thภาษา
หน้าหลัก / ความรู้ / เนื้อหา

ความรู้

Chimeric Human Papillomavirus-16 อนุภาคคล้ายไวรัสที่นำเสนอเปปไทด์ P18I10 และ T20 จาก HIV-1 ซองจดหมายทำให้เกิด HPV16 และ HIV-1-ภูมิคุ้มกันจำเพาะของฮอร์โมนและทีเซลล์ในหนู BALB/c

Dec 07, 2023

เชิงนามธรรม:

ในการศึกษานี้ เปปไทด์ HIV-1 P18I10 CTL ที่ได้มาจากลูป V3 ของ HIV-1 gp120 และเปปไทด์ต้านฟิวชั่น T20 ของ HIV-1 gp41 ถูกแทรกเข้าไปในโปรตีน capsid HPV16 L1 เพื่อสร้าง chimeric HPV: HIV (L1:P18I10 และ L1:T20) VLPs โดยใช้ระบบการแสดงออกของเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม HPV: HIV VLP ได้รับการทำให้บริสุทธิ์โดยโครมาโตกราฟี เราแสดงให้เห็นว่าการแทรกเปปไทด์ P18I10 หรือ T20 เข้าไปในลูป DE ของโปรตีน capsid HPV16 L1 ไม่ส่งผลกระทบต่อความเสถียร ในหลอดทดลอง การประกอบตัวเอง และสัณฐานวิทยาของ chimeric HPV: HIV VLPs ที่สำคัญ มันไม่รบกวนปฏิกิริยาของแอนติบอดีต่อ HIV-1 ซึ่งกำหนดเป้าหมายเปปไทด์ P18I10 และ T20 ที่เป็นลำดับและตามโครงสร้างที่แสดงบน HPV แบบไคเมอริก: HIV VLP หรือการเหนี่ยวนำของแอนติบอดีที่จำเพาะต่อ HPV16 L1- ในร่างกาย เราสังเกตว่าวัคซีน L1:P18I10/L1:T20 VLP แบบไคเมอริกสามารถกระตุ้น HPV16- แต่การตอบสนองของแอนติบอดีจำเพาะของ HIV{35}} ที่อ่อนแอ และกระตุ้น HPV16- และ T- ที่จำเพาะต่อ HIV-1- การตอบสนองของเซลล์ในหนู BALB/c ยิ่งไปกว่านั้น อาจเป็นตัวกระตุ้นที่มีศักยภาพในการเพิ่มการตอบสนองของเซลล์ที่จำเพาะต่อเอชไอวีในการสร้างภูมิคุ้มกันแบบเฮเทอโรโลกัส หลังจากเตรียมวัคซีน BCG.HIVA แล้ว งานวิจัยนี้จะมีส่วนช่วยในการพัฒนา HPV ชนิดใหม่: แพลตฟอร์มวัคซีนที่ใช้ HIV VLP เพื่อควบคุมการติดเชื้อ HPV16 และ HIV-1 ซึ่งมีความจำเป็นเร่งด่วนในประเทศกำลังพัฒนาและประเทศอุตสาหกรรม

Desert ginseng-Improve immunity (12)

ประโยชน์ของซิสตานช์สำหรับระบบภูมิคุ้มกันของผู้ชาย

คลิกที่นี่เพื่อดูผลิตภัณฑ์ Cistanche Enhance Immunity

【สอบถามเพิ่มเติม】 อีเมล:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

คำสำคัญ:

เอชไอวี-1; HPV16; วัคซีน; อนุภาคคล้ายไวรัส P18I10; T20 เอนฟูเวียร์ไทด์; บีซีจี.เอชไอวา; ภูมิคุ้มกันของร่างกาย ภูมิคุ้มกันโดยอาศัยทีเซลล์

1. บทนำ

ไวรัสโรคภูมิคุ้มกันบกพร่องของมนุษย์-1 (HIV-1) ซึ่งเป็นสาเหตุของกลุ่มอาการภูมิคุ้มกันบกพร่อง (AIDS) ถูกค้นพบในช่วงต้นทศวรรษ 1980 และตั้งแต่นั้นมาก็กลายเป็นโรคระบาดไปทั่วโลก [1] แม้ว่าการรักษาด้วยยาต้านรีโทรไวรัส (HAART) ที่มีฤทธิ์สูง ร่วมกับการป้องกันก่อนสัมผัสเชื้อ (PrEP) อาจมีผลกระทบอย่างแท้จริงต่อการควบคุมการติดเชื้อ HIV-1 แต่การฉีดวัคซีนยังคงเป็นแนวทางพื้นฐานเพื่อสาธารณประโยชน์ และเพื่อให้ ยุติการแพร่ระบาดของเอชไอวี-1 ทั่วโลก [2] แม้ว่าจะใช้เวลากว่าสามทศวรรษในการวิจัยเอชไอวี-1 อย่างละเอียดและการทดลองทางคลินิกเกี่ยวกับวัคซีนจำนวนมาก แต่วัคซีนเอชไอวี-1 ที่ได้รับใบอนุญาตจนถึงขณะนี้ยังคงไม่บรรลุผลสำเร็จ การทดลอง RV144 ที่ดำเนินการในประเทศไทยเป็นกรณีแรกที่เปิดเผยประสิทธิภาพเพียงเล็กน้อยที่ 31.2% ต่อการได้รับเชื้อ HIV-1 [3] ผู้สมัครรับวัคซีนเอชไอวีอื่นๆ-1 ส่วนใหญ่ที่เข้ารับการทดลองทางคลินิกมีพื้นฐานมาจาก DNA, พาหะของไวรัสชนิดรีคอมบิแนนท์ หรือแบบจำลองโปรตีนหน่วยย่อย [4,5] ตามหลักการแล้ว วัคซีนเอชไอวี-1 ที่มีประสิทธิภาพสามารถกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ การทำให้แอนติบอดีเป็นกลางเพื่อป้องกันการติดเชื้อไวรัส [6] เช่นเดียวกับการตอบสนองของทีลิมโฟไซต์ (CTL) ที่เป็นพิษต่อเซลล์เพื่อกำจัดเซลล์ที่ติดเชื้อ [7] อย่างไรก็ตาม การกระตุ้นการตอบสนองแต่ละครั้งอาจต้องใช้กลยุทธ์วัคซีนที่แตกต่างกัน ซึ่งรับประกันความพยายามในการพัฒนาที่แยกจากกันแต่ขนานกัน การเลือกอิมมูโนเจนและพาหะการนำส่งจะมีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อการทำงานและความจำเพาะของวัคซีนเอชไอวี-1 [8,9] ความล้มเหลวซ้ำแล้วซ้ำเล่าโดยใช้แนวทางมาตรฐานสำหรับการพัฒนาวัคซีน HIV-1 นำไปสู่การตระหนักถึงความสำคัญของการเลือกพาหะนำส่ง ระบบการให้ไพรม์บูสต์ และความจำเพาะของภูมิคุ้มกันในการตอบสนองทั้งทางร่างกายและเซลล์ ไวรัส papillomavirus (HPV) ของมนุษย์มากกว่า 100 ชนิดเป็นที่ทราบกันดีอยู่แล้ว และจีโนไทป์ของ HPV 16 และ 18 ถือเป็นสาเหตุของมะเร็งปากมดลูกประมาณ 70% ทั่วโลก [10] อนุภาคคล้ายไวรัส HPV L1 (VLPs) ซึ่งจัดอยู่ในประเภทของวัคซีนหน่วยย่อย สามารถกระตุ้นให้เกิดการตอบสนองทางร่างกายจำเพาะของ L1- ต่อไวรัสชนิด wild และการตอบสนองโดยอาศัย T-cell เป็นสื่อกลางด้วย [11–13] ปัจจุบัน วัคซีนป้องกัน HPV สามชนิดได้รับใบอนุญาตในท้องตลาด และทั้งหมดนั้นใช้ VLP ของโปรตีน capsid ของ HPV L1 สองชนิดคือ Gardasil (Merck, Rahway, NJ, USA) และ Gardasil-9 (Merck) ผลิตโดยระบบการแสดงออกของยีสต์ (Saccharomyces cerevisiae) ในขณะที่อีกชนิดหนึ่งคือ Cervarix (GSK, Brentford, UK) ผลิตโดยระบบการแสดงออกของยีสต์ (Saccharomyces cerevisiae) โดยระบบเวกเตอร์/เซลล์แมลง (BEVS/IC) ของการแสดงออกของไวรัสบาคิวโลไวรัส [14] จนถึงขณะนี้ สภาวะที่เหมาะสมในการผลิตโปรตีน HPV16 L1 ในระบบการแสดงออกของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมยังไม่ได้รับการยอมรับอย่างดี ดังนั้น การพัฒนาวัคซีนรวมที่จะป้องกันการติดเชื้อ HPV และ HIV จึงเป็นความพยายามเชิงตรรกะในการต่อสู้กับเชื้อโรคสำคัญสองชนิดนี้ทั่วโลก

ในเอกสารตีพิมพ์ทบทวนครั้งก่อนของเราเกี่ยวกับแนวคิดการออกแบบวัคซีนเอชไอวีที่มีอนุภาคคล้ายไวรัส (VLP)-1 เราได้กล่าวถึงว่า VLP ที่ไม่ห่อหุ้ม เช่น papillomavirus VLP สามารถมีบทบาทหน้าที่เป็นพาหะนำส่งในปัจจุบัน HIV-1 CTL หรือเอพิโทปแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลาง [15,16] สมมติฐานนี้ได้รับการยืนยันในไคเมอริกโบวีน papillomaviruses (BPV) หลายชนิด L1 VLP ที่นำเสนอ P18I10 CTL epitope จากลูป V3 ของ gp120 HIV-1 โปรตีนซองจดหมาย (Env) และ 2F5 epitope หรือบริเวณ MPER ของ gp41 HIV-1 Env [17–22]. ลักษณะทางโครงสร้างของโปรตีน capsid L1 ของมนุษย์ papillomavirus ประเภท-16 (HPV16) มีความคล้ายคลึงกับโปรตีน BPV และสามารถประกอบตัวเองเป็น L1 VLP ชั้นเดียวได้ [23] โปรตีน HPV16 L1 ห้าชนิดสร้างเพนทาเมอร์ และเพนทาเมอร์ 72 ตัวประกอบกันเองเป็น HPV16 VLP [24] อย่างไรก็ตาม ยังไม่มีหลักฐานชัดเจนว่า HPV16: โปรตีน capsid ของเชื้อ HIV สามารถคงตัว ในหลอดทดลอง และประกอบตัวเองเป็น VLP ที่มีลักษณะทางสัณฐานวิทยาได้ ในทางกลับกัน HPV16 L1 VLP ได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีภูมิคุ้มกันสูงและสามารถกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของ T และ B-cell ที่จำเพาะต่อแอนติเจนได้ [11–13] ยังคงต้องรอดูต่อไปว่าการนำเสนอของเอพิโทปของ HIV-1 ผ่าน HPV: HIV VLP สามารถสร้างภูมิคุ้มกันได้หรือไม่ ในการศึกษานี้ เรามุ่งเป้าที่จะพัฒนาวัคซีน HPV ที่ใช้ VLP แบบไคเมอริก: วัคซีน HIV โดยใช้เซลล์ 293F ของมนุษย์ ซึ่งเป็นระบบการแสดงออกของเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่ได้รับการยอมรับอย่างดี โปรตีน HPV 16 L1 ทำหน้าที่เป็นโครงโครงสร้างของวัคซีน และเปปไทด์ P18I10 และ T20 ได้รับเลือกให้เป็นอิมมูโนเจนของ HIV-1 และแทรกเข้าไปในลูป DE ของโปรตีน HPV 16 L1 อีพิโทป P18I10 CTL ที่มีภูมิคุ้มกันเด่นซึ่งประกอบรวมด้วยกรดอะมิโน 10 ตัว (เรซิดิว 311–320: RGP GRAFVTI) ได้มาจากโดเมนตัวแปรที่สาม (V3) ของไกลโคโปรตีนในซอง HIV-1 gp120 เปปไทด์ P18I10 ได้รับการระบุว่าเป็นโมเลกุล MHC คลาส I ที่จำกัด H-2 Dd เพื่อกระตุ้นการตอบสนองของทีลิมโฟไซต์ (CTL) ที่เป็นพิษต่อเซลล์ [25,26] เปปไทด์ T20 หรือที่รู้จักกันในชื่อ Enfuvirtide และได้รับการออกแบบให้เป็นเปปไทด์ฟิวชั่นมัลติเมอริกต้านไวรัส ประกอบด้วยลำดับกรดอะมิโน 36 ลำดับ (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ ELLELDKWASLWNWF) ซึ่งเลียนแบบลำดับเฮลิกส์ที่ปลาย C-terminal ใกล้กับเมมเบรน0 บริเวณภายนอกใกล้เคียง (MPER) ของไกลโคโปรตีนในซอง HIV-1 41 (gp41) [27] เอพิโทปที่มีเซลล์ HIV-1 T (P18I10) และ B (T20) สองตัวนี้ได้รับเลือกให้เป็นจุดเริ่มต้นและการพิสูจน์แนวคิดในการทดลองสำหรับ HPV ที่ใช้ไคเมอริก VLP: แพลตฟอร์มการพัฒนาวัคซีน HIV

ในช่วงทศวรรษที่ผ่านมา มีการทดสอบวัคซีนเอชไอวีที่ใช้ VLP{2}} ในรูปแบบไพรม์บูสต์ที่แตกต่างกันจำนวนมาก [15] แม้ว่ากลยุทธ์วัคซีน HIV{4}} VLP [28] หรือ chimeric BPV ก่อนหน้าส่วนใหญ่: HIV VLP [17–22] จะมุ่งเน้นไปที่การกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยใช้สูตรไพรม์บูสต์ที่คล้ายคลึงกัน แต่การศึกษาสองงานก่อนหน้านี้เสนอแนะว่าการสร้างภูมิคุ้มกันแบบต่างกัน ประกอบด้วยรีคอมบิแนนท์มัยโคแบคทีเรียม โบวิสBacillus Calmette-Guérin (rBCG) แสดงออกถึง HIV-1 Gag prime และ HIV-1 Gag VLP ที่เพิ่มขึ้นอาจช่วยเพิ่มภูมิคุ้มกันของ T-cell [29,30] ในกลุ่มการวิจัยของเรา เราได้สาธิตการรองพื้นด้วย rBCG ที่แสดงออกถึงภูมิคุ้มกันของ HIVA และการกระตุ้นด้วยเวกเตอร์ไวรัส MVA ชนิดรีคอมบิแนนท์HIVA มีความปลอดภัยและกระตุ้นให้เกิดการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของทีเซลล์ที่จำเพาะต่อ HIV-1- ในหนู BALB/c [31–33] อิมมูโนเจนของ HIVA ซึ่งออกแบบโดย Dr. Tomas Hanke ประกอบด้วยโปรตีน HIV{11}} Gag แบบเต็มความยาวรวมกับอีพิโทป CTL หลายตัว รวมถึงอีพิโทป P18I10 ที่ปลาย C [34] ดังนั้นเราจึงมุ่งประเมินว่า BCG.HIVA สามารถเพิ่มการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของ T-cell ที่เกิดจาก HIV: HPV (L1:P18I10) VLPs ในหนู BALB/c ได้หรือไม่

ในการศึกษานี้ อิมมูโนเจน HPV: HIV (L1:P18I10 และ L1:T20) แบบคิเมริกได้รับการออกแบบและผลิตโดยการใช้ระบบการแสดงออก 293F การแสดงออกของโปรตีน L1:P18I10 และ L1:T20 แบบไคเมอริกได้รับการยืนยันโดยการสร้างภูมิคุ้มกัน HPV: HIV VLP ได้รับการทำให้บริสุทธิ์ในเวลาต่อมาโดยวิธีโครมาโตกราฟีแบบขั้นตอน 3- ซึ่งรวมถึงแคตไอออน (CEC) การแยกตามขนาด (SEC) และโครมาโทกราฟีแบบความสัมพันธ์ของเฮปาริน (H-AC) จากนั้น ความเสถียร ในหลอดทดลอง การประกอบตัวเอง ในหลอดทดลอง และสัณฐานวิทยาของ HPV บริสุทธิ์: HIV VLPs ได้รับการยืนยันโดย SDS-PAGE แบบไม่รีดิวซ์ การทดสอบมวลโมเลกุล และกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (TEM) ตามลำดับ เปปไทด์ P18I10 และ T20 ตามลำดับและตามโครงสร้างที่นำเสนอบน chimeric HPV: HIV VLP ถูกแสดงคุณลักษณะเพิ่มเติมโดยโมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อต้าน HIV-1 gp120 V3 และ 2F5 ในหลอดทดลอง โดยใช้ Western blot และ indirect ELISA assay ในที่สุด การประเมินภูมิคุ้มกันของ HPV: HIV VLP ได้รับการประเมินในแบบจำลองหนู BALB/c เราแสดงให้เห็นว่าวัคซีนที่ใช้ไคเมอริก L1:P18I10 และ L1:T20 VLP สามารถกระตุ้นการตอบสนองของแอนติบอดีจำเพาะของ HPV16- และ HIV-1- และ L1:P18I10 VLP ที่เป็นไคเมอริกสามารถกระตุ้น HPV16- และ HIV{ {37}}การตอบสนองของทีเซลล์จำเพาะในหนู BALB/c เนื่องจากการพัฒนาและการผลิตวัคซีนป้องกันเชื้อ HPV: HIV ยังคงไม่สามารถทำได้ การศึกษานี้จึงเป็นกลยุทธ์พื้นฐานที่อาจคุ้มค่าที่จะสนับสนุนความพยายามระดับโลกในการพัฒนาวัคซีนที่ใช้ไคเมอริก VLP เพื่อควบคุมการติดเชื้อ HPV และ HIV-1

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. การสร้างวัคซีนสายพันธุ์ BCG.HIVA2auxo.int

Recombinant BCG ที่แสดงภูมิคุ้มกัน HIVA ถูกสร้างขึ้นก่อนหน้านี้โดยใช้เวกเตอร์กระสวยเชิงบูรณาการ E.coli-mycobacteria p2auxo.int การสร้างเวกเตอร์ของ E. coli/mycobacteria ที่แสดงแอนติเจนของ HIVA ได้รับการอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [31–33] BCG.HIVA2auxo.int ถูกเจือจางใน PBS-Tween20 ถึง 2 × 107 cfu/mL, โซนิคเพื่อรบกวนการจับตัวเป็นก้อนของแบคทีเรีย และปลูกเชื้อลงในแผ่นอาหารด้านหลังหรือหนูเมาส์ BALB/c (50 µL, 106 cfu/เมาส์)

Desert ginseng-Improve immunity (23)

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

2.2. วัฒนธรรมและการเปลี่ยนแปลงของแบคทีเรีย

เซลล์ของไกลซีนออกโซโทรฟิคสายพันธุ์ของ E. coli, M151GlyA (Invitrogen, Waltham, MA, USA) จัดหาโดย Dr. Pau Ferrer ได้รับการเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่เป็นอนุพันธ์ M9- ขั้นต่ำ (M9-D: Na2HPO4, 6.78 กรัม/ลิตร; KH2PO4, 3 กรัม/ลิตร; NaCl, {{10}}.5 กรัม/ลิตร; NH4Cl, 1 กรัม/ลิตร, กลูโคส, 1{{20 }} กรัม/ลิตร; MgSO4, 2 มิลลิโมล/ลิตร; CaCl2, 0.1 มิลลิโมล/ลิตร; ไทอามีน, 0.1 กรัม/ลิตร; FeCl3, 0.{{56 }}25 กรัม/ลิตร; AlCl3·6H2O, 0.13 มก./ลิตร; ZnSO4·7H2O, 2.6 มก./ลิตร; CoCl2·6H2O, 0.47 มก./ลิตร; CuSO4·H2O, 4.6 มก./ลิตร; H3BO3, 0.03 มก./ลิตร; MnCl2·4H2O, 4.2 มก./ลิตร; NiCl2·6H2O, 0.02 มก./ลิตร; Na2MoO4·2H2O, 0.06 มก./ลิตร) , เสริมด้วยไกลซีน (70 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เซลล์ E. coli M151Gly ถูกเปลี่ยนด้วยพลาสมิด p2auxo.HIVA โดยการใช้ไฟฟ้า ด้วยเหตุนี้ การเพาะเลี้ยงเชื้อ E. coli จึงมีความหนาแน่นเชิงแสง 0.9 ที่ 600 นาโนเมตร และเปลี่ยนรูปโดยใช้เครื่องอิเล็กโตรโพเรเตอร์พัลเซอร์ของยีน Bio-Rad ที่ 2.5 kV, 25 µF และ 200 Ω เซลล์ที่ถูกทรานส์ฟอร์มในเวลาต่อมาถูกเพาะเลี้ยงบนเพลตวุ้น M9-D (ส่วนประกอบตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ โดยมีแบคโทอาการ์ 1.5% ที่เติม) โดยไม่มีการเสริมไกลซีนสำหรับการคัดเลือกหรือด้วยการเสริมไกลซีนเป็นตัวควบคุม ไลซีน auxotrophic BCG สายพันธุ์ BCG∆lys จัดทำโดย WR Jacobs Jr., BR Bloom และ T. Hsu ได้รับการแปลงสภาพด้วย p2auxo.HIVAint plasmid DNA โดยการใช้ไฟฟ้า เพาะเลี้ยงเชื้อมัยโคแบคทีเรียในอาหารเลี้ยงเชื้อ Middlebrook 7H9 หรืออาหารเลี้ยงเชื้อ Middlebrook agar 7H10 ที่เสริมด้วย albumin-dextrose-catalase (ADC; Difco) ที่มี 0.05% Tween 80 L-lysine monohydrochloride (Sigma, Kawasaki, Japan) ละลายในน้ำกลั่นและ ใช้เป็นอาหารเสริมที่ความเข้มข้นสุดท้ายที่ 40 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร สำหรับการแปลงสภาพ BCG ได้รับการเพาะเลี้ยงให้มีความหนาแน่นเชิงแสง 1.5 ที่ 600 นาโนเมตร และถูกแปลงโดยใช้เครื่องอิเล็กโตรโพเรเตอร์พัลเซอร์ของยีน Bio-Rad ที่ 2.5 kV, 25 µF และ 1000 Ω จากนั้นทรานส์ฟอร์มแมนต์ถูกเพาะเลี้ยงบนอาหารเลี้ยงเชื้อ Middlebrook agar 7H10 ที่ได้รับการเสริมด้วย ADC ซึ่งมี Tween 80 0.05% โดยไม่มีการเสริมไลซีน

