สูงโดยการลดการแสดงออกของโปรตีนและ mRNA ของ AQP4 ในเนื้อเยื่อสมองของแบบจำลองหนู

สารสกัดจาก CISTANCHE TUBULOSA ธรรมชาติ อาหารว่างปรับปรุงหน่วยความจำ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าสารประกอบสมุนไพรจีน รวมถึงส่วนผสมสามอย่างของ C. tubulosa, epimedium และ rhizoma polygonati ช่วยบรรเทาความเสียหายต่อเซลล์ประสาทโดปามีน และเพิ่มระดับโดปามีนโดยควบคุมการแสดงออกของปัจจัยทางระบบประสาท (Wu et al., 2013) ดังนั้นจึงยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัดว่าผลการป้องกันระบบประสาทที่เกิดจาก C. tubulosa นั้นมีอายุการใช้งานยาวนานหรือไม่ และการช่วยเหลือเซลล์ประสาท nigral DA โดยการบริหารงานของ GDNF ในระดับใดสามารถรักษาพฤติกรรมทางการเคลื่อนไหวที่เกี่ยวข้องกับอาการของสัตว์ PD ได้อย่างมีนัยสำคัญ การศึกษานี้ใช้ผงนาโน C. tubulosa สูตรปรับสภาพไตของ TCM ที่ได้รับสิทธิบัตรระดับชาติ (หมายเลขสิทธิบัตร: 2011103028541) ในประเทศจีน และก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นผลการรักษาบางอย่างใน PD การศึกษาครั้งนี้จึงได้รับการออกแบบมาเพื่อตรวจสอบผลกระทบของการป้องกันระบบประสาทและการฟื้นฟูของการรักษา C. tubulosa และเพื่อตรวจสอบการตายของเซลล์ในเซลล์ MES23.5 และหนูที่มีพฤติกรรมชัดเจน และการควบคุมของ GDNF ซึ่งวัดโดยแบตเตอรี่ของการทดสอบเป้าหมาย .

วัสดุและวิธีการ

วัสดุ รีเอเจนต์ และอุปกรณ์

C. tubulosa ถูกซื้อจาก Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd., ปักกิ่ง, จีน ECH, VER และ ICA มาจากสถาบันควบคุมอาหารและยาแห่งชาติ ประเทศจีน เซลล์ประสาทโดปามีน MES23.5 เป็นของขวัญจากศาสตราจารย์ Biao Chen, ห้องทดลองประสาทชีววิทยา, Capital Medical University, ปักกิ่ง ประเทศจีน หนูตัวผู้ C57BL/6 ตัวจำนวนห้าสิบตัว (น้ำหนักตัวละ 20–25 กรัม) ถูกซื้อจาก Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (หมายเลขใบอนุญาต: SCXK 2012-0002), เซี่ยงไฮ้, จีน

ซื้อ MPP +, MTT และกลูตามีนจาก Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA); ซื้อซีรั่มวัวขนาดกลางและวัวของทารกในครรภ์ DMEM / F12 จาก Gibco Co. (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA); และมาตรฐาน MPTP, DA และมาตรฐานกรดโฮโมวานิลลิก (HVA) ซื้อจาก Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA) -actin, Bax, Bcl2, GDNF, GDNF family receptor alpha (GFR 1) และ Ret antibodies ถูกซื้อจาก Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, USA); ซื้อชุดรีเอเจนต์การย้อมสี 3,3'-diaminobenzidine (DAB) จาก Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. (ฝูเจี้ยน, จีน); และชุดเตรียมตัวอย่างเจล SDS-PAGE, ชุดตรวจจับเคมีเรืองแสง (ECL) ที่ไวต่อแสงพิเศษ และการทดสอบกรด bicinchoninic (BCA) ถูกซื้อจากสถาบันเทคโนโลยีชีวภาพ Beyotime (ปักกิ่ง, จีน)

