Cistanche Deserticola Polysaccharide ลดทอน Osteoclastogenesis และการสลายของกระดูกผ่านการยับยั้งการส่งสัญญาณ RANKL และการผลิตออกซิเจนปฏิกิริยา

ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Dezhi Song et al

โรคกระดูกพรุนเป็นโรคที่เกิดจากการเผาผลาญที่มีลักษณะ osteopenia และการเสื่อมสภาพของโครงสร้างจุลภาคของกระดูก Osteoclasts เป็นเซลล์เอฟเฟกเตอร์หลักที่ทำให้เมทริกซ์ของกระดูกเสื่อมโทรมและการทำงานที่ผิดปกติของพวกมันนำไปสู่การพัฒนาของโรคกระดูกพรุน การสะสมของชนิดออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา (ROS) ระหว่างการเผาผลาญของเซลล์ส่งเสริมการเพิ่มจำนวนและการสร้างความแตกต่างของ osteoclast ดังนั้นจึงมีบทบาทสำคัญในโรคกระดูกพรุนCistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์(CDP) มีฤทธิ์ต้านเนื้องอก ต้านการอักเสบ และต้านอนุมูลอิสระ อย่างไรก็ตาม ผลกระทบของ CDP ต่อเซลล์สร้างกระดูกยังไม่ชัดเจน ในการศึกษานี้ ใช้การย้อมสีกรดฟอสฟาเตสที่ต้านทานทาร์เตรต, อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์, ปฏิกิริยาลูกโซ่การถอดรหัสแบบย้อนกลับ-โพลีเมอเรส และการวิเคราะห์ western blot เพื่อแสดงให้เห็นว่า CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ยับยั้ง osteoclastogenesis และ hydroxyapatite resorption นอกจากนี้ CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ยังยับยั้งการแสดงออกของยีนเครื่องหมาย osteoclast รวมถึง Ctsk, Mmp9 และ Acp5 และไม่มีผลต่อการแสดงออกของปัจจัยกระตุ้นนิวเคลียร์ κB (RANK) จากการวิเคราะห์ทางกลไกพบว่า CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)เพิ่มการแสดงออกของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระเพื่อลดการผลิต ROS ที่อาศัย RANKL ในเซลล์สร้างกระดูกและยับยั้งปัจจัยนิวเคลียร์ของทีเซลล์ที่ถูกกระตุ้นและการกระตุ้นโปรตีนไคเนสที่กระตุ้นด้วยไมโตเจน ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า CDP อาจเป็นตัวแทนของยาที่เป็นตัวเลือกสำหรับการรักษาโรคกระดูกพรุนที่เกิดจากกิจกรรมของ osteoclast มากเกินไป

คีย์เวิร์ดการสลายของกระดูก,Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์, MAPK, osteoclast, ออกซิเจนชนิดปฏิกิริยา

เพาะกาย cistanche

1|การแนะนำ

ความสมดุลระหว่างการสร้างกระดูกที่อาศัยเซลล์สร้างกระดูกและการสลายของกระดูกโดยอาศัยเซลล์สร้างกระดูก มีบทบาทสำคัญในการรักษาสภาวะสมดุลการเผาผลาญของกระดูก (Manolagas, 2000; Zhu et al., 2018) เมื่อการสลายของกระดูกเกินกว่าการสร้างกระดูก จะเกิดโรคกระดูกพรุน ซึ่งมีลักษณะเฉพาะโดยมวลกระดูกลดลงและความเสียหายของโครงสร้างจุลภาคของกระดูก (Ikeda, 2008) โรคกระดูกพรุนเป็นโรคที่พบได้บ่อยในผู้สูงอายุและสตรีวัยหมดประจำเดือน และการเกิดโรคยังไม่ได้รับการอธิบายอย่างสมบูรณ์ (Cooper & Melton, 1992) การขาดฮอร์โมนเอสโตรเจนเป็นสาเหตุหลักของโรคกระดูกพรุน (Manolagas, O'Brien, & Almeida, 2013) นอกจากนี้ สปีชีส์ออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา (ROS) สามารถเหนี่ยวนำได้โดยตัวกระตุ้นตัวรับของปัจจัยนิวเคลียร์ κB ลิแกนด์ (RANKL) และสัมพันธ์กับการสร้างเซลล์สร้างกระดูก (Yip et al., 2005) และอาจนำไปสู่การพัฒนาของโรคกระดูกพรุน (Manolagas, 2553). การศึกษาบางชิ้นพบว่าการขาดสารต้านอนุมูลอิสระ Nrf2 เพิ่มระดับ ROS และส่งเสริมการสร้างความแตกต่างของ osteoclast ที่เกิดจาก RANKL (Hyeon, Lee, Yang, & Jeong, 2013) ดังนั้น การลดการผลิต ROS ระหว่างการสร้างความแตกต่างของ osteoclast ควรได้รับการประเมินว่าเป็นกลยุทธ์ในการรักษาโรคกระดูกพรุน

