การจำแนกลักษณะความเสี่ยงก่อนการปลูกถ่ายและหลังการปลูกถ่ายไตโดยการจัดลำดับรายการภูมิคุ้มกันของ B
Mar 16, 2022
ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
การศึกษารายการภูมิคุ้มกันในบริบทของการปลูกถ่ายอวัยวะให้ข้อมูลที่สำคัญว่าภูมิคุ้มกันแบบปรับตัวอาจมีส่วนช่วยและปรับเปลี่ยนการปฏิเสธการรับสินบนได้อย่างไร ที่นี่เราแสดงลักษณะละครภูมิคุ้มกันในเลือดของบุคคลก่อนและหลังไตการปลูกถ่ายโดยใช้การจัดลำดับตัวรับบีเซลล์ในการศึกษาทางคลินิกตามยาว บุคคลที่ถูกปฏิเสธหลังการปลูกถ่ายมีภูมิคุ้มกันที่หลากหลายมากขึ้นก่อนการปลูกถ่าย ซึ่งบ่งชี้ถึงความโน้มเอียงสำหรับความเสี่ยงในการปฏิเสธหลังการปลูกถ่าย นอกจากนี้ การติดตามผลนานกว่า 2 ปี ผู้ป่วยที่พัฒนาการปฏิเสธจะแสดงชุดโคลนขยายเฉพาะที่ยังคงมีอยู่หลังจากการปฏิเสธ แม้ว่าความหลากหลายของเซลล์ B ต่อพ่วงจะลดลงโดยรวม ซึ่งน่าจะเกิดจากการได้รับภูมิคุ้มกันโดยรวมที่เพิ่มขึ้นในกลุ่มนี้ การตรวจหาการใช้ยีน IGHV เฉพาะในผู้ป่วยที่ปฏิเสธทั้งหมดสนับสนุนว่ากลุ่มของแอนติเจนที่สร้างภูมิคุ้มกันโดยทั่วไปอาจผลักดันการปฏิเสธหลังการปลูกถ่าย การค้นพบของเราอาจมีนัยทางคลินิกสำหรับการทำนายและการจัดการทางคลินิกของการปฏิเสธการปลูกถ่ายไต
ไตการปลูกถ่ายเป็นการรักษาที่ต้องการสำหรับโรคไตวายเรื้อรังระยะสุดท้าย (ESRD) และเรื้อรังไตโรค. แม้ว่าจะมีการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญในด้านเทคโนโลยีและการจับคู่เนื้อเยื่อตามการทดสอบความเข้ากันได้ของฮิสโตสำหรับแอนติเจนของเม็ดเลือดขาวในมนุษย์ (HLA) ของผู้บริจาค/ผู้รับ การทำนายผลของการปลูกถ่ายอวัยวะยังคงเป็นปัญหาที่ยังไม่ได้แก้ไข เนื้อเยื่อที่ตรวจวัดไม่ตรงกันที่ loci23 รองลงมาที่ไม่ใช่ HLA ยังสามารถกระตุ้นการบาดเจ็บของ alloimmune ด้วยการปฏิเสธแบบเฉียบพลันและแบบเรื้อรัง ส่งผลให้ผลการปลูกถ่ายในระยะยาวไม่ดี4 นอกจากนี้ ประมาณร้อยละ 50 ของไตallografts ที่ไม่มี HLA ไม่ตรงกัน ยังคงสูญหายไปภายใน 10 ปีของการปลูกถ่าย² ก่อนหน้านี้เราได้ตั้งสมมติฐานว่า loci ที่ไม่ใช่ HLA อาจส่งผลต่อการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของผู้รับต่อ hisไตdonor graft6. More research needs to be done to better understand and predict the recipient's risk of rejection to substantially improve long-term patient and graft outcomes. Nevertheless, the diversity of the immune response to various immunogenic epi-topes is as yet, poorly understood. The role of T cells in organ transplant rejection has been demonstrated, but there is increasing appreciation of the additional role of B cells and antibodies in triggering this process8. In this regard, B-cell receptor sequencing(BCRSeq)is a promising high-throughput technique that allows the sequencing of millions of Immunoglobulin (Ig)regions in parallel to study the immune response. The key feature of B cells is their enormous diversity. Each individual is capable of producing >1013 แอนติบอดีที่ต่างกัน0 ซึ่งทำให้พวกมันสามารถจดจำแอนติเจนต่างถิ่นมากมาย BCR ของมนุษย์หรือ Ig ประกอบด้วยสายหนักที่เหมือนกันสองสาย (I) ที่ก่อรูปโดยห้าไอโซไทป์: IgM, IgD, IgA, IgE และ IgG และสายเบาสองสาย แอนติบอดีที่สมบูรณ์ประกอบด้วยตัวแปรและโดเมนคงที่ การจับแอนติเจนเกิดขึ้นในโดเมนที่แปรผันได้ ซึ่งเกิดขึ้นจากการรวมตัวกันของชุดของตัวแปร (V), ความหลากหลาย (D) และการรวมกลุ่มของยีน (J) ที่สร้างรายการภูมิคุ้มกันของ B-cell และความหลากหลายของมันส่วนใหญ่กระจุกตัวอยู่ใน บริเวณกำหนดส่วนเสริม 3(CDR3) ในระหว่างกระบวนการของการเจริญเต็มที่ของสัมพรรคภาพ โซมาติกไฮเปอร์มิวเทชัน (SHM) เกิดขึ้นในบริเวณแปรผัน การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันแบบปรับตัวที่มีศักยภาพขึ้นอยู่กับการขยายตัวของสำเนาพันธุ์ B-cell และกระบวนการที่เรียกว่าการเจริญเต็มที่ของสัมพรรคภาพ ในระหว่างที่การกลายพันธุ์แบบโซมาติกถูกนำเข้าไปในการจัดเรียงยีน Ig ใหม่และเซลล์ B ที่มีสัมพรรคภาพสูงกว่าสำหรับแอนติเจนที่กำหนดจะถูกเลือก