การศึกษานี้ใช้เครื่องมือต่อไปนี้: เครื่องอ่านไมโครเพลท ELX800 (Bio Tek Winooski, VT, USA); ตู้ฟัก CO2 (Heraeus, Hanau, เยอรมนี); ระบบวิเคราะห์ด้วยภาพเจล Gel DOC 2000, เซลล์อิเล็กโตรโฟเรซิสและถังอิเล็กโทรโฟรีซิส (Bio-Rad, Hercules, CA, USA); เครื่องวิเคราะห์โปรตีน DU-650 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA); เครื่องหมุนเหวี่ยงแช่เย็นความเร็วสูง 5417R (Eppendorf, ฮัมบูร์ก, เยอรมนี); โรงสีลูกกลมดาวเคราะห์คู่ SXQM (ฉางชา, Tencan Powder Technology Co., Ltd, หูหนาน, จีน); โรงผสม MM400 (Retsch GmbH, Haan, เยอรมนี); โครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง Agilent 1200 (HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA); อิเล็กโทรโฟเรซิส PowerPac Basic, ระบบถ่ายโอนเมมเบรน PowerPac Basic, เครื่องสร้างภาพเคมีเคมี Universal Hood II, ระบบถอดรหัสกลับ RNA ของ Thermal Cycler S1000 (Bio-Rad); ระบบวิเคราะห์เนื้อเยื่อและภาพเซลล์ Motic Med 6.0 (Motic China Group, Co., Ltd, เซียะเหมิน, จีน)

การเตรียมตัวของค. ทูบูโลซาผงนาโน

ชั่งน้ำหนัก C. tubulosa จากนั้นทำให้บริสุทธิ์และทำให้แห้ง หลังจากการบดแบบธรรมดา ผงละเอียดของ C. tubulosa จะถูกส่งผ่านตะแกรงตาข่าย 200- และทำแห้งแบบแช่แข็ง มีการใช้สุญญากาศควบคุมอุณหภูมิและโรงสีลูกบอลพลังงานสูงเพื่อเตรียมผงนาโน C. tubulosa ขั้นแรก ให้วางผงนาโน C. tubulosa ดิบไว้ในถังกัดลูกบอลสุญญากาศซึ่งเต็มไปด้วยลูกบอลบดคาร์ไบด์ อัตราส่วนระหว่างลูกบดและผงนาโน C. tubulosa อยู่ระหว่าง 15:1 ถึง 5:1 เพื่อให้ได้ผงละเอียด ความเร็วและระยะเวลาของเครื่องบดลูกกลิ้งพลังงานสูงถูกตั้งไว้ที่ 300 รอบต่อนาที และ 20 นาที ตามลำดับ ชั่งน้ำหนักผงละเอียดเพื่อแปรรูปวัสดุระดับนาโนและแปรรูปในโรงสีผสมด้วยความถี่ 25/วินาที และการแกว่ง 20 วินาทีสำหรับการทำซ้ำสามครั้ง PBS ใช้ในการละลายและเตรียมสารละลายสต็อก 25 มก./มล. ตามด้วยอัลตราโซนิก 30 นาที การนึ่งฆ่าเชื้อ และสุดท้ายคือการเก็บรักษาที่ -20°C

การควบคุมคุณภาพของส่วนประกอบที่ใช้งานของค. ทูบูโลซาโดย HPLC

ECH และ VER ประกอบด้วยการชะแบบไล่ระดับด้วยซิลิกาที่มีพันธะออกทาเดซิลไซเลนเป็นสารตัวเติม เมทานอลเป็นเฟส A ที่เคลื่อนที่ได้ และสารละลายกรดฟอร์มิก 0.1% เป็นเฟส B ที่เคลื่อนที่ได้ ความยาวคลื่นในการตรวจจับคือ 330 นาโนเมตร ICA ประกอบด้วยการชะแบบไล่ระดับด้วยซิลิกาที่มีพันธะออกตาเดซิลไซเลนเป็นสารตัวเติมและอะซิโตไนไตรล์-น้ำ (30:70) เป็นเฟสเคลื่อนที่ ความยาวคลื่นการตรวจจับคือ 270 นาโนเมตร ตัวอย่าง, กลุ่มควบคุมและกลุ่มควบคุมเชิงลบถูกวัดเป็น 10 ไมโครลิตรสำหรับการทดสอบ