2.3. เส้นเซลล์และการเพาะเลี้ยงเซลล์

เซลล์ 293F (Tibco) ที่ได้มาจากเซลล์ไตเอ็มบริโอของมนุษย์ (HEK) 293 ถูกเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับการแสดงออก FreeStyle 293 (Tibco) เสริมด้วยเพนิซิลลิน-สเตรปโตมัยซิน (Tibco) 5 มล./ลิตร และบ่มในตู้อบ 37 ◦C ที่มี บรรยากาศที่มีความชื้น 5% CO2 บนแท่นเครื่องปั่นแบบวงโคจรหมุนที่ 125 รอบต่อนาที

2.4. การผลิตโปรตีน L1:P18I10 และ L1:T20 โดยใช้ระบบการแสดงออก 293F

โครงสร้าง pCDNA3.1 มีลำดับการเข้ารหัส DNA L1:P18I10 หรือ L1:T20 ที่สอดคล้องกับไคเมอริกโปรตีน L1:P18I10 และ L1:T20 ตามลำดับ เปปไทด์ HIV-1 P18I10 CTL (RGPGRAFVTI) หรือ T20 เปปไทด์ (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE LLELD KWASLWNWF) ถูกแทรกเข้าไปในลูป DE ของโปรตีน capsid HPV16 L1 ลำดับลูป HPV16 L1 DE ที่เข้ารหัสกรดอะมิโน 130–136 ถูกแทนที่ด้วยเปปไทด์ P18I10I10 หรือ T20 ลำดับการเข้ารหัส DNA L1:P18I10 หรือ L1:T20 ได้รับการแก้ไขด้วยลำดับ Kozak ปรับให้เหมาะสมด้วยโคดอนของมนุษย์ ขนาบข้างด้วยตำแหน่งเอนไซม์จำกัดของ HindIII และ XbaI และโคลนเป็นเวกเตอร์ pcDNA3.1(+) โดยใช้บริการการสังเคราะห์ยีน GeneArt ( เทอร์โม ฟิชเชอร์, วอลแทม, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา) recombinant plasmid DNA (pDNA) ถูกแปลงเป็นเซลล์ที่มีความสามารถของ E. coli DH5 (Invitrogen) เพื่อการขยายและสกัดโดยใช้ชุดพลาสมิด Maxi (QIAGEN, Hilden, Germany) เซลล์ 293F ถูกเพาะเลี้ยงด้วยสื่อการแสดงออก FreeStyle 293 ขนาด 30 มล. ในขวดรูปชมพู่ขนาด 125 มล. (คอร์นนิ่ง นิวยอร์ก นิวยอร์ก สหรัฐอเมริกา) จนถึงความหนาแน่น 1.0 × 106/มล. และทรานส์เฟกชั่วคราวด้วย L1:P18I10 หรือ L1:T20 pDNA โดยใช้กิ่ง โพลีเอทิลีนอิมีนที่มี MW 25 kDa (PEI-25K) (โพลีวิทยาศาสตร์) ที่อัตราส่วนที่เหมาะสมที่สุดของ DNA ต่อ PEI 1:3 (w/w) และ DNA ต่ออาหารเลี้ยงเชื้อ 1:1 (w/v) ตาม ตามคำแนะนำของผู้ผลิต [35] เซลล์ 293F ถูกเก็บเกี่ยวที่ 96 ชั่วโมงหลังทรานส์เฟกชัน เซลล์ 293F สามารถเข้าถึงความหนาแน่นที่ไหลมารวมกันที่ 3.6 × 106 เซลล์/มล. ที่มีความมีชีวิตได้ประมาณ 50%

2.5. การย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์

เซลล์ถูกซึมผ่านบนกระจกสไลด์ด้วยอะซิโตนเย็น 100% ต่อมา เซลล์คงที่ถูกตรวจสอบด้วยแอนติบอดีต้าน HPV16 L1 CAMVIR-1 (Abcam, เมืองเคมบริดจ์ สหราชอาณาจักร) และถูกจับด้วย IgG-FITC (Sigma) ที่ต้านหนูเมาส์ ชั้นเดียวของเซลล์ที่เปื้อนภูมิคุ้มกันถูกล้างอย่างทั่วถึงด้วย PBS และปิดด้วยตัวกลางการยึดติดด้วย DAPI (Abcam) ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ได้รับการตรวจสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบกลับด้านที่กำลังขยาย 40 เท่า ประสิทธิภาพการทรานส์เฟกชันถูกกำหนดโดยอัตราส่วนของเซลล์ที่เป็นบวกของ FITC (สีเขียว) ต่อเซลล์ที่ย้อมด้วย DAPI (สีน้ำเงิน)

2.6. การทำให้ HPV บริสุทธิ์: HIV (L1:P18I10 และ L1:T20) VLPs

เซลล์ 293F ที่ถูกทรานส์เฟกทั้งหมด 10 เซลล์ในขวดรูปชมพู่ขนาด 125 มล. (อาหารเลี้ยงเชื้อ 30 มล./ขวด) ถูกรวบรวมโดยการปั่นแยกที่ 1500 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาทีและล้างสองครั้งด้วย PBS เม็ดเซลล์ถูกแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์ไลซิสที่ทำสูตรผสมด้วย 1% ไทรทัน X-100, สารยับยั้งโปรตีเอส (1:100) (มิลลิพอร์) และเบนโซเนส (25 ยู/มิลลิลิตร) (มิลลิพอร์) ไลซีนของเซลล์ถูกทำให้ใสด้วยตัวกรองไซริงก์ PVDF 0.45 ไมโครเมตร (มิลลิพอร์) HPV: ตัวอย่าง VLP ของ HIV (L1:P18I10 และ L1:T20) ได้รับการทำให้บริสุทธิ์ตามลำดับโดยใช้การแลกเปลี่ยนไอออนบวก (Capto SP ImpRes, GE, บอสตัน, MA, สหรัฐอเมริกา), การแยกขนาด (Capto Core 700, GE) และความสัมพันธ์ (HiTrap Heparin HP , GE) โครมาโตกราฟี โปรโตคอลโครมาโตกราฟีได้อธิบายไว้ในการศึกษาก่อนหน้าของเรา [36,37] และปฏิบัติตามระเบียบวิธีของผู้ผลิต [38] สัญญาณโปรตีน L1 ในแต่ละขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์แสดงคุณลักษณะโดยการวิเคราะห์เวสเทิร์นบล็อตและตรวจสอบด้วย CAMVIR แอนติบอดี L1 ที่ต้าน HPV16-1 [39]

2.7. SDS-PAGE แบบไม่ลดขนาด

HPV16 L1, L1:P18I10 และ L1:T20 VLP ถูกผสมกับบัฟเฟอร์ตัวอย่าง Laemmli 2 เท่า (BIO-RAD) ในกรณีที่ไม่มีหรือมีอยู่ 5% (ปริมาตร/ปริมาตร) 2-เมอร์แคปโตเอธานอล ({{11} }ME) และทำปฏิกิริยาที่อุณหภูมิห้อง (RT) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ตัวอย่างถูกแยกด้วยเจลโปรตีนไร้คราบ TGX (BIO-RAD) 8–16% จากนั้น เจลถูกถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF ตรวจสอบเมมเบรนด้วยสารต้าน HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb ที่การเจือจาง 1:4000 หลังจากนั้นเมมเบรนจะถูกบ่มด้วย IgG Peroxidase Conjugate ที่ต่อต้านเมาส์ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ที่เจือจาง 1: 4000 สัญญาณได้รับการพัฒนาและแสดงภาพโดยเคมีเรืองแสงโดยใช้ชุดสารตั้งต้น Western Blot ECL (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ภาพบล็อตได้มาโดยใช้ระบบสร้างภาพ Odyssey Fc

2.8. การวิเคราะห์มวลโมเลกุล

HPV16 L1, L1:P18I10 และ L1:T20 VLP ที่ไม่มีการบำบัดด้วย 2-ME ถูกกรองออกผ่านทางอุปกรณ์อัลตราฟิลเตรชันที่ตัดด้วยน้ำหนักโมเลกุล (MWCO) 1000 กิโลดัลตัน (SARTORIUS) HPV16 L1, L1:P18I10 และ L1:T20 VLP ที่มีการบำบัด 2- ME ถูกส่งผ่านอุปกรณ์อัลตราฟิลเตรชัน MWCO 100 กิโลดาลตัน (Amicon) สิ่งที่กักไว้ถูกสร้างขึ้นใหม่เป็นปริมาตรดั้งเดิมและรวบรวมจากแหล่งกักเก็บตัวอย่างอุปกรณ์กรอง ในขณะที่สิ่งกรองถูกรวบรวมที่ด้านล่างของหลอดหมุนเหวี่ยง สัญญาณ L1 ถูกวัดโดยใช้ดอตบล็อตที่ตรวจสอบด้วยแอนติ-HPV16 L1 mAb และตรวจพบโดยคอนจูเกต IgG-เปอร์ออกซิเดสของแอนติ-เมาส์ (Sigma-Aldrich) รูปภาพถูกได้มาโดยใช้ระบบสร้างภาพ Odyssey Fc ที่ช่องเคมีเรืองแสง

Desert ginseng-Improve immunity

ประโยชน์ของ Cistanche Tubulosa-เสริมสร้างระบบภูมิคุ้มกัน

2.9. การย้อมสีและการส่งผ่านด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบลบ

หลังจากชาร์จกริดทองแดงเคลือบคาร์บอน (Sigma-Aldrich) ภายใต้แสงอัลตราไวโอเลตเป็นเวลา 5 นาที HPV16 L1 เชิงพาณิชย์ (Abcam) L1:P18I10 และ L1:T20 VLP บริสุทธิ์ที่ปรับสมดุลด้วย Tris-HCl 20 มิลลิโมลาร์ (pH 7.4, 137 มิลลิโมลาร์ NaCl ) ถูกดูดซับบนตะแกรงเป็นเวลา 1 นาทีและล้างสามครั้งด้วยน้ำ miliQ HPV: HIV VLPs มีรอยเปื้อนเป็นลบด้วย 2% uranyl acetate ที่ pH 4.5 (Sigma-Aldrich) เป็นเวลา 1 นาที สารย้อมสีส่วนเกินถูกกำจัดออกโดยกระดาษกรองเชิงคุณภาพ Whatman (Sigma-Aldrich) กริดถูกวางไว้ในห้องลดความชื้นอย่างน้อย 2 ชั่วโมงก่อนการสังเกต ภาพได้มาโดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (Tecnai Spirit 120 kV) ที่กำลังขยาย SA135K (100 นาโนเมตร) และ SA59000 (200 นาโนเมตร) ตามลำดับ

2.10. โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต–โพลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโตรโฟรีซิสและการวิเคราะห์แบบ Western Blotting

ปริมาณที่เท่ากัน (500 ng) ของโปรตีน HPV16 L1 (Abcam), L1:P18I10 บริสุทธิ์ และ L1:T20 VLP ถูกผสมกับบัฟเฟอร์ตัวอย่าง Laemmli 2× ที่มี 5% 2-ME และต้มที่ 95 ◦C เป็นเวลา 5 นาที . ตัวอย่างถูกแยกด้วยเจลโปรตีนปราศจากคราบ TGX 8–16% จากนั้นถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF (มิลลิพอร์, เบอร์ลิงตัน, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา) โดยใช้อุปกรณ์ถ่ายโอนแบบกึ่งแห้ง (Bio-Rad) เมมเบรนถูกปิดกั้นด้วยนมพร่องมันเนย 5% ใน TBST จากนั้น เมมเบรนถูกตรวจสอบด้วย anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb ที่การเจือจาง 1:4000, anti-HIV-1 gp120 V3 loop mAb (NIBSC, EVA3012) ที่การเจือจาง 1: 40 และ HIV1 gp41 (2F5) mAb (NIBSC, ARP3063) ที่การเจือจาง 1:4000 ตามลำดับ หลังจากนั้น เมมเบรนถูกบ่มด้วยคอนจูเกต IgG Peroxidase Conjugate (Sigma-Aldrich) ที่ต่อต้านหนูเมาส์ที่การเจือจาง 1:4000 ชุดซับสเตรต Western ECL (BIO-RAD) ใช้สำหรับการพัฒนาสัญญาณ ภาพบล็อตได้มาโดยใช้ระบบสร้างภาพ Odyssey Fc ที่ช่องเคมีเรืองแสง

2.11. การสร้างภูมิคุ้มกันให้กับหนู การสะสมของซีรั่ม และการแยกเซลล์ม้าม

นี่เป็นการศึกษาพิสูจน์แนวคิดเบื้องต้นเพื่อแสดงให้เห็นถึงภูมิคุ้มกันของ HPV: HIV VLPs (L1:P18I10 และ L1:T20 VLPs) ขนาดยา เส้นทางการให้ยา และช่วงเวลาไพรม์บูสต์ของ HPV ของเรา: HIV VLPs อ้างถึงการศึกษาก่อนหน้านี้ที่ให้ภูมิคุ้มกันหนูด้วย bovine papillomavirus (BPV): HIV VLPs เพื่อกระตุ้นการตอบสนองของแอนติบอดี [20,21] HPV บริสุทธิ์: HIV VLP ถูกอิมัลชันด้วยอะลูมิเนียมไฮดรอกซีฟอสเฟตซัลเฟต (เทอร์โม ฟิชเชอร์) ในปริมาณที่เท่ากัน (225 ไมโครกรัมต่อโดส 0.5 มล.) เพื่อให้แน่ใจว่ามีสูตรคล้ายกับวัคซีน Gardasil-9 HPV ที่ได้รับอนุญาต [40] กลุ่มเมาส์ทั้งหมดมีการกระจายเพศที่เท่าเทียมกัน (เพศชาย=4 และเพศหญิง n=4 ต่อกลุ่ม) ในกลุ่ม A และ B หนูเมาส์ BALB/c ได้รับการก่อภูมิคุ้มกันในกล้ามเนื้อ (im) ด้วย 10 ไมโครกรัมของ L1:P18I10 หรือ L1:T20 VLP ตามลำดับ โดยปฏิบัติตามรูปแบบการเพิ่มไพรม์แบบโฮโมโลกัส ในกลุ่ม C หนูได้รับการฉีดวัคซีนด้วย BCG.HIVA2auxo.int 106 ซีเอฟยูในผิวหนัง (id ที่ถาดอาหาร) และกระตุ้นด้วย 10 ไมโครกรัมของ L1:P18I10 VLP ในกล้ามเนื้อ ในกลุ่ม D หนูควบคุมเชิงบวกถูกปลูกเชื้อด้วยไพรม์ Gardasil- 9 ตามด้วย Gardasil-9 บูสต์ในกล้ามเนื้อด้วย 10 ไมโครกรัมของ HPV16 L1 VLP ในกลุ่ม E หนูกลุ่มควบคุมเชิงลบได้รับการก่อภูมิคุ้มกันสองครั้งด้วยบัฟเฟอร์ PBS ช่วงเวลาไพรม์บูสต์คือ 2 สัปดาห์ หนูถูกบูชายัญในวันที่ 28 เก็บตัวอย่างเลือดจากหัวใจของหนู ซีรั่มถูกนำกลับมาใช้ใหม่โดยการปั่นแยกและเก็บไว้ที่ −20 ◦C สำหรับการทดสอบ ELISA ม้ามของหนูถูกเอาออกและกดแยกกันผ่านเครื่องกรองเซลล์ (ฟอลคอน) ด้วยลูกสูบยางสำหรับหลอดฉีดยาขนาด 5 มล. หลังจากการกำจัดเซลล์เม็ดเลือดแดงด้วย ACK lysing buffer (Lonza) ม้ามจะถูกล้างและแขวนลอยใหม่ในลิมโฟไซต์ขนาดกลาง R10 (RPMI 1640 เสริมด้วยซีรั่มลูกวัวของทารกในครรภ์ 10% (FCS), เพนิซิลลิน-สเตรปโตมัยซิน, 20 มิลลิโมลาร์ HEPES และ 15 มิลลิโมลาร์ {{ 46}}ME) ที่ความเข้มข้น 2 × 107 เซลล์/มิลลิลิตร

2.12. เอนไซม์ที่เชื่อมโยงการทดสอบอิมมูโน

เพื่อทดสอบแอนติบอดีจำเพาะ HPV16 L1- และ HIV-1- ซึ่งจับกับไคเมอริก HPV: โครงสร้าง HIV VLP สร้าง ในหลอดทดลอง โดยมีความเข้มข้นเท่ากัน 50 µL (200 ng/mL) ของโปรตีน recombinant HPV16 L1 (Abcam, ab119880 ), L1:P18I10 และ L1:T20 VLP ที่ถูกทำให้บริสุทธิ์ในบัฟเฟอร์คาร์บอเนตไบคาร์บอเนต 50 มิลลิโมลาร์ (pH=9.6) (Sigma) ถูก 2- เจือจางแบบอนุกรมและเคลือบลงบนเพลต Maxisorb (Nunc) เพลตถูกฟักที่อุณหภูมิ 4 ◦C ข้ามคืน เพลตถูกปิดกั้นด้วยบัฟเฟอร์บล็อค (นมพร่องมันเนย 5% ใน TBST) ที่อุณหภูมิ 37 —C เป็นเวลาอย่างน้อย 2 ชั่วโมง หลังจากการล้างสองครั้งด้วย TBST, เพลตที่เคลือบ VLP ถูกบ่มด้วยแอนติ-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb ที่การเจือจาง 1:8000, 2F5 mAb (NIBSC, ARP3063) ที่การเจือจางที่ 1:8000 และแอนติ- HIV-1 gp120 V3 ลูป mAb (NIBSC, EVA3012) ที่เจือจาง 1:40 ในบัฟเฟอร์การบล็อก ตามลำดับ ที่ 37 ◦C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง หลังจากล้างด้วย TBST สามครั้ง จานจะถูกบ่มด้วยคอนจูเกตโปรตีน recombinant G peroxidase (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) ที่เจือจาง 1:4000 ในบัฟเฟอร์ปิดกั้นที่ 37 —C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง TMB ถูกนำมาใช้เพื่อพัฒนาสัญญาณการทดสอบอิมมูโนซอร์เบนท์ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ELISA) และหยุดด้วย 2M H2SO4 50 µL ความหนาแน่นเชิงแสง (OD) ของแต่ละหลุมถูกวัดและบันทึกที่ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลทดูดกลืนแสง EL × 800

เพื่อวัดแอนติบอดีที่เหนี่ยวนำด้วย VLP ในหนูเมาส์ BALB/c เพลตไมโครไตเตอร์ถูกเคลือบด้วยโปรตีนรีคอมบิแนนท์ HPV16 L1 50 ไมโครลิตรของ 2 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (Abcam, ab119880), เปปไทด์ P18I10 ของ HIV-1 (NIBSC, ARP734) T20 เปปไทด์ (NIBSC, ARP984) ตามลำดับ โดยมีบัฟเฟอร์คาร์บอเนต-ไบคาร์บอเนต 50 มิลลิโมลาร์ (pH=9.6) เพลตถูกฟักที่อุณหภูมิ 4 ◦C ข้ามคืน เพลตถูกปิดกั้นด้วยบัฟเฟอร์บล็อค (นมพร่องมันเนย 5% ใน TBST) ที่อุณหภูมิ 37 —C เป็นเวลาอย่างน้อย 2 ชั่วโมง ในเวลาเดียวกัน ซีรั่มที่เก็บจากหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกันกลุ่ม AE ถูกเจือจางด้วยนมพร่องมันเนย 5% ใน TBST ในอัตราส่วน 1:50 หลังจากล้างสองครั้งด้วย TBST จานจะถูกบ่มด้วยซีรั่มเจือจางที่ 37 —C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง หลังจากการล้างสามครั้งด้วย TBST เพลตถูกเติมด้วยคอนจูเกตโปรตีนรีคอมบิแนนท์ G HRP ที่เจือจาง 1:4000 ในบัฟเฟอร์ขัดขวางและบ่มที่ 37 —C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง TMB ถูกใช้เพื่อพัฒนาสัญญาณ ELISA และหยุดด้วย 50 µL ของ 2M H2SO4 OD ของแต่ละหลุมถูกวัดที่ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลทการดูดกลืนแสง EL × 800 (Biotek)

