Cistanche Tubulosa Phenylethanoid Glycosides ทำให้เกิดการตายของเซลล์ในเซลล์ Eca-109 ผ่านทางวิถีทางที่ขึ้นกับไมโตคอนเดรีย

การแนะนำ

มะเร็งหลอดอาหารเป็นมะเร็งประเภทหนึ่งที่พบบ่อยที่สุด โดยมีอัตราการเจ็บป่วยสูงสุดอันดับที่ 11 และอัตราการเสียชีวิตสูงสุดอันดับที่ 6 ของโลก และทำให้เกิดการเสียชีวิตประมาณ 439,000 รายในปี 2558 อุบัติการณ์ของมะเร็งหลอดอาหารมีความแตกต่างกันไปในแต่ละภูมิภาค โดยทางตะวันออก เอเชีย แอฟริกาตะวันออกและแอฟริกาตอนใต้มีอัตราการเกิดอุบัติการณ์สูงสุด และแอฟริกาตะวันตกมีอัตราต่ำที่สุดในปี 2012 ในประเทศจีน จำนวนผู้ป่วยมะเร็งหลอดอาหารและการเสียชีวิตโดยประมาณอยู่ที่ 477,000 และ 375,000 ตามลำดับ ในปี พ.ศ. 2558 แม้ว่าอัตราการป่วยด้วยโรคมะเร็งหลอดอาหารจะลดลงในประเทศที่มีดัชนีประชากรสังคมระดับกลางและระดับสูงระหว่างปี พ.ศ. 2548 ถึง พ.ศ. 2558 แต่อัตราการเสียชีวิตยังคงสูงเนื่องจากการพยากรณ์โรคที่ไม่ดี การผ่าตัดร่วมกับเคมีบำบัดหรือการฉายรังสีร่วมกันถูกนำมาใช้เพื่อรักษามะเร็งหลอดอาหาร อย่างไรก็ตาม มีรายงานว่าระหว่างปี 2003 ถึง 2014 อัตราการรอดชีวิต 5- ปียังคงอยู่<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studyแสดงให้เห็นว่าCistanche tubulosa ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์(CTPG) สามารถยับยั้งการเติบโตของเซลล์มะเร็งผิวหนังชนิด B16-F10 ในหลอดทดลอง และในร่างกาย (24) อย่างไรก็ตาม ความสามารถในการละลายน้ำต่ำของ CTPG ที่ใช้ก่อนหน้านี้จำกัดการพัฒนายา ดังนั้นจึงใช้ CTPG ที่ละลายน้ำได้ (CTPG-W) และฤทธิ์ต้านเนื้องอกต่อเซลล์มะเร็งหลอดอาหาร (Eca{5}}) จึงถูกตรวจสอบ ได้มีการพิจารณาแล้วว่า CTPG-W สามารถยับยั้งความมีชีวิตของเซลล์ Eca-109 โดยขึ้นอยู่กับขนาดยา ผ่านการเหนี่ยวนำของการตายของเซลล์ผ่านทางวิถีที่ขึ้นกับไมโตคอนเดรีย

CISTANCHE TUBULOSA ธรรมชาติสำหรับการปรับปรุงการทำงานทางเพศ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

วัสดุและวิธีการ

สัตว์.

หนูเมาส์ C57BL/6 ตัวเมีย (6-8 สัปดาห์ ~25 กรัม) ซื้อจากศูนย์วิจัยสัตว์ทดลองปักกิ่ง (ปักกิ่ง ประเทศจีน) และเลี้ยงไว้ในห้องควบคุมอุณหภูมิ (25˚C) แบบหมุนเวียนแสง (12/ 12) สิ่งอำนวยความสะดวกด้านสัตว์ของมหาวิทยาลัยซินเจียง (อุรุมชี จีน) สัตว์ทุกตัวได้รับน้ำและอาหารปลอดเชื้อโรค

เส้นเซลล์และวัฒนธรรม

เซลล์มะเร็งหลอดอาหารของมนุษย์ (Eca-109) ได้รับการเก็บรักษาโดยห้องปฏิบัติการทรัพยากรชีวภาพและพันธุศาสตร์หลักของซินเจียง (วิทยาลัยวิทยาศาสตร์ชีวภาพและเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยซินเจียง อุรุมชี ประเทศจีน) และเพาะเลี้ยงใน RPMI{{1} } สื่อ (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., วอลแทม, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา) เสริมด้วยซีรั่มของวัวในครรภ์ที่ยับยั้งความร้อน 10% (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, เจียงซู, จีน), 1% ลิตร -กลูตามีน (100 มิลลิโมลาร์) เพนิซิลลิน 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร และสเตรปโตมัยซิน 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ที่ 37°C ในบรรยากาศที่มีความชื้นซึ่งมี CO2 5%

โครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง (HPLC)