การศึกษาเรื่องภูมิคุ้มกันในการปลูกถ่ายอวัยวะมีความสำคัญอย่างยิ่งในการทำความเข้าใจว่าอะไรเป็นตัวกระตุ้นและรักษากระบวนการปฏิเสธ และในที่สุดจะเร่งเส้นทางไปสู่ความล้มเหลวของการปลูกถ่ายอวัยวะได้อย่างไร ด้วยความก้าวหน้าของการจัดลำดับยุคหน้าและวิธีการคำนวณที่มีประสิทธิภาพ เราสามารถศึกษาขอบเขต VDJ อย่างละเอียดได้12 จนถึงปัจจุบัน การวิเคราะห์รายการภูมิคุ้มกัน T-cell ในไตการปลูกถ่ายดำเนินการในจำนวนที่จำกัดของผู้ป่วย3-15 และแม้ว่า BCRSeq จะถูกนำมาใช้กับโรคอื่นๆ และการตอบสนองของภูมิคุ้มกันของมนุษย์ เช่น โรคเส้นโลหิตตีบหลายเส้น6 วัคซีนป้องกันไข้หวัดใหญ่7หรือโรคภูมิคุ้มกันบกพร่อง8 ยังขาดการศึกษาในการปลูกถ่าย การปฏิเสธ ในไตการปลูกถ่าย BCRSeq ดำเนินการในบริบทของความอดทนเท่านั้น HLA sensitizedไตผู้เข้ารับการปลูกถ่ายที่เข้ารับการบำบัดด้วยการลดความรู้สึกไว 20 และการแทรกซึมของเซลล์บีซึ่งเปรียบเทียบการขยายตัวของโคลนในเลือดและการปลูกถ่ายอวัยวะ2l แอปพลิเคชันอื่นเกี่ยวกับ BCRSeq ในการปลูกถ่ายได้รับการเผยแพร่ก่อนหน้านี้ในกลุ่มผู้รับการปลูกถ่ายหัวใจจำนวน 12 ราย
โดยตระหนักถึงความสำคัญของการตอบสนองต่อระบบภูมิคุ้มกันของร่างกายในการปฏิเสธการปลูกถ่ายในช่วงปลายและความล้มเหลวของการปลูกถ่ายอวัยวะแบบเรื้อรัง เราจึงกำหนดลักษณะของรายการภูมิคุ้มกันในเลือดส่วนปลายโดยใช้ BCRSeq ในการศึกษาระยะยาวในอนาคต เราพบว่าความหลากหลายของรายการภูมิคุ้มกันก่อนการปลูกถ่ายนั้นสูงกว่าในบุคคลที่ปฏิเสธไตแสดงให้เห็นการขยายตัวของโคลนและยีน IGHVgenes บางส่วนตลอด 24 เดือนของการติดตามผล ผลลัพธ์เหล่านี้อาจช่วยทำนายความเสี่ยงในการปฏิเสธก่อนการปลูกถ่าย และอาจมีผลทางคลินิกในการตรวจหาแอนติเจนที่ขับการปฏิเสธโดยเฉพาะ
ผลลัพธ์
วิชาเรียน. เราทำ BCRSeq ในตัวอย่างเลือด 83 ตัวอย่างจากผู้ป่วยที่ไม่ซ้ำกัน 27 ราย และดำเนินการไปป์ไลน์การวิเคราะห์ที่แสดงในรูปที่ 1 กลุ่มฟีโนไทป์ทางคลินิกสามกลุ่มที่กำหนดโดยการอ่านค่าพยาธิวิทยาส่วนกลางที่ตาบอดของการตรวจชิ้นเนื้อ allograft แบบอนุกรมที่ทำคะแนนโดยเกณฑ์ของ Banff 23,24 และคะแนนดัชนีความเสียหายของ allograft เรื้อรัง (CADI) ได้รับการพิจารณาในการศึกษานี้: ผู้ไม่ดำเนินกิจการ (NP; n=10) มีคะแนน CADI ที่ไม่เพิ่มขึ้นในระดับต่ำโดยไม่มีการปฏิเสธเฉียบพลัน ผู้ที่ลุกลามโดยไม่มีการปฏิเสธ (PNR;n=10) มีคะแนน CADI ที่เพิ่มขึ้นในช่วง 2 ปีโดยไม่มีการปฏิเสธ และผู้ที่มีความก้าวหน้าที่มีการปฏิเสธ (PR; n=7) คะแนน CADI สูงที่เพิ่มขึ้นในช่วง 2 ปีที่ผ่านมากับตอนที่ถูกปฏิเสธ ข้อมูลประชากร สาเหตุของไตความล้มเหลวและการใช้การกดภูมิคุ้มกันแสดงไว้ในตารางที่ 1 สิ่งสำคัญคือต้องเน้นถึงลักษณะเฉพาะของผู้ป่วยเหล่านี้ การศึกษาระดับผู้ปกครองที่ผู้ป่วยเหล่านี้ลงทะเบียนมีอัตราโดยรวมต่ำ (17 เปอร์เซ็นต์) ของการปฏิเสธเฉียบพลันที่ได้รับการยืนยันโดยการตรวจชิ้นเนื้อ (เฉลี่ย {min, max}=12 {6,24} เดือนเวลาในการปฏิเสธ) ผู้ป่วยเหล่านี้ล้วนมีความเสี่ยงต่อการปฏิเสธภูมิคุ้มกันต่ำ<20%), and="" also="" had="" low="" rates="" of="" generation="" of="" donor-specific="" antibody(dsa)and="" only="" two="" of="" the="" rejection="" phenotype="" patients="" included="" in="" the="" analysis="" had="" dsa.