2.13. IFN-ELISpot Assay

การทดสอบจุดดูดซับภูมิคุ้มกันที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ELISpot) ดำเนินการโดยใช้ชุด IFN-ELISpot ของหนูเชิงพาณิชย์ (Mabtech, Nacka Strand, สวีเดน) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต เพลต ELISpot (MSISP4510, 96-เพลตหลุมที่มีเมมเบรนโพลีไวนิลดีน ไดฟลูออไรด์, มิลลิพอร์, มิดเดิลเซ็กซ์เคาน์ตี้, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา) ได้รับการบำบัดด้วย EtOH 70% และเคลือบด้วยอินเตอร์เฟอรอน- (IFN-) ดักจับโมโนโคลนอล แอนติบอดีบริสุทธิ์ที่เจือจางใน น้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) จนถึงความเข้มข้นสุดท้ายที่ 5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ที่ 4 ◦C ข้ามคืน จากนั้นเติมเซลล์ม้ามสด 2.5 × 105 ลงในแต่ละหลุม ต่อมา เซลล์จากกลุ่ม A และ B ถูกกระตุ้นด้วยเปปไทด์ P18I10 ของ HPV16 L1 VLP และ HIV{17}} 2 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ตามลำดับ ตัวอย่างและส่วนควบคุมทั้งหมดถูกชุบในหลุมที่ซ้ำกัน การตรวจวิเคราะห์ ELISpot ถูกบ่มเป็นเวลา 16 ชั่วโมงที่ 37 ◦C, 5% CO2 ต่อมาจานถูกล้าง 5 ×ด้วย PBS, บ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงด้วยไบโอทินิเลตต้าน IFN- โมโนโคลนอลแอนติบอดี (mAb) เจือจางใน PBS 2% เซรั่มลูกวัวของทารกในครรภ์ (FCS) จนถึงความเข้มข้นสุดท้ายที่ 2 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร, ล้าง 5 ครั้ง ใน PBS และบ่มด้วยคอนจูเกตสเตรปตะวิดิน-อัลคาไลน์ฟอสฟาเตสใน PBS 2% FCS จากนั้น ล้างเพลต 5 ครั้งด้วย PBS ก่อนบ่มด้วยสารละลายซับสเตรต 5-โบรโม-4-คลอโร-3-อินโดลิล ฟอสเฟต (BCIP)/ไนโตร บลู เตตราโซเลียม (NBT) 100 µL (Sigma-Aldrich , เซนต์หลุยส์ มิสซูรี สหรัฐอเมริกา) หลังจากผ่านไป 5–10 นาที จานจะถูกล้างด้วยน้ำประปา ตากแห้ง และจุดผลลัพธ์ที่นับโดยใช้เครื่องอ่าน ELISPOT (AID, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasberg, Germany) สำหรับสัตว์แต่ละตัว ค่าเฉลี่ยของการตอบสนองเบื้องหลังถูกลบทีละหลุมจากทุกหลุมเพื่อให้สามารถเปรียบเทียบเซลล์ที่สร้างจุด IFN (SFC)/106 ระหว่างกลุ่มได้ ในการกำหนดการตอบสนองเชิงบวก เกณฑ์ถูกกำหนดไว้อย่างน้อยห้าจุดต่อหลุม และการตอบสนองเกินจำนวนเฉลี่ยของจุดในหลุมควบคุมเชิงลบ บวกด้วยค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานสามจุดของหลุมควบคุมเชิงลบ

2.14. การวิเคราะห์ทางสถิติ

การวิเคราะห์ทางสถิติทั้งหมดดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ Prism 6 GraphPad (CA, USA) เราใช้ข้อมูลจากการทดลองที่ดำเนินการความเข้มข้นของการเคลือบเพลต ELISA ที่แตกต่างกันมากกว่า 5 แบบ (0, 50, 100, 150, 200 ng/mL) ของโปรตีนรีคอมบิแนนท์ HPV16 L1 (Abcam, ab119880) และ HPV: HIV VLPs เรารวบรวมข้อมูลจาก 2 กลุ่ม (HPV16 L1 และ HPV: HIV VLPs) และรวบรวมสามซ้ำสำหรับความเข้มข้นของสารเคลือบแต่ละชนิด กราฟในปริซึมแสดงข้อมูลในรูปแบบกระจายที่แสดงความเข้มข้นของการเคลือบ (นาโนกรัม/มิลลิลิตร) บนแกน X และ OD450 บนแกน Y เนื่องจากเราตั้งสมมติฐานว่าข้อมูล ELISA ในหลอดทดลองของเรามีความสัมพันธ์ในรูปแบบเชิงเส้น เราจึงทำการวิเคราะห์การถดถอยเชิงเส้นและเปรียบเทียบความชันของสองบรรทัดเพื่อยืนยันว่าชุดข้อมูล-1 และชุดข้อมูล-2 (แอนติบอดี ปฏิกิริยาระหว่าง HPV16 L1 และ HPV: HIV VLPs) จะแตกต่างกันในการกระทำ เราเลือกช่วงความเชื่อมั่น 95% ควบคู่ไปกับเส้นที่เหมาะสมที่สุด ปริซึมจะวางทับเส้นการถดถอยเชิงเส้นบนชุดข้อมูลทั้งสองของเราโดยอัตโนมัติ และได้พล็อตเส้นประซึ่งแสดงถึงช่วงความเชื่อมั่น 95% ในระหว่างการวิเคราะห์การถดถอยเชิงเส้น ซอฟต์แวร์จะคำนวณเฉพาะค่า Y เฉลี่ยของชุดข้อมูลของเราที่ระบุแสดงให้เห็นถึงความเหมาะสม นอกจากนี้ ปริซึมยังให้คำอธิบายแก่เราด้วย ดังนั้นเราจึงสรุปได้ว่าความแตกต่างระหว่างเนินทั้งสองนั้นมีความสำคัญอย่างยิ่ง

เรามีข้อมูล 5 ชุด (ELISA) และ 4 ชุด (ELISPOT) ที่รวบรวมจากการทดลองสร้างภูมิคุ้มกันให้กับหนู ชุดข้อมูลเหล่านี้มีจำนวนเท่ากัน (ชาย n=4 และเพศหญิง n=4) ในแต่ละกลุ่ม เราใช้หนูที่ได้รับภูมิคุ้มกัน Gardasil-9-เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก และหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกัน PBS เป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบ ข้อมูลของการทดลองที่เราออกแบบไม่ตรงกันหรือจับคู่กัน เราทำการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (one-way) เพื่อดูว่าค่าเฉลี่ยเหล่านี้แตกต่างกันหรือไม่ ก่อนอื่น เราตรวจสอบข้อมูลของเราว่าสอดคล้องกับการแจกแจงแบบปกติแบบเกาส์เซียน เราพบว่าข้อมูลบางกลุ่มในการทดสอบ ELISA ไม่ผ่านการทดสอบการแจกแจงแบบปกติแบบเกาส์เซียน ดังนั้นเราจึงดำเนินการวิเคราะห์ทางสถิติแบบไม่อิงพารามิเตอร์ของข้อมูลเหล่านี้ ในทางตรงกันข้าม ข้อมูลทุกกลุ่มในการทดสอบ ELISPOT จะผ่านการทดสอบการแจกแจงแบบปกติแบบเกาส์เซียน ดังนั้นเราจึงทำการวิเคราะห์ทางสถิติแบบพาราเมตริกของข้อมูลเหล่านี้ เกณฑ์ที่มีนัยสำคัญและระดับความเชื่อมั่นถูกกำหนดไว้ที่ 0.05 (เทียบเท่ากับช่วงความเชื่อมั่น 95%) ค่า p แสดงความน่าจะเป็นโดยทั่วไปที่มีความแตกต่างระหว่างกลุ่ม เนื่องจากความกังวลหลักของเราสำหรับการทดลองนี้คือความแตกต่างระหว่างกลุ่มของเรา การเปรียบเทียบพหุคูณในปริซึมทำให้เราได้ผลลัพธ์ของการเปรียบเทียบในกลุ่มทั้งหมดกับกลุ่มอื่นๆ ทุกกลุ่ม

2.15. คำชี้แจงด้านจริยธรรม

หนู BALB/c อายุหกถึงแปดสัปดาห์ถูกซื้อจาก Envigo (บริษัท Inotiv, ชิคาโก, อิลลินอยส์, สหรัฐอเมริกา) และได้รับการอนุมัติโดยหน่วยงานท้องถิ่น (Generalitat de Catalunya, โครงการหมายเลข 11157) และคณะกรรมการจริยธรรม Universitat Autònoma de Barcelona การทดลองกับสัตว์เป็นไปตามกฎหมายสวัสดิภาพสัตว์ของ Generalitat de Catalunya อย่างเคร่งครัด การทดลองทั้งหมดได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมการวิจัยในพื้นที่ (ขั้นตอน 43.19, Hospital de la Vall d'Hebron, Universitat Autònoma de Barcelona)

3. ผลลัพธ์

3.1. การออกแบบภูมิคุ้มกัน L1:P18I10 และ L1:T20 และการประเมิน HPV: การแสดงออกของโปรตีน HIV โดยใช้ระบบการแสดงออก 293F

เพปไทด์ P18I10 จากลูปโดเมนตัวแปรที่สาม (V3) ของ HIV-1 Env และเปปไทด์ T20 จากบริเวณใกล้เคียงภายนอก (MPER) ของเมมเบรน Env -1 ถูกแทรกเข้าไปในโปรตีนลูป HPV16 L1 DE เพื่อสร้าง L1 แบบไคเมอริก :P18I10 และ L1:T20 อิมมูโนเจน ลำดับการเข้ารหัส DNA L1:P18I10 และ L1:T20 แบบไคเมอริกถูกโคลนไปเป็นเวกเตอร์การแสดงออกพลาสมิด DNA ของ pcDNA3.1 (+) สำหรับการทรานส์เฟกชั่นชั่วคราวในเซลล์ 293F (รูปที่ 1A) โครงสร้างโมโนเมอร์ของ HPV16 L1, chimeric L1:P18I10 และ L1:T20 capsid โปรตีนถูกทำนายเบื้องต้นโดยใช้เซิร์ฟเวอร์รุ่น SWISS (รูปที่ 1B) โปรตีนแคปซิดหลัก HPV16 L1 (7cn2.1.R) ถูกเลือกเป็นเทมเพลตโครงสร้างเพื่อสร้างแบบจำลองที่คล้ายคลึงกันของโปรตีนแคปซิด HPV16 L1, L1:P18I10 และ L1:T20 เมื่อเปรียบเทียบกับโครงสร้างของเปปไทด์ P18I10 ที่ถูกผูกไว้ในการศึกษาก่อนหน้านี้ [41] ทิศทางสายโซ่หลักของปลายทาง N ถึง C ของเปปไทด์ P18I10 บนโปรตีน L1: P18I10 แบบไคเมอริกของเราวิ่งจากขวาไปซ้าย (รูปที่ 1B แผงกลางและด้านบน) และโซ่ด้านข้าง P18I10 ที่เปิดเผยอาจมีปฏิกิริยากับตัวรับ T เซลล์ (รูปที่ 1B แผงกลางและด้านล่าง) เมื่อเปรียบเทียบกับโครงสร้างของเปปไทด์ตัวยับยั้งฟิวชั่น HIV-1 ในรายงานการทบทวนครั้งก่อน [42] เปปไทด์ T20 ที่ใส่ไว้บนโปรตีน capsid ของ HPV16 L1 จะถูกนำเสนอในรูปแบบ - คล้ายเกลียว (รูปที่ 1B แผงด้านขวาและด้านบน ) และสายด้านข้าง T20 ที่เปิดออกอาจถูกจดจำได้โดยรีเซพเตอร์บีเซลล์ (รูปที่ 1B แผงด้านขวาและด้านล่าง) เนื่องจากโปรตีน capsid ของ HPV16 L1 สามารถรวมตัวกันเป็นอนุภาค icosahedral T=7 ที่มี capsomeres เพนทาแมริก 72 ตัว [43] การแสดงเปปไทด์ P18I10 หรือ T20 ที่มีความหนาแน่นสูงไปยังพื้นผิวด้านนอกของ chimeric HPV: HIV VLPs มีศักยภาพในการกระตุ้นภูมิคุ้มกันสูง เพื่อกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่จำเพาะต่ออีพิโทป

Figure 1. L1:P18I10 and L1:T20 immunogen design and construction of chimeric HPV: HIV VLPs by using 293F expression system. (A) The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 DNA coding sequences were cloned into pcDNA3.1+ expression vectors, respectively, for transient transfection in 293F cells. (B) Prediction of monomer structures of HPV16 L1 and chimeric HPV: HIV capsid proteins by using the SWISS-model server. HPV16 major capsid protein L1 (7cn2.1.R) was selected as the structural template to build the HPV16 L1 (left panel), L1:P18I10 (middle panel), and L1:T20 (right panel) capsid protein homology modeling. Secondary structural elements of HPV16 L1 capsid protein are labeled, with letters h1–h5 for the 5 α-helices. Loops of HPV16 L1 capsid protein between strands are labeled BC, CD, DE, EF, FG, and HI. Secondary structural elements of HIV-1 P18I10 and T20 peptides L1 are labeled by the arrows (top panel). The part of the P18I10 and T20 peptide that protrudes above the surface of the HPV16 L1 capsid protein is indicated by the arrows (bottom panel). (C) Immunofluorescence staining of L1 protein in 293F cells. The following pDNA.L1:P18I10 (left), pDNA.L1:T20 (middle), and pDNA.without insertion (right) were transfected in 293F cells. The transfected cells were probed with anti-HPV16 L1 mAb and detected with anti-mouse IgG-FITC (green channel). Cell nuclei were stained with DAPI (blue channel). Immunofluorescence images were merged by using Adobe Photoshop


รูปที่ 1 การออกแบบอิมมูโนเจน L1:P18I10 และ L1:T20 และการสร้าง Chimeric HPV: HIV VLP โดยใช้ระบบการแสดงออก 293F (A) ลำดับการเข้ารหัส DNA L1:P18I10 และ L1:T20 แบบไคเมอริกถูกโคลนเข้าไปในเวกเตอร์นิพจน์ pcDNA3.1+ ตามลำดับสำหรับการทรานส์เฟกชั่นชั่วคราวในเซลล์ 293F ( B ) การทำนายโครงสร้างโมโนเมอร์ของ HPV16 L1 และ chimeric HPV: โปรตีน capsid ของ HIV โดยใช้เซิร์ฟเวอร์รุ่น SWISS HPV16 major capsid โปรตีน L1 (7cn2.1.R) ถูกเลือกเป็นเทมเพลตโครงสร้างเพื่อสร้าง HPV16 L1 (แผงด้านซ้าย), L1:P18I10 (แผงกลาง) และ L1:T20 (แผงด้านขวา) การสร้างแบบจำลองที่คล้ายคลึงกันของโปรตีน capsid องค์ประกอบโครงสร้างทุติยภูมิของโปรตีน capsid HPV16 L1 มีป้ายกำกับ โดยมีตัวอักษร h1–h5 สำหรับเอนริเก้ 5 - ลูปของโปรตีน capsid HPV16 L1 ระหว่างสายจะมีป้ายกำกับว่า BC, CD, DE, EF, FG และ HI องค์ประกอบโครงสร้างทุติยภูมิของ HIV-1 เปปไทด์ P18I10 และ T20 L1 มีป้ายกำกับโดยลูกศร (แผงด้านบน) ส่วนของเปปไทด์ P18I10 และ T20 ที่ยื่นออกมาเหนือพื้นผิวของโปรตีน capsid HPV16 L1 จะแสดงด้วยลูกศร (แผงด้านล่าง) (C) การย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ของโปรตีน L1 ในเซลล์ 293F pDNA.L1:P18I10 (ซ้าย), pDNA.L1:T20 (กลาง) และ pDNA. ต่อไปนี้โดยไม่มีการแทรก (ขวา) ได้รับการทรานส์เฟกในเซลล์ 293F เซลล์ที่ถูกทรานส์เฟกถูกตรวจสอบด้วยสารต้าน HPV16 L1 mAb และตรวจพบด้วยสารต้าน IgG-FITC ของหนูเมาส์ (ช่องสีเขียว) นิวเคลียสของเซลล์ถูกย้อมด้วย DAPI (ช่องสีน้ำเงิน) ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ถูกรวมเข้าด้วยกันโดยใช้ Adobe Photoshop

เนื่องจากลำดับเทอร์มินัล C ของโปรตีน HPV16 L1 เป็นสื่อกลางในการนำเข้าเครื่องจักรนิวเคลียร์ระหว่างการติดเชื้อ [44] จึงได้มีการระบุสัญญาณการแปลนิวเคลียร์ (NLS) ของโปรตีน HPV16 L1 ในการศึกษาก่อนหน้านี้ [45] โมโนโคลนอลแอนติบอดี CAMVIR-1 ถูกเลือกเพื่อจดจำเอพิโทป HPV16 L1 (GFGAMDF, 230–236 aa) [39] และใช้ FITC ที่มีฟลูออเรสซีนเป็นพื้นฐานเป็นผู้รายงานเพื่อติดตามการแสดงออกของ L1:P18I10 และ L1: โปรตีน T20 ภาพอิมมูโนฟลูโอแสดงอย่างชัดเจนว่า HPV16 L1 (เป็นสีเขียว) ส่วนใหญ่อยู่ในนิวเคลียส (สีน้ำเงิน) ของเซลล์ 293F ไม่พบสัญญาณ L1 ในเซลล์ 293F ที่ทรานส์เซกต์ด้วยพลาสมิดควบคุม (พลาสมิด pcDNA3.1 ที่ไม่มีส่วนแทรก) (รูปที่ 1C) ผลลัพธ์ชี้ให้เห็นว่าทั้งไคเมอริก L1:P18I10 และ L1:T20 capsid สามารถแสดงออกได้โดยใช้โพลีเอทิลีนไอมีน (PEI) ซึ่งเป็นสื่อกลางในการเปลี่ยนถ่าย และจดจำโดยโมโนโคลนอลแอนติบอดี HPV16 L1 CAMVIR-1

3.2. การทำให้บริสุทธิ์ของ L1:P18I10 และ L1:T20 VLP โดยใช้วิธีการโครมาโตกราฟี

The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 proteins were produced by using the 293F expression system. The capture, intermediate purification, and polishing (CiPP) strategy to develop our chromatographic purification protocol is shown in Figure 2A. Flowthrough (FT) in each purification step was collected and the level of L1 protein expression was detected by Western blot analysis using anti-L1 mAb to trace intermediate HPV: HIV VLPs (Figure 2B, C). A cation exchange (CEC) column was selected as a capturing step to isolate HPV: HIV VLPs from host cell proteins (HCPs). The result of CEC FT revealed that most of the L1:P18I10 and L1T20 VLPs were lost in the FT over the CEC column (Figure 2B, C, lane 2). Traditional CEC matrices we used heavily rely on diffusion-limited mass transfer [46]. Large macromolecular complexes, such as our HPV: HIV VLP samples, might be inefficient for the VLP binding to CEC matrices. In order to reach the maximum binding capacities of the CEC column (~50 mg protein/mL resin), we loaded a double amount of soluble cell lysate containing approximately 2% of HPV: HIV VLPs into the CEC column. In the intermediate purification step, HPV: HIV VLPs were purified using a layered-bead size exclusion chromatography (SEC) resin [38]. Large HPV: HIV particles (>700 kDa) were eluted while most of the small impurities were trapped in the beads (Figure 2B, C, lane 5). Due to heparin having a similar structure as DNA and possibly binding to positively charged peptides of conformational HPV16 L1 VLPs, we selected a heparin affinity chromatography (H-AC) as a polishing step to remove heterogeneous or closely related particles [47]. Analysis of densitometry from Western blot analysis and bovine serum albumin (BCA) assay confirmed that purity of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs after diafiltration step was high, over 76% (Figure 2B, C, lane 10). The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were detected as a band in size of approximately 56 kDa and 58 kDa, respectively. We found that the commercial HPV16 L1 protein and our purified chimeric HPV: HIV VLPs (L1:P18I10 and L1:T20) share a similar protein pattern (a target band >50 kDa และแถบล่างที่ต่างกัน<50 kDa). These heterologous lower bands could be detected, especially, when we loaded SDS-PAGE gel with a high amount of chimeric HPV: HIV VLP samples (Figure 2B, C, lane 1 to 10). It is probably caused by proteolytic degradation or heterogeneous formation of L1 proteins. A similar pattern (2 bands) was also found in many previous HPV16 L1 purification studies [23,48–51]. These data demonstrated that the 293F expression system and chromatographic purification methods are feasible approaches to engineer chimeric HPV: HIV VLPs.

Figure 2. Purification and characterization of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Schematic process flowchart of L1:P18I10 and L1:T20 VLP purification by chromatography. (B, C) Western blot analysis of L1:P18I10 and L1:T20 VLP samples from each purification step. The signal of L1 in each purification step was characterized by Western blot analysis probed with anti-HPV16 L1 mAb. The arrow indicates the molecular weight of ~56 kDa of L1:P18I10 and ~58 kDa of L1:T20 proteins. Lane 1: clarified cell lysate (CCL); Lane 2: flow-through (FT) from cation exchange chromatography (CEC) sample loading; Lane 3: CEC eluate; Lane 4: FT from CEC 2M NaCl regeneration step; Lane 5: size exclusion chromatography (SEC) FT-1; Lane 6: SEC FT-2; Lane 7: FT from heparin affinity chromatography (H-AC) sample loading; Lane 8: H-AC eluate; Lane 9: FT from H-AC 2M NaCl regeneration step; Lane 10: 10-fold diafiltration.