Osteoclasts มาจาก monocyte หรือ macrophage hematopoietic lineage และเป็นเซลล์ที่มีหลายนิวเคลียสเพียงเซลล์เดียวที่ทำหน้าที่สลายกระดูก (Teitelbaum, 2000) ดังนั้นการวิจัยเกี่ยวกับการสร้างเซลล์สร้างกระดูกจึงมีความสำคัญอย่างยิ่งในการพัฒนาวิธีการรักษาที่มีประสิทธิภาพสำหรับโรคเกี่ยวกับการเผาผลาญของกระดูก (Lorenzo, 2017). Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) และ RANKL ที่ผลิตโดยเซลล์สร้างกระดูกและทีเซลล์ที่ถูกกระตุ้น เป็นไซโตไคน์ที่สำคัญที่ควบคุมการสร้างกระดูก (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003) RANKL กระตุ้นการแสดงออกของปัจจัยนิวเคลียร์ของทีเซลล์ที่ถูกกระตุ้น (NFATc1) ซึ่งเป็นปัจจัยการถอดรหัสที่สำคัญซึ่งทำงานในระหว่างการสร้าง osteoclast (Ishida et al., 2002) Activated NFATc1 ส่งเสริมการแสดงออกของยีน osteoclast marker เช่น tartrate-resistant acid phosphatase (TRAcP) และ cathepsin K (CTSK) ที่ควบคุม osteoclastogenesis และ osteoclast function (Balkan et al., 2009; Crotti et al., 2008)

Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์(CDP) แยกออกจากลำต้นเนื้อของCistancheและมีการควบคุมภูมิคุ้มกัน ต้านเนื้องอก การต่อต้านวัย และผลทางเภสัชวิทยาอื่นๆ (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo, & Du, 2012) CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)มีผลยับยั้งการผลิตไนตริกออกไซด์ (NO) ที่เกิดจากไลโปโพลีแซ็กคาไรด์ในเซลล์ไมโครเกลียของหนูเมาส์ (เซลล์ BV-2; Nan et al., 2013) นอกจากนี้ สารสกัดที่อุดมด้วยฟีนิลทานอยด์ (ECD) ของCistancheเพิ่มความสามารถในการว่ายน้ำของหนูด้วยการลดความเสียหายของกล้ามเนื้อ ชะลอการสะสมของกรดแลคติก และปรับปรุงการจัดเก็บพลังงาน (Cai et al., 2010) อย่างไรก็ตาม ผลกระทบของ CDP ต่อหน้าที่และกิจกรรมของ osteoclast ยังไม่ทราบ

ในการศึกษานี้ เราแสดงให้เห็นว่า CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ยับยั้งการสร้างความแตกต่างของ osteoclast ที่เกิดจาก RANKL และการสลายของกระดูก กลไกพื้นฐานคือ CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ช่วยเพิ่มการแสดงออกของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระเพื่อลดการผลิต ROS จากนั้นยับยั้ง NFAT ที่เปิดใช้งาน RANKL และโปรตีนไคเนสที่กระตุ้นด้วยไมโตเจน (MAPK) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)อาจใช้รักษาโรคกระดูกพรุนที่เกิดจากการสลายตัวของกระดูกที่มากเกินไป

มาค่าโสม cistanche

2|วัสดุและวิธีการ

2.1|วัสดุ

CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)(ความบริสุทธิ์ > 98 เปอร์เซ็นต์ ) ซื้อมาจาก Solarbio (ปักกิ่ง ประเทศจีน) และเตรียมที่ความเข้มข้น 1 มิลลิโมลาร์ในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) แอนติบอดีจำเพาะสำหรับ c-Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, phosphorylated (p)-ERK, p-p38, p-JNK และ ‐actin ได้จากซานต้า ครูซ ไบโอเทคโนโลยี (ซาน โฮเซ่ แคลิฟอร์เนีย) แอนติบอดีต่อ V-ATPase d2 ถูกผลิตขึ้นตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (H. Feng et al., 2009) ระบบ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5- (3-carboxymethoxyphenyl)-2- (4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) และ luciferase assay ได้มาจาก Promega (ซิดนีย์ ประเทศออสเตรเลีย) . ซื้อ Recombinant M-CSF จาก R&D Systems (มินนิอาโปลิส, มินนิโซตา) โปรตีน GST-rRANKL แบบลูกผสมถูกแสดงและทำให้บริสุทธิ์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Xu et al., 2000)

2.2|การเพาะเลี้ยงเซลล์

เซลล์ RAW264.7 (เซลล์มาโครฟาจของเมาส์) ได้มาจาก American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) และเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่จำเป็นขั้นต่ำที่ดัดแปลง (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, ออสเตรเลีย) เสริมด้วยซีรัมของทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml ของ penicillin และ 100 ug/ml ของ streptomycin (อาหารสมบูรณ์) monocytes ที่ได้จากไขกระดูก (BMMs) ถูกแยกออกจากหนู C57BL/6J อายุ 6 สัปดาห์ ซึ่งถูกทำการุณยฆาตตามขั้นตอนที่อนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมของสัตว์แห่งมหาวิทยาลัยเวสเทิร์นออสเตรเลีย (RA/3/100/1244) กระดูกยาวถูกผ่าโดยไม่มีเนื้อเยื่ออ่อน และไขกระดูกถูกล้างออกจากกระดูกโคนขาและกระดูกหน้าแข้ง ซึ่งจากนั้นจึงเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่สมบูรณ์ต่อหน้า M-CSF (50 ng/ml)