="" the="" generation="" of="" dsa="" to="" hla="" and="" mica="" was="" measured="" in="" all="" serial="" sera="" throughout="" the="" study25.="" national="" experience="" with="" similar="" immunosuppressive="" protocols="" in="" similar="" patient="" cohorts="" have="" confirmed="" similar="" good="" clinical="" outcomes="" and="" low="" rejection="">
การจัดลำดับเพลงภูมิคุ้มกัน B-cell ทำ BCRSeq ในตัวอย่างจีโนม DNA (gDNA) ที่สกัดจากลิ่มเลือดในตัวอย่าง 81 ตัวอย่างจาก 27 ตัวอย่างไตผู้รับการปลูกถ่ายที่จุดสามครั้ง (0,6,24 เดือน) การจัดลำดับได้รับจำนวนการอ่านทั้งหมด 327,703 ครั้ง (ค่าเฉลี่ย 4045/ตัวอย่าง) หลังจากการควบคุมคุณภาพ (ดูส่วนวิธีการ) สำหรับการตรวจสอบความถูกต้องของผลลัพธ์และการประเมินเพิ่มเติมของแต่ละไอโซไทป์ เราได้สกัด RNA เพิ่มเติมจาก PBMC ที่ตรงกันซึ่งมีให้สำหรับตัวอย่าง 55 ตัวอย่าง รวบรวมในเวลาเดียวกับก้อนเลือด และทำการจัดลำดับ DNA(cDNA) เสริมที่ระดับความลึกมากขึ้น โดยได้ค่าอ่าน 1,773,330 ครั้ง สำหรับ IgD (เฉลี่ย 31,667/ตัวอย่าง), 1,708,227 อ่านสำหรับ IgM (เฉลี่ย 30,504/ตัวอย่าง), 973,444 อ่านสำหรับ IgA (เฉลี่ย 17,383/ตัวอย่าง), 139,7345 อ่านสำหรับ IgG (เฉลี่ย 24,953/ตัวอย่าง) และ 29,{{27 }} อ่านค่า IgE (ค่าเฉลี่ย 5178/ตัวอย่าง) (รูปที่ 1) ไลบรารีสำหรับไอโซไทป์แต่ละอันถูกขยายแยกกันและจากนั้นจึงรวมกลุ่มสำหรับการจัดลำดับ ดังนั้น การวิเคราะห์ไอโซไทป์แบบเปรียบเทียบจึงไม่สามารถทำได้
ดังที่แสดงในรูปที่ 1b เรากำหนดโคลนเป็นกลุ่มของเซลล์ที่สืบเชื้อสายมาจากโมเลกุลบรรพบุรุษร่วมกันที่มีเซ็กเมนต์ IGHV และ IGHJ เดียวกัน ความยาว CDR3 เท่ากัน และเอกลักษณ์ของนิวคลีโอไทด์ 90 เปอร์เซ็นต์ระหว่าง CDR3 ตามที่กำหนดไว้ก่อนหน้านี้ในการศึกษาดัดแปลง B -การตอบสนองของเซลล์'8 คำจำกัดความนี้ช่วยให้ศึกษาความหลากหลาย โคนที่ใช้ร่วมกันหรือโคนทั่วไป และการขยายตัวของโคลนในบริบทของ alloimmunity ในไตการปลูกถ่าย จำนวนกรวยที่ไม่ซ้ำกันต่อแต่ละจุดในแต่ละช่วงเวลาจะแสดงเป็นกราฟแท่งในวัสดุเสริม (รูปที่ 1) เพื่อความเข้มงวดของการวิเคราะห์ข้อมูล เราได้ลดตัวอย่างด้วย<100 clones="" (69="" samples="" from="" gdna="" and="" 55="" samples="" from="" cdna="" were="" left="" for="" further="" study.="" ige="" isotype="" was="" discarded="" completely="" due="" to="" a="" very="" small="" number="" of="" reads).="" in="" addition,="" we="" filtered="" outpatient="" 8="" in="" the="" np="" group="" from="" subsequent="" analysis,="" as="" we="" recognized="" after="" the="" run,="" that="" he="" had="" developed="" ebv+post="" transplant="" lymphoproliferative="" disease(ptld)at="" 2.2="" years="" post="">ไตการปลูกถ่ายลักษณะการขยายพันธุ์ของ Epstein Barr
รูปที่ 1 ไปป์ไลน์การศึกษาโดยรวม การแสดงแผนผังของโครงสร้างแอนติบอดีและกระบวนการ VDJrecombination ที่รับผิดชอบต่อความหลากหลายที่ผลิตในรายการภูมิคุ้มกัน b โคลน B-cell ที่กำหนดเป็นเซลล์จากบรรพบุรุษร่วมกันและไปป์ไลน์การวิเคราะห์ c ของการศึกษา: B-cell การจัดลำดับสำหรับ gDNA และ cDNA การวิเคราะห์ความหลากหลายโดยพิจารณาจากจำนวนของโคลน (ความสมบูรณ์) และความถี่ของโคลนแต่ละตัว (แชนนอนเอนโทรปี) การวิเคราะห์เครือข่าย และการวิเคราะห์โคลนและ IGHV