รูปที่ 2 การทำให้บริสุทธิ์และการกำหนดลักษณะเฉพาะของ L1:P18I10 และ L1:T20 VLP (A) ผังกระบวนการแผนผังของการทำให้บริสุทธิ์ L1:P18I10 และ L1:T20 VLP โดยโครมาโทกราฟี (B, C) การวิเคราะห์ Western blot ของตัวอย่าง L1:P18I10 และ L1:T20 VLP จากแต่ละขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ สัญญาณของ L1 ในแต่ละขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์แสดงคุณลักษณะโดยการวิเคราะห์เวสเทิร์นบล็อตที่ตรวจสอบด้วยสารต้าน HPV16 L1 mAb ลูกศรบ่งชี้น้ำหนักโมเลกุลที่ ~56 kDa ของ L1:P18I10 และ ~58 kDa ของโปรตีน L1:T20 เลน 1: เซลล์ไลเซทชี้แจง (CCL); ช่องที่ 2: การไหลผ่าน (FT) จากการโหลดตัวอย่างด้วยการแลกเปลี่ยนไอออนบวก (CEC) ช่องที่ 3: CEC อธิบาย; ช่องที่ 4: FT จากขั้นตอนการฟื้นฟู NaCl ของ CEC 2M; ช่องที่ 5: โครมาโตกราฟีแบบแยกขนาด (SEC) FT-1; เลน 6: ก.ล.ต. FT-2; ช่องที่ 7: FT จากการโหลดตัวอย่างเฮปารินอัฟฟินิตี้โครมาโทกราฟี (H-AC) เลน 8: H-AC ชะล้าง; เลน 9: FT จากขั้นตอนการฟื้นฟู H-AC 2M NaCl; เลน 10: 10-การกรองแบบพับ

3.3. ความเสถียรภายนอกร่างกายและการประกอบตัวเองของ L1:P18I10 และ L1:T20 VLP

เพื่อยืนยันว่า HPV บริสุทธิ์: HIV VLP แสดงความเสถียร ในหลอดทดลอง คล้ายกับ HPV16 L1 VLPs เราได้ดำเนินการ SDS-PAGE แบบไม่ลดขนาดเพื่อประเมินการเชื่อมโยงข้ามซัลไฟด์ของ HPV: โปรตีน capsid ของ HIV (รูปที่ 3A) เป็นที่ทราบกันดีว่า pH ความแรงของไอออน อุณหภูมิ [52] และสภาพแวดล้อมรีดอกซ์ทั้งหมดมีความสัมพันธ์กับพันธะไดซัลไฟด์ของโปรตีน capsid ของ HPV16 L1 [53] HPV L1 VLP มีแนวโน้มที่จะประกอบตัวเองที่ pH ต่ำและมีความแข็งแรงของไอออนิกสูง โดยทั่วไปการถอดแยกชิ้นส่วน VLP สูงสุดจำเป็นต้องสัมผัสกับสารรีดิวซ์ที่มีความเข้มข้นสูง เช่น 5% 2-mercaptothanolol (2-ME) ในระยะเวลาที่ค่อนข้างนาน [54] ในกรณีที่ไม่มีสารรีดิวซ์ 2-ME โปรตีน HPV-16 L1, L1:P18I10 และ L1:T20 เพียงส่วนเล็กๆ เท่านั้นที่ถูกย้ายไปยังโมโนเมอร์ที่มีน้ำหนักโมเลกุลปรากฏ (MW) ที่ 55 kDa . ประมาณ 70% ของโปรตีน L1 ถูกพันธะไดซัลไฟด์ไปเป็นไดเมอร์หรือเพนทาเมอร์ที่มีขนาดใหญ่กว่า โดยมี MW ที่คาดการณ์ไว้ที่ 110 kDa และ 280 kDa (รูปที่ 3A, เลน 2, 4 และ 6) ในทางตรงกันข้าม โปรตีน L1, L1:P18I10 และ L1:T20 เกือบทั้งหมดของ HPV-16 ในบัฟเฟอร์การแยกชิ้นส่วนปรากฏโครงสร้างโมโนเมอร์ใน SDS-PAGE ที่ไม่รีดิวซ์ (รูปที่ 3A, เลน 3, 5 และ 7) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าความเสถียร ภายนอกร่างกาย ของ L1:P18I10 และ L1:T20 VLP ที่ถูกทำให้บริสุทธิ์แสดงรูปแบบการเชื่อมโยงข้ามไดซัลไฟด์ที่คล้ายกันกับ HPV16 L1 VLP ภายใต้ pH, ความแรงของไอออนิก และสภาวะความร้อนที่เหมือนกัน VLP บริสุทธิ์ดูเหมือนจะถูกแยกย่อยจนถึงระดับของเพนทาเมอร์ ไตรเมอร์ และไดเมอร์หลังจากการสัมผัสกับสารรีดิวซ์ที่มีความเข้มข้นสูงในระยะยาว ข้อมูลเหล่านี้สอดคล้องกับการศึกษาก่อนหน้านี้ [53,54] อย่างไรก็ตาม การแยกชิ้นส่วนของ HPV: HIV VLP ยังห่างไกลจากความสมบูรณ์ (โมโนเมอร์)

Figure 3. In vitro stability of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Disulfide cross-linking of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs in non-reducing SDS-PAGE. The HPV16 L1 VLPs, purified L1:P18I10, and L1:T20 VLPs were mixed with Laemmli sample buffer in the absence or presence of 2-mercaptoethanol (2-ME), respectively, and analyzed by non-reducing SDS-PAGE. The position of the L1 monomer (55 kDa), L1 dimer (110 kDa), and L1 pentamer (280 kDa) are indicated by the arrow. Lane 1: protein molecular weight marker; Lane 2: HPV16 L1 VLP; Lane 3: HPV16 L1 VLP treated with 2-ME; Lane 4: L1:P18I10 VLP; Lane 5: L1:P18I10 VLP treated with 2-ME; Lane 6: L1:T20 VLP; Lane 7: L1:T20 VLP treated with 2-ME. (B) Molecular mass analysis of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. Assembled VLPs untreated with 2-ME (lanes 2, 4, and 6) were filtered out through 1000kDa molecular weight cutoff (MWCO) diafiltration devices (upper panel). Disassembled VLPs treated with 2-ME (lanes 3, 5, and 7) were filtered out through 100kDa MWCO centrifugal filter devices (lower panel). Retentates (R) were collected from filter device sample reservoirs, while the filtrates (F) were collected at the bottom of centrifuge tubes. The L1 protein signal was detected by using a dot blot probed with anti-HPV16 L1 mAb.


รูปที่ 3 ความคงตัว ภายนอกร่างกาย ของ L1:P18I10 และ L1:T20 VLP (A) การเชื่อมโยงข้ามด้วยไดซัลไฟด์ของ L1:P18I10 และ L1:T20 VLP ใน SDS-PAGE ที่ไม่รีดิวซ์ HPV16 L1 VLP, L1:P18I10 และ L1:T20 VLP ที่ถูกทำให้บริสุทธิ์ถูกผสมกับบัฟเฟอร์ตัวอย่าง Laemmli ในกรณีที่ไม่มีหรือมี 2-เมอร์แคปโตเอทานอล (2-ME) ตามลำดับ และวิเคราะห์โดยการไม่รีดิวซ์ SDS-หน้า ตำแหน่งของ L1 โมโนเมอร์ (55 kDa), L1 ไดเมอร์ (110 kDa) และ L1 เพนทาเมอร์ (280 kDa) ถูกระบุโดยลูกศร ช่องที่ 1: เครื่องหมายน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีน เลน 2: HPV16 L1 VLP; ช่องที่ 3: HPV16 L1 VLP รักษาด้วย 2-ME; เลน 4: L1:P18I10 VLP; ช่องที่ 5: L1:P18I10 VLP รักษาด้วย 2-ME; เลน 6: L1:T20 VLP; ช่องที่ 7: L1:T20 VLP รักษาด้วย 2-ME (B) การวิเคราะห์มวลโมเลกุลของ L1:P18I10 และ L1:T20 VLP VLP ที่ประกอบขึ้นที่ไม่ถูกบำบัดด้วย 2-ME (เลน 2, 4 และ 6) ถูกกรองออกผ่านทางอุปกรณ์ไดอะฟิลเตรชันที่ตัดด้วยน้ำหนักโมเลกุล (MWCO) 1000 กิโลดาลตัน (แผงด้านบน) VLP ที่ถูกแยกชิ้นส่วนที่บำบัดด้วย 2-ME (เลน 3, 5 และ 7) ถูกกรองออกผ่านอุปกรณ์กรองแบบหมุนเหวี่ยง MWCO ขนาด 100kDa MWCO (แผงด้านล่าง) สิ่งที่กักไว้ (R) ถูกรวบรวมจากแหล่งกักเก็บตัวอย่างอุปกรณ์กรอง ในขณะที่สิ่งกรอง (F) ถูกรวบรวมที่ด้านล่างของหลอดสำหรับการปั่นแยก สัญญาณโปรตีน L1 ถูกตรวจพบโดยการใช้ดอทบล็อตที่ตรวจสอบด้วยสารต้าน HPV16 L1 mAb

To demonstrate that purified HPV: HIV proteins by chromatography are able to self-assemble to icosahedral particles, we further performed molecular mass analysis under the same reducing condition (5% 2-ME). The commercial HPV16 L1, purified L1:P18I10, and L1T20 proteins without reducing agent treatment were filtered out through 1000 kDa molecular weight cut-off (MWCO) diafiltration devices individually (Figure 3B, top panel). The L1 monomers (55 kDa), oligomers (110~200 kDa), or pentameric capsomers (280 kDa) were expected to pass through an ultrafiltration membrane retaining the integral VLPs (MW~20,000 kDa). The L1 signal of commercial HPV16 L1 proteins was detected in both retentates and filtrates. Most of the purified L1:P18I10 and L1T20 proteins formed large particles (>1000 กิโลดาลตัน) และถูกเก็บรักษาไว้ในสิ่งที่กักไว้ รูปแบบนี้เกิดขึ้นพร้อมกันกับข้อมูลที่พบใน SDS-PAGE ที่ไม่ลดขนาด แม้ว่ากลุ่ม VLP ทั้งหมดที่ถูกบำบัดด้วย 2-ME ถูกแสดงไว้ในแถบโมโนเมอร์ (~55 kDa) ใน SDS-PAGE ที่ไม่รีดิวซ์ (รูปที่ 3A, เลน 3, 5 และ 7) อย่างไรก็ตาม VLP ที่รีดิวซ์ที่สอดคล้องกันไม่ถูกกรองออกผ่านทางเยื่ออัลตราฟิลเตรชัน 100kDa (รูปที่ 3B, แผงด้านล่าง) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าโปรตีน HPV: HIV ชนิด chimeric สามารถประกอบตัวเองเป็นอนุภาคขนาดใหญ่ได้ แต่การถอดแยกชิ้นส่วน VLP ให้เป็นโมโนเมอร์ในระดับสูงสุดนั้น ไม่เพียงแต่ต้องลดพันธะไดซัลไฟด์เท่านั้น แต่ยังรวมถึงปัจจัยที่ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงอื่นๆ ด้วย เช่น pH หรือความแรงของไอออนิก

3.4. การแสดงคุณลักษณะทางสัณฐานวิทยาของ L1:P18I10 และ L1:T20 VLP

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (TEM) ถูกนำมาใช้เพื่อตรวจสอบโครงสร้างทางสัณฐานวิทยาของ HPV16 L1 และ HPV: HIV VLPs เปปไทด์ HIV-1 P18I10 และ T20 ถูกแทรกเข้าไปในลูป DE ของโปรตีน HPV16 L1 ตามลำดับ HPV16 L1 เชิงพาณิชย์และ HPV แบบ chimeric เหล่านี้: โปรตีน capsid ของ HIV สามารถประกอบเอง ในหลอดทดลอง ให้เป็น VLP แบบรวมในเส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 50–60 นาโนเมตร (รูปที่ 4A – C แผงด้านขวา) เมื่อเปรียบเทียบกับ micrographs อิเล็กตรอนของ HPV16 L1 VLPs ที่เผยแพร่ในการศึกษาก่อนหน้านี้ [55,56] โครงสร้าง icosahedral ของ HPV16 L1, L1:P18I10 และ L1:T20 VLPs ที่นี่มีความเปรียบต่างและคลุมเครือน้อยกว่า อาจเนื่องมาจากสารรีเอเจนต์ที่เป็นลบที่เราใช้ในการศึกษานี้ ในการศึกษาล่าสุดของเราที่ตีพิมพ์ในการศึกษาก่อนหน้านี้ [37] และรายงานที่กำลังดำเนินอยู่อีกฉบับภายใต้การตรวจสอบโดยผู้ทรงคุณวุฒิ (ไม่แสดงข้อมูล) เรามีคุณภาพที่ดีและความละเอียดของไมโครกราฟอิเล็กตรอน เมื่อยีสต์และ baculovirus ได้มาจาก L1:P18I10 VLPs (chimeric เดียวกัน) โครงสร้าง) ถูกปรับสมดุลใน PBS และย้อมด้วยกรดฟอสโฟทังสติก (PTA) เนื่องจากเราใช้ระบบการผลิตและการทำให้บริสุทธิ์ VLP ที่แตกต่างกันในการศึกษานี้ L1: P18I10 และ L1: T20 VLP ที่ได้มาจากเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมจึงถูกปรับสมดุลด้วย Tris-HCl และย้อมสีด้วย uranyl acetate แม้ว่าไมโครกราฟอิเล็กตรอนสามารถปรับปรุงได้ แต่เรายังคงสังเกตรูปแบบที่ชัดเจนว่าโปรตีน capsid HPV16 L1, L1: P18I10 และ L1: T20 ส่วนใหญ่สามารถประกอบตัวเองเป็น VLP ทางสัณฐานวิทยาภายใต้หน้าจอ TEM (รูปที่ 4A – C แผงด้านซ้าย ). โดยพื้นฐานแล้ว HPV VLP ได้รับการปกป้องจากการรวมตัวกันในสภาวะที่มีเกลือสูง [57] การรวมตัวที่ตรวจพบได้ของ HPV16 L1 และ HPV: HIV VLPs ในบัฟเฟอร์ Tris-HCl ที่มีเกลือต่ำสามารถมองเห็นได้ภายใต้การขยายที่ต่ำกว่า (รูปที่ 4A – C แผงด้านซ้าย) จากผลลัพธ์เหล่านี้ เราสรุปได้ว่าการปรับเปลี่ยนลำดับลูป L1 DE บางส่วนโดยการแทรกเปปไทด์ HIV-1 P18I10 หรือ T20 ไม่ส่งผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อสัณฐานวิทยาของ HPV: HIV VLPs

Figure 4. Electron micrographs of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Morphology of HPV16 VLPs. (B) Morphology of L1:P18I10 VLPs. (C) Morphology of L1:T20 VLPs. Purified VLPs were absorbed on UV-charged carbon-coated copper grids, and negatively stained with 2% uranyl acetate. Images were acquired under transmission electron microscopy. The bar represents 200 nm at magnification 59,000 (left panel) and 100 nm at magnification 135K (right panels), respectively


รูปที่ 4 ภาพไมโครกราฟอิเล็กตรอนของ L1:P18I10 และ L1:T20 VLP (A) สัณฐานวิทยาของ HPV16 VLP (B) สัณฐานวิทยาของ L1:P18I10 VLP (C) สัณฐานวิทยาของ L1:T20 VLP VLP บริสุทธิ์ถูกดูดซับบนกริดทองแดงเคลือบคาร์บอนที่มีประจุด้วยรังสียูวี และย้อมด้วยยูเรนิล อะซีเตต 2% ภาพได้มาภายใต้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน แถบแสดงถึง 200 นาโนเมตรที่กำลังขยาย 59,000 (แผงด้านซ้าย) และ 100 นาโนเมตรที่กำลังขยาย 135K (แผงด้านขวา) ตามลำดับ

3.5. การนำเสนอและปฏิกิริยาของเอพิโทป HPV-16 และ HIV-1 

เพื่อยืนยันว่าเอพิโทป P18I10 หรือ 2F5 ของ HIV{0}} ที่เป็นลำดับถูกนำเสนอใน L1:P18I10 หรือ L1:T20 VLP ที่ทำให้บริสุทธิ์ด้วยโครมาโทกราฟี การวิเคราะห์เวสเทิร์นบล็อตและ ELISA ทางอ้อมถูกเตรียมไว้ล่วงหน้าโดยใช้ mAbs ที่จำเพาะต่ออีพิโทป เราเลือกโมโนโคลนอลแอนติบอดี (mAb) ที่รู้จักกันดี ซึ่งกำหนดให้ CAMVIR-1 เพื่อจดจำอีพิโทปที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างสูง (GFGAMDF, aa 230–236) ของโปรตีน HPV16 L1 [39,58] mAb ที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้ซึ่งกำหนดเป้าหมาย HIV-1 gp120 V3 epitope ของลูป (RIQRGPGRAFVTIGK, aa308–322) ได้รับเลือกให้ตรวจหา epitopes P18I10 ตามลำดับ (RGPGRAFVTI, aa311–320) [59] ในทางกลับกัน แอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางในวงกว้าง (bnAb) ที่จดจำ HIV-1 gp41 2F5 เอพิโทป (ELDKWA) ที่ต้านเชื้อ HIV-1 ในห้องปฏิบัติการที่หลากหลายได้รับเลือกสำหรับการแสดงลักษณะเฉพาะของเปปไทด์ T20 60,61]. การทดสอบเวสเทิร์นบล็อตที่ตรวจสอบด้วย HPV16 L1 mAb แสดงแถบ 55, 56 และ 58 kDa ที่สอดคล้องกับโปรตีน HPV16 L1, L1:P18I10 และ L1:T20 ตามลำดับ (รูปที่ 5A, B, ซ้าย) น้ำหนักโมเลกุล (MW) ของโปรตีน L1:P18I10 มีความคล้ายคลึงกับโปรตีน HPV16 L1 (รูปที่ 5A ซ้าย) แถบที่สอดคล้องกับโปรตีน L1:T20 ถูกสังเกตพบว่าสูงกว่าโปรตีน HPV16 L1 เล็กน้อย ตามที่คาดการณ์ไว้จากลำดับกรดอะมิโนเพิ่มเติม (รูปที่ 5B ซ้าย) ตรวจพบแถบขนาดประมาณ 56 และ 58 kDa ซึ่งสอดคล้องกับโปรตีน L1:P18I10 และ L1:T20 ใน Western blot assay ที่ตรวจสอบด้วย anti-HIV-1 gp120 V3 และ 2F5 mAb ตามลำดับ (รูปที่ 5A, B, ขวา ). เราคิดว่าน้ำหนักโมเลกุล (MW) ของโปรตีน L1:T20 ที่ย้อม-2F5-นั้นถูกต้องและพอดีกับค่าที่คาดไว้ 58 kDa (รูปที่ 5B ขวา) อย่างไรก็ตาม MW ของโปรตีน L1:P18I10 ที่เปื้อนสารต้าน HIV-1 gp120 V3- นั้นต่ำกว่าเล็กน้อย (รูปที่ 5A ขวา) สิ่งนี้อาจมีสาเหตุมาจากโครงสร้างที่ต่างกันของโปรตีน L1:P18I10 แบบไคเมอริก เนื่องจากโครงสร้างอีพิโทปแบบลำดับอาจสูญหายไปภายใต้เงื่อนไขการเสียสภาพใน SDS-PAGE ดังนั้นเราจึงดำเนินการ ELISA ทางอ้อมเพิ่มเติมเพื่อสาธิตเปปไทด์ P18I10 ที่มีโครงสร้างซึ่งแสดงอย่างเหมาะสมบน L1:P18I10 VLP แบบไคเมอริกของเรา (รูปที่ 5E) ในทางกลับกัน แอนติบอดีลูป anti-HIV-1 gp120 V3 ที่เราใช้จดจำลูป HIV{103}} V3 ทั้งหมด แทนที่จะเป็นอีพิโทป P18I10 ดังนั้น สัญญาณต้าน V3 โดยรวมจึงต่ำกว่า (รูปที่ 5A, B, แผงด้านขวา) อย่างไรก็ตาม ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่ามีการนำเสนอเปปไทด์ P18I10 และ T20 ของ HIV{110}} ตามลำดับใน HPV: HIV VLP

Figure 5. Presentation of HPV-16 and HIV-1 epitopes. (A, B) Sequential epitope detection of chimeric L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were analyzed by Western blot, using anti-HPV16 L1, anti-HIV-1 gp120 V3 and 2F5 mAb. The HPV16 L1 VLPs were used as a control. The molecular weight of the L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa), and L1:T20 (58 kDa) proteins are indicated by the arrow. Lane 1: protein molecular weight marker; Lane 2: HPV16 L1 protein; Lane 3: L1:P18I10 protein; Lane 4: L1:T20 protein. (C, D) Binding of HPV16 L1 mAb to chimeric L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (E) Binding of anti-HIV-1 gp120 V3 mAb to chimeric L1:P18I10 VLPs. (F) Binding of HIV-1 2F5 mAb to chimeric L1:T20 VLPs. The line graph of indirect ELISAs was performed to detect the conformational epitopes of recombinant HPV16 L1, L1:P18I10, and L1:T20 VLPs bound to anti-L1, anti-HIV-1 gp120 V3 or 2F5 mAbs, respectively. Data are representative of three independent experiments. A simple linear regression test was done to compare the line difference of purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs with the standard curve of commercial L1 VLPs; ns: not significant; ** p < 0.01.