การเพาะเลี้ยงเซลล์และการทดสอบ MTT เพื่อวัดความมีชีวิตของ MPP+- เซลล์ที่ได้รับการบำบัด

เซลล์ MES23.5 ได้รับการฉีดวัคซีนด้วยซีรั่มลูกวัวของทารกในครรภ์ 5%, กลูตามีน 1%, สารละลายของ Sato 2% 50× และสื่อ DMEM/F12 ที่มีเพนิซิลลิน/สเตรปโตมัยซิน 2% พวกมันถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37°C ในตู้ฟัก CO2 5% ที่มีความชื้นอิ่มตัว เซลล์ถูกแยกออกและส่งผ่านด้วยทริปซิน 0.25% และเซลล์แขวนลอยถูกเก็บเกี่ยวในระยะการเจริญเติบโตแบบลอการิทึม เซลล์ที่แยกเดี่ยวที่มีความหนาแน่น 1 × 105 ถูกเพาะลงในเพลตหลุม 96- ที่เคลือบโพลีไลซีน ตามด้วยการเติมความเข้มข้นสุดท้ายที่แตกต่างกัน (6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 และ 800 µmol/L ) ของสื่อ MPP+ เซลล์ MES23.5 ที่ถูกบ่มด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อปกติเป็นเวลา 24 ชั่วโมงและ 48 ชั่วโมงถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบในการทดลอง ในหลอดทดลอง เซลล์จากกลุ่มการบำบัดที่แตกต่างกันถูกบ่มด้วยรีเอเจนต์ MTT เป็นเวลา 4 ชั่วโมง สารละลายในหลุมถูกทิ้งในเวลาต่อมาและ DMSO 150 ไมโครลิตรถูกเติมและแกว่งเป็นเวลา 10 นาที วัดการดูดกลืนแสงของแต่ละตัวอย่างที่ความยาวคลื่น 570 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลทอัตโนมัติ เปอร์เซ็นต์ของการมีชีวิตของเซลล์ (%)=ค่าเฉลี่ยการดูดกลืนแสงของกลุ่มทดลอง/ค่าเฉลี่ยการดูดกลืนแสงของกลุ่มควบคุมเชิงลบ × 100%

ความเข้มข้นที่เกี่ยวข้องของตัวกลาง MPP+ ถูกเติมสำหรับการบำบัด 24- ชั่วโมงในเซลล์ MES23.5 โดยใช้วิธีการเดียวกันกับสำหรับการเพาะเลี้ยง ในหลอดทดลอง หลังจากบำบัดแล้วสารละลายในบ่อก็ถูกทิ้งไป ตัวกลางที่มีความเข้มข้นต่างกัน (10, 50, 100, 200, 250, 500 และ 1,000 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ของผงนาโน C. tubulosa ถูกเติมไปยังเซลล์ MES23.5 ในหลุมที่แตกต่างกัน และปล่อยให้บ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมงและ 48 ชั่วโมง เซลล์ MES23.5 ที่ถูกบ่มด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อปกติเป็นเวลา 24 ชั่วโมงและ 48 ชั่วโมงถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบ เซลล์ MES23.5 ที่ถูกบ่มด้วยตัวกลาง MPP+ ถูกใช้เป็นกระสายยา ทำการวัดเป็นสามเท่าสำหรับแต่ละตัวอย่าง การดูดกลืนแสงของกลุ่มการบำบัดและกลุ่มควบคุมที่สอดคล้องกันถูกวัดเพื่อคำนวณความมีชีวิตของเซลล์

สารสกัดจาก CITANCHE TUBULOSA ธรรมชาติ ป้องกันความเหนื่อยล้า PHGS75% ECH 30% ACT 12%