ไวรัส (EBV) ที่ติดเชื้อบีเซลล์ เราสังเกตจำนวนโคลนที่เพิ่มขึ้น ณ เวลาที่ 6 ในผู้ป่วยรายนี้ โดยมีความหลากหลายของโคลนที่ต่ำกว่ามาก่อนไตการปลูกถ่ายและเมื่อ 24 เดือนหลังการปลูกถ่ายไต เนื่องจากไลบรารีถูกขยายจากเทมเพลตจำนวนคงที่ สัดส่วนที่สูงขึ้นของเซลล์ B ในเลือดอาจส่งผลให้มี clonotypes จำนวนมากขึ้นที่แสดงในผลิตภัณฑ์ที่มีลำดับ เนื่องจากกระบวนการทางพยาธิวิทยาที่แตกต่างและไม่เหมือนใครในผู้ป่วยรายนี้ ตัวอย่างนี้จึงไม่รวมอยู่ในการวิเคราะห์ในอนาคต
ความหลากหลายของเซลล์บีก่อนการปลูกถ่ายสัมพันธ์กับการปฏิเสธ ดังที่แสดงในรูปที่ 1c เราตรวจสอบความหลากหลายของรายการภูมิคุ้มกันของ B-cell โดยพิจารณาจากความสมบูรณ์ของสปีชีส์ (จำนวนโคลนที่ไม่ซ้ำกัน) และเอนโทรปีของแชนนอน (สมการ (1) จากวิธีการ) ข้ามจุดเวลาและผลลัพธ์ทางคลินิกโดยใช้แบบจำลองการถดถอยเชิงเส้นโดยพิจารณาจากจำนวน ของโคลนหรือเอนโทรปีเป็นตัวแปรตามและผลลัพธ์ทางคลินิกหรือ SHM เป็นตัวแปรปัจจัยอิสระ ละครก่อนไตการปลูกถ่ายใน PR มีความหลากหลายมากกว่าใน NP (ความสมบูรณ์: P-value=0.005, entropy: P-value=0.01) โดยมีแนวโน้มเหมือนเดิมที่ 6 เดือนหลังจากนั้นไตการปลูกถ่าย (ความสมบูรณ์: P-value=0.02, entropy: P-value=0.02) และไม่มีความแตกต่างของกลุ่มที่แยกได้ในช่วง 2 ปีหลังการปลูกถ่าย (รูปที่ 2a และรูปที่ 2). ข้อมูลการจัดลำดับ cDNA หลังการปลูกถ่าย แสดงให้เห็นแนวโน้มเดียวกันในความหลากหลายทางละครที่มากขึ้นในช่วง 6 เดือนหลังการปลูกถ่าย ส่วนใหญ่เป็นไอโซไทป์ของ IgD (ความสมบูรณ์: ค่า P=0.02 เอนโทรปี: ค่า P=0 03) (รูปที่ 2b และรูปที่ 2). ไม่มีผลกระทบต่อข้อมูลจากตัวแปรทางประชากรศาสตร์และทางคลินิกต่างๆ เช่น อายุผู้รับ เพศ เชื้อชาติ แหล่งผู้บริจาค ประเภทของภูมิคุ้มกันบกพร่อง HLA ไม่ตรงกัน และสาเหตุของภาวะไตวาย เนื่องจากการตอบสนองของ B-cell ของ 1-ปี (อายุขั้นต่ำในข้อมูล) และ 19-ปี (อายุสูงสุดในข้อมูล) อาจแตกต่างกันมาก เราจึงดำเนินการความไว การวิเคราะห์โดยไม่รวมผู้ป่วยทั้งสองนี้ และผลลัพธ์ยังคงมีนัยสำคัญ (NP เทียบกับ PR ณ เวลา 0: ความสมบูรณ์: P-value=0.01, เอนโทรปี: P-value=0.03) ในการวัดความหลากหลายของรายการภูมิคุ้มกัน เราประเมิน SHM ซึ่งกำหนดเป็นความถี่ของการกลายพันธุ์ในแต่ละส่วนของยีน V และพบแนวโน้มสำหรับจำนวน SHM ที่สูงขึ้นสำหรับ PR ก่อนการปลูกถ่าย และแนวโน้มสำหรับ SHM ที่สูงขึ้นในไอโซไทป์ IgD ใน PR ที่ 6 เดือนหลังปลูกถ่าย (P-value=0.06)
ความหลากหลายของเซลล์บีเปลี่ยนแปลงไปตามกาลเวลาโดยผลลัพธ์ทางคลินิก เพื่อค้นหาว่าความหลากหลายของรายการภูมิคุ้มกันเปลี่ยนแปลงตลอดเวลาตามผลลัพธ์ทางคลินิก เราจำลองข้อมูลตามยาวโดยใช้แบบจำลองผลผสมเชิงเส้นโดยพิจารณาจากปฏิสัมพันธ์ระหว่างผลลัพธ์ทางคลินิกกับเวลา เราพบว่า NP และ PR มีพฤติกรรมแตกต่างกันเมื่อเวลาผ่านไปหลังจากการปลูกถ่าย ซึ่งแสดงถึงความหลากหลายที่เพิ่มขึ้นใน NP และการลดลงของความหลากหลายใน PR ในขณะที่สำหรับ PNR ความหลากหลายยังคงไม่เปลี่ยนแปลงตลอดเวลา สิ่งนี้ถูกสังเกตพบสำหรับ gDNA (ความสมบูรณ์: P-value=0.007, entropy: P-value=0.001, รูปที่ 3a) และไอโซไทป์ทั้งหมดสำหรับ cDNA โดยมีความแตกต่างที่ชัดเจนที่สุดในเอนโทรปีคือ สำหรับไอโซไทป์ของ IgM และ IgD (IgA: P-value=0.07, IgD: P-value=0.02, IgG: P-value=0.05, IgM: P-value=0.04, รูปที่ 3b) แปลงสำหรับความสมบูรณ์ที่มีค่า P ที่สอดคล้องกันจะแสดงในรูปที่ 3 ตามที่สังเกตในแปลง บุคคลหนึ่งมีตัวอย่างเพิ่มเติมในเวลา 32 เดือน ซึ่งอาจบิดเบือนผลลัพธ์ ดังนั้นจึงทำการวิเคราะห์ความไวโดยไม่รวมตัวอย่างนี้จาก การวิเคราะห์และการสังเกตผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกัน ยกเว้นไอโซไทป์ของ IgG และ IgM ที่ significance หายไป (gDNA-entropy: P-value=0.004. cDNA- เอนโทรปี: IgA: P-value=0.1 , IgD: P-value=0.05, IgG: P-value=0.08, IgM: P-value=0.1)