2.3|การทดสอบ Osteoclastogenesis

BMM ถูกชุบลงในเพลตเพาะเลี้ยง 96 หลุมที่ความหนาแน่น 6 × 103 เซลล์ต่อหลุมและบำบัดด้วยตัวกลางที่สมบูรณ์ที่มี M-CSF (50 ng/ml) และ GST-rRANKL (100 ng/ml) ต่อหน้าหรือ ไม่มีความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>สามนิวเคลียส) ถูกระบุว่าเป็นเซลล์สร้างกระดูก

2.4|การทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์

BMM ถูกเพาะลงในเพลต 96 หลุมที่ 6 × 103 เซลล์ต่อหลุมและปล่อยทิ้งไว้ค้างคืนเพื่อให้เกาะติด วันรุ่งขึ้น เซลล์ถูกบ่มด้วยความเข้มข้นของ CDP . ที่แตกต่างกัน(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์). หลังจากผ่านไป 48 ชั่วโมง สารละลาย MTS (20 ไมโครลิตร/หลุม) ถูกเติมและบ่มด้วยเซลล์เป็นเวลา 2 ชั่วโมง การดูดกลืนแสงที่ 490 นาโนเมตรถูกกำหนดด้วยเครื่องอ่านไมโครเพลท (Multiscan Spectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA

2.5|การย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์

BMM ถูกเพาะที่ความหนาแน่น 6 × 103 เซลล์ต่อหลุมโดยมี M-CSF (50 ng/ml) ค้างคืน จากนั้นเซลล์ถูกกระตุ้นด้วย M-CSF และ GST-rRANKL (100 ng/ml) จนกระทั่งสร้างเซลล์สร้างกระดูกที่เจริญเต็มที่ จากนั้นจึงทำการบำบัดเซลล์สร้างกระดูกด้วยความเข้มข้นของ CDP . ที่แตกต่างกัน(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)เป็นเวลา 48 ชั่วโมงก่อนทำการตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% ซึมผ่านด้วย 0.1 เปอร์เซ็นต์ Triton X-100–PBS และปิดกั้นด้วย 3 เปอร์เซ็นต์ของ bovine serum albumin ใน PBS เซลล์ที่เตรียมไว้ถูกบ่มด้วย phalloidin ที่คอนจูเกตโรดามีนเป็นเวลา 45 นาทีในความมืดเพื่อย้อม F-actin จากนั้นล้างเซลล์ด้วย PBS นิวเคลียสที่ย้อมด้วย 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) และติดตั้งด้วยแผ่นปิดสำหรับกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล

ประสบการณ์ cistanche

2.6|การทดสอบการสลายของไฮดรอกซีอะพาไทต์

ในการวัด BMM ของการทำงานของ Osteoclast (1 × 105 เซลล์ต่อหลุม) ที่เพาะเลี้ยงบนแผ่นเคลือบคอลลาเจนหกหลุม (BD Biocoat; Thermo Fisher Scientific) ถูกกระตุ้นด้วย GST-rRANKL (100 ng/ml) และ M-CSF (50 ng/ ml) จนกระทั่งสร้างเซลล์สร้างกระดูกที่โตเต็มที่ (Zhou et al., 2016) จากนั้นเซลล์ถูกแยกออกจากเพลตอย่างนุ่มนวลโดยใช้สารละลายการแยกตัวของเซลล์ (Sigma-Aldrich) และจำนวนเซลล์สร้างกระดูกที่โตเต็มที่จำนวนเท่ากันถูกเพาะลงบนแต่ละหลุมในเพลต 96 หลุมที่เคลือบด้วยไฮดรอกซีอะพาไทต์ (Corning Osteoassay, Corning, NY) เซลล์สร้างกระดูกที่โตเต็มที่ถูกฟักในตัวกลางที่มี GST-rRANKL และ M-CSF โดยมีหรือไม่มี CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ที่ความเข้มข้นที่ระบุ หลังจาก 48 ชั่วโมง ครึ่งหนึ่งของหลุมถูกย้อมด้วยอิมมูโนฮิสโตเคมีสำหรับกิจกรรม TRAcP ตามที่อธิบายข้างต้น เพื่อประเมินจำนวนของเซลล์ที่มีนิวเคลียสหลายนิวเคลียสต่อหลุม หลุมที่เหลือถูกฟอกเป็นเวลา 10 นาทีเพื่อเอาเซลล์ออกและยอมให้วัดพื้นที่ที่ถูกดูดซับ พื้นที่ที่ถูกดูดซับถูกถ่ายภาพภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงมาตรฐาน และซอฟต์แวร์ Image J (สถาบันสุขภาพแห่งชาติ, เบเทสดา, แมรี่แลนด์) ถูกใช้เพื่อหาปริมาณพื้นที่เปอร์เซ็นต์ของพื้นผิวไฮดรอกซีอะพาไทต์ที่ถูกดูดซับโดยเซลล์สร้างกระดูก