TH การแสดงออก วัดโดยอิมมูโนไซโตเคมี

เมื่อผงนาโน C. tubulosa อยู่ใน 100, 200 และ 250 µg/ml อัตราการรอดชีวิตของเซลล์เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 2G) ดังนั้น ในการทดลองครั้งต่อๆ มา เราได้ทดสอบความเข้มข้นสามแบบ: กลุ่มที่มีขนาดต่ำ ขนาดกลาง และสูง มีการทดสอบการจำลองสามครั้งสำหรับแต่ละกลุ่ม C. tubulosa แผ่นปิดเคลือบโพลีไลซีนที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วถูกใส่ลงในจานหลุม 6- จากนั้น เพาะเซลล์ขนาด 5 × 104 เซลล์ในแต่ละหลุมและฟักเป็นเวลา 24 ชั่วโมง อาหารสดแบบธรรมดาถูกแทนที่ในกลุ่มควบคุมปกติและความเข้มข้นสุดท้ายของตัวกลาง MPP+ 100 ไมโครโมล/ลิตรถูกแทนที่ในกลุ่มการบำบัดที่เหลือเพื่อบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นสื่อสดแบบธรรมดาถูกแทนที่ในกลุ่มควบคุมปกติและกลุ่มกระสายยา และความเข้มข้นสุดท้ายที่ 100, 200 และ 250 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ผงนาโน C. tubulosa ถูกบ่มด้วยเซลล์เป็นเวลา 24 ชั่วโมงในปริมาณต่ำ ปานกลาง และสูง กลุ่มการรักษา C. tubulosa ตามลำดับ เซลล์ MES23.5 ในกลุ่มที่แตกต่างกันถูกล้างสามครั้งใน PBS เพื่อกำจัดส่วนลอยเหนือตะกอนออกและตรึงเพิ่มเติมในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% เป็นเวลา 15 นาที หลังจากการล้างด้วย PBS เซลล์ถูกบ่มด้วยเปอร์ออกซิเดสบล็อคเกอร์ที่ 37°C เป็นเวลา 30 นาทีแล้วล้างอีกครั้งด้วย PBS สารละลายไทรทัน X-100 0.2% ถูกใช้สำหรับการซึมผ่านของเซลล์เป็นเวลา 10 นาที ตามด้วยการล้างด้วย PBS ซีรั่มแพะปกติถูกเติมไปยังแต่ละตัวอย่างและบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที จากนั้นซีรั่มแพะปกติจะถูกเอาออก และเติมแอนติบอดีปฐมภูมิที่เจือจาง 1:400 ใน PBS ลงในแต่ละตัวอย่างและบ่มที่อุณหภูมิ 4°C ข้ามคืน เซลล์ในกลุ่มควบคุมเชิงลบถูกบ่มด้วย PBS ที่ 4°C ข้ามคืน หลังจากการล้างด้วย PBS เซลล์จะถูกบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่มีฉลากไบโอตินในห้องความชื้นที่ 37°C เป็นเวลา 20 นาที จากนั้นตัวอย่างแต่ละตัวอย่างถูกล้างใน PBS และติดฉลากด้วยคอนจูเกตฮอสราดิช เปอร์ออกซิเดส-สเตรปตะวิดิน (สารละลายทำงาน C) ที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 20 นาที หลังจากล้างด้วย PBS เซลล์จะถูกย้อมด้วยรีเอเจนต์ DAB ในที่มืดเป็นเวลาประมาณ 1–10 นาที และตรวจสอบการพัฒนาของสีน้ำตาลภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง จากนั้นแต่ละตัวอย่างจะถูกล้างสองครั้งในน้ำกลั่นเป็นเวลา 1–2 นาที และนิวเคลียสถูกขัดขวางด้วยสารละลายฮีมาทอกซิลินเป็นเวลา 0.5–1 นาที หลังจากล้างตัวอย่างแต่ละตัวอย่างในน้ำอย่างละเอียดแล้ว เซลล์จะถูกแช่ในกรดไฮโดรคลอริกแอลกอฮอล์ 1% เพื่อสร้างความแตกต่างและแอมโมเนียที่เป็นน้ำ 1% ตามด้วยการล้างเซลล์ในน้ำอย่างทั่วถึง จากนั้น เซลล์จากแต่ละตัวอย่างจะถูกทำให้แห้งในเอทานอล 70% เป็นเวลา 2 นาที, เอทานอล 80% เป็นเวลา 2 นาที, เอทานอล 90% เป็นเวลา 2 นาที สองครั้ง, เอทานอล 95% เป็นเวลา 2 นาที สองครั้ง และเอทานอล 100% เป็นเวลา 2 นาที สองครั้ง จากนั้น เซลล์ถูกแช่ในสารละลายไซลีนเป็นเวลา 2 นาทีสองครั้งและติดตั้งบนสไลด์แก้วที่มีเรซินที่เป็นกลาง ภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง แต่ละตัวอย่างได้รับการจับภาพและสุ่มเลือกเขตข้อมูลภาพที่มีประสิทธิภาพ 5-10 ช่อง เพื่อกำหนดการแสดงออกของโปรตีนที่เลือกในเซลล์ประสาทโดปามิเนอร์จิคที่ระบุโดยความเข้มของอนุภาคสีน้ำตาล และเพื่อหาปริมาณโปรตีนแบบกึ่งด้วยค่าสีเทาเฉลี่ย .