มาตรการความหลากหลายอาจได้รับผลกระทบจากการสุ่มตัวอย่างทางชีวภาพและทางเทคนิค ความหลากหลายของตัวอย่างอาจแตกต่างอย่างเห็นได้ชัดจากความหลากหลายโดยรวมในละคร เนื่องจากมีการแสดงเซลล์เพียงเศษเสี้ยวของพันล้าน ซึ่งเรียกว่าปัญหาของสปีชีส์ที่หายไป การสุ่มตัวอย่างทางเทคนิคอาจมีอยู่เนื่องจากตัวอย่างแต่ละตัวอย่างอาจมีความลึกในการจัดลำดับและระดับข้อผิดพลาดในการทดลองแตกต่างกันไป เพื่อจัดการกับปัญหาของสปีชีส์ที่หายไป เราใช้เครื่องมือ Recon (การสร้างโคลนโดยประมาณขึ้นใหม่จากจำนวนที่สังเกตได้) ซึ่งประมาณการการกระจายขนาดโคลนโดยรวม Recon แสดงค่าประมาณที่แม่นยำและแข็งแกร่งของชุดการวัดความหลากหลาย ซึ่งรวมถึงความสมบูรณ์และเอนโทรปี ซึ่งช่วยให้สามารถเปรียบเทียบความหลากหลายระหว่างบุคคลได้อย่างมีประสิทธิภาพ เพื่อจัดการกับความลึกของการจัดลำดับและระดับของข้อผิดพลาดในการทดลอง เราได้ใช้กลยุทธ์การสุ่มตัวอย่าง กลยุทธ์ที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในการวิเคราะห์ละครภูมิคุ้มกัน11,17,30 ในการวิเคราะห์ Recon (รูปเสริม S4: A–E) ทั้งความสมบูรณ์และความหลากหลายได้รับการจำลองแบบสำหรับข้อมูล gDNA ในข้อมูล cDNA ไอโซไทป์ของ IgD ของเวลาที่ 6 แสดงแนวโน้มแต่ไม่ถึงความสำคัญแม้ว่าผลลัพธ์ตามยาวสำหรับไอโซไทป์ของ IgA, IgD และ IgG จะถูกจำลองแบบ ในการวิเคราะห์การสุ่มตัวอย่าง (รูปเสริม S4: F–J) ทุกอย่างถูกจำลองแบบ แต่เวลาเป็น 0 สำหรับข้อมูล gDNA นี่อาจเป็นผลสืบเนื่องมาจากข้อจำกัดที่ทำให้การสุ่มตัวอย่างลดลง
รูปที่ 2 แปลงไวโอลินแสดงจำนวนโคลน (ความสมบูรณ์) ในผลลัพธ์ทางคลินิกทั้งสาม จำนวนโคลนในบางครั้ง 0, 6 และ 24 จากตัวอย่าง gDNA b จำนวนโคลน ณ เวลา 6 สำหรับไอโซไทป์ IgD จากตัวอย่าง cDNA ค่า P ได้มาจากการปรับแบบจำลองการถดถอยเชิงเส้นโดยพิจารณาจากจำนวนของโคลนเป็นตัวแปรตามและผลลัพธ์ทางคลินิกเป็นตัวแปรปัจจัยอิสระ (ตัวอย่าง n=27 รายการ) แปลงไวโอลินแสดงถึงความหนาแน่นของความน่าจะเป็นของข้อมูลในแต่ละค่า เครื่องหมายจุดแสดงค่ามัธยฐานที่มีช่วงควอร์ไทล์ ข้อมูลต้นทางถูกจัดเตรียมไว้เป็นไฟล์ข้อมูลต้นทาง
รูปที่ 3 ข้อมูลตามยาวพล็อตด้วยเส้นที่พอดีสำหรับผลลัพธ์ทางคลินิกแต่ละรายการ ความหลากหลายที่วัดโดยเอนโทรปีของแชนนอนแสดงข้ามจุดเวลาด้วยผลลัพธ์ทางคลินิกสามประการ (NP, PNR, PR) ใน gDNA b ความหลากหลายที่วัดโดยเอนโทรปีของแชนนอนที่แสดงข้ามจุดเวลาด้วยผลลัพธ์ทางคลินิกสามประการ (NP, PNR, PR) โดยไอโซไทป์ใน cDNA ค่า P สอดคล้องกับเงื่อนไขการโต้ตอบที่กำหนดโดยเวลา × ผลลัพธ์ทางคลินิกที่ปรับแบบจำลองผลผสมเชิงเส้น (n=27 ตัวอย่าง) แต่ละจุดแสดงถึงเอนโทรปีต่อตัวอย่างตลอดช่วงเวลาด้วยเส้นตรงและช่วงความเชื่อมั่น ข้อมูลต้นทางถูกจัดเตรียมไว้เป็นไฟล์ข้อมูลต้นทาง
กลยุทธ์โดยนัย โดยเฉพาะอย่างยิ่งในข้อมูล gDNA ที่จำนวนลำดับต่ำกว่าข้อมูล cDNA มาก ใน gDNA เราจำกัดการวิเคราะห์เฉพาะบุคคลที่มีโคลนอย่างน้อย 1000 ตัวเพื่อรักษาลำดับที่เพียงพอ การสุ่มตัวอย่างทำจนถึงอย่างน้อย 1,062 โคลนเมื่อเปรียบเทียบกับ 62,173 โคลนใน cDNA แม้จะมีข้อจำกัดนี้ แต่เราสังเกตแนวโน้มสำหรับเวลา 0 อนุรักษ์ความสำคัญสำหรับการวิเคราะห์ตามยาวใน gDNA และจำลองการเชื่อมโยงทั้งหมดใน cDNA ในการวิเคราะห์ทั้งสอง (recon และ downsampling) เราจำลองผลลัพธ์ แม้ว่าจะมีการเน้นย้ำข้อจำกัดบางประการที่นี่ ซึ่งแสดงความถูกต้องของผลลัพธ์ที่รายงานก่อนหน้านี้