2.7|นักข่าว Luciferase ตรวจ

เพื่อตรวจสอบการเปิดใช้งานการถอดรหัส NFATc1 เซลล์ RAW264.7 ได้รับการถ่ายอย่างเสถียรด้วยโครงสร้างตัวรายงาน luciferase ที่ตอบสนองต่อ NFATc1 (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013) เซลล์ที่ทรานส์เฟกถูกเพาะเลี้ยงในเพลต 48 หลุมที่ความหนาแน่น 1.5 × 105 เซลล์ต่อหลุมและปรับสภาพด้วยความเข้มข้นต่างๆ ของ CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)เป็นเวลา 1 ชม. หลังการปรับสภาพ เซลล์ถูกกระตุ้นด้วย GST-rRANKL (100 ng/ml) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และวัดฤทธิ์ของลูซิเฟอเรสโดยใช้ระบบทดสอบลูซิเฟอเรสรีพอร์เตอร์ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต (โพรเมกา)

2.8|การวิเคราะห์ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสเชิงปริมาณเชิงปริมาณ (RT-PCR)

RNA ทั้งหมดถูกแยกออกจากเซลล์โดยใช้รีเอเจนต์ Trizol ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต (Thermo Fisher Scientific) DNA เสริมถูกสังเคราะห์โดยใช้ Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase ที่มีเทมเพลต RNA 1 ไมโครกรัมและไพรเมอร์ oligo-dT การขยายปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสของลำดับจำเพาะได้ดำเนินการโดยใช้โปรแกรมต่อไปนี้: 94 องศาเป็นเวลา 5 นาที ตามด้วย 30 รอบที่ 94 องศาเป็นเวลา 40 วินาที, 60 องศาเป็นเวลา 40 วินาที และ 72 องศาเป็นเวลา 40 วินาที และขั้นตอนการขยายขั้นสุดท้ายของ 5 นาทีที่ 72 องศา ข้อมูลโดยละเอียดของไพรเมอร์เฉพาะแสดงไว้ในตารางที่ 1 ระดับ RNA ของผู้ส่งสารสัมพัทธ์คำนวณโดยการทำให้เป็นมาตรฐานสำหรับการแสดงออกของยีน Hmbs การดูแลทำความสะอาด

2.9|การวิเคราะห์ Western blot

BMM ถูกเพาะเลี้ยงในตัวกลางที่สมบูรณ์ด้วย M-CSF ในเพลตหกหลุมและกระตุ้นด้วย GST-rRANKL (100 ng/ml) ตามเวลาที่ระบุไว้ เซลล์ถูกสลายในบัฟเฟอร์การแยกสลายด้วยเรดิโออิมมูโนพรีซิเดชั่น และโปรตีนได้รับการแก้ไขโดยโซเดียม โดเดซิล ซัลเฟต-โพลีอะคริลาไมด์ เจล อิเล็กโตรโฟรีซิส และถ่ายโอนไปยังเมมเบรนโพลี (ไวนิลลิดีน ฟลูออไรด์) (GE Healthcare, Silverwater, Australia) เยื่อเมมเบรนถูกปิดกั้นในนมพร่องมันเนย 5 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นจึงตรวจสอบด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิที่จำเพาะต่างๆ โดยเขย่าเบาๆ ข้ามคืนที่ 4 องศา เมมเบรนถูกล้างและต่อมาบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่ควบคู่กับฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดส จากนั้นจึงตรวจพบปฏิกิริยาของแอนติบอดีด้วยรีเอเจนต์เคมีลูมิเนสเซนส์ที่ได้รับการปรับปรุง (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) และแสดงภาพด้วย Image‐quant LAS 4000 (GE Healthcare)

2.10|การตรวจจับ ROS ภายในเซลล์

ตรวจพบระดับ ROS ภายในเซลล์โดยใช้ 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate cellular ROS ชุดทดสอบ (Abcam, เมลเบิร์น, ออสเตรเลีย) BMM (5 × 103 เซลล์ต่อหลุม) ถูกเพาะเลี้ยงในเพลต 96 หลุมและบำบัดด้วย RANKL (100 นาโนกรัม/มล.), M-CSF (50 นาโนกรัม/มล.) และ CDP เป็นเวลา 72 ชั่วโมง วัดระดับ ROS ภายในเซลล์โดยใช้ 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate ซึ่งออกซิไดซ์เป็น DCF เรืองแสงเมื่อมี ROS เซลล์ถูกล้างในบัฟเฟอร์ของแฮงค์และฟักในที่มืดเป็นเวลา 30 นาทีด้วย DCFH-DA 10 ไมโครโมลาร์ ได้ภาพโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล

2.11|การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลทั้งหมดเป็นตัวแทนของการทดลองอย่างน้อยสามครั้งที่ทำขึ้นเป็นสามเท่า เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวตามด้วยการทดสอบหลังเฉพาะของ Student–Newman–Keuls เพื่อกำหนดความสำคัญของความแตกต่างระหว่างผลลัพธ์ โดย p < 0.05="">