CTPG-W (cat. no. SGJG20170410) ถูกซื้อจาก Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (เซี่ยงไฮ้, จีน) สารประกอบหลักของ CTPG มีคุณสมบัติและปริมาณโดย HPLC ตามการศึกษาก่อนหน้าของเรา (24) โดยสรุป HPLC ถูกดำเนินการบนคอลัมน์ ZORBAX SB‑C18 (250x4.6 มม.; 5 ไมโครเมตร) ที่ 30°C และชะด้วยสารละลายกรดฟอร์มิก 0.2% และการไล่ระดับของเมทานอลเริ่มต้นที่ 23% โดยที่ 1 มิลลิลิตรถูกเติมทุกๆ นาที เป็นเวลา 45 นาที จนถึง 31% ตัวอย่างทั้งหมด 10 ไมโครลิตรถูกฉีดและตรวจพบที่ 330 นาโนเมตร มาตรฐานเอคินาโคไซด์ซื้อจาก Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (เซี่ยงไฮ้, จีน) และมาตรฐานแอคทีโอไซด์ซื้อจาก Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) มาตรฐานถูกใช้เพื่อวิเคราะห์ส่วนประกอบของ CTPG-W

การทดสอบ MTT

การเพิ่มจำนวนเซลล์ถูกวัดด้วยการสอบวิเคราะห์ MTT เซลล์ Eca{{0}} ได้รับการปลูกเชื้อในเพลตหลุม 96- ที่ความหนาแน่น 5x103 เซลล์ใน 100 µl RPMI{{5 }} ตัวกลาง/หลุมและเพาะเลี้ยงที่ 37°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกัน (0, 200, 400, 600 และ 800 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ของ CTPG-W หรือ 0.4% ไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO) เป็นเวลา 24 48 และ 72 ชม. DMSO ถูกใช้เป็นตัวควบคุมตัวทำละลาย (800 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร CTPG-W ที่มี 0.4 เปอร์เซ็นต์ DMSO) ซิสพลาติน (20 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวก ต่อมา, ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกทิ้งหลังจากการปั่นเหวี่ยงที่ 225 xg เป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้องและสารละลาย MTT 100 µl (0.5 มก./มล. ในตัวกลาง RPMI-1640 ที่ไม่มี FBS) ถูกเติมลงในแต่ละหลุมและบ่มที่ 37°C เป็นเวลา 3 ชม. ผลึกฟอร์มาซานที่ถูกขึ้นรูปถูกละลายใน 200 ไมโครลิตร DMSO ค่าความหนาแน่นของแสง (OD) วัดที่ความยาวคลื่น 490 นาโนเมตรโดยเครื่องอ่านไมโครเพลท 96-หลุม (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) ความมีชีวิตของเซลล์สัมพัทธ์ถูกคำนวณตามสูตร: ความอยู่รอดของเซลล์ (%)=(OD ทรีต/OD ที่ไม่ทรีท) x100% สัณฐานวิทยาของเซลล์ Eca‑109 ถูกสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบกลับหัว (กำลังขยาย x200) (Nikon Eclipse Ti‑E; Nikon Corporation, โตเกียว, ญี่ปุ่น)

สำหรับการแพร่กระจายของม้ามโต หนูเมาส์ C57BL/6 ถูกการุณยฆาตโดยการเคลื่อนตัวของปากมดลูก และม้ามถูกแยกออก สารแขวนลอยเซลล์เดียวถูกสร้างขึ้นและเซลล์ม้ามถูกเพาะลงในจานหลุม 96- ที่ความหนาแน่น 1x1 0 5 เซลล์/หลุมในตัวกลาง 100 µl RPMI-1640 จากนั้นจึงบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกัน (0, 200, 400, 600 และ 800 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ของ CTPG-W เป็นเวลา 24, 48 และ 72 ชั่วโมงที่ 37°C โดยมี CO2 5% การแพร่กระจายของม้ามโตถูกวัดโดยการทดสอบ MTT ตามเกณฑ์วิธีดังกล่าวข้างต้น ดัชนีการกระตุ้น=ODได้รับการรักษา/ODไม่ถูกรักษา