อัตราการตายของเซลล์ MES23.5 ที่วัดโดยโฟลว์ไซโตเมทรี

เซลล์ที่เกาะติดถูกล้างหนึ่งครั้งด้วย PBS สำหรับการแยกเซลล์ มีการเติมสารละลายทริปซินที่ปราศจาก EDTA ในปริมาณที่เหมาะสมที่อุณหภูมิห้อง และสารละลายถูกปิเปตอย่างอ่อนโยนเพื่อให้เซลล์ที่ยึดเกาะหลุดออก จากนั้นจึงเติมอาหารเลี้ยงเซลล์เพื่อหยุดทริปซิไนเซชัน ของผสมถูกถ่ายโอนไปยังหลอดสำหรับการหมุนเหวี่ยงใหม่แล้วปั่นเหวี่ยงเป็นเวลา 5 นาทีที่ 1500 รอบต่อนาทีเพื่อรวบรวมเซลล์ที่แยกเดี่ยว หลังจากการทิ้งส่วนลอยเหนือตะกอน เม็ดเซลล์ถูกแขวนลอยใหม่อย่างอ่อนโยนโดยใช้ PBS และเซลล์ถูกนับ เซลล์ที่ถูกแขวนลอยใหม่ประมาณ 1 × 105 ถึง 5 × 105 ถูกปั่นแยกเป็นเวลา 5 นาทีที่ 1500 รอบต่อนาที และส่วนลอยเหนือตะกอนถูกทิ้งไป สารละลายการจับ Annexin V-FITC ห้าไมโครลิตรถูกเติมไปยังเพลเลตของเซลล์เพื่อแขวนลอยเซลล์อีกครั้งอย่างอ่อนโยน แอนเนกซิน V-FITC อีก 5 ไมโครลิตรถูกเติมและผสมให้เข้ากัน ใช้สารละลายโพรพิเดียม ไอโอไดด์ 5 ไมโครลิตรในการย้อมสีเซลล์โดยการบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาทีไม่นานก่อนโฟลว์ไซโตเมทรี

การวิเคราะห์ Western Blot สำหรับในหลอดทดลอง

เซลล์ถูกแบ่งออกเป็นกลุ่มปกติ กลุ่มบำบัด MPP+ ขนาดต่ำค. ทูบูโลซากลุ่มการรักษา กลุ่มการรักษา C. tubulosa ขนาดปานกลาง และกลุ่มการรักษา C. tubulosa ขนาดสูง วัดการแสดงออกของ Bcl2 และ Bax ในแต่ละอัน มีการใช้เซลล์ทั้งหมด 1 × 105 เซลล์ต่อหลุมในเพลตหลุม 6- สำหรับการสร้างแบบจำลองและการบำบัดในแต่ละกลุ่มก่อนการเก็บเกี่ยวเซลล์ ไลเซตผสมซึ่งประกอบด้วยบัฟเฟอร์ RIPA, ตัวยับยั้งโปรตีเอส และตัวยับยั้งฟอสฟาเตส ถูกเติมเพื่อทำให้ไลเซเซลล์เป็นเวลา 30 นาทีบนน้ำแข็ง หลังจากการปั่นเหวี่ยง ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์โปรตีน โปรตีนทั้งหมดถูกหาปริมาณโดยใช้การสอบวิเคราะห์ BCA และแยกออกด้วย SDS-PAGE 10% โปรตีนที่แยกออกมาถูกถ่ายโอนไปยังเมมเบรนและบ่มด้วยบัฟเฟอร์ขัดขวางนมพร่องมันเนย 5% ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 ชั่วโมง จากนั้นเมมเบรนถูกบ่มในแอนติบอดีปฐมภูมิ (Bcl-2 0.34 มก./มล., Bax 0.11 มก./มล., การเจือจาง 1:200) ที่ 4°C ในชั่วข้ามคืน หลังจากขั้นตอนการล้าง เมมเบรนถูกบ่มในแอนติบอดีทุติยภูมิ (0.5 มก./มล., การเจือจาง 1:5000) ที่ 4°C เป็นเวลา 1 ชั่วโมงและจากนั้นในผู้พัฒนา ECL เป็นเวลา 2 นาทีสำหรับการพัฒนาแบบทั่วไป ซอฟต์แวร์ Number One ใช้สำหรับการวิเคราะห์แบบกึ่งปริมาณของการแสดงออกของโปรตีน

ถังเก็บน้ำธรรมชาติ TUBULOSA เพื่อต้านความเหนื่อยล้า ปกป้องตับ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

การสร้างแบบจำลองสัตว์ทดลองและการบริหารยา

หนูตัวผู้ที่ปลอดเชื้อโรคจำเพาะ 8- จำนวนห้าสิบตัวถูกสุ่มแบ่งออกเป็นห้ากลุ่ม: กลุ่มปกติ, กลุ่มบำบัด MPTP (พาหะนำ), กลุ่มบำบัด C. tubulosa ขนาดต่ำ, การบำบัด C. tubulosa ขนาดปานกลาง และกลุ่มรักษา C. tubulosa ขนาดสูง สัตว์เหล่านี้ถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 20–22°C และสามารถเข้าถึงอาหารและน้ำได้ฟรี หนูในกลุ่มปกติถูกฉีดเข้าช่องท้องด้วยน้ำเกลือปกติในปริมาณเท่ากันเป็นเวลาเจ็ดวันติดต่อกัน หนูในกลุ่มการบำบัดอื่นๆ ถูกฉีดในช่องท้องด้วย MPTP (30 มก./กก./วัน) เป็นเวลาเจ็ดวันติดต่อกันเพื่อสร้างกระสายยา

ในระหว่างการสร้างแบบจำลอง PD หนูในกลุ่มการรักษา C. tubulosa ขนาดต่ำ, ขนาดปานกลาง และขนาดสูงได้รับการบริหารให้ในปริมาตรทางคลินิกที่เทียบเท่ากันในกระเพาะอาหารที่ 4 กรัม/กก./วัน, 8 กรัม/กก./วัน และ 16 กรัม/ กิโลกรัม/วันC. tubulosa ผงนาโนตามลำดับเป็นเวลา 14 วันติดต่อกัน หนูเมาส์ในกลุ่มควบคุมและกลุ่มกระสายยาถูกบริหารให้ปริมาตรที่เท่ากันของน้ำเกลือปกติทางช่องท้องเป็นเวลา 14 วันติดต่อกัน ขั้นตอนการทดลองทั้งหมดได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมของมหาวิทยาลัยฝูเจี้ยนแห่ง TCM และดำเนินการตามหลักการที่ได้รับการยอมรับในระดับสากลสำหรับการใช้และการดูแลสัตว์ทดลอง มีความพยายามทุกวิถีทางเพื่อลดความทุกข์ทรมานของสัตว์ในการศึกษานี้