3|ผลลัพธ์

3.1|CDP ยับยั้งการสร้าง osteoclastogenesis ที่เกิดจาก RANKL และการรวมตัวของ osteoclast

เพื่อตรวจสอบว่า CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)สามารถยับยั้งการสร้าง osteoclast ที่เกิดจาก RANKL ได้ ขั้นแรกเราทำการทดสอบ osteoclastogenesis โดยใช้เมาส์ BMM (Liu et al., 2013; Song et al., 2016) BMM ได้รับการรักษาด้วย RANKL และ M-CSF เป็นเวลา 5 วันโดยเพิ่มความเข้มข้นของ CDP CDP ลดจำนวนเซลล์หลายนิวเคลียสที่เป็นบวก TRAcP เมื่อความเข้มข้นของ CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ถึง 5 µM หรือสูงกว่า (รูปที่ 1a,b) เพื่อประเมิน CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ความเป็นพิษและยืนยันว่าผลลัพธ์เหล่านี้ไม่ใช่ภาพสะท้อนของการตายของเซลล์หรือจำนวน เราทำการทดสอบ MTS BMM ได้รับการรักษาด้วย RANKL และ M-CSF เป็นเวลา 48 ชั่วโมงด้วยปริมาณ CDP . ที่แตกต่างกัน(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์). CDP ไม่มีผลต่อการเพิ่มจำนวน BMM ที่ความเข้มข้น 15 ไมโครโมลาร์หรือน้อยกว่า (รูปที่ 1c)

เพื่อทดสอบผลกระทบของ CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ในการหลอมรวม osteoclast นั้น osteoclasts ถูกเหนี่ยวนำด้วยการบำบัด RANKL และ M-CSF โดยมีหรือไม่มีปริมาณ CDP ที่แตกต่างกัน(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์). Osteoclasts ถูกย้อมด้วย rhodamine-phalloidin และ DAPI เพื่อประเมินจำนวนนิวเคลียสต่อ osteoclast (รูปที่ 2a) จำนวน osteoclast และจำนวนนิวเคลียสเฉลี่ยต่อ osteoclast ลดลงตาม CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)การบำบัด (5–10 ไมโครโมลาร์; รูปที่ 2b,c) ดังนั้น CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)มีผลยับยั้งต่อการสร้างกระดูกเชิงกรานที่เหนี่ยวนำโดย RANKL และการหลอมรวมของกระดูกเสื่อมในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา

3.2|CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ลดทอนกิจกรรมการสลายของ osteoclastic hydroxyapatite ที่เกิดจาก RANKL

ทำการทดสอบการสลายของไฮดรอกซีอะพาไทต์เพื่อตรวจหาผลของ CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)เกี่ยวกับฟังก์ชัน osteoclast (รูปที่ 3a) หลังจากการบ่ม 24 ชั่วโมง จำนวนเซลล์สร้างกระดูกต่อหลุมไม่เปลี่ยนแปลงในขณะที่พื้นที่การดูดซับของไฮดรอกซีอะพาไทต์ลดลงอย่างมีนัยสำคัญโดยการบำบัดด้วย CDP 5 และ 10 ไมโครโมลาร์เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 3b,c) ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)มีผลการยับยั้งที่แข็งแกร่งทั้งต่อการสร้าง osteoclast และกิจกรรมการสลายของ osteoclast โดยไม่มีผลกระทบต่อเซลล์

3.3|CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ยับยั้งการแสดงออกของยีน osteoclast marker

เพื่อตรวจสอบเพิ่มเติมเกี่ยวกับผลการยับยั้งของ CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ใน osteoclastogenesis และ osteoclastic bone resorption, BMM ได้รับการรักษาด้วย RANKL และ M-CSF เป็นเวลา 5 วันด้วยความเข้มข้นของ CDP ที่แตกต่างกัน(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์). จากนั้นทำ RT-PCR เพื่อตรวจหาการแสดงออกของยีนเครื่องหมาย osteoclast การแสดงออกของ Nfatc1 ซึ่งเป็นปัจจัยการถอดรหัสที่สำคัญระหว่างการสร้างกระดูก ถูกยับยั้งโดย CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา (รูปที่ 4a) นอกจากนี้ CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)(5 และ 10 ไมโครโมลาร์) ปรับลดการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการสลายของกระดูก ซึ่งรวมถึง Mmp9, Ctsk และ Acp5 (รูปที่ 4b–d)

3.4|CDP ยับยั้งกิจกรรม NFATc1 และการแสดงออกของโปรตีนที่ปลายน้ำ

เพื่อตรวจสอบผลกระทบของ CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ในกิจกรรม NFATc1 ที่เกิดจาก RANKL ได้ทำการทดสอบนักข่าว luciferase การรักษาด้วย CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ที่ความเข้มข้น 5 µM และสูงกว่า ยับยั้งการออกฤทธิ์ของ NFATc1 ที่เหนี่ยวนำโดย RANKL อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 5a) นอกจากนี้ การวิเคราะห์ Western blot พบว่า CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ยับยั้งการแสดงออกของโปรตีนอย่างมีนัยสำคัญของ NFATc1 และ c-Fos ใน BMM ที่บำบัดด้วย RANKL และ M-CSF เป็นเวลา 3 และ 5 วัน (รูปที่ 5b) นอกจากนี้ การแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับหน้าที่ของ osteoclast เช่น V-ATPase-d2 และ CTSK ถูกปรับลดลงเมื่อมี CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม อย่างไรก็ตาม CDP ไม่มีผลต่อนิพจน์ RANK (รูปที่ 5b)