เครือข่าย B-cell แสดงความแตกต่างในการขยายแบบโคลน ละครบีเซลล์สามารถแสดงโดยธรรมชาติเป็นเครือข่ายตามความหลากหลายของลำดับ31 ในข้อมูลของเรา เราได้พัฒนาเครือข่ายภาพสำหรับแต่ละตัวอย่าง (รูปที่ 4 และรูปที่ 5–7) โดยที่จุดยอดแต่ละจุดแสดง BCR ที่ไม่ซ้ำกัน และจำนวนของ BCR ที่เหมือนกันตามลำดับนิวคลีโอไทด์ของพวกมันกำหนดขนาดจุดยอด มีขอบอยู่ระหว่างจุดยอดเมื่ออยู่ในโคลนเดียวกัน ดังนั้นกลุ่มของเซลล์ B สามารถแสดงเป็นกลุ่มของจุดยอดที่เชื่อมต่อถึงกันซึ่งก่อตัวเป็นโคลน ในการหาปริมาณเครือข่าย เราใช้ดัชนี Gini ซึ่งเป็นการวัดความไม่สม่ำเสมอที่ใช้กับจุดยอดและการแจกแจงคลัสเตอร์ เมื่อนำไปใช้กับขนาดจุดยอด Gini(V) จะแสดงลักษณะของโคลนโดยรวม ถ้า Gini(V) เข้าใกล้ 1 มากขึ้น จุดยอดจะไม่เท่ากันซึ่งแสดงให้เห็นการขยายตัวของจุดบางจุด และใกล้กับ 0 ไม่เช่นนั้น เมื่อนำไปใช้กับขนาดคลัสเตอร์ Gini(C) จะแสดงการครอบงำแบบโคลน หากเข้าใกล้ 1 คลัสเตอร์จะไม่เท่ากัน ดังนั้นจึงเป็นตัวแทนของโคลนเด่น หากใกล้กับ 0 คลัสเตอร์ทั้งหมดจะมีขนาดเท่ากัน
ในรูปที่ 4 เราแสดงตัวอย่างของความแตกต่างทางภาพและเชิงปริมาณที่ทำเครื่องหมายไว้ระหว่างรายการ B-cell ที่เป็นตัวแทนจากแต่ละกลุ่มผลลัพธ์ทางคลินิกทั้งสามกลุ่ม ในช่วงเวลาที่แตกต่างกันสามจุด (ก่อนการปลูกถ่าย และหลังการปลูกถ่าย 6 และ 24 เดือน) . ในละคร PR มีลำดับ B-cell มากมายที่สร้างคลัสเตอร์โคลนมากขึ้นเรื่อยๆ เมื่อเปรียบเทียบกับ NP ในขณะที่ PNR อยู่ระหว่างนั้น เมื่อเวลาผ่านไป กลุ่ม PR แสดงจำนวน BCR และสำเนาพันธุ์ที่ลดลงเมื่อเปรียบเทียบกับ NP เครือข่ายบีเซลล์โดยละเอียดของแต่ละคนในการศึกษามีให้ในรูปที่เสริม 5-7. เป็นที่น่าสนใจที่จะสังเกตรูปแบบที่หลากหลายมากของเครือข่าย B-cell ในบุคคลที่พัฒนา PTLD ในกลุ่ม NP (รูปที่ 5 เพิ่มเติม) โดยไม่มีการขยายตัวของ B-cell ก่อนการปลูกถ่าย ตามด้วยการเพิ่มขึ้นของ B เซลล์หลัง 6 เดือนและการขยายตัวของโคลนที่ชัดเจนพร้อมกับความหลากหลายที่ลดลงในช่วง 24 เดือนหลังการปลูกถ่าย
ในการประเมินเพิ่มเติมของการวัดดัชนีจินี (รูปที่ 5) กลุ่ม PR แสดงมาตรการที่สูงขึ้นอย่างต่อเนื่องสำหรับทั้งจุดยอดและคลัสเตอร์เหนือกลุ่ม NP อย่างสม่ำเสมอ ซึ่งบ่งชี้ว่าผู้ป่วยกลุ่ม PR มีการขยายตัวแบบโคลนที่สูงขึ้นที่การตรวจวัดพื้นฐาน
รูปที่ 4 เครือข่ายรายการเพลง B-cell จากบุคคลสามคนซึ่งเป็นตัวแทนของผลลัพธ์ทางคลินิกทั้งสามแบบในช่วงเวลาต่างๆ จุดยอดแต่ละจุดแสดงถึง BCR ที่ไม่ซ้ำกันซึ่งเป็นขนาดจุดยอดที่กำหนดโดยจำนวนของ BCR ที่เหมือนกันโดยพิจารณาจากลำดับนิวคลีโอไทด์ มีขอบอยู่ระหว่างจุดยอดเมื่ออยู่ในโคลนเดียวกันตามที่กำหนดไว้ก่อนหน้านี้ ดังนั้นคลัสเตอร์จึงเป็นกลุ่มของจุดยอดที่เชื่อมต่อถึงกันซึ่งก่อตัวเป็นโคลน ตัวอย่างแต่ละตัวอย่างแสดงดัชนีจินีที่ได้รับสำหรับขนาดจุดยอด (Gini(V)) และขนาดคลัสเตอร์ (Gini(C)) BCR จำลองตัวรับ B-cell ทั้งหมดสำหรับตัวอย่างเฉพาะนั้นและสำเนาพันธุ์ที่สะท้อนจำนวนทั้งหมดของสำเนาพันธุ์ที่ไม่ซ้ำกัน ข้อมูลต้นทางถูกจัดเตรียมไว้เป็นไฟล์ข้อมูลต้นทาง
และการขยายตัวหลังการปลูกถ่ายเพิ่มเติมของชุดย่อยของโคลนเด่น (ค่า P [การถดถอยเชิงเส้น] < 0.05,="" รูปที่="" 5)="" กลุ่ม="" pnr="" อยู่ระหว่าง="" np="" และ="" pr="" ดังที่แสดงไว้ก่อนหน้านี้="" แม้ว่าเวลานี้จะแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญกับกลุ่ม="" np="" ณ="" เวลา="" 24="" (ค่า="" p="" [ค่าการถดถอยเชิงเส้น]="">< 0.05)="" แม้ว่าข้อมูลสำหรับรูปที่="" 5="" จะถูกสร้างขึ้นจากข้อมูล="" gdna="" แต่ไอโซไทป์ของ="" igm="" สำหรับ="" cdna="" ก็มีความแตกต่างกัน="" (ค่า="" p="" [การถดถอยเชิงเส้น]="0.05)" (รูปที่="" 8)="">
ยีนบางตัวและยีน IGHV เกี่ยวข้องกับการปฏิเสธ