การวัดการตายของเซลล์และวัฏจักรของเซลล์ เพาะเลี้ยงเซลล์ Eca{{0}} ในจานขนาด 60 มม. ที่ความหนาแน่น 2.5x105 เซลล์/จานเป็นเวลา 24 ชั่วโมงและบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกัน ({{31} }, 200, 400, 600 และ 800 µg/ml) ของ CTPG-W หรือ 0.4% DMSO เป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 37˚C โดยมี CO2 5% เซลล์ถูกรวบรวมและย้อมด้วยชุดตรวจหาการตายของเซลล์ของ Annexin V ‑ fluorescein isothiocyanate (FITC) / Propidium iodide (PI) (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., เซี่ยงไฮ้, จีน) ตามระเบียบการของผู้ผลิต ตัวอย่างถูกรวบรวมโดย flow cytometry (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) และวิเคราะห์โดย FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA) เพื่อวิเคราะห์ผลกระทบของ CTPG-W ต่อวัฏจักรของเซลล์ เซลล์ Eca-109 2.5x105 ถูกเพาะในจานเพาะเลี้ยงขนาด 60 มม. และบำบัดด้วย CTPG-W (0, 100, 200 และ 400 µg/ml) หรือ 0.4 % DMSO เป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 37°C โดยมี CO2 5% เซลล์ทั้งหมดถูกเก็บเกี่ยวและล้างสองครั้งด้วย PBS เย็นน้ำแข็ง (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) จากนั้นตรึงในเอธานอลเย็นน้ำแข็ง 70% ที่ 4°C เป็นเวลา 30 นาที หลังจากการล้างสองครั้งด้วย PBS เย็นฉ่ำ เซลล์จะถูกแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์การย้อมสี 300 µl PI/RNase (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง การกระจายวัฏจักรของเซลล์ถูกวิเคราะห์ด้วยซอฟต์แวร์ ModFit LT 3.0 โดยโฟลว์ไซโตเมทรี (BD FACSCalibur)

ถังเก็บน้ำธรรมชาติ TUBULOSAต่อต้านความเหนื่อยล้าปกป้องตับ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

การวิเคราะห์ศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรีย (Δψm) และสายพันธุ์ออกซิเจนปฏิกิริยา (ROS)เพื่อวิเคราะห์เซลล์ Δψm เซลล์ Eca{{0}} ได้รับการบำบัดด้วย CTPG-W (0, 400, 600 และ 800 µg/ml) หรือ 0.4% DMSO สำหรับ 24 ชั่วโมงที่ 37°C โดยมี CO2 5% และย้อมด้วยชุดทดสอบศักยภาพของเยื่อไมโตคอนเดรียด้วย JC-1 (สถาบันเทคโนโลยีชีวภาพบีโยไทม์ เซี่ยงไฮ้ จีน) ตามระเบียบการของผู้ผลิต เป็นเวลา 20 นาทีที่ 37˚ ค. หลังจากการล้างสองครั้งด้วยบัฟเฟอร์การล้าง JC-1 (สถาบันเทคโนโลยีชีวภาพ Beyotime) ตัวอย่างถูกแขวนลอยอีกครั้งด้วยบัฟเฟอร์การล้าง JC‑1 300 ไมโครลิตร และวิเคราะห์โดยโฟลว์ไซโตเมทรี (BD FACSCalibur) นอกจากนี้ ยังสังเกตการเรืองแสงของสีย้อม JC‑1 ในเซลล์ Eca‑109 ด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบกลับหัว (กำลังขยาย x200; Nikon Eclipse Ti‑E) สำหรับการวิเคราะห์ ROS เซลล์ Eca-109 ได้รับการบำบัดด้วย CTPG-W (0, 400, 600 และ 800 µg/ml) เป็นเวลา 2, 4, 6, 12 และ 24 ชั่วโมง และย้อมด้วย Reactive Oxygen Species Assay ชุดอุปกรณ์ (สถาบันเทคโนโลยีชีวภาพ Beyotime) ตามระเบียบการของผู้ผลิต เป็นเวลา 20 นาทีที่ 37°C หลังจากการล้างสามครั้งด้วย PBS เย็นน้ำแข็ง ตัวอย่างถูกรวบรวมโดยโฟลว์ไซโตเมทรี (BD FACSCalibur) และวิเคราะห์โดยซอฟต์แวร์ FlowJo 7.6

รูปที่ 1 การควบคุมที่มีคุณสมบัติเหมาะสมของ CTPG-W ส่วนประกอบของ CTPG-W ได้รับการวิเคราะห์ในเชิงคุณภาพและเชิงปริมาณโดยโครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง และเปรียบเทียบกับมาตรฐานของเอคินาโคไซด์และแอกทีโอไซด์ CTPG-W ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ที่ละลายน้ำได้C. ทูบูโลซา.

ฤทธิ์กำจัดอนุมูลอิสระ 2,2-ไดฟีนิล-1-พิคริลไฮดราซิล (DPPH) กิจกรรมการกำจัดอนุมูลอิสระของ CTPG-W ถูกกำหนดด้วยการทดสอบอนุมูลอิสระ DPPH ตามระเบียบการที่เผยแพร่พร้อมการดัดแปลงเล็กน้อย เนื่องจากเมทานอลถูกแทนที่ด้วยเอทานอลเพื่อละลาย DPPH (25,26) สำหรับการวัดในสภาวะคงตัว DPPH 150 µl (100 มิลลิโมล/ลิตร) ในเอทานอลถูกผสมกับความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 และ 600 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ใน 50 ไมโครลิตร PBS และบ่มในที่มืดเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ตรวจพบการดูดกลืนแสงที่ 517 นาโนเมตรเมื่อมีและไม่มี CTPG-W วิตามินซีทั้งหมด 50 ไมโครลิตรถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก กิจกรรมการกำจัดอนุมูลอิสระของ DPPH คำนวณโดยใช้สูตร: การกำจัด (%)=[1-(Asample-Ablank)/A0] x100 โดยที่ Ablank คือค่าการดูดกลืนแสงของส่วนควบคุม (ไม่มี DPPH) Asample คือค่าการดูดกลืนแสงของตัวอย่าง และ A0 คือค่าการดูดกลืนแสงของ PBS ที่มี DPPH