3.5|CDP ส่งเสริมการแสดงออกของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระเพื่อกำจัดการผลิต ROS ในระหว่างการสร้างกระดูกที่เกิดจาก RANKL

เพื่อสำรวจกลไกพื้นฐานของการยับยั้งการสร้างกระดูกที่ขึ้นกับ CDP BMM ได้รับการรักษาด้วย RANKL (100 ng/ml) และ M-CSF (50 ng/ml) ร่วมกับ PBS หรือ CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)นาน 72 ชม. เราตรวจสอบผลกระทบของ CDP ต่อการผลิต ROS ภายในเซลล์ที่กระตุ้นโดย RANKL ระดับ ROS ภายในเซลล์เพิ่มขึ้นโดยการบำบัดด้วย RANKL ซึ่งถูกทำให้อ่อนฤทธิ์โดย CDP (5 และ 10 ไมโครโมลาร์; รูปที่ 6a) ทั้งจำนวนของเซลล์ที่เป็นบวก ROS และความเข้มของการย้อมสี ROS ลดลงโดยการบำบัดด้วย CDP ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา (รูปที่ 6b,c) การวิเคราะห์ Western blot พบว่า CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ส่งเสริม thioredoxin (TRX1) และการแสดงออกของกลูตาไธโอนรีดักเตส (GSR) ในขณะที่ยับยั้งการแสดงออกของไนตริกออกไซด์ที่เหนี่ยวนำให้เกิด (NOS2) ใน BMM ที่บำบัดด้วย RANKL และ M-CSF เป็นเวลา 3 วัน (รูปที่ 6d)

เพื่อสำรวจเพิ่มเติมว่า CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ยับยั้งการสร้างความแตกต่างของ osteoclast โดยลดการผลิต ROS จากนั้นเราบำบัด BMM ด้วยเปอร์ออกไซด์ (10 µM) เพื่อเลียนแบบสถานะ ROS ที่สูงในเซลล์ BMM ถูกเหนี่ยวนำโดย RANKL และ M-CSF เป็นเวลา 3 วัน และผลของการวิเคราะห์ western blot และ RT-PCR พบว่าเปอร์ออกไซด์ส่งเสริมการแสดงออกของ NFATc1 และ c-Fos เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม สอดคล้องกับผลลัพธ์ในรูปที่ 5 การแสดงออกของ NFATc1 และ c-Fos ถูกระงับโดย CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ในขณะที่เปอร์ออกไซด์ช่วยผลการยับยั้งของ CDP (รูปที่ 6e,f) ข้อมูลเหล่านี้ระบุว่า CDP ยับยั้งการแสดงออกของ NFATc1 และ c-Fos โดยการขจัดการผลิต ROS

3.6|CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ยับยั้งเส้นทางของ MAPK ในระหว่างการสร้างกระดูกเชิงกรานโดย RANKL

ต่อไป เราตรวจสอบผลกระทบของ CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)การรักษานิพจน์ TRAF6 ที่เป็นสื่อกลาง RANKL และการเปิดใช้งานเส้นทาง MAPK หลังจากการฟักไข่ในตัวกลางที่ปราศจากซีรัมเป็นเวลา 2 ชั่วโมง BMM ถูกกระตุ้นด้วย RANKL โดยมีหรือไม่มี CDP เป็นเวลา 60 นาที การกระตุ้นด้วย CDP (10 ไมโครโมลาร์) ไม่มีผลต่อการแสดงออกของ TRAF6 และฟอสโฟรีเลชั่นที่ถูกทำให้อ่อนฤทธิ์ของ JNK2 และ ERK1/2 ที่ 10 และ 20 นาที (รูปที่ 7) นอกจากนี้ ฟอสโฟรีเลชัน p38 ยังถูกยับยั้งโดย CDP . อย่างมีนัยสำคัญ(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)การรักษา 60 นาทีเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 7) ข้อมูลเหล่านี้เปิดเผยว่า CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ยับยั้งเส้นทางการส่งสัญญาณ MAPK ที่เกิดจาก RANKL ซึ่งสอดคล้องกับผลการยับยั้งต่อการสร้างและกิจกรรมของ osteoclast