รูปที่ 5 การนำเสนอของ HPV-16 และ HIV-1 เอพิโทป (A, B) การตรวจหาอีพิโทปตามลำดับของไคเมอริก L1:P18I10 และ L1:T20 VLP L1:P18I10 และ L1:T20 VLP ที่ถูกทำให้บริสุทธิ์ได้รับการวิเคราะห์โดยเวสเทิร์นบล็อต โดยใช้สารต้าน HPV16 L1, สารต้าน HIV-1 gp120 V3 และ 2F5 mAb HPV16 L1 VLP ถูกใช้เป็นตัวควบคุม น้ำหนักโมเลกุลของโปรตีน L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa) และ L1:T20 (58 kDa) ถูกระบุด้วยลูกศร ช่องที่ 1: เครื่องหมายน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีน ช่องที่ 2: โปรตีน HPV16 L1; ช่องที่ 3: โปรตีน L1:P18I10; เลน 4: โปรตีน L1:T20 (C, D) การจับของ HPV16 L1 mAb กับไคเมอริก L1:P18I10 และ L1:T20 VLP (E) การจับของแอนติ-HIV-1 gp120 V3 mAb กับไคเมอริก L1:P18I10 VLP (F) การจับของ HIV-1 2F5 mAb กับ L1:T20 VLP แบบไคเมอริก กราฟเส้นของ ELISA ทางอ้อมถูกดำเนินการเพื่อตรวจจับอีพิโทปเชิงโครงสร้างของ HPV16 L1, L1, L1:P18I10 และ L1:T20 ชนิดรีคอมบิแนนท์ที่จับกับ anti-L1, anti-HIV-1 gp120 V3 หรือ 2F5 mAbs ตามลำดับ ข้อมูลเป็นตัวแทนของการทดลองอิสระสามครั้ง ทำการทดสอบการถดถอยเชิงเส้นอย่างง่ายเพื่อเปรียบเทียบความแตกต่างของเส้นระหว่าง L1:P18I10 และ L1:T20 VLP ที่ได้รับการบริสุทธิ์กับเส้นโค้งมาตรฐานของ L1 VLP เชิงพาณิชย์ ns: ไม่มีนัยสำคัญ; ** พิ < 0.01

ยิ่งไปกว่านั้น เพื่อตรวจสอบว่าเอพิโทปที่มีโครงสร้าง HIV{{{{50}}}} ปรากฏบน HPV หรือไม่: HIV VLP สามารถระบุได้โดยแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลาง gp120 V3 และ 2F5 ในหลอดทดลอง เราทำการทดสอบ ELISA ทางอ้อมเพื่อตรวจสอบ ความจำเพาะและปฏิกิริยาที่มีผลผูกพันกับอีพิโทป ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 5C, D, HPV16 L1, L1:P18I10 และ L1:T20 VLP ถูกจดจำโดยแอนติ-L1 mAb เราทำการวิเคราะห์การถดถอยเชิงเส้นเพื่อเปรียบเทียบความชันของเส้นเจือจางแต่ละเส้น ผลลัพธ์เปิดเผยว่าความจำเพาะในการจับอีพิโทป L1 ของ L1:P18I10 หรือ L1:T20 VLP ไม่แตกต่างจาก HPV16 L1 VLP ยิ่งไปกว่านั้น anti-HIV-1 gp120 V3 mAb สามารถจับ L1:P18I10 VLP ได้ แต่ไม่ใช่ HPV16 L1 VLP (รูปที่ 5E) นอกจากนี้ 2F5 mAb สามารถจดจำ L1:T20 VLP ได้ แต่ไม่ใช่ HPV16 L1 VLP (รูปที่ 5F) หลังจากการวิเคราะห์การถดถอยเชิงเส้น ความแตกต่างในความจำเพาะการจับกับอีพิโทป gp120 V3 ระหว่าง L1:P18I10 และ HPV16 L1 มีนัยสำคัญอย่างยิ่ง (p < 0.01%) ความจำเพาะในการจับอีพิโทป 2F5 ของ L1:T20 VLP แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญจาก HPV16 L1 VLP (p < 0.01%) รูปแบบนี้เผยให้เห็นว่าไขมันในเซลล์ที่ไม่ชอบน้ำไม่จำเป็นสำหรับการจับแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลาง 2F5- กับ HPV: HIV VLP ในหลอดทดลอง แม้ว่าปฏิกิริยาของแอนติบอดีต่อต้านเชื้อ HIV-1 gp120 V3 และ 2F5 ที่ทำให้เป็นกลางต่อ HPV: HIV VLP ค่อนข้างไม่รุนแรง แต่การจับกันของแอนติบอดีต่อต้าน HIV-1 gp120 V3 และ 2F5 mAb กับ HPV: HIV VLP มีนัยสำคัญ เฉพาะ epitope

3.6. ภูมิคุ้มกันของ L1:P18I10 และ L1:T20 VLP หลังการกระตุ้นภูมิคุ้มกันของหนูเมาส์ BALB/c

เราประเมินการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันจำเพาะของ HPV16- และ HIV-1- หลังการฉีดวัคซีนให้หนู BALB/c ด้วย L1:P18I10 และ L1:T20 VLP ตารางการก่อภูมิคุ้มกันถูกแสดงไว้ในรูปที่ 6A เนื่องจากภูมิคุ้มกันที่เกิดจาก VLP หลังการบริหารเยื่อเมือกโดยทั่วไปจะอ่อนแอกว่าการบริหารระบบทั่วๆ ไป หนูจึงได้รับการฉีดวัคซีนเข้ากล้ามด้วย Gardasil-9 HPV16 L1 ขนาดหนึ่งในหก [22,62] สารเสริมอะลูมิเนียมไฮดรอกซีฟอสเฟตซัลเฟตสำหรับไคเมอริก HPV ในขนาด (10 ไมโครกรัม/100 ไมโครลิตร): HIV VLP ได้รับการปรับให้มีความเข้มข้นเท่ากัน (1 มก./1 มล.) กับ Gardasil-9 เพื่อประเมินความแตกต่างทางเพศในผลลัพธ์ของการฉีดวัคซีน จึงมีการประเมินการเปรียบเทียบการตอบสนองของแอนติบอดีระหว่างหนูตัวผู้ (n=4) และตัวเมีย (n=4) ในกลุ่มของ L1:P18I10 VLP, L1:T20 VLP และการ์ดาซิล-9 การตอบสนองของแอนติบอดีต้าน HPV16 L1 ของหนูเมาส์ตัวเมียโดยเฉลี่ยสูงกว่าหนูตัวผู้เหล่านั้นโดยเฉลี่ย (รูปที่ 6B) 2 ใน 4 (50%) L1:P18I10 ตัวเมียที่ได้รับภูมิคุ้มกัน VLP, 3 ใน 4 (75%) L1:T20 ตัวเมียที่ได้รับภูมิคุ้มกัน VLP และหนูตัวเมียทั้งหมด (100%) ที่ได้รับภูมิคุ้มกัน Gardasil มีระดับแอนติบอดีต่อต้าน L1 ที่สูงกว่า มากกว่าหนูตัวผู้ การตอบสนองของการต่อต้าน L1 ที่เกิดจากหนูตัวเมียในกลุ่ม Gardasil-9 นั้นสูงกว่าหนูตัวผู้อย่างมีนัยสำคัญ (p=0.0041) (รูปที่ 6B) การตอบสนองของแอนติบอดีต้าน L1 ระดับต่ำมากถูกตรวจพบในกลุ่มของไพรมิ่ง BCG.HIVA และการเพิ่ม L1:P18I10 VLP รูปแบบนี้สอดคล้องกับการค้นพบก่อนหน้านี้ที่อธิบายว่า BCG กระตุ้นการตอบสนองของ T-cell เป็นหลักมากกว่าการผลิต IgG [63]

Figure 6. Induction of humoral immune responses by L1:P18I10 and L1:T20 VLPs in BALB/c mice. The immunization schedule is depicted in (A) All mouse groups had equal gender distribution (male n = 4 and female n = 4). Groups A and B: homologous prime-boost immunization with 10 µg L1:P18I10 or L1:T20 VLPs intramuscularly (i.m.); Group C: priming with 106 cfu rBCG.HIVA intradermally (i.d.) and boosting with 10 µg L1:P18I10 VLPs i.m.; Group D: homologous prime-boost vaccination with Gardasil-9 containing 10 µg of HPV16 L1 VLPs i.m.; Group E: immunization twice with PBS buffer. The prime-boost interval was 2 weeks. The endpoint of this trial was on day 28. Sera were collected and diluted at a titer of 1:50 for ELISA assay. (B) HPV L1-specific IgG in male and female mice. (C–E) Epitope-specific IgG induced by L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. ELISA was performed to analyze anti-L1, anti-P18I10, and anti-T20 IgG induced by BALB/c mice following different prime-boost combinations as described above. Data are shown as mean ± S.D. One-way ANOVA (nonparametric) test was done to compare differences between groups. OD: opticaldensity. Ns not significant; ** p < 0.01


รูปที่ 6 การเหนี่ยวนำการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกายโดย L1:P18I10 และ L1:T20 VLP ในหนูเมาส์ BALB/c ตารางการฉีดวัคซีนแสดงไว้ใน (A) กลุ่มเมาส์ทั้งหมดมีการกระจายเพศที่เท่าเทียมกัน (ชาย n=4 และเพศหญิง n=4) กลุ่ม A และ B: การสร้างภูมิคุ้มกันแบบไพรม์บูสต์ที่คล้ายคลึงกันด้วย 10 ไมโครกรัม L1:P18I10 หรือ L1:T20 VLPs ในกล้ามเนื้อ (im); กลุ่ม C: ไพรเมอร์ด้วย 106 cfu rBCG.HIVA ในผิวหนัง (id) และเสริมด้วย 10 µg L1:P18I10 VLPs im; กลุ่ม D: การฉีดวัคซีนไพรม์บูสต์ที่คล้ายคลึงกันด้วย Gardasil-9 ที่มี HPV16 L1 VLPs 10 µg ใน im; กลุ่ม E: สร้างภูมิคุ้มกันสองครั้งด้วยบัฟเฟอร์ PBS ช่วงเวลาไพรม์บูสต์คือ 2 สัปดาห์ จุดสิ้นสุดของการทดลองนี้คือวันที่ 28 ซีรั่มถูกรวบรวมและเจือจางที่ไทเทอร์ 1:50 สำหรับการทดสอบ ELISA (B) HPV L1-IgG เฉพาะในหนูตัวผู้และตัวเมีย (C–E) IgG ที่จำเพาะต่ออีพิโทป เหนี่ยวนำโดย L1:P18I10 และ L1:T20 VLP ELISA ถูกดำเนินการเพื่อวิเคราะห์สารต้าน L1, สารต้าน P18I10 และสารต้าน T20 IgG ที่ถูกเหนี่ยวนำโดยหนูเมาส์ BALB/c หลังจากการรวมกันของไพรม์บูสต์ที่แตกต่างกันตามที่บรรยายไว้ข้างต้น ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SD ทำการทดสอบการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ไม่ใช่พารามิเตอร์) เพื่อเปรียบเทียบความแตกต่างระหว่างกลุ่ม OD: ความหนาแน่นของแสง ไม่มีนัยสำคัญ ** พิ < 0.01

เราประเมินว่าหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกันด้วย L1: P18110 และ L1: T20 VLP สามารถกระตุ้น HPV-16 L1-แอนติบอดีจำเพาะต่อเอพิโทปและ HIV-1 ในหนู BALB/c หรือไม่ แอนติบอดี IgG ที่เกิดจาก VLP ในซีรั่มของหนูถูกวัดโดย ELISA ที่เคลือบด้วยเปปไทด์ HPV16 L1 ชนิดลูกผสม, P18I10 หรือ T20 ตามลำดับ ตรวจพบความแตกต่างทางสถิติใน IgG จำเพาะของ L1- ที่ระดับไทเตอร์ของซีรัมที่ 1:50 ในกลุ่ม Gardasil-9 เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม PBS (p=0.0039) การตอบสนองต่อต้าน L1 ในกลุ่มหนู Gardasil-9, L1:P18I10 และ L1:T20 VLP ที่ได้รับภูมิคุ้มกันจะคล้ายคลึงกันและไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 6C) ไพรม์ BCG.HIVA2auxo.int และหนูเมาส์เสริม L1:P18I10 VLP กระตุ้นระดับของสารต้าน L1 IgG ที่ต่ำมาก ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า HPV: หนูที่ได้รับภูมิคุ้มกัน HIV VLP ผลิตสารต่อต้าน L1 IgG ในระดับเดียวกับหนูที่ได้รับวัคซีน Gardasil-9- (รูปที่ 6C) แม้ว่ากลุ่ม L1:P18I10 VLP มีแนวโน้มไปทางระดับ IgG ที่จำเพาะต่ออีพิโทป P18I10 ที่สูงกว่ากลุ่มภูมิคุ้มกันอื่นๆ แต่ความแตกต่างเหล่านี้ไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ (รูปที่ 6D) ในหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกัน L1:P18I10 VLP บางตัว (4 จาก 8, 50%) มีการตรวจพบแอนติบอดีต่อการจับต้าน P18I10 ที่สูงกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกัน Gardasil-9- อีกทางหนึ่ง การวิเคราะห์การทดสอบทีเปิดเผยว่าความแตกต่างระหว่างกลุ่ม L1:P18I10 VLP และ Gardasil-9 มีนัยสำคัญ (p=0.005) (ข้อมูลไม่แสดง) ในกลุ่ม L1:T20 VLP ตรวจพบการตอบสนองของแอนติบอดีที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญต่อเปปไทด์ T20 เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม Gardasil-9 (p=0.0083) ตามที่คาดไว้ ไทเทอร์ต้าน T20 ไม่สามารถตรวจพบได้ในการ์ดาซิล-9, PBS, L1:P18I10 VLP และไพรม์ BCG.HIVA รวมกับกลุ่มบูสต์ L1:P18I10 VLP (รูปที่ 6E) ไทเทอร์ของแอนติบอดีจำเพาะเปปไทด์ T20 ค่อนข้างต่ำ อาจเนื่องมาจาก: (1) T20 เป็นเปปไทด์รอง; (2) การกระตุ้น MPER หรือ 2F5 แอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางต้องใช้คอนจูเกตเพปไทด์-ลิพิด (รูปที่ 6E) โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่า L1:P18I10 และ L1:T20 VLP สามารถกระตุ้น HPV16- แต่การตอบสนองของแอนติบอดีจำเพาะของ HIV{97}} ที่อ่อนแอในหนู

Desert ginseng-Improve immunity (2)

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

เพื่อประเมินการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของ HPV และ T-cell ที่จำเพาะต่อ HIV ในหนู เราได้ทำตามตารางการสร้างภูมิคุ้มกันที่แสดงในรูปที่ 7A นอกจากนี้ ไพรม์ BCG.HIVA2auxo.int ที่ต่างกันและการเพิ่ม L1:P18I10 VLP ถูกเปรียบเทียบกับไพรม์ L1:P18I10 VLP ที่คล้ายคลึงกันและการเพิ่มภูมิคุ้มกันเพื่อประเมินความถี่ของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของ HPV16 และ HIV{12}} ที่จำเพาะต่อทีเซลล์ ไม่มีความแตกต่างระหว่างกลุ่ม Gardasil-9 และ PBS เกี่ยวกับการหลั่ง IFN หลังการกระตุ้นเซลล์ม้ามด้วย HPV16 L1 VLP ความแตกต่างในการหลั่ง IFN เฉพาะของ L1- ก็ไม่มีนัยสำคัญเช่นกันระหว่างกลุ่ม L1:P18I10 VLP และ Gardasil-9 เราอนุมานได้ว่าการหลั่ง IFN ที่จำเพาะของ L1- ที่อ่อนแออาจมีสาเหตุมาจากความเข้มข้นต่ำ (2 µg/mL) ของ HPV16 L1 VLP ที่ใช้เป็นสิ่งเร้า กลุ่มของการเพิ่ม BCG.HIVA2auxo.int prime และ L1:P18I10 VLP ทำให้เกิดความถี่ที่สูงขึ้นของเซลล์ม้ามที่หลั่ง IFN และความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในการหลั่ง IFN ถูกสังเกตเมื่อเปรียบเทียบกับหนูที่ได้รับการฉีดวัคซีนด้วยกลุ่ม Gardasil-9 (p {{36 }}.0103) หนู 3 ตัวจาก 8 ตัว (~38%) ได้รับการตอบสนอง IFN- เฉพาะ L1- สูงสุด (รูปที่ 7B) นี่อาจเป็นผลมาจาก adjuvanticity ที่ไม่เฉพาะเจาะจงของ BCG ตามการศึกษาก่อนหน้าของเรา [64–66] ผลกระทบเบื้องต้นที่เห็นได้ชัด แม้จะเกิดจาก BCG ชนิด wild ก็สอดคล้องกับความสามารถของอนุพันธ์ rBCG ในการทำหน้าที่เป็นตัวเสริมที่มีศักยภาพสำหรับการกระตุ้นวัคซีนในภายหลัง [64,65] ในส่วนของการตอบสนองของทีเซลล์ที่จำเพาะต่อเอชไอวี-1-นั้น ขนาดรวมสูงสุดของเซลล์ที่ก่อตัวเป็นจุด (SFC)/106 เซลล์ม้ามของ IFN ถูกตรวจพบในหนูที่เตรียม BCG.HIVA2auxo.int เมื่อเปรียบเทียบกับหนูที่ได้รับ Gardasil{{54} } วัคซีนหรือ L1:P18I10 VLP หนูที่ไพรม์บูสต์ด้วย BCG.HIVA และเสริมด้วย L1:P18I10 VLP กระตุ้นการหลั่ง IFN ที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับหนูที่ได้รับการฉีดวัคซีนด้วย L1:P18I10 VLP homologous prime-boost (p=0.0268) นอกจากนี้ พบการหลั่ง IFN ที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในหนูที่ได้รับวัคซีน L1:P18I10 VLP เมื่อเปรียบเทียบกับหนูที่ได้รับวัคซีน Gardasil-9 (p=0.0157) (รูปที่ 7C) ตามที่คาดไว้ การหลั่ง IFN ไม่สามารถตรวจพบได้ในกลุ่ม Gardasil -9 และ PBS ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า (1) L1:P18I10 VLP กระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของทีเซลล์ที่จำเพาะต่อเอชไอวี (2) L1:P18I10 VLP กระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของทีเซลล์ที่จำเพาะต่อ HPV และ (3) BCG.HIVA2auxo.int สามารถกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของทีเซลล์ที่จำเพาะต่อ HIV-1- ที่กระตุ้นโดย L1:P18I10 VLP

Figure 7. Induction of HPV16 and HIV-1 specific T cell responses by chimeric L1:P8I10 VLPs and BCG.HIVA in BALB/c mice. The immunization schedule is depicted in (A). All mouse groups had equal gender distribution (male n = 4 and female n = 4). Group A: homologous prime-boost immunization with 10 µg L1:P18I10 VLPs intramuscularly (i.m.); Group B: priming with 106 cfu rBCG.HIVA intradermally (i.d.) and boosting with 10 µg L1:P18I10 VLPs i.m.; Group C: homologous prime-boost vaccination with Gardasil-9 containing 10 µg of HPV16 L1 VLPs i.m.; Group D: immunization twice with PBS buffer. The prime-boost interval was 2 weeks. The endpoint of this trial was on day 28. Splenocytes were isolated for IFN-γ ELISpot assay. T-cell immune responses to HPV16 and HIV-1 were assessed ex vivo by IFN-γ ELISpot after splenocyte stimulation with HPV16 L1 VLP and P18I10 peptide. (B, C) HPV16 L1- and HIV-1 P8I10-specific T-cell responses elicited by L1:P8I10 VLPs and BCG.HIVA prime combined with L1:P18I10 VLP boost. Data are shown as median ± S.D. A one-way ANOVA test was done to compare differences between groups. Ns not significant; * p < 0.05.