การวิเคราะห์แบบตะวันตก เซลล์ Eca{{0}} ได้รับการบำบัดด้วย CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) หรือ 0.4% DMSO เป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 37˚C พร้อมด้วย 5% CO2 ต่อไปนี้ล้างสองครั้งด้วย PBS เซลล์ 

รูปที่ 2 ผลของ CTPG-W ต่อการเจริญเติบโตของเซลล์ Eca-109 และเซลล์ม้าม (A) เซลล์ Eca-109 ได้รับการบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CTPG-W เป็นเวลา 24, 48 และ 72 ชั่วโมง จากนั้นตรวจพบความมีชีวิตของเซลล์ด้วยการทดสอบ MTT (B) การเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาของเซลล์ Eca-109 ตามการรักษาด้วย CTPG-W ที่ 24 ชั่วโมง (C) เซลล์ม้ามของหนู C57BL/6 ได้รับการบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CTPG-W เป็นเวลา 24, 48 และ 72 ชั่วโมง จากนั้นวิเคราะห์การแพร่กระจายด้วยการสอบวิเคราะห์ MTT**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. ทูบูโลซา.

ถูก lysed ใน Radioimmunoprecipitation Assay Lysis buffer (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Beijing, China) เป็นเวลา 20 นาทีบนน้ำแข็ง หลังจากการปั่นเหวี่ยงที่ 10,000 xg เป็นเวลา 10 นาทีที่ 4°C ส่วนลอยเหนือตะกอนจะถูกรวบรวม และตรวจพบความเข้มข้นของโปรตีนด้วยชุดกรดไบซินโคนิก (Thermo Fisher Scientific, Inc.) ตามระเบียบการของผู้ผลิต การวิเคราะห์ Western blot ดำเนินการตามคำอธิบายก่อนหน้าของเรา (24) แอนติบอดีต่อแคสเพส-7 (cat. no. D120077), แคสเพส-8 (cat. no. D155240), แคสเพส-9 (cat. no. D220078), มะเร็งต่อมน้ำเหลืองบีเซลล์{ {13}} (Bcl-2)-X ที่เกี่ยวข้องกัน (Bax) (cat. no. D220073) และ Bcl-2 (cat. no. D260117) และ IgG-ฮอสแรดิชเปอร์ออกซิเดสที่ต้านหนูเมาส์ (HRP ) (cat. no. D111050) และ anti-rabbit IgG-HRP (cat. no. D110058) ถูกซื้อจาก BBI Life Sciences (เซี่ยงไฮ้, จีน) แอนติบอดีต่อแคสเปส-3 (cat. no. E-AB-10050) และแคสเปสที่ออกฤทธิ์-3 (cat. no. E-AB-22115) ถูกซื้อจาก Elabscience ( เมืองอู่ฮั่น ประเทศจีน) แอนติบอดีอื่นๆ ที่ต้านแคสเปส-7 (cat. no. 9492), โพลี (ADP-ไรโบส) โพลีเมอเรส (PARP) (cat. no. 9542), ไซโตโครม c (cat. no. AC909), c-Jun NH{ {37}}เทอร์มินัลไคเนส (JNK) (cat. no. 9252S) และ -actin (cat. no. 58169) ได้มาจาก Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) แอนติบอดีปฐมภูมิและทุติยภูมิทั้งหมดถูกเจือจางที่ 1:1,000 แอนติบอดีปฐมภูมิถูกบ่มที่ 4°C ข้ามคืนและแอนติบอดีทุติยภูมิถูกบ่มที่ 37°C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง

รูปที่ 3 การตายของเซลล์ Eca-109 ที่เกิดจาก CTPG-W เซลล์ได้รับการบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CTPG-W เป็นเวลา 24 ชั่วโมง (A) เซลล์ Eca-109 แบบ apoptotic และ necrotic ถูกวิเคราะห์โดย flow cytometry แผงด้านบนแสดงแผนภาพจุดแต่ละจุด และแผงด้านล่างแสดงข้อมูลสรุป * ป<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. ทูบูโลซา.