4|อภิปรายผล

Cistanche หรือที่รู้จักในชื่อ "โสมทะเลทราย" ได้รับความสนใจอย่างมากเมื่อเร็ว ๆ นี้สำหรับความสามารถในการปรับภูมิคุ้มกันและทำหน้าที่ป้องกันในช่วงอายุมากขึ้นและความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน (Jia et al., 2012; Snytnikova et al., 2012) ไกลโคไซด์ที่ถูกแทนที่ด้วยฟีนิลโพรพานอยด์ ซึ่งเป็นส่วนประกอบสำคัญของ Cistanche แสดงให้เห็นว่าสามารถยับยั้ง NO กิจกรรมในแมคโครฟาจ (Ahn, Chae, Chin, & Kim, 2017) นอกจากนี้ aCistancheสารสกัดลดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในกล้ามเนื้อหัวใจตายที่เกิดซ้ำหลังขาดเลือดขาดเลือด และมีบทบาทสำคัญในการยับยั้งวิถี apoptotic ที่นำไปสู่การป้องกันโรคหัวใจ (Yu, Li, & Cao, 2016) เป็นองค์ประกอบสำคัญของ Cistanche, CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)มีหน้าที่ทางเภสัชวิทยาที่หลากหลาย การศึกษาปัจจุบันของเราพบว่า CDP ยับยั้งการสร้างความแตกต่างและการเปิดใช้งานของ osteoclast ที่เปิดใช้งาน RANKL โดยการลดทอนการผลิต ROS เช่นเดียวกับการเปิดใช้งาน NFAT และ MAPK

ในฐานะที่เป็นกรดฟอสฟาเตส TRAcP มีอยู่ในเซลล์ที่หลากหลายและมีมากในเซลล์สร้างกระดูกและเซลล์มาโครฟาจในถุงน้ำ (Snipes, Lam, Dodd, Grey, & Cohen, 1986) TRAcP เป็นเอนไซม์ที่มีลักษณะเฉพาะของ osteoclasts และการแสดงออกของมันสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับหน้าที่ของ osteoclast ซึ่งถือเป็นตัวบ่งชี้กิจกรรมของ osteoclast และการสลายของกระดูก (Minkin, 1982) ในการศึกษาของเรา CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ยับยั้งจำนวนเซลล์ที่เป็นบวก TRAcP ซึ่งบ่งชี้ว่าการสร้างกระดูกพรุนที่เกิดจาก RANKL ถูกปิดกั้นโดย CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์). การเสื่อมสภาพของเมทริกซ์กระดูกโดย osteoclasts ขึ้นอยู่กับ cathepsin K (CTSK) และ MMPs (Gruber, 2015) ในที่นี้ CDP ปรับลดการแสดงออกของยีนที่ทำหน้าที่ของ osteoclast ลงอย่างมีนัยสำคัญ เช่น Mmp9, Ctsk และ Acp5

ความแตกต่างและการทำงานของ Osteoclast ถูกควบคุมโดยเส้นทางการส่งสัญญาณที่หลากหลาย (Boyle, Simonet, & Lacey, 2003) หลังจากผูกมัดกับ RANK แล้ว RANKL จะคัดเลือกโปรตีนอะแดปเตอร์ TRAF6 เพื่อกระตุ้นการแสดงออกของ NFATc1 ซึ่งเป็นปัจจัยการถอดรหัสที่สำคัญสำหรับการสร้างเซลล์สร้างกระดูก ซึ่งส่งผลต่อการแสดงออกของยีนที่จำเพาะต่อเซลล์กระดูก ซึ่งรวมถึง TRAcP และ CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). ในการศึกษานี้ เราพบว่า CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ไม่มีผลต่อการแสดงออกของ RANK และ TRAF6 ในเซลล์สร้างกระดูก อย่างไรก็ตาม CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ยับยั้งการกระตุ้น NFATc1 ที่เกิดจาก RANKL ในระหว่างการสร้างกระดูกของ BMM นอกจากนี้ยังแสดงให้เห็นว่า ROS ซึ่งผลิตโดยไมโตคอนเดรียในกระบวนการส่งอิเล็กตรอน ส่งเสริมการเพิ่มจำนวนและการสร้างความแตกต่างของเซลล์สร้างกระดูกและการสลายตัวของเมทริกซ์ของกระดูกที่มีการควบคุม (Ha et al., 2004) การศึกษาเมื่อเร็ว ๆ นี้พบว่า RANKL ชักนำการนำเข้านิวเคลียร์ของ Bach1 และลดการผลิตเอ็นไซม์สารต้านอนุมูลอิสระด้วย Nrf2 ซึ่งจะช่วยเพิ่มการแสดงออกของ ROS ภายในเซลล์และการสร้างกระดูกในหนูทดลอง (Kanzaki et al., 2017) นอกจากนี้ การสร้าง ROS ภายในเซลล์เพิ่มขึ้นโดย homocysteine ​​ช่วยเพิ่มการสร้างและกิจกรรมของ osteoclast (Koh et al., 2006) การศึกษาของเราพบว่า CDP ลดการสะสม ROS ในเซลล์สร้างกระดูกโดยการยับยั้งการแสดงออกของ NOS2 และส่งเสริมการแสดงออกของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ เช่น TRX1 และกลูตาไธโอนรีดักเตส เมื่อเราบำบัด BMM ด้วยเปอร์ออกไซด์เพื่อเพิ่มการสะสม ROS ภายในเซลล์ ผลลัพธ์ที่ ROS ที่เพิ่มขึ้นสามารถปรับปรุงการแสดงออกของ NFATc1 ได้เปิดเผยว่า ROS นั้นอยู่ที่ต้นน้ำของ NFATc1 นอกจากนี้เรายังพบว่าเปอร์ออกไซด์ช่วยผลการยับยั้งของ CDP ต่อการแสดงออกของ NFATc1 ดังนั้น ข้อมูลของเราแนะนำว่า CDP ยับยั้งการสะสม ROS เพื่อยับยั้งการแสดงออกของ NFATc1 จากนั้นจึงยับยั้งการก่อตัวและการทำงานของ osteoclast

ERK, JNK และ p38 เป็นของตระกูล MAPK ซึ่งเกี่ยวข้องกับกฎระเบียบของการสร้างความแตกต่างของ osteoclast (Seger & Krebs, 1995) RANKL เปิดใช้งานเส้นทาง MAPK โดยเพิ่มฟอสโฟรีเลชั่นของ ERK, JNK และ p38 (Mizukami et al., 2002) เราแสดงให้เห็นว่า CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ยับยั้งฟอสโฟรีเลชั่นที่อาศัย RANKL ของโปรตีนหลักในวิถีของ MAPK ดังนั้นจึงมีส่วนทำให้เกิดผลการยับยั้งของ CDP ต่อการแสดงออกของยีนเครื่องหมายออสติโอคลาสต์ สำหรับความรู้ของเรา นี่เป็นการศึกษาครั้งแรกที่แสดงผลการยับยั้งของ CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)เกี่ยวกับการผลิต ROS, การเปิดใช้งาน NFAT และ MAPK ซึ่งแสดงถึงกลไกใหม่ของการกระทำของ CDP ในหลอดทดลอง

โดยสรุป เราแสดงให้เห็นว่า CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ลดทอน osteoclastogenesis และ hydroxyapatite resorption และการแสดงออกของยีน osteoclast marker รวมถึง Ctsk, Mmp9 และ Acp5 CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)สามารถระงับการผลิต ROS ที่ใช้ RANKL ได้ เช่นเดียวกับการเปิดใช้งาน NFAT และ MAPK (รูปที่ 8) โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์ของเราแนะนำว่า CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)อาจเป็นตัวแทนของยาที่เป็นตัวเลือกในการรักษาภาวะที่เกี่ยวข้องกับ osteoclast ร่วมกับ ROS overproduction

รูปที่ 8 แผนผังของ CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ทำหน้าที่ในการสร้างความแตกต่างของ osteoclast CDP(Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์)ยับยั้งการผลิต ROS ที่เกิดจาก RANKL เช่นเดียวกับการเปิดใช้งาน NFATc1 และ MAPK ดังนั้นจึงเป็นการยับยั้ง osteoclastogenesis ซีดีพีCistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์; MAPK, ไคเนสโปรตีนที่กระตุ้นด้วยไมโตเจน; NFATc1, ปัจจัยนิวเคลียร์ของทีเซลล์ที่ถูกกระตุ้น; RANKL ตัวกระตุ้นตัวรับของปัจจัยนิวเคลียร์ κB ลิแกนด์; ROS ออกซิเจนชนิดปฏิกิริยา [สามารถดูสีได้ที่ wileyonlinelibrary.com]

กิตติกรรมประกาศ

การศึกษานี้ได้รับการสนับสนุนโดยมูลนิธิวิทยาศาสตร์ธรรมชาติแห่งประเทศจีน (81572164) โครงการวิจัยและพัฒนาเทคโนโลยีหลักแห่งชาติของจีน (2017YFC1103300) มูลนิธิวิทยาศาสตร์ธรรมชาติของมณฑลกวางสี (2016GXNSFAA380295) และโครงการวิจัยวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีของมหาวิทยาลัยกวางสี จังหวัด (KY2015YB054). นอกจากนี้ยังได้รับการสนับสนุนบางส่วนโดยโครงการแผนพัฒนาการวิจัยทางวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีกวางสี (GKG13349003, 1598013-15), กองทุนโครงสร้างพื้นฐานด้านการวิจัยทางการแพทย์และสุขภาพของรัฐเวสเทิร์นออสเตรเลีย, มูลนิธิโรคข้ออักเสบออสเตรเลีย, รางวัลความร่วมมือด้านการวิจัยมหาวิทยาลัยเวสเทิร์นออสเตรเลีย (UWA) และ สภาวิจัยด้านสุขภาพและการแพทย์แห่งออสเตรเลีย (NHMRC, Nos. 1107828 and 1027932)

ผลประโยชน์ทับซ้อน

ผู้เขียนขอประกาศว่าไม่มีความขัดแย้งทางผลประโยชน์

จาก: 'Cistancheทะเลทรายพอลิแซ็กคาไรด์ลดทอน osteoclastogenesis และการสลายของกระดูกผ่านการยับยั้งการส่งสัญญาณ RANKL และการผลิตออกซิเจนปฏิกิริยาโดย Dezhi Song et al

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol 2018;233:9674–9684