แม้ว่าจุดสนใจหลักของเราคือการกำหนดลักษณะของรายการบีเซลล์ตามกลุ่มผลลัพธ์ทางคลินิก โดยให้ภาพรวมของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันก่อนและหลังการปลูกถ่าย ข้อมูลของเรายังช่วยให้เราสามารถทำการวิเคราะห์เฉพาะลำดับ Ig ที่โคลนและ IGHV ระดับยีน
สำหรับการวิเคราะห์โคลน เราประเมินความสัมพันธ์ของการมีอยู่หรือไม่มีของโคลนแต่ละตัวโดยเฉพาะ (118,223 โคลนทั้งหมด) กับผลลัพธ์ทางคลินิก (PR, PNR, NR) ในแต่ละช่วงเวลา จากการใช้การทดสอบที่แม่นยำของฟิชเชอร์ เราพบ 8, 4 และ 21 โคลนในนามที่เกี่ยวข้องกับผลลัพธ์ทางคลินิกในแต่ละ 0, 6 และ 24 เดือนตามลำดับ (ตารางเสริม 1) แม้ว่าจะไม่มีใครผ่านการทดสอบหลาย ๆ ครั้ง สาเหตุหลักมาจากการขาดพลังงาน เนื่องจากเรามีขนาดตัวอย่างที่จำกัดในการวิเคราะห์ด้วยพารามิเตอร์ (โคลน) หลายพันตัว เราสามารถสังเกตได้ว่าโคลนสองสามตัวที่เข้าใกล้ความสำคัญ (ค่า P < {{="" 11}}.05)="" ถูกแบ่งระหว่างผู้ป่วยในกลุ่ม="" pr="" เท่านั้นและถูกทำให้สมบูรณ์ที่="" 24="">
เรายังพิจารณาด้วยว่าสำเนาพันธุ์บางตัวยังคงอยู่ในช่วงเวลาสุ่มตัวอย่าง มากกว่าตัวอื่นๆ ภายในผลลัพธ์ทางคลินิกแต่ละรายการหรือไม่ (รูปที่ 9) เราพิจารณาสองมาตรการที่แตกต่างกัน: (1) จำนวนโคลนที่คงอยู่และ (2) การขยายตัวของโคลน เราสังเกตว่าสำเนาพันธุ์ที่ยังคงอยู่ใน PR นั้นขยายตัวมากขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (ค่า P [การถดถอยเชิงเส้น]=0.01, PR เทียบกับ NP) และแสดงแนวโน้มของจำนวนสำเนาถาวรที่สูงขึ้น (P- ค่า [การถดถอยเชิงเส้น]=0.09) เราตรวจสอบเพิ่มเติมว่ามีการแบ่งปันสำเนาพันธุ์แบบถาวรเหล่านี้กับบุคคลต่างๆ ภายในผลลัพธ์ทางคลินิกแต่ละรายการหรือไม่ จากสำเนาพันธุ์ถาวร 263 ตัวที่ตรวจพบ มีการใช้ร่วมกัน 23 ตัวในแต่ละคน ห้าถูกใช้ร่วมกันภายใน PNR เดียวกันและหกภายในกลุ่ม PR และไม่มีการใช้โคลนร่วมกันระหว่างกลุ่ม NP โดยรวมแล้ว 12 โคลนที่ใช้ร่วมกันเป็นเรื่องธรรมดาในทั้งสองกลุ่มของผู้ป่วยที่ได้รับบาดเจ็บจากการปลูกถ่ายเรื้อรังและพังผืดเมื่อเวลาผ่านไป (PR และ PNR) รายชื่อโคลนที่ใช้ร่วมกันระหว่างบุคคลมีอยู่ในเอกสารประกอบ (ตารางเสริม 2)
ต่อไปเราทำการวิเคราะห์ยีน IGHV โดยดูที่การใช้ยีน IGHV ต่อตัวอย่าง โดยกำหนดเป็นจำนวนครั้งในการใช้ยีน IGHV แต่ละยีน ทำให้เป็นมาตรฐานด้วยจำนวนโคลน
รูปที่ 5 ดัชนี Vertex Gini พล็อตเทียบกับดัชนี Cluster Gini พล็อตกระจายแสดงตัวอย่างแต่ละตัวอย่าง ณ เวลา 0, 6 และ 24 Boxplots แสดงความแตกต่างของ Gini(V) และ Gini(C) ณ เวลาที่ 24 ค่า P ได้มาจากการปรับโมเดลการถดถอยเชิงเส้น โดยพิจารณาว่า Gini(V) และ Gini(C) เป็นตัวแปรตามและผลลัพธ์ทางคลินิกเป็นตัวแปรปัจจัยอิสระสำหรับแต่ละจุดเวลา (n=27 ตัวอย่าง) ใน boxplot แสดงเวลาเพียง 24 แต่เวลา 0 และ 6 ซึ่งมีความสำคัญสำหรับ NP เทียบกับ PR: เวลา 0: P (Gini (V))=0.1, P ( จินี่(C))=0.05; เวลา 6 P (Gini(V))=0.02, P (Gini(C))=0.01; เวลา 24: P (Gini(V))=0.003, P (Gini(C))=0.01 แถบภายในกล่องแสดงถึงค่ามัธยฐาน กล่องกำหนดช่วงระหว่างควอไทล์ (IQR) และเครากำหนดควอร์ไทล์ที่หนึ่งและสาม ± 1.5 × IQR ข้อมูลต้นทางถูกจัดเตรียมไว้เป็นไฟล์ข้อมูลต้นทาง