ตรวจพบโปรตีนเป้าหมายโดยใช้ชุดทดสอบเคมีเรืองแสงที่ได้รับการปรับปรุง (สถาบันเทคโนโลยีชีวภาพ Beyotime) ตามระเบียบการของผู้ผลิต

การวิเคราะห์ทางสถิติ. นัยสำคัญทางสถิติคำนวณโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวด้วยการทดสอบหลังการทดลองของ Tukey และวิเคราะห์ผลลัพธ์โดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism 5.0 (ซอฟต์แวร์ GraphPad, La Jolla, CA, USA) ในกลุ่มการรักษาและกลุ่มควบคุม ข้อมูลทั้งหมดนำเสนอเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน ป<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

สารสกัด CISTANCHE TUBULOSA สำหรับการปรับปรุงการทำงานของไต PHGS75% ECH 30% ACT 12%

ผลลัพธ์

CTPG-W ยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลล์ Eca-109

ส่วนประกอบของ CTPG-W ผ่านการรับรองและวัดปริมาณโดย HPLC (รูปที่ 1) ซึ่งเปรียบเทียบกับมาตรฐานของเอคินาโคไซด์และแอคทีโอไซด์ ตามเวลาการคงอยู่สูงสุดและพื้นที่พีค CTPG-W มีเอไคนาโคไซด์ 39.16% และแอคทีโอไซด์ 2.44% ประการแรก ผลของ CTPG-W ต่อการมีชีวิตของเซลล์ Eca-109 ถูกกำหนดด้วยการสอบวิเคราะห์ MTT CTPG-W ถูกละลายใน DMSO ที่ 200 มก./มล. และเจือจางด้วยตัวกลาง RPMI-1640 ที่มี FBS ที่ทำให้หมดฤทธิ์ด้วยความร้อน 10% จนถึงความเข้มข้นที่ระบุ เซลล์ Eca-109 ได้รับการบำบัดด้วย CTPG-W และความมีชีวิตของเซลล์ได้รับการวิเคราะห์ด้วยการสอบวิเคราะห์ MTT ที่จุดเวลาที่ระบุ การบำบัดด้วย CTPG‑W ลดความมีชีวิตของเซลล์ Eca-109 ลงอย่างมีนัยสำคัญในลักษณะขนาดยาและขึ้นอยู่กับเวลา (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

รูปที่ 4 ผลของ CTPG-W ต่อการกระจายวัฏจักรของเซลล์ในเซลล์ Eca-109 ความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CTPG-W ถูกนำมาใช้เพื่อรักษาเซลล์ Eca-109 เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และการวิเคราะห์การกระจายวัฏจักรของเซลล์โดยโฟลว์ไซโตเมทรี * ป<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. ทูบูโลซา.

CTPG-W ทำให้เกิดการตายของเซลล์ในเซลล์ Eca-109 เพื่อตรวจสอบว่า CTPG-W ยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลล์ Eca-109 ผ่านการเหนี่ยวนำของการตายของเซลล์หรือเนื้อร้ายหรือไม่ เซลล์จะได้รับการบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CTPG-W หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมง ตรวจพบการตายของเซลล์และเนื้อร้ายของเซลล์ Eca-109 ด้วยการย้อมสี Annexin V/PI ตามที่แสดงไว้ในรูปที่ 3A เซลล์ของแอนเน็กซิน V- /PI+ ถูกควบคุมเป็นเซลล์ที่ตายแล้ว และเซลล์ของแอนเน็กซิน V+ /PI+ และแอนเน็กซิน V+ /PI- ถูกควบคุมเป็นเซลล์อะพอพโทติก CTPG-W ชักนำให้เกิดการตายของเซลล์ Eca-109 ในลักษณะขึ้นอยู่กับขนาดยาเป็นหลัก แม้ว่าเซลล์ Eca-109 ที่ตายยังเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญภายใต้การบำบัดด้วย CTPG-W 600 และ 800 µg/ml (P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG-W ชักนำให้เกิดการหยุดวัฏจักรของเซลล์ที่ระยะ S ใน Eca-109 เซลล์ การรบกวนของวัฏจักรของเซลล์มะเร็งจะยับยั้งการเติบโตของเซลล์และส่งเสริมการตายของเซลล์ (27) ตรวจพบการกระจายของวัฏจักรของเซลล์ในเซลล์ Eca-109 ด้วยการย้อมสี PI หลังการบำบัดด้วย CTPG-W เป็นเวลา 24 ชั่วโมง พบว่าเซลล์ในระยะ S เพิ่มขึ้นและเซลล์ในระยะ G0/G1 บ่งชี้ว่าการรักษา CTPG-W ลดลงอย่างมีนัยสำคัญโดยรวม (P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG-W ลดลง Δψm และกระตุ้นการปล่อยไซโตโครม c การตายของเซลล์สามารถเกิดขึ้นได้จากวิถีทางที่ขึ้นกับไมโตคอนเดรีย (28,29) สมาชิกโปรและแอนตี้อะพอพโทติคของตระกูลโปรตีน BCL-2 มีบทบาทสำคัญในการควบคุมความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรีย (30,31) หลังจากการรักษาด้วย CTPG-W เป็นเวลา 24 ชั่วโมง Δψm ได้รับการประเมินโดยใช้การย้อมสี JC-1 มวลรวม JC‑1 (ตรวจพบเรืองแสงสีแดงใน FL‑2) จะสลายตัวเป็นโมโนเมอร์ (ตรวจพบเรืองแสงสีเขียวใน FL-1) เมื่อ Δψm ลดลง (32) ดังที่ปรากฎในรูปที่ 5A ความถี่ของเซลล์ FL -1+ FL -2-/+ เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา ซึ่งบ่งชี้ว่า Δψm ของเซลล์ Eca-109 ลดลง การเปลี่ยนแปลงของแสงเรืองแสงในเซลล์ Eca-109 ยังถูกสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงแบบกลับด้าน (รูปที่ 5B) เมื่อความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นของ CTPG-W แสงเรืองแสงสีแดงลดลง และแสงเรืองแสงสีเขียวเพิ่มขึ้น ซึ่งสอดคล้องกับข้อมูลจากโฟลไซโตเมทรี นอกจากนี้ยังพบว่าระดับของไซโตโครม c ในไซโตโซลเพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัด (รูปที่ 5C) ซึ่งเป็นผลมาจากการลดลงของΔψm สิ่งนี้ตอกย้ำข้อสรุปที่ได้จากจำนวนเซลล์ FL-1+ FL-2-/+ ที่เพิ่มขึ้นที่ Δψm ลดลงอันเป็นผลมาจากการรักษา CTPG-W มีรายงานว่า JNK สามารถควบคุมการกระตุ้นการทำงานของตระกูลโปรตีน BCL-2 ซึ่งทำให้เกิดการปลดปล่อยไซโตโครม c (33-35) นอกจากนี้ยังพิจารณาด้วยว่าระดับของ JNK ได้รับการควบคุมอย่างเห็นได้ชัดหลังจากการรักษาด้วย CTPG-W (รูปที่ 5C) ผลการวิจัยระบุว่า CTPG-W อาจกระตุ้นการตายของเซลล์ Eca-109 ผ่านทางวิถีที่ขึ้นกับไมโตคอนเดรีย

รูปที่ 5 การลดลงของ Δψm และการควบคุมไซโตโครม c และ JNK เซลล์ Eca-109 ได้รับการบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CTPG-W เป็นเวลา 24 ชั่วโมง (A) ตรวจพบ Δψm โดยการย้อมสี JC-1 และวิเคราะห์ตัวอย่างโดย flow cytometry ดอตพล็อตแต่ละจุดแสดงถึงการเปลี่ยนแปลงของการเรืองแสง JC-1 ความถี่ของเซลล์ FL-1+ FL-2-/+ จะแสดงอยู่ในแผงด้านล่าง ***ป<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

รูปที่ 6 ระดับของ ROS ในเซลล์ Eca-109 ตามการรักษาด้วย CTPG-W และฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของ CTPG-W (A) เซลล์ Eca -109 ได้รับการบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CTPG-W และระดับของ ROS ถูกวิเคราะห์โดย flow cytometry ณ จุดเวลาที่ระบุ * ป<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

ผลของ CTPG-W ต่อการสร้าง ROS ภายในเซลล์ROS สามารถลด Δψm เพื่อกระตุ้นการตายของเซลล์ (36) เพื่อตรวจสอบว่า CTPG-W สามารถเพิ่มการผลิต ROS ได้หรือไม่ เซลล์ Eca-109 ได้รับการบำบัดด้วย CTPG-W ที่มีความเข้มข้นต่างกัน เซลล์ถูกรวบรวมที่จุดเวลาที่ระบุไว้และย้อมด้วย DCFH-DA การผลิต ROS ภายในเซลล์ในเซลล์ Eca-109 ถูกกำหนดโดยโฟลว์ไซโตเมทรี ตามที่แสดงไว้ในรูปที่ 6A, 800 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร CTPG-W เพิ่มการผลิต ROS อย่างมีนัยสำคัญตั้งแต่ 2-6 ชั่วโมง และลดลงจาก 12-24 ชั่วโมง นอกจากนี้ CTPG‑W 400 µg/ml เพิ่มการผลิต ROS อย่างมีนัยสำคัญจาก 12-24 ชั่วโมง นอกจากนี้ CTPG-W 200 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรไม่ได้เปลี่ยนแปลงการผลิต ROS อย่างเห็นได้ชัด การเปลี่ยนแปลงแบบไดนามิกในการผลิต ROS อาจเกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ Eca{15}} นอกจากนี้ยังพิจารณาด้วยว่า CTPG-W มีฤทธิ์กำจัดอนุมูลอิสระ (รูปที่ 6B) ซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับการผลิต ROS ที่ลดลงในเซลล์ Eca-109 ที่บำบัดด้วย CTPG-W 800 µg/ml หลังจาก 12 ชั่วโมง

รูปที่ 7 ระดับของแคสเปสที่แยกออกและ PARP ที่แยกออกหลังการบำบัดด้วย CTPG-W แยกโปรตีนออกจากเซลล์ Eca -109 ที่บำบัดด้วย CTPG-W เป็นเวลา 24 ชั่วโมงและตรวจพบระดับของ cleaved-caspases และ cleaved-PARP ด้วยการวิเคราะห์แบบ western blot DMSO, ไดเมทิลซัลฟอกไซด์; CTPG-W ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ที่ละลายน้ำได้C. ทูบูโลซา- PARP, โพลี (ADP-ribose) โพลีเมอเรส

CTPG-W ควบคุมกิจกรรมของ caspase-3, caspase-7, caspase-9 และ PARP การปล่อยไซโตโครม c เนื่องจากการลดลง Δψm สามารถกระตุ้นแคสเปสโปรตีเอสเพื่อกระตุ้นการตายของเซลล์ (29,30,37) หลังจากการรักษาด้วย CTPG-W เป็นเวลา 24 ชั่วโมง การเปิดใช้งานแคสเปส -3, 7, 8, 9 และ PARP ถูกตรวจพบโดยการวิเคราะห์แบบเวสเทิร์นบล็อต เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม ระดับของ cleaved-caspase-9, cleaved-caspase-7, cleaved-caspase-3 และ cleaved-PARP แต่ไม่ใช่ระดับของ cleaved-caspase{{20 }} ได้รับการควบคุมโดยการรักษาด้วย CTPG ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา (รูปที่ 7) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า CTPG-W ลด Δψm และส่งเสริมการปล่อยไซโตโครม c เพื่อกระตุ้นแคสเปสที่กระตุ้นการตายของเซลล์ Eca-109

การอภิปราย

CHM แบบดั้งเดิมสามารถกระตุ้นการตายของเซลล์มะเร็งหลอดอาหารผ่านวิถีทางที่แตกต่างกัน รวมถึงตัวรับการเสียชีวิตจากภายนอก และวิถีทางความเครียดจากไมโตคอนเดรียภายในและเอนโดพลาสมิกเรติคูลัมภายใน (29) การศึกษาก่อนหน้าของเราแสดงให้เห็นว่า CTPG ซึ่งเป็นส่วนประกอบหลักของ C. tubulosa ยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลล์มะเร็งผิวหนังชนิด B16-F10 ผ่านการเหนี่ยวนำให้เกิดการตายของเซลล์ผ่านวิถีทางที่ขึ้นกับไมโตคอนเดรีย (24) ในการศึกษานี้ มีการตรวจสอบฤทธิ์ต้านเนื้องอกของ CTPG-W ต่อเซลล์ Eca-109 และพบว่า CTPG-W ยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลล์ Eca-109 ทำให้เกิดการตายของเซลล์ และการหยุดวัฏจักรของเซลล์ ลดลงΔψm เพิ่มการปล่อยไซโตโครม c และแคสเปสที่เปิดใช้งาน CTPG และ CTPG-W สามารถกระตุ้นการตายของเซลล์และการจับกุมวัฏจักรของเซลล์ในเซลล์มะเร็ง อย่างไรก็ตาม กลไกที่แม่นยำจะแตกต่างกันเนื่องจากส่วนประกอบที่แตกต่างกันของ CTPG (เอชินาโคไซด์ 26.64%, แอกทีโอไซด์ 10.19% และไอโซแอคทีโอไซด์ 1.71%) และ CTPG-W (เอชินาโคไซด์ 39.16% และแอกทีโอไซด์ 2.44%) CTPG จับเซลล์ B16-F10 ที่ระยะ G0/G1 แต่ CTPG-W จับเซลล์ Eca-109 ที่ระยะ S (24) การผลิต ROS เพิ่มขึ้นขึ้นอยู่กับขนาดยาโดย CTPG แต่บ่งชี้ถึงการเปลี่ยนแปลงในลักษณะขึ้นอยู่กับเวลาด้วยขนาดยาสูงของ CTPG-W ซึ่งเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในช่วงเริ่มต้นของการรักษา CTPG-W (2-6 ชั่วโมง) และ ลดลงอย่างมีนัยสำคัญหลังจาก 12 ชั่วโมง เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม เหตุผลที่เป็นไปได้ก็คือองค์ประกอบหลักของ CTPG-W คือเอไคนาโคไซด์ การศึกษาหลายชิ้นรายงานว่าเอคินาโคไซด์สามารถยับยั้งการผลิต ROS และการตายของเซลล์ที่เกิดจาก ROS เพื่อออกฤทธิ์ป้องกันระบบประสาทและต่อต้านวัย (38-40) ในทำนองเดียวกัน กิจกรรมการกำจัดอนุมูลอิสระถูกพบในการศึกษานี้ ดังนั้นจึงสันนิษฐานได้ว่าส่วนประกอบบางอย่าง รวมถึงเวอร์บาสโคไซด์ ไอโซเวอร์บาสโคไซด์ และซาลิโดรไซด์ในปริมาณสูงของ CTPG-W อาจกระตุ้นให้เกิดการสร้าง ROS ทันทีเพื่อทำให้เกิดการตายของเซลล์ Eca-109 (41,42) จากนั้น ROS ถูกขับไล่โดยเอจินาโคไซด์- อีกสาเหตุที่เป็นไปได้สำหรับความแตกต่างในการผลิต ROS โดย CTPG และ CTPG-W คือมีการใช้เซลล์ที่แตกต่างกันในการศึกษานี้และการศึกษาก่อนหน้า (24) Dong et al (43) รายงานว่า echinacoside สามารถกระตุ้นการตายของเซลล์มะเร็งลำไส้ใหญ่ SW480 ของมนุษย์ผ่านการสร้างความเสียหายของ DNA ออกซิเดชั่นโดยไม่เพิ่มระดับ ROS

การบำบัดด้วย CTPG-W ลดลง Δψm และทำให้เกิดการปลดปล่อยของไซโตโครม c ซึ่งส่งเสริมการแตกแยกของแคสเปส-9 (28) ระดับของคลีฟ-แคสเปส-9 ได้รับการควบคุมอย่างต่อเนื่องโดยการบำบัดด้วย CTPG-W ต่อมา แคสเพสที่ทำงานอยู่-9 สามารถกระตุ้นแคสเพส-3 เพื่อกระตุ้นการตายของเซลล์ (44) ระดับของคลีฟ-แคสเปส-3 ยังได้รับการควบคุมโดยการบำบัดด้วย CTPG-W อย่างไรก็ตาม แคสเปส-8 ไม่ได้ถูกกระตุ้นโดย CTPG-W ซึ่งบ่งชี้ว่าวิถีทางของตัวรับความตายภายนอกไม่เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ที่เกิดจาก CTPG-W การสังเกตเหล่านี้บ่งชี้ว่า CTPG-W ชักนำให้เกิดการตายของเซลล์ Eca-109 ผ่านการกระตุ้นวิถีที่ขึ้นกับไมโตคอนเดรีย

PARP มีบทบาทสำคัญในความเสถียรของจีโนมและสามารถแยกออกได้โดยแคสเปสที่ทำงานอยู่ โดยเฉพาะแคสเปส-3 และ -7 (45) ถูกกำหนดว่าการบำบัดด้วย CTPG-W กระตุ้นแคสเปส-3 และ -7 ซึ่งอาจแยก PARP ออกเพื่อยับยั้งการซ่อมแซม DNA และทำให้เกิดอะพอพโทซิส

CTPG-W ยังยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลล์มะเร็งเซลล์ตับ BEL-7404 ของมนุษย์ (ข้อมูลที่ยังไม่ได้เผยแพร่) โดยขึ้นอยู่กับขนาดยาและเวลา แม้ว่า CTPG-W จะยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลล์ Eca-109 และ BEL-7404 แต่ก็ส่งเสริมการแพร่กระจายของเซลล์ม้าม ซึ่งอาจเนื่องมาจากเนื้อหาของโพลีแซ็กคาไรด์ (~50%) ใน CTPG-W (46 ). ในทำนองเดียวกัน การศึกษาหลายชิ้นได้รายงานว่าโพลีแซ็กคาไรด์สามารถส่งเสริมการแพร่กระจายของเซลล์ม้าม (46-49) ในแบบจำลองเมาส์ พบว่า CTPG-W เพิ่มดัชนีม้ามอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม แต่ไม่ส่งผลกระทบต่อน้ำหนักตัวและดัชนีอวัยวะอื่นๆ รวมถึงหัวใจ ตับ ไต และปอด (ข้อมูลที่ยังไม่ได้เผยแพร่) บ่งชี้ว่า CTPG-W ไม่มีผลกระทบต่อเซลล์ปกติ

โดยรวมแล้ว ข้อมูลบ่งชี้ว่า CTPG-W ยับยั้งการเติบโตของเซลล์ Eca-109 โดยการเหนี่ยวนำการตายของเซลล์ผ่านทางวิถีที่ขึ้นกับไมโตคอนเดรีย

CISTANCHE TUBULOSA ธรรมชาติสำหรับการปรับปรุงการทำงานทางเพศ PHGS75% ECH 30% ACT 12%