รูปที่ 7 การเหนี่ยวนำการตอบสนองของทีเซลล์จำเพาะของ HPV16 และ HIV-1 โดยไคเมอริก L1:P8I10 VLP และ BCG.HIVA ในหนูเมาส์ BALB/c ตารางการฉีดวัคซีนแสดงไว้ใน (A) กลุ่มเมาส์ทั้งหมดมีการกระจายเพศที่เท่าเทียมกัน (เพศชาย n=4 และเพศหญิง n=4) กลุ่ม A: การสร้างภูมิคุ้มกันแบบไพรม์บูสต์ที่คล้ายคลึงกันด้วย 10 ไมโครกรัม L1:P18I10 VLPs เข้ากล้าม (im); กลุ่ม B: ไพรเมอร์ด้วย 106 cfu rBCG.HIVA ในผิวหนัง (id) และเสริมด้วย 10 µg L1:P18I10 VLPs im; กลุ่ม C: การฉีดวัคซีนไพรม์บูสต์ที่คล้ายคลึงกันด้วย Gardasil-9 ที่มี HPV16 L1 VLPs 10 µg ใน im; กลุ่ม D: สร้างภูมิคุ้มกันสองครั้งด้วยบัฟเฟอร์ PBS ช่วงเวลาไพรม์บูสต์คือ 2 สัปดาห์ จุดสิ้นสุดของการทดลองนี้คือวันที่ 28 แยกเซลล์ม้ามเพื่อการทดสอบ IFN-ELISpot การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของทีเซลล์ต่อ HPV16 และ HIV-1 ได้รับการประเมินภายนอกร่างกายโดย IFN-ELISpot หลังการกระตุ้นเซลล์ม้ามด้วยเปปไทด์ HPV16 L1 VLP และ P18I10 (B, C) การตอบสนองของทีเซลล์ HPV16 L1- และ HIV-1 P8I10-เฉพาะที่กระตุ้นโดย L1:P8I10 VLPs และ BCG.HIVA ไพรม์รวมกับการเพิ่ม L1:P18I10 VLP ข้อมูลจะแสดงเป็นค่ามัธยฐาน ± SD มีการทดสอบความแปรปรวนแบบทางเดียวเพื่อเปรียบเทียบความแตกต่างระหว่างกลุ่ม ไม่มีนัยสำคัญ * พี < 0.05

4. โรคการอภิปราย

ทั้ง HPV16 และ HIV-1 เป็นโรคติดต่อทางเพศสัมพันธ์ และปัจจุบันเป็นจุดสนใจของการศึกษาวัคซีนจำนวนมาก แม้ว่าวัคซีนป้องกัน HPV จะได้รับการจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ และการแพร่เชื้อ HIV-1 ได้รับการควบคุมอย่างมากโดยการรักษาด้วยยาต้านไวรัสรีโทรไวรัส (ART) และ PrEP แต่ HPV ชนิดผสมเทียมที่มีประสิทธิภาพ ปลอดภัย และราคาไม่แพง: วัคซีน HIV สำหรับป้องกันไวรัสทั้งสองชนิดนั้นมีความจำเป็นเร่งด่วน ในการศึกษานี้ (1) เราแสดงให้เห็นว่าระบบการแสดงออก 293F และวิธีการทำให้บริสุทธิ์ด้วยโครมาโทกราฟีอาจเป็นแนวทางที่เป็นไปได้ในการผลิตและทำให้บริสุทธิ์ไคเมอริก L1:P18I10 และ L1:T20 VLP; (2) เรายืนยันว่าการแทรกเปปไทด์ P18I10 หรือ T20 เข้าไปในลูป DE ของโปรตีน capsid HPV16 L1 ไม่ส่งผลกระทบต่อความเสถียร ในหลอดทดลอง การประกอบตัวเองและสัณฐานวิทยาของ chimeric HPV: HIV VLPs; (3) เปปไทด์ P18I10 หรือ T20 ตามลำดับและตามโครงสร้างที่สัมผัสกับลูป DE ของ chimeric HPV: HIV VLP สามารถตรวจพบได้โดย anti-HIV-1 gp120 V3 และ 2F5 แอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลาง ในหลอดทดลอง; (4) L1:P18I10 และ L1:T20 VLP แบบไคเมอริกสามารถกระตุ้น HPV แต่แอนติบอดีที่จำเพาะต่อการจับที่จำเพาะต่อ HIV-1- ในหนู BALB/c นอกจากนี้ การแทรกเปปไทด์ P18I10 หรือ T20 ของ HIV-1 เข้าไปในโปรตีน HPV16 L1 ไม่ส่งผลกระทบต่อการเหนี่ยวนำแอนติบอดีจำเพาะของ HPV16 L{1- ในสิ่งมีชีวิต (5) L1:P18I10 VLP สามารถกระตุ้นการตอบสนองของทีเซลล์เฉพาะของ HPV16 และ HIV-1- (6) การเพิ่ม BCG.HIVA ไพรม์และ L1:P18I10 VLP กระตุ้นขนาดสูงสุดของเซลล์ม้ามที่สร้าง IFN เมื่อเปรียบเทียบกับ L1:P18I10 VLPs การเพิ่มไพรม์ที่คล้ายคลึงกันในหนู BALB/c การค้นพบนี้สนับสนุนการพัฒนาวัคซีนเอชไอวี-1 เพิ่มเติมโดยใช้ rBCG และไคเมอริก HPV: HIV VLP โดยรวมแล้ว การศึกษาครั้งนี้เป็นกลยุทธ์พื้นฐานที่อาจคุ้มค่าที่จะสนับสนุนความพยายามระดับโลกในการพัฒนาวัคซีนที่ใช้ไคเมอริก VLP เพื่อควบคุมการติดเชื้อ HPV และ HIV

ในการศึกษานี้ L1:P18I10 และ L1:T20 VLP สามารถกระตุ้นแอนติบอดีต่อการจับ L1 ที่ต่อต้าน HPV16 ในระดับเดียวกันกับวัคซีน HPV Gardasil-9 อย่างไรก็ตาม L1:P18I10 และ L1:T20 VLP กระตุ้นการตอบสนองของแอนติบอดีซึ่งจับ HIV ซึ่งจำเพาะต่อการจับ HIV ที่จำเพาะต่อ P18I10 และ T20 อีพิโทปในระดับต่ำเท่านั้น เราตั้งสมมติฐานว่าอาจเป็นเพราะแผ่นตรวจ ELISA ถูกเคลือบด้วยโปรตีนรีคอมบิแนนท์ HPV16 L1, เปปไทด์ HIV-1 P18I10 และเปปไทด์ HIV-1 T20 ตามลำดับ แอนติบอดีต้าน L1 ของหนูที่ถูกเหนี่ยวนำโดย VLP L1:P18I10 และ L1:T20 ของเราอาจมุ่งเป้าเอพิโทปการจับหลายตัวของโปรตีน L1 ในทางตรงกันข้าม แอนติบอดีต่อต้าน HIV-1 ของหนูที่ถูกกระตุ้นโดย L1:P18I10 และ L1:T20 VLP ของเรากำหนดเป้าหมายเพียงเปปไทด์ HIV เดียว (P18I10 หรือ T20) บน HPV: HIV VLP ดังนั้น ค่า OD450 สูงสุดโดยรวมของแอนติบอดีซึ่งจับต้าน HIV-1 จึงต่ำกว่าแอนติบอดี L1 ต้าน HPV16 มาก

เหตุผลที่เราเลือก HPV16 L1 capsid โปรตีน DE loop เป็นบริเวณแทรกเบื้องต้นของอิมมูโนเจน HIV-1 อ้างอิงถึงการศึกษาก่อนหน้านี้ที่ให้ภูมิคุ้มกันหนูด้วย bovine papillomavirus (BPV): HIV VLP สำหรับกระตุ้นการตอบสนองของแอนติบอดี [20] เป็นที่ทราบกันว่าอีพิโทปที่อยู่ภายในลูป DE และ FG ที่สัมผัสพื้นผิวของโปรตีนแคปซิดหลัก HPV L1 มีส่วนสำคัญต่อแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางข้ามที่เกิดจากวัคซีน [67] นอกจากนี้ การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นแล้วว่าการแทรก HIV-1 MPER เข้าไปในลูป BPV L1 DE สามารถกระตุ้นให้แอนติบอดีที่เป็นกลางบางส่วนที่รับรู้ถึงโครงสร้างดั้งเดิมของ MPER ใน HIV-1 Env [20] โดยเฉพาะ อย่างไรก็ตาม ไม่มีข้อมูลที่แสดงให้เห็นว่า BPV L1:MPER VLP ชนิดรีคอมบิแนนท์ส่งผลต่อการสร้างภูมิคุ้มกันและการทำให้เป็นกลางต่อ BPV หลังจากการแทรก MPER ของ HIV-1 เข้าไปในโปรตีน BPV L1 หรือไม่ ในการศึกษาของเราโดยใช้ HPV16 L1 VLP เป็นเวกเตอร์การนำส่งแอนติเจนของ HIV เราได้สังเกตว่าการแทรกเปปไทด์ของ HIV-1 ไม่ได้ปรับเปลี่ยนโครงสร้างของ HPV L1 และ HPV แบบไคเมอริก: โปรตีนของ HIV ยังคงมีความสามารถในการสร้าง VLP นอกจากนี้ เรายังดำเนินการแนวคิดเรื่องการสร้างภูมิคุ้มกันเพื่อสาธิตการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่เปรียบเทียบได้ระหว่าง HPV: ผู้สมัคร HIV VLP (ของเรา) และวัคซีน HPV ที่ใช้ VLP ที่ได้รับอนุมัติ (Gardasil ที่มีใบอนุญาต-9) ข้อมูลของเราเปิดเผยว่าการแทรก HIV-1 P18I10 หรือ T20 เปปไทด์เข้าไปใน chimeric HPV: HIV VLP สามารถกระตุ้นแอนติบอดีที่จำเพาะต่อการจับ HPV16 L1-ในระดับไตเตอร์ที่คล้ายกัน เมื่อเปรียบเทียบกับ HPV Gardasil-9 วัคซีน. แอนติบอดีต่อการจับ L1 ที่ต่อต้าน HPV16 เฉพาะประเภทที่ตรวจพบด้วยวัคซีน HPV Gardasil-9 VLP ที่ได้รับอนุญาต เปรียบเทียบกับวัคซีน HPV Gardasil-9 VLP เวอร์ชันคิเมริกมีความสอดคล้องกับข้อมูลของเรา

ความยาวและตำแหน่งของแอนติเจนจากต่างประเทศที่เหมาะสมที่สุด-1 ที่รวมอยู่ใน HPV16 L1 VLP และความเสถียร ภายนอกร่างกาย ของ HPV แบบไคเมอริกที่เป็นผล: HIV VLP ควรได้รับการตรวจสอบก่อนที่จะสร้างภูมิคุ้มกันให้กับหนู การศึกษาในปัจจุบันของเราแสดงให้เห็นว่าการแทรกเปปไทด์ P18I10 หรือ T20 เข้าไปในโปรตีน HPV16 L1 ไม่ส่งผลกระทบต่อความเสถียร ในหลอดทดลอง การประกอบตัวเอง และสัณฐานวิทยาของ chimeric HPV: HIV VLPs ผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องกับการศึกษาก่อนหน้านี้ที่บ่งชี้ว่าการแทรกโดเมน MPER ของ HIV-1 เข้าไปในลำดับลูป BPV L1 DE ไม่ส่งผลต่อความสามารถของโปรตีน BPV L1 capsid ที่ประกอบเองกับ VLPs [20] โดยพื้นฐานแล้ว อีพิโทปที่อยู่ภายในลูป DE และ FG ที่เปิดเผยบนพื้นผิวของโปรตีน capsid ของ HPV L1 มีส่วนสำคัญในการกระตุ้นให้เกิดแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางแบบจำเพาะของ L1- ได้ [67] ในที่นี้ เราแสดงให้เห็นว่าการแทรกเปปไทด์ HIV-1 P18I10 หรือ T20 เข้าไปในลูป HPV16 L1 DE ไม่ส่งผลกระทบต่อการเหนี่ยวนำแอนติบอดีจำเพาะ L1- โดย HPV แบบไคเมอริก: HIV VLP หลังการสร้างภูมิคุ้มกันให้กับหนู นอกจากนี้ HIV-1 P18I10 หรือ T20 เอพิโทปไปบนลูป HPV16 DE ของไคเมอริก HPV: HIV VLP ถูกตรวจพบ ภายนอกร่างกาย และมีการสร้างภูมิคุ้มกันในร่างกาย HPV16 L1 VLP ก่อร่างเป็นโครงที่เป็นไปได้สำหรับการแสดงพื้นผิวของเอพิโทป HIV{33}} ที่น่าสนใจ ในการศึกษานี้ เราได้ดำเนินการ ELISA ทางอ้อมเพื่อสาธิตเปปไทด์ P18I10 และ T20 ที่มีโครงสร้างที่แสดงบนพื้นผิวของ HPV แบบไคเมอริกของเรา: HIV VLP ในอนาคต กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบภูมิคุ้มกันอาจเป็นวิธีการเพิ่มเติมในการสาธิตการแปลโครงสร้างแอนติเจน P18I10 หรือ T20 และการจัดองค์กรภายใน HPV: HIV VLP

การประกอบตัวเองเป็นดัชนีตัวแทนของความเสถียรภายนอกร่างกายของ HPV16 L1 VLP เป็นที่ทราบกันดีว่า pH ความแรงของไอออน อุณหภูมิ [52] และสภาพแวดล้อมรีดอกซ์ทั้งหมดมีความสัมพันธ์กับพันธะไดซัลไฟด์ของโปรตีน capsid ของ HPV16 L1 [53] งานก่อนหน้านี้เกี่ยวกับ papillomavirus VLPs ชี้ให้เห็นถึงความสำคัญของพันธะไดซัลไฟด์ต่อการประกอบตัวเองของ L1 major capsid [68,69] การก่อตัวของไดซัลไฟด์บ่งชี้ว่าซิสเทอีนของโปรตีน L1 capsid สูงขึ้นในรูปทรงที่เหมาะสม [53] การเชื่อมโยงข้ามไดซัลไฟด์เหล่านี้เชื่อมต่อสารตกค้าง 175 และ 428 (สำหรับ HPV16) ที่ทำให้ HPV virions และ VLP คงที่ [70] ในการศึกษานี้ เราวิเคราะห์รูปแบบการเชื่อมโยงข้ามระหว่างโมเลกุลไดซัลไฟด์เป็นหลักฐานทางอ้อมเพื่อพิสูจน์ว่าโปรตีนแคปซิด L1:P18I10 และ L1:T20 ของเรามีแนวโน้มที่จะประกอบตัวเอง ในหลอดทดลอง ในรูปที่ 3A เราแสดงให้เห็นว่า L1:P18I10 และ L1:T20 VLP ที่ถูกทำให้บริสุทธิ์แสดงรูปแบบการเชื่อมโยงข้ามระหว่างโมเลกุลไดซัลไฟด์ที่คล้ายกันกับ HPV16 L1 VLP ภายใต้ pH, ความแรงของไอออนิก และสภาวะความร้อนที่เหมือนกัน ในรูปที่ 3B เรายังแสดงให้เห็นเพิ่มเติมว่าโปรตีน L1:P18I10 และ L1:T20 บริสุทธิ์มีความสามารถในการประกอบตัวเองเป็นอนุภาคขนาดใหญ่กว่า (ใหญ่กว่า L1 เพนทาเมอร์ MW 280 kDa) ในหลอดทดลอง ดังนั้น เมื่อรวมกับรูปแบบ VLP ที่ประกอบตัวเองทางสัณฐานวิทยา (แม้ว่าโครงสร้าง icosahedral จะไม่ค่อยดีนัก) ที่สังเกตได้ในรูปที่ 4 เราจึงสรุปว่า HPV แบบไคเมอริกบริสุทธิ์ของเรา: HIV VLPs มีความเสถียร ในหลอดทดลอง นอกจากความเสถียรของ VLP แล้ว ปัจจัยสำคัญอื่นๆ อีกมากมายที่อาจส่งผลต่อภูมิคุ้มกันของเชื้อ HPV ชนิด chimeric ควรพิจารณา HIV VLPs เช่น ตำแหน่งการแทรกอิมมูโนเจนในลูปต่างๆ ของ VLP [71] ขนาดยา ช่วงเวลา Prime-boost และเส้นทางการบริหาร [22] ฯลฯ

เปปไทด์ P18I10 ที่ได้มาจากลูป HIV-1 gp120 V3 ถูกนำเสนอในเซลล์ที่ติดเชื้อ HIV โดยโมเลกุลคลาส I ที่ซับซ้อนทางจุลพยาธิวิทยาที่สำคัญ (MHC-I) [26] CD8+ ซึ่งเป็น cytotoxic T lymphocytes (CTL) สามารถรับรู้แอนติเจน P18I10 ที่จำกัดด้วย MHC-I และหลั่งไซโตไคน์หลายชนิด เช่น IFN- เพื่อกำจัดเซลล์ที่ติดเชื้อ HIV [72–75] DNA ของไวรัสหรือพลาสมิดชนิดรีคอมบิแนนท์เป็นสื่อนำวัคซีนที่ดีในการแสดงออกเปปไทด์ P18I10 ในเซลล์เจ้าบ้าน และกระตุ้นการตอบสนองของเซลล์เฉพาะของ P18I10- ผ่านวิถี MHC-I [76–79] ตัวอย่างเช่น การผสมผสานระหว่างการเพิ่ม DNA prime และไวรัสวัคซีนวัคซีน Ankara (MVA) ที่ดัดแปลงนั้นเพียงพอสำหรับการเหนี่ยวนำการตอบสนองของ IFN- และ CTL ต่อ epitope P18I10 [79] ในทางตรงกันข้าม เปปไทด์ P18I10 จากภายนอกไม่ได้แสดงอย่างมีประสิทธิภาพต่อ CD8+ ทีเซลล์โดยวิถีทาง MHC-I [80,81] และต้องการการมีส่วนร่วมของสารเสริมที่เหมาะสม [82–85] หรือตัวพาแอนติเจน เช่น VLP ตัวอย่างเช่น การสร้างภูมิคุ้มกันของเปปไทด์ P18I10 สังเคราะห์ที่เสริมด้วย adjuvants นั้นมีค่าเล็กน้อยเนื่องจากไม่มีปัจจัยกำหนด T-helper [82–85] มีรายงานก่อนหน้านี้ว่า HIV-1 Gag VLPs [86], hepatitis B surface antigen (HBsAg) VLPs [87), parvovirus VP2 VLPs [88] และ papillomavirus L1 VLPs [17–19] สามารถทำหน้าที่เป็นเวกเตอร์การนำส่งสำหรับการนำเสนอ epitope CTL ที่จำกัดด้วย MHC-I ในวิฟ แม้ว่ากลไกของการตอบสนองของทีเซลล์ที่ถูกจำกัดด้วย MHC-I ที่เกิดจาก VLP ยังคงไม่ชัดเจน โครงสร้างอนุภาคของ VLP อาจเป็นประโยชน์ต่อการดูดซึมของมาโครฟาจหรือเซลล์เดนไดรต์ที่เกิดจากเอนโดไซติก ดังนั้นการเข้าถึงไซโตโซลและต่อมาเข้าสู่วิถีทาง MHC-I โดยทั่วไป [89, 90]. นอกจากนี้ ดีเทอร์มิแนนต์ P18I10 ที่จำกัดด้วย MHC-I ถูกสังเกตพบว่ากระตุ้นการตอบสนองของทีเซลล์ตัวช่วยของ CD4+ ผ่านทางวิถี MHC-II [91,92] Hybrid BPV1 L1 VLP สามารถใช้เป็นพาหะของอีพิโทปแอนติเจนเพื่อกระตุ้นการตอบสนองของ CTL ที่จำเพาะต่อไวรัสในการรักษาโรคผ่านวิถีทาง MHC-I และ MHC-II [17,19] ซึ่งถือเป็นกลยุทธ์ที่มีแนวโน้มสำหรับการออกแบบวัคซีนเพื่อควบคุมการติดเชื้อไวรัส การศึกษาในช่วงต้นบางการศึกษายังบ่งชี้ว่า BPV L1 VLP แสดงอีพิโทป HPV16 E7 หรืออีพิโทป P18I10 ของพื้นผิวเยื่อเมือกที่เหนี่ยวนำให้เกิดลูป HIV-1 gp120 V3 และยังมีภูมิคุ้มกันของอีพิโทปที่จำเพาะต่อระบบของ VLP และภูมิคุ้มกันของทีเซลล์ [18] จากการศึกษาก่อนหน้านี้ เราได้แสดงให้เห็นเบื้องต้นแล้วว่า chimeric HPV: HIV (L1:P18I10) VLPs ของเราสามารถกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของ T-cell ที่จำเพาะต่อ HIV ในหนู BALB/c หลังจากกระตุ้นเซลล์ม้ามด้วยเปปไทด์ P18I10 นอกจากนี้ ไพรเมอร์ BCG.HIVA ยังช่วยเพิ่ม-1-การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของทีเซลล์ที่จำเพาะต่อเอชไอวีในหนูอีกด้วย อย่างไรก็ตาม การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของทีเซลล์แบบมัลติฟังก์ชั่นที่เกิดจาก L1:P18I10 VLP จะต้องมีการศึกษาทางภูมิคุ้มกันเพิ่มเติม

การตอบสนองของทีเซลล์ของ CD8+ ที่กว้างขึ้นต่อเอพิโทป CTL ที่ได้รับการอนุรักษ์หลายรายการมีประโยชน์ในการเอาชนะความหลากหลายทางพันธุกรรมของ HIV-1 และการหลบหนี [7,93–100] การออกแบบที่สมเหตุสมผลของเอชไอวี-1 ทีเซลล์อิมมูโนเจน เช่น HIVA ควรมีศักยภาพในการตอบสนองต่อหลายเอพิโทป CTL [34] อิมมูโนเจน HIV-1 HIVA ออกแบบโดยดร. Tomas Hanke ประกอบด้วยโปรตีน HIV-1 Gag แบบเต็มความยาวรวมกับเอพิโทป CTL หลายตัว รวมถึงเอพิโทป P18I10 ที่ปลาย C [34] DNA, MVA และ rBCG ได้รับเลือกเป็นพาหะนำส่งภูมิคุ้มกัน HIVA และเหนี่ยวนำให้เกิดขนาดและความกว้างของการตอบสนองของเซลล์ที่จำเพาะต่อ CTL epitope โดยการใช้ระบบไพรม์บูสต์แบบเฮเทอโรโลจีสในโมเดลเมาส์และไพรเมตที่ไม่ใช่มนุษย์ (NHP) การศึกษาก่อนหน้าของเราแสดงให้เห็นว่า BCG.HIVA ไพรม์เมื่อใช้ร่วมกับ MVA.HIVA กระตุ้น-1-ทีเซลล์ที่ผลิต IFN ที่จำเพาะต่อ HIV8+ ในหนู BALB/c [31–33,102] สิ่งที่น่าสนใจคือ VLP อาจเป็นตัวกระตุ้นที่มีศักยภาพในการเพิ่มการตอบสนองของเซลล์ที่จำเพาะต่อเอชไอวีในการสร้างภูมิคุ้มกันแบบเฮเทอโรโลกัสด้วย rBCG [29,30] หรือวัคซีน DNA [103,104] ตัวอย่างเช่น rBCG ที่แสดงออกถึง HIV-1 Gag โปรตีนสามารถเตรียมระบบภูมิคุ้มกันของ T-cell ได้อย่างมีประสิทธิภาพเพื่อเสริมด้วย Gag VLP ในแบบจำลอง NHP [29,30] ในการศึกษาปัจจุบัน เราได้แสดงให้เห็นว่าการเตรียม BCG.HIVA สามารถเพิ่มการตอบสนองภูมิคุ้มกันของ T-cell ที่เกิดจาก HPV: HIV (L1:P18I10) VLPs เราจะตรวจสอบเพิ่มเติมขนาดของการตอบสนองของโพลีฟังก์ชัน CD4+, CD8+ และการตอบสนองของทีเซลล์หน่วยความจำที่สร้างขึ้นโดยระบบการเสริม rBCG ไพรม์และ VLP นี้

Cistanche deserticola-improve immunity -

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

ปัจจุบัน กลุ่มวิจัยของเรากำลังมุ่งเน้นไปที่การพัฒนา rBCG ที่มีแนวโน้มดี: วัคซีนเอชไอวีที่แสดงภูมิคุ้มกันชนิดทีเซลล์ HIV-1 เช่น tHIVconsvX และ HIVACAT (HTI) ทีเซลล์อิมมูโนเจน เพื่อปรับปรุงเอชไอวี-1 การจับคู่ตัวแปรและความกว้างการตอบสนองของ T-cell อิมมูโนเจน HIVconsvX รุ่นที่ 2 ได้รับการออกแบบโดยการกำหนดภูมิภาคอนุรักษ์กลุ่ม M ใหม่ และใช้การออกแบบโมเสกแบบไบวาเลนต์เพื่อเพิ่มการจับคู่ของ 9-เอพิโทปของ T-cell mer ในวัคซีนกับตัวแปรทั่วโลก [64] อิมมูโนเจน HTI ได้รับการออกแบบมาเพื่อครอบคลุมเป้าหมายของ T-cell ซึ่งการตอบสนองของ T-cell มักพบในผู้ติดเชื้อ HIV-1-ที่มีปริมาณไวรัส HIV{13}} ต่ำ [65,66] เนื่องจาก papilloma VLP ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็นพาหะของ CTL epitope หลายตัว [17] เรามุ่งเป้าที่จะสร้าง HPV16 L1 VLP แบบไคเมอริกซึ่งมี epitopes CTL ของ HIV-1 ที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้หลายตัว ร่วมกับ rBCG ที่แสดง ThivconsvX หรือ HTI T-cell immunogens เพื่อชักนำให้กว้างขึ้น การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของ CTL ต่อ HIV-1 ความหนาแน่นสูงและสำเนาหลายสำเนาของเอพิโทป CTL ของ HIV-1 ที่แสดงบน HPV ชนิดคิเมริก: HIV VLP อาจปรับปรุงการนำส่งแอนติเจนไปยังระบบภูมิคุ้มกัน และกระตุ้นให้เกิดความถี่ในการตอบสนองของ CTL ที่สูงขึ้น ในทางตรงกันข้าม recombinant BCG มีแนวโน้มที่จะสร้างความถี่ที่ต่ำกว่าของการตอบสนอง CTL เนื่องจากการจำลองแบบช้า ในวิฟ เนื่องจาก BCG มีอิทธิพลที่ชัดเจนต่อความแตกต่างของทีเซลล์ ซึ่งหมายความว่า BCG สามารถกระตุ้นการจำของทีเซลล์ CD8+ ผ่านทางการมีส่วนร่วมของ CD4+ T-helper cells [105] คุณสมบัติภูมิคุ้มกันนี้ อาจทำให้ BCG เหมาะสมเป็นสารรองพื้นในสูตรการเพิ่มไพรม์แบบต่างกัน ดังนั้น เราคาดว่า HPV: HIV VLP ของเราอาจดูเหมือนจะเป็นตัวกระตุ้นที่มีแนวโน้มว่าจะเพิ่มขนาดและความกว้างของการตอบสนองของ HIV-1 CTL เมื่อทำการไพรเมอร์ด้วย BCG ชนิดรีคอมบิแนนท์ที่แสดงภูมิคุ้มกันชนิด T-cell ใหม่ของ HIV-1 .

เปปไทด์ T20 มีเอพิโทปเชิงเส้นที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้สูง 2F5 (ELDKWA) แอนติบอดี 2F5 ที่รวบรวมจากผู้ป่วยที่ติดเชื้อ HIV ในระยะยาวได้รับรายงานว่ามีประสิทธิภาพในการทำให้เป็นกลางในวงกว้าง [106,107] MPER ของ gp41 ถือว่ามีภูมิคุ้มกันต่ำ ซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับตำแหน่งของมันใกล้กับ bilayer ฟอสโฟไลปิดของเซลล์และไวรัส [108] การใช้เวกเตอร์ DNA ที่แสดง MPER ในสภาพแวดล้อมที่เป็นไขมันมีประโยชน์ในการกระตุ้น gp41-nAbs ที่จำเพาะเจาะจง [109–111] ตัวอย่างเช่น วัคซีน DNA เข้ารหัส HIV-1 T{20-ซึ่งออกแบบโดยดร. บริตตา วาห์เรน ได้รับการพิสูจน์แล้วว่ากระตุ้นการตอบสนองของแอนติบอดีที่เป็นกลาง (nAb) แบบ cross-clade [109] ในทางตรงกันข้าม ความพยายามในช่วงแรกๆ หลายครั้งในการกระตุ้น nAbs ที่กำหนดเป้าหมาย gp41 โดยใช้กลยุทธ์เปปไทด์หรือวัคซีนหน่วยย่อยล้มเหลว [112–116] เมื่อเร็วๆ นี้ การศึกษาบางชิ้นบ่งชี้ว่า BPV L1 VLP แสดง 2F5 เอพิโทปหรือ MPER ของแอนติบอดีจำเพาะ 2F-1 gp41 ที่ชักนำให้เกิด HIV5- ในหนูที่ส่งผลให้เกิดการวางตัวเป็นกลางแบบข้ามเคลด [20,21] พบรูปแบบภูมิคุ้มกันที่คล้ายกันเมื่อแอนติเจนพื้นผิวตับอักเสบบี (HBsAg) ผสมกับ HIV-1 2เอพิโทป F5 หรือ MPER [59,117–119] ที่นี่ เราแสดงให้เห็นว่าการนำเสนอของเปปไทด์ HIV-1 T20 และ P18I10 ในไคเมอริก HPV16 L1 VLP ของเราสามารถกระตุ้นการตอบสนองของแอนติบอดีต่อ HIV-1 และ HPV16 การทำให้อีพิโทปเป็นกลางที่ถูกทำให้เสถียรบนโครงโครงสร้าง เช่น เดือยเชิงฟังก์ชันหรือ VLP ของ HIV-1 อาจเป็นกระแสหลักของการออกแบบอิมมูโนเจนของบีเซลล์เพื่อให้ได้แอนติบอดีที่เป็นกลางในวงกว้าง (bnAbs) [93] อย่างไรก็ตาม อีพิโทป bnAb ใหม่ส่วนใหญ่ (ประมาณ 90%) เป็นบริเวณที่ไม่ต่อเนื่องและประกอบขึ้นถูกนำมารวมกันใน 3- โครงสร้างมิติ [120] แม้ว่าการนำเสนอของอีพิโทปที่ไม่ต่อเนื่องบนโครงโปรตีนสามารถทำนายได้โดยการสร้างแบบจำลองทางคอมพิวเตอร์ [121] แต่อีพิโทป bnAb เหล่านี้อาจถูกท้าทายให้ฝังอยู่ในโครงโปรตีน HPV16 L1 ที่ไม่ห่อหุ้ม ในทางตรงกันข้าม อิมมูโนเจนบีเซลล์ HIV-1 ส่วนน้อย เช่น MPER (2F5) ของ HIV-1 gp41 หรือลูป V3 (P18IIB) ของ gp120 มีอีพิโทปการทำให้เป็นกลางเชิงเส้นและอาจเหมาะสำหรับ HPV: โปรตีนกระดูกสันหลังของเอชไอวี ดังนั้นเราจึงเลือกเอพิโทปการทำให้เป็นกลางแบบเส้นตรง 2F5 ที่รวมอยู่ในเปปไทด์ T20 ที่ขยายออกไปของ MPER HIV-1 ในแง่ของโครงสร้างที่ดีสำหรับการสร้าง -helix [122] เปปไทด์ T20 สามารถหลอมรวมและทำให้คงตัวบนโครงสร้าง L1 capsid เพื่อกระตุ้นการตอบสนองของแอนติบอดีที่เป็นกลางหากโครงร่างตามธรรมชาติของ 2F5 อีพิโทปสามารถถูกนำเสนอได้ ในการศึกษานี้ เราพบว่า 2F5 nAbs ผูกพันกับ HPV แบบ chimeric: HIV (L1:T20) VLPs ในหลอดทดลอง นอกจากนี้ L1:T20 VLP ยังสามารถเหนี่ยวนำ T20- แอนติบอดีในการจับซึ่งจำเพาะในหนูเมาส์ BALB/c ได้อีกด้วย มีหลักฐานเพิ่มขึ้นเรื่อยๆ ว่าแอนติบอดีที่เกิดจากเปปไทด์ที่เหนี่ยวนำให้เกิดฟิวชั่น (T20) ของ HIV{81}} มีคุณสมบัติคล้ายคลึงกับเปปไทด์ฟิวชั่นต้านเชื้อ HIV-1 Enfuvirtide เพื่อจับกับเรซิดิว T20 ของทรานส์เมมเบรนที่ไม่ชอบน้ำซึ่งอยู่ใน MPER ของ gp41 ในระหว่าง เอชไอวี-1 หลอมรวมและมีส่วนช่วยในการควบคุมไวรัส [109,123,124] จากการทบทวนครั้งก่อนของเรา การออกแบบที่มีเหตุผลของวัคซีนที่ใช้ไคเมอริก VLP เพื่อกระตุ้นแอนติบอดีที่เป็นกลางที่จำเพาะต่อ HPV และ HIV และการตอบสนองของ CTL จะต้องได้รับการพิจารณาเสมอในแง่ของการเลือกอิมมูโนเจน พาหะนำส่งแอนติเจน และระบบการกระตุ้นให้ไพรม์ โดยสรุป การศึกษานี้ได้แสดงให้เห็นถึงแพลตฟอร์มการแสดงออกทางเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมทางเลือก และวิธีการทำให้บริสุทธิ์ด้วยโครมาโทกราฟีที่ปรับขนาดได้เพื่อสร้าง HPV แบบไคเมอริก: HIV VLP เราพิจารณาว่าวิธีการทำให้บริสุทธิ์แบบใหม่ของเราจะช่วยในการฟื้นฟู HPV ซึ่งเป็นแอนติเจน: HIV VLP จากเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมโดยมีเป้าหมายในการประหยัดเวลา ต้นทุน และแรงงาน ในขณะเดียวกันก็เพิ่มกำลังการผลิตทางอุตสาหกรรม นอกจากนี้ เรายังแสดงให้เห็นว่า HPV16 L1 VLP สามารถทำงานเป็น แพลตฟอร์มการนำส่งเพื่อนำพาแอนติเจนเปปไทด์ HIV-1 เนื่องจากการแทรกเปปไทด์ P18I10 หรือ T20 เข้าไปในลูป DE ของโปรตีน capsid ของ HPV16 L1 ไม่ส่งผลกระทบต่อความคงตัวในหลอดทดลอง การประกอบตัวเอง และสัณฐานวิทยาของ chimeric HPV: HIV VLP และ ไม่รบกวนการเหนี่ยวนำแอนติบอดีจำเพาะของ HPV16 L{107} ในสิ่งมีชีวิต ในทางกลับกัน HPV แบบเพ้อฝัน: HIV VLP สามารถกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของ HPV16 และ B และ T-cell ที่จำเพาะต่อ HIV ต่อไวรัสทั้งสองชนิด รายงานนี้สำรวจความเป็นไปได้ในการพัฒนาวัคซีนเอชไอวี-1 โดยอิงจาก BCG ชนิดรีคอมบิแนนท์ที่แสดงอิมมูโนเจนของเอชไอวี{112}} และ HPV: HIV VLP ซึ่งสามารถใช้สำหรับการสร้างภูมิคุ้มกันเอชไอวี{113}} ในวัยเด็กได้ เนื่องจากการพัฒนาวัคซีนไคเมอริกที่มีประสิทธิภาพสำหรับป้องกัน HPV16 และ HIV-1 ยังคงเป็นความท้าทาย งานนี้มีส่วนช่วยอีกก้าวหนึ่งสู่การพัฒนา HPV ชนิดไคเมอริกแบบใหม่: แพลตฟอร์มวัคซีนที่ใช้ HIV VLP สำหรับควบคุม HPV16 และ HIV{{118 }} ซึ่งจำเป็นเร่งด่วนในประเทศกำลังพัฒนาและประเทศอุตสาหกรรม

อ้างอิง

1. เอกสารข้อเท็จจริงเกี่ยวกับสถิติเอชไอวีและเอดส์ทั่วโลกของ UNAIDS-2018 2019. เข้าถึงได้ทางออนไลน์: http://www.unaids.org/en/resources/fact sheet (เข้าถึงเมื่อ 15 มิถุนายน 2020)

2. Baeten, JM PrEP สำหรับ HIV: เกรด A สำหรับหลักฐานแต่อยู่ระหว่างการพิจารณาผลกระทบ แนท. สาธุคุณอูโรล 2019, 16, 570–571. [ครอสอ้างอิง]

3. ส.ฤกษ์งาม.; ปิติสุทธิธรรม ป.; ส.นิตยาพันธุ์.; เจ แก้วกุ้งวัลย์.; ชิว เจ.; ปารีส ร.; นพ.เปรมศรี.; น้ำวัฒน์, ช.; เดอ ซูซ่า ม.; อดัมส์ อี.; และคณะ การฉีดวัคซีน ALVAC และ AIDSVAX เพื่อป้องกันการติดเชื้อ HIV-1 ในประเทศไทย น. ภาษาอังกฤษ เจ.เมด. 2009, 361, 2209–2220. [ครอสอ้างอิง]

4. อึ้งอูนี ต.; ชสาร ค.; Ndhlovu, ZM อุปสรรคทางวิทยาศาสตร์ที่สำคัญในการพัฒนาวัคซีนเอชไอวี: มุมมองทางประวัติศาสตร์และทิศทางในอนาคต ด้านหน้า. อิมมูนอล. 2020, 11, 590780. [CrossRef]

5. วัคซีนโรบินสัน, เอชแอล เอชไอวี/เอดส์: 2018. คลินิก เภสัช เธอ. 2018, 104, 1062–1073. [ครอสอ้างอิง]

6. วังคิว.; Zhang, L. การออกแบบแอนติบอดีและวัคซีนต่อต้านการติดเชื้อ HIV-1 ในวงกว้าง ด้านหน้า. ยา 2020, 14, 30–42. [ครอสอ้างอิง]

7. คอลลินส์ DR; ไกฮา จีดี; วอล์คเกอร์, BD CD8+ ทีเซลล์ในการควบคุม การรักษา และการป้องกัน HIV แนท. สาธุคุณอิมมูนอล. 2020, 20, 471–482. [CrossRef] [PubMed]

8. พอลลาร์ด, เอเจ; Bijker, EM คู่มือด้านวิทยาวัคซีน: จากหลักการพื้นฐานไปจนถึงการพัฒนาใหม่ๆ แนท. สาธุคุณอิมมูนอล. 2021, 21, 83–100. [ครอสอ้างอิง]

9. ชาปิโร บทเรียน SZ สำหรับการวิจัยวัคซีนทั่วไปจากความพยายามในการพัฒนาวัคซีนเอชไอวี วัคซีน 2019, 37, 3400–3408. [ครอสอ้างอิง]

10. อาเหม็ด เอชจี; เบนสุไมเดีย, SH; อัลชัมมารี เอฟดี; อเลนาซี, FSH; อัลมุทลัค, บริติชแอร์เวย์; อัลเติร์กสตานี, MZ; Aladani, IA ความชุกของ papillomavirus ชนิดย่อย 16 และ 18 ของมนุษย์ในผู้ป่วยเยเมนที่เป็นมะเร็งปากมดลูก เอเชียแปซิฟิก เจ. แคนเซอร์ ก่อนหน้า 2017, 18, 1543–1548. [ครอสอ้างอิง]

11. โอลเซเซ่, เวอร์จิเนีย; เฉิน ย.; ชเลเกล, อาร์.; Yuan, H. การแสดงลักษณะของโดเมนลูป HPV16 L1 ในรูปแบบของอีพิโทปเชิงโครงสร้างเฉพาะประเภท บีเอ็มซี ไมโครไบโอล 2547, 4, 29. [CrossRef]

12. ดูปุย ค.; บูโซนี-เกต, D.; ทูซ, อ.; เลอคานน์ ป.; บูท, ด.; Coursaget, P. ภูมิคุ้มกันแบบพึ่งเซลล์กระตุ้นในหนูโดยอนุภาคคล้ายไวรัส HPV 16 L1 ไมโครบ. ปาทอก. 1997, 22, 219–225. [CrossRef] [PubMed]

13. ชิลเลอร์ เจ.; Lowy, D. คำอธิบายเกี่ยวกับศักยภาพสูงของวัคซีนป้องกัน HPV วัคซีน 2018, 36, 4768–4773 [CrossRef] [PubMed]

14. มาร์โควิทซ์, แอลอี; ชิลเลอร์, วัคซีน JT Human Papillomavirus เจติดเชื้อ โรค 2021, 224, S367–S378 [CrossRef] [PubMed]

15. เฉิน CW; โซบี น.; Joseph-Munné, J. ออกแบบแนวคิดเกี่ยวกับวัคซีนเอชไอวีที่มีอนุภาคคล้ายไวรัส-1 ด้านหน้า. อิมมูนอล. 2020, 11, 573157. [CrossRef] [PubMed]

16. เอโตะ ย.; โซบี น.; เฟอร์เรอร์, พี.; Joseph, J. การออกแบบวัคซีนที่ใช้อนุภาคคล้ายไวรัสไคเมอริกสำหรับ papillomavirus ของมนุษย์และ HIV: บทเรียนที่ได้รับ ฉบับแก้ไขเรื่องโรคเอดส์ 2019, 21, 218–232 [ครอสอ้างอิง]

17. หลิว ดับบลิวเจ; หลิว XS; จ้าว KN; เลกกัตต์ GR; Frazer อนุภาคคล้ายไวรัส IH Papillomavirus สำหรับการนำส่งอีพิโทปของทีเซลล์ที่เป็นพิษต่อเซลล์หลายชนิด ไวรัสวิทยา 2000, 273, 374–382 [ครอสอ้างอิง]

18. หลิว เอ็กซ์เอส; อับดุล-จับบาร์ ไอ.; ฉี, วายเอ็ม; เฟรเซอร์, ไอเอช; การสร้างภูมิคุ้มกันของ Zhou, J. Mucosal ด้วยอนุภาคคล้ายไวรัส papillomavirus ทำให้เกิดภูมิคุ้มกันทางระบบและเยื่อเมือกในหนู ไวรัสวิทยา 1998, 252, 39–45 [ครอสอ้างอิง]

19. เป็ง ส.; เฟรเซอร์, ไอเอช; เฟอร์นันโด จีเจ; อนุภาคคล้ายไวรัส Zhou, J. Papillomavirus สามารถส่ง epitopes CTL ที่กำหนดไปยังวิถี MHC คลาส I ไวรัสวิทยา 1998, 240, 147–157 [ครอสอ้างอิง]

20. ไจ่ ย.; จง, ซ.; ซาริฟาร์ด ม.; หอก GT; Qiao, L. Bovine papillomavirus อนุภาคที่มีลักษณะคล้ายไวรัสนำเสนอ epitopes ที่ได้รับการอนุรักษ์จากบริเวณภายนอกของเยื่อหุ้มเซลล์ที่ใกล้เคียงของ HIV-1 gp41 กระตุ้นเยื่อเมือกและแอนติบอดีในระบบ วัคซีน 2013, 31, 5422–5429 [ครอสอ้างอิง]

21. จาง ฮ.; หวาง ย.; ฟาแยด ร.; หอก GT; Qiao, L. การเหนี่ยวนำแอนติบอดีต่อเยื่อเมือกและการทำให้เป็นกลางต่อระบบต่อไวรัสโรคภูมิคุ้มกันบกพร่องของมนุษย์ประเภท 1 (HIV{2}}) โดยการสร้างภูมิคุ้มกันทางปากด้วยอนุภาคคล้ายไวรัส chimeric จากวัว papillomavirus-HIV-1 gp41 เจ. วิโรล. 2004, 78, 8342–8348. [ครอสอ้างอิง]

22. เซียว SL; เหวิน เจแอล; กง, นิวซีแลนด์; ยู เอชแอล; เลกกัตต์ ก.; เส้นทางการบริหารให้ Frazer, IH ของ BPV1 VLP แบบไคเมอริกเป็นตัวกำหนดลักษณะของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่ถูกชักนำ อิมมูนอล. เซลล์ไบโอล 2002, 80, 21–29. [ครอสอ้างอิง]

23. เคิร์นบาวเออร์ ร.; ทอบ, เจเน็ต; กรีนสโตน, เฮเทอร์; โรเดน, ริชาร์ด; เดิร์สต์ ม.; กิสมันน์, ล.; โลวี DR; Schiller, JT การประกอบตัวเองอย่างมีประสิทธิภาพของ Human Papillomavirus Type 16 LI และ L1-L2 ให้เป็นอนุภาคคล้ายไวรัส เจ. วิโรล. 1993, 67, 6929–6936. [CrossRef] [PubMed]

24. จ้าวคิว.; พอตเตอร์ ซีเอส; คาร์ราเกอร์ บ.; แลนเดอร์ ก.; สาบาน, เจ.; ทาวน์, วี.; อับราฮัม ด.; ดันแคน ป.; วอชบอห์ เมกะวัตต์; Sitrin, RD การศึกษาลักษณะเฉพาะของอนุภาคคล้ายไวรัสในGARDASIL®โดยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านด้วยไครโอ ฮัม วัคซีนภูมิคุ้มกัน. 2014, 10, 734–739. [CrossRef] [PubMed]

25. อชัวร์ อ.; เลมฮัมเมดี ส.; พิคาร์ด โอ.; มบิกา, เจพี; ซากูรี เจเอฟ; มูคริม, ซ.; วิลเลอร์, อ.; เบกซ์, ฟ.; เบิร์นนี่ อ.; Zagury, D. Cytotoxic T Lymphocytes เฉพาะสำหรับ HIV-1 gp160 แอนติเจนและเปปไทด์สังเคราะห์ P18IIIB ในบุคคลที่ได้รับภูมิคุ้มกัน HLA-A11- โรคเอดส์ ฮัม รีโทรไวรัส 1994, 10, 19–25 [ครอสอ้างอิง]

26. นาคากาว่า ย.; คิคุจิ เอช.; Takahashi, H. การวิเคราะห์ระดับโมเลกุลของอันตรกิริยาของ TCR และเปปไทด์/MHC โดยใช้เปปไทด์ที่ได้มาจาก P18-I10- ด้วยการแทนที่กรด D-amino เพียงตัวเดียว ชีวฟิสิกส์ เจ. 2550, 92, 2570–2582. [ครอสอ้างอิง]

27. ชิว ซ.; ชอง เอช.; ยาวเอ็กซ์.; ซูย.; ชุย ส.; He, Y. การระบุและจำแนกลักษณะของช่องย่อยบน N-trimer ของ HIV-1 Gp41: ผลกระทบต่อการเข้าของไวรัสและเป้าหมายของยา โรคเอดส์ 2015, 29, 1015–1024 [ครอสอ้างอิง]

28. ปีเตอร์ส บีเอส; เฉิงซอง-โปปอฟ ร.; แคลโลว์ ด.; ฟ็อกซอลล์ ร.; ปาตู ก.; ฮอดจ์กิน, เค.; เวเบอร์ เจเอ็น การศึกษานำร่องระยะที่ 2 เกี่ยวกับความปลอดภัยและภูมิคุ้มกันของ HIV p17/p24:VLP (p24-VLP) ในผู้รับการทดลองที่ไม่มีอาการ เจติดเชื้อ 1997, 35, 231–235. [ครอสอ้างอิง]

29. เชเก, จีเค; เบอร์เกอร์, วอชิงตัน; สตุทซ์, เอช.; เมเยอร์ส AE; แชปแมนอาร์.; คิราวู, อ.; บันจุน ร.; เชพเพิร์ด อี.อี.; จาคอบส์ ดับบลิวอาร์; ไรบิคกี้ อีพี; และคณะ ภูมิคุ้มกันที่แข็งแกร่งต่อเชื้อจุลินทรีย์ Auxotrophic bovis BCG-VLP Prime-Boost HIV Vaccine Candidate ในแบบจำลองไพรเมตที่ไม่ใช่มนุษย์ เจ. วิโรล. 2013, 87, 5151–5160. [ครอสอ้างอิง]

30. เชเก, จีเค; โทมัส ร.; เชพเพิร์ด อี.อี.; เมเยอร์ส, อ.; บอร์น, ว.; วิลเลียมสัน, ซี.; คลีน เจ.; สีเทา ซม.; ไรบิคกี้ อีพี; วิลเลียมสัน รัฐแอละแบมา สูตรการสร้างภูมิคุ้มกันแบบกระตุ้นไพรม์โดยใช้วัคซีนอนุภาคคล้ายไวรัส BCG และ Pr55gag ชนิดรีคอมบิแนนท์ที่มีพื้นฐานจากเชื้อ HIV ประเภท 1 ชนิดย่อย C ประสบความสำเร็จในการกระตุ้นการตอบสนองแบบ Gag เฉพาะในลิงบาบูน วัคซีน 2009, 27, 4857–4866 [ครอสอ้างอิง]

31. โจเซฟ เจ.; โซบี น.; ฉัน อีเจ; เฟอร์นันเดซ-โยริส ร.; กิลโอ.; คาร์โดนา, พีเจ; เกเทล, เจเอ็ม; Hanke, T. การฉีดวัคซีน BCG.HIVA222 + MVA.HIVA สำหรับหนูแรกเกิดช่วยเพิ่มการตอบสนองทางระบบภูมิคุ้มกันจำเพาะของ HIV-1-: อิทธิพลของอายุและเส้นทางการสร้างภูมิคุ้มกัน คลินิก. นักพัฒนา อิมมูนอล. 2011, 2011, 516219. [CrossRef]

32. นฤ. ซาบี; Gea-Mallorquí, อี.; เฟอร์เรอร์, พี.; เฮอร์ทาโด, ค.; ซานเชซ-อูเบดา ส.; อีโต้, ย.; เกเทล, เจเอ็ม; ฮันเก ต.; โจเซฟ เจ. วิศวกรรมการออกแบบวัคซีนมัยโคแบคทีเรียใหม่สำหรับวัคซีนสำหรับเด็ก HIV-TB ซึ่งเวกเตอร์โดยไลซีน auxotroph ของ BCG โมล เธอ. วิธีการ คลินิก. นักพัฒนา 2014, 1, 14017. [CrossRef]

33. มาฮันต์ อ.; โซบี น.; อีโต้, ย.; กีต้าร์ต น.; เกเทล, เจเอ็ม; ฮันเก ต.; Joseph, J. การพัฒนาพรีคลินิกของ BCG.HIVA2auxo.int ซึ่งมีเวกเตอร์การแสดงออกเชิงบูรณาการสำหรับวัคซีนสำหรับเด็ก HIV-TB การเพิ่มความคงตัวและภูมิคุ้มกันของทีเซลล์ HIV-1 โดยเฉพาะ ฮัม วัคซีนภูมิคุ้มกัน. 2017, 13, 1798–1810. [CrossRef] [PubMed]

34. ฮันเก ต.; McMichael, AJ การออกแบบและสร้างวัคซีนเอชไอวีเชิงทดลอง-1 สำหรับการทดลองทางคลินิกเป็นเวลาหนึ่งปี-2000 ในเคนยา แนท. ยา 2000, 6, 951–955. [CrossRef] [PubMed]

35. ดูโรเชอร์ ย.; เพอร์เร็ต ส.; Kamen, A. การผลิตโปรตีนรีคอมบิแนนท์ระดับสูงและปริมาณงานสูงโดยการเปลี่ยนถ่ายชั่วคราวของเซลล์ 293-EBNA1 ของมนุษย์ที่เติบโตแบบแขวนลอย กรดนิวคลีอิก Res 2002, 30, E9. [CrossRef] [PubMed]

36. คิม ฮจ.; คิม SY; ลิม เอสเจ; คิม เจวาย; ลี เอสเจ; Kim, HJ การทำโครมาโตกราฟีในขั้นตอนเดียวของโปรตีน papillomavirus ประเภท 16 L1 ของมนุษย์จาก Saccharomyces cerevisiae โปรตีนเอ็กซ์พีอาร์ ปุริฟ. 2010, 70, 68–74. [CrossRef] [PubMed]

37. เอโต ย.; โซบี น.; เฟอร์เรอร์, พี.; Joseph-Munné, J. การแสดงออกของโปรตีน HPV-HIV แบบ chimeric L1P18 ใน Pichia Pastoris; การทำให้บริสุทธิ์และการกำหนดลักษณะเฉพาะของอนุภาคคล้ายไวรัส เภสัชศาสตร์ 2021, 13, 1967 [CrossRef]

38. จีอี การใช้ CaptoTM Core 700 และ Capto Q ImpRes ในการทำให้อนุภาคคล้ายไวรัส papilloma ของมนุษย์บริสุทธิ์ เจ.เอเซีย ฟาร์มา. ไบโอฟาร์ม Ind. 2014, 1–4.

39. แมคลีน ซีเอส; เชอร์เชอร์, เอ็มเจ; ไมน์เค เจ.; สมิธ, GL; ฮิกกินส์จี.; สแตนลีย์ ม.; Minson, การผลิต AC และการศึกษาคุณสมบัติของโมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อ papillomavirus ประเภท 16 ของมนุษย์โดยใช้ไวรัสวัคซีนรีคอมบิแนนท์ เจ.คลิน. ปทุม. 1990, 43, 488–492. [ครอสอ้างอิง]

40. เอกสารผลิตภัณฑ์ของ Merck Canada Inc. Gardasil® แยง. โมโนแกรม ผลิตภัณฑ์โมโนพริล โมโนแกรม 2015, 1–71.

41. อชัวร์ อ.; เพอร์สัน, เค.; แฮร์ริส RA; ซุนเด็ค เจ.; เซนท์แมน, ซีแอล; ลินด์ควิสต์, ย.; ชไนเดส, ก.; Kärre, K. โครงสร้างผลึกของ H-2D(d) MHC คลาส I ที่ซับซ้อนด้วยเปปไทด์ที่ได้รับ HIV-1- P18-110 ที่ความละเอียด 2.4 Å: ผลกระทบสำหรับทีเซลล์และเซลล์ NK การยอมรับ. ภูมิคุ้มกัน 1998, 9, 199–208. [ครอสอ้างอิง]

42. แป้ง ว.; ทอม เซาท์แคโรไลนา; Zheng, YT สารยับยั้งฟิวชั่นเปปไทด์ประเภท HIV{1}} ปัจจุบัน แอนติไวรัส เคมี. เคมีบำบัด 2552, 20. [ครอสอ้างอิง]

43. เฉิน เอ็กซ์เอส; การ์เซีย RL; โกลด์เบิร์ก ไอ.; คาสินี ก.; Harrison, SC โครงสร้างอนุภาคคล้ายไวรัสขนาดเล็กที่ประกอบจากโปรตีน L1 ของ Human Papillomavirus 16. โมล เซลล์ 2000, 5, 557–567 [CrossRef] [PubMed]

44. วัน PM; ไวส์เบิร์ก, AS; ทอมป์สัน ซีดี; ฮิวจ์ เอ็มเอ็ม; แป้ง ใช่; โลวี DR; Schiller, JT Human Papillomavirus 16 Capsids เป็นสื่อกลางในการเข้าสู่นิวเคลียร์ระหว่างการติดเชื้อ เจ. วิโรล. 2019, 93, จ00454-19 [ครอสอ้างอิง]

45. โจวเจ.; ดอร์บาร์เจ.; ซัน, เอ็กซ์วาย; ครอว์ฟอร์ด, แอลวี; แมคลีน ซีเอส; Frazer, IH การบ่งชี้สัญญาณการแปลนิวเคลียร์ของโปรตีน L1 papillomavirus ชนิด 16 ของมนุษย์ ไวรัสวิทยา 1991, 185, 625–632. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​วีแอลพีเอส อ.; มิดเดลเบิร์ก, APJ; Lua, LHL การประมวลผลทางชีวภาพของอนุภาคคล้ายไวรัส: ความท้าทายและโอกาส เภสัช กระบวนการทางชีวภาพ 2013, 1, 407–409.

47. บูซาร์กิน ล.; ตูเซ่, อ.; Combita-Rojas, อลาบามา; Coursaget, P. ลำดับที่มีประจุบวกของโปรตีน capsid papillomavirus ประเภท 16 ของมนุษย์นั้นเพียงพอที่จะเป็นสื่อกลางในการถ่ายโอนยีนไปยังเซลล์เป้าหมายผ่านตัวรับ heparan sulfate เจ. พล. วิโรล. 2003, 84, 157–164. [ครอสอ้างอิง]

48. ต.ซาซากาว่า.; ปุชโก, ป.; สเตียร์ส ก.; เกชไมส์เนอร์ เซาท์อีสต์; นัสเซอร์ ฮาจิบาเกรี, แมสซาชูเซตส์; ฟินช์, เจ.; ครอว์ฟอร์ด, ล.; Tommasino, M. การสังเคราะห์และการประกอบอนุภาคคล้ายไวรัสของ papillomaviruses ของมนุษย์ประเภท 6 และประเภท 16 ในยีสต์ฟิชชัน Schizosaccharomyces pombe ไวรัสวิทยา 1995, 206, 126–135 [ครอสอ้างอิง]

49. บีเมลท์ ส.; ซอนเนวาลด์, ยู.; กัลม์บาเชอร์, ป.; วิลมิทเซอร์, ล.; Müller, M. การผลิตอนุภาคคล้ายไวรัส Human Papillomavirus Type 16 ในพืชดัดแปลงพันธุกรรม เจ. วิโรล. 2003, 77, 9211–9220. [ครอสอ้างอิง]

50. ซาฮิน ม.; โจ เจ.; คาแนล ส.; แกลบ, อ.; เมสันเอช.; วาร์เซชา เอช.; กิม เอสเจ; มิลเลอร์, DM; มาโตบา น.; Jenson, AB การผลิตโปรตีน HPV16 L1 และ VLP ที่ปรับขนาดได้จากใบยาสูบ โปรดหนึ่ง 2016, 11, e0160995 [ครอสอ้างอิง]

51. ไอเรส แคลิฟอร์เนีย; เซียนเซียรุลโล น. คาร์เนโร, เอสเอ็ม; วิลล่า, LL; บ็อกคาร์โด อี.; เปเรซ-มาร์ติเนซ, ซี.; เปเรซ-อาเรลลาโน, I.; โอลิเวรา, MLS; Ho, PL การผลิตอนุภาคคล้ายไวรัส papillomavirus ประเภท 16 L1 ของมนุษย์โดยเซลล์ recombinant Lactobacillus casei ใบสมัคร สภาพแวดล้อม ไมโครไบโอล 2549, 72, 745–752. [ครอสอ้างอิง]

52. แชงค์-เรทซลาฟฟ์ ม.ล.; จ้าวคิว.; แอนเดอร์สัน, ซี.; แฮมม์ ม.; สูง, ก.; เหงียน ม.; วังเอฟ.; วัง น.; วัง บ.; วังย.; และคณะ การประเมินเสถียรภาพทางความร้อนของ Gardasil® ฮัม วัคซีน. 2549, 2, 147–154. [CrossRef] [PubMed]

53. มูเคอร์จี ส.; ธอร์สเตนส์สัน, MV; จอห์นสตัน, ปอนด์; เดอฟิลลิปส์, เพนซิลเวเนีย; Zlotnick, A. คำอธิบายเชิงปริมาณของการประกอบอนุภาคคล้ายไวรัสในหลอดทดลองของมนุษย์ Papillomavirus 16 เจ. โมล. ไบโอล 2008, 381, 229–237. [CrossRef] [PubMed]

54. แม็กคาร์ธี ส.ส.; ไวท์, วิสคอนซิน; พาลเมอร์-ฮิลล์ เอฟ.; โคนิก ส.; Suzich, JA การถอดชิ้นส่วนเชิงปริมาณและการประกอบกลับคืนของอนุภาคคล้ายไวรัส Human Papillomavirus Type 11 ในหลอดทดลอง เจ. วิโรล. 1998, 72, 32–41. [CrossRef] [PubMed]

55. เคิร์นบาวเออร์ ร.; บู๊ฟ.; เฉิง น.; โลวี DR; Schiller, JT Papillomavirus L1 โปรตีนแคปซิดหลักที่ประกอบตัวเองเป็นอนุภาคคล้ายไวรัสซึ่งมีภูมิคุ้มกันสูง โปรค Natl. อคาด. วิทยาศาสตร์ สหรัฐอเมริกา 1992, 88, 12180–12184 [ครอสอ้างอิง]

56. พาเทล พิธีกร; ปัทการ์, KK; บาซู, อ.; โมฮันดาส, กม.; Mukhopadhyaya, R. การผลิตอนุภาคคล้ายไวรัสที่คล้ายกับไวรัส papillomavirus ของมนุษย์ที่สร้างภูมิคุ้มกันบกพร่อง-16 อินเดียน เจ. เมด. ความละเอียด 2009, 130, 213–218.

57. ชิ, ล.; ซันยาล ก.; พรรณี, อ.; หลัว ซ.; ดอชน่า ส.; วัง บ.; เกรแฮม, TL; วัง น.; Volkin, DB ความคงตัวของอนุภาคคล้ายไวรัส papillomavirus ของมนุษย์โดยสารลดแรงตึงผิวที่ไม่ใช่ไอออนิก เจ ฟาร์มา. วิทยาศาสตร์ 2005, 94, 1538–1551. [ครอสอ้างอิง]

58. คาร์เตอร์ เจเจ; วิปฟ์, GC; เบนกิ ซานฟรานซิสโก; คริสเตนเซน นอร์ทดาโคตา; Galloway, DA การบ่งชี้ชนิดของไวรัสพาพิลโลมาของมนุษย์ 16-อีพิโทปจำเพาะบนแขนของเทอร์มินัล C ของโปรตีนแคปซิดหลัก L1 เจ. วิโรล. 2003, 77, 11625–11632. [ครอสอ้างอิง]

59. วอน บรุนน์ อ.; ยี่ห้อ, ม.; ไรช์ฮูเบอร์, ค.; มอริส-เวิร์ทมันน์, ซี.; ไดน์ฮาร์ด, เอฟ.; Schdelt, F. โดเมนการทำให้เป็นกลางหลักของ HIV-I นั้นมีภูมิคุ้มกันสูงเมื่อแสดงออกบนพื้นผิวของอนุภาคหลักของไวรัสตับอักเสบบี วัคซีน 1993, 11, 817–824. [ครอสอ้างอิง]

60. เดนนิสสัน เอสเอ็ม; อนาสติเค; สเซิร์ซ RM; ซูเธอร์แลนด์, ล.; สวนสาธารณะร.; เซี่ย ส.-ม.; เหลียว H.-X.; กอร์นี เอ็มเค; โซล่า-ปาซเนอร์ ส.; เฮย์เนส BF; และคณะ โมโนโคลนอลแอนติบอดีของมนุษย์ที่ไม่ทำให้เอชไอวี-1 เป็นกลาง gp41 Envelope Cluster II แสดงปฏิกิริยาหลายปฏิกิริยาสำหรับการจับกับฟอสโฟไลปิดและโปรตีนออโตแอนติเจน เจ. วิโรล. 2011, 85, 1340–1347. [ครอสอ้างอิง]

61. ตรโคลา อ.; คัสเตอร์ เอช.; รูเซิร์ต, ป.; จูส บ.; ฟิสเชอร์ ม.; ลีมันน์, ค.; มันริเก้, อ.; ฮูเบอร์ ม.; เรห์ ม.; อ็อกซีเนียส, อ.; และคณะ ความล่าช้าของ HIV-1 การฟื้นตัวหลังจากการหยุดการรักษาด้วยยาต้านไวรัสผ่านการถ่ายโอนแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางของมนุษย์ แนท. ยา 2005, 11, 615–622. [ครอสอ้างอิง]

62. แชงค์-เรทซลาฟฟ์ ม.; วังเอฟ.; มอร์ลีย์ ต.; แอนเดอร์สัน, ซี.; แฮมม์ ม.; บราวน์ ม.; โรว์แลนด์, เค.; แพนคาริ ก.; ซอร์แมน เจ.; ต่ำกว่า.; และคณะ ความสัมพันธ์ระหว่างประสิทธิภาพของเมาส์และศักยภาพสัมพัทธ์ ในหลอดทดลอง สำหรับอนุภาคคล้ายไวรัส papillomavirus ประเภท 16 ของมนุษย์และตัวอย่างวัคซีน Gardasil ฮัม วัคซีน. 2005, 1, 191–197. [CrossRef] [PubMed]

63. คิลเปไลเนน อ.; มายา-โฮโยส ม.; โซบิ น.; โซโต แคลิฟอร์เนีย; Joseph Munne, J. ความก้าวหน้าและความท้าทายในการพัฒนาวัคซีนเอชไอวีโดยใช้ BCG แบบรีคอมบิแนนท์: บทเรียนที่ได้รับ รายได้วัคซีนของผู้เชี่ยวชาญ 2018, 17, 1005–1020 [CrossRef] [PubMed]




คุณอาจชอบ