ยีน (การใช้ยีน IGHV > {{0}}.05 ในอย่างน้อย 10 เปอร์เซ็นต์ของกลุ่มตัวอย่าง) และใช้แบบจำลองการถดถอยเชิงเส้นเพื่อค้นหายีนที่เกี่ยวข้อง กับผลลัพธ์ทางคลินิกในแต่ละช่วงเวลา จากยีน IGHV 27 ยีนที่ผ่านตัวกรองการแสดงออกต่ำ เราพบยีนที่มีนัยสำคัญระหว่างกลุ่ม PR และ NP (ค่า P < 0.05)="" โดยมีสามยีนที่เวลา="" 0,="" 7="" ที่เวลา="" 6="" และ="" 16="" ที่="" เวลา="" 24="" (รูปที่="" 6a–c)="" จากยีนเหล่านี้="" 1="" (ighv3-11)="" ที่เวลา="" 0,="" 5="" ยีน="" (ighv3-7,="" ighv3-15,="" ighv3-21,="" ighv3-23,="" ighv{="" {22}})="" ที่เวลา="" 6="" และ="" 16="" ยีน="" (ighv1-8,="" ighv1-18,="" ighv1-46,="" ighv2-="" 5,="" ighv3-7,="" ighv{{="" 30}},="" ighv3-15,="" ighv3-23,="" ighv3-30,="" ighv3-33,="" ighv3-48,="" ighv3-74,="" ighv{{37}="" }},="" ighv4-59,="" ighv4-61,="" ighv5-51)="" ที่เวลา="" 24="" ผ่านการแก้ไขการทดสอบหลายรายการจาก="" false="" discovery="" rate="" (fdr)="" ที่น่าสนใจคือ="" เราพบว่า="" ighv3-23="" เป็นยีนที่มีนัยสำคัญและมีความอุดมสมบูรณ์มากที่สุดในทั้งสามจุดเวลาในการเปรียบเทียบ="" np="" กับ="" pr="" (เวลา="" 0:="" ค่า="" p-value="0.04" เวลา="" 6:="" p-="" ค่า="0.003" เวลา="" 24:="" ค่า="" p="0.02)" (รูปที่="" 6d)="" นอกจากนี้="" เราประเมินว่าลำดับ="" ighv3-23="" นั้นแสดงเกินในลำดับที่ใช้ร่วมกันจากการวิเคราะห์โคลนครั้งก่อนหรือไม่="" เราพบว่าโดยใช้การวิเคราะห์การเพิ่มสมรรถนะด้วยการทดสอบที่แน่นอนของฟิชเชอร์="" ว่าลำดับ="" ighv3-23="" มีการแสดงให้เห็นมากเกินไปอย่างมีนัยสำคัญในทั้งสอง="" สำเนาถาวรที่ใช้ร่วมกันระหว่างบุคคล="" (ตารางเสริม="" 2)="" (ค่า="" p="">< 2.2="" ×="" 10="" −="" 16="" )="" และโคลนที่เกี่ยวข้องกับผลลัพธ์ทางคลินิก="" ณ="" เวลา="" 24="" (ตารางเสริม="" 1)="" (ค่า="" p="">< 2.2="" ×="" 10–="" 16)="" เราสังเกตว่าบุคคลที่="" 9="" ในกลุ่ม="" nr="" ซึ่งพบว่ามีการแบ่งปันสำเนาถาวรบางส่วนกับผู้ก้าวหน้าในการวิเคราะห์ครั้งก่อน="" ซึ่งจัดประเภทไว้กับกลุ่ม="" pr="" ตลอดเวลา="" ไม่มีผลกระทบต่อข้อมูลจากตัวแปรทางประชากรศาสตร์และทางคลินิกต่างๆ="" เช่น="" อายุผู้รับ="" เพศ="" เชื้อชาติ="" แหล่งผู้บริจาค="" ประเภทของภูมิคุ้มกันบกพร่อง="" hla="" ไม่ตรงกัน="" และสาเหตุของภาวะไตวาย="" นอกจากนี้="" ยีนนี้ยังพบว่ามีนัยสำคัญทั้งในไอโซไทป์ของ="" igm="" (ค่า="" p="" [การถดถอยเชิงเส้น]="0.008)" และ="" igd="" (ค่า="" p="" [การถดถอยเชิงเส้น]="0.05)" ขึ้นอยู่กับ="" cdna="" ที่="" 24="" เดือนหลังการปลูกถ่าย="" โดยสอดคล้องกับผลลัพธ์ก่อนหน้านี้ซึ่งแสดงให้เห็นความสอดคล้องกับไอโซไทป์ทั้งสองนี้ที่ได้รับการเสริมสมรรถนะมากที่สุดในกลุ่ม="" pr="" พบยีนอื่นเพียงสามยีนที่มีนัยสำคัญในการวิเคราะห์="" cdna="" และทั้งหมดอยู่ที่="" 24="" เดือนหลังการปลูกถ่ายในไอโซไทป์ของ="" igd="" และ="" igm="" (ighv3-15="" และ="" ighv4-="" 61="" ใน="" igd="" และ="" ighv4-39="" ใน="">
การอภิปราย
ความหลากหลายเป็นลักษณะสำคัญของระบบภูมิคุ้มกัน และในมนุษย์ที่มีสุขภาพดี มีความสำคัญต่อเชื้อโรคในการจัดการกับโรคต่างๆ ในการปลูกถ่ายอวัยวะ การจัดการการรักษาโดยเจตนาได้รับการกำหนดทางคลินิกเพื่อให้อวัยวะภายนอกถูกละเลยหรือยอมรับโดยระบบภูมิคุ้มกันของผู้ป่วยเองอย่างแข็งขันว่าจะไม่เพิ่มการตอบสนองของ alloimmune ซึ่งนำไปสู่การปฏิเสธ บีเซลล์เป็นองค์ประกอบที่สำคัญของกระบวนการนี้ และได้แสดงให้เห็นโดยกลุ่มของเราและคนอื่นๆ ว่าเป็นส่วนสำคัญในการนำเสนอแอนติเจน32,33 และการผลิตอัลโลแอนติบอดี34,35 ในงานนี้ เราได้ใช้การจัดลำดับ B-cell ที่มีปริมาณงานสูงเพื่อทำความเข้าใจความหลากหลายและการโคลนของเซลล์ B ในไตการไหลเวียนของผู้รับการปลูกถ่าย ทั้งก่อนการปลูกถ่ายและหลังจากติดตามผล 24 เดือน โดยมีการประเมินระยะยาวของรายการภูมิคุ้มกันบีเซลล์ โดยรวมแล้ว การวิเคราะห์ของเราแสดงให้เห็นถึงความหลากหลายของบีเซลล์ที่สูงขึ้นก่อนการปลูกถ่าย ความแตกต่างตามยาวโดยมีความหลากหลายลดลงพร้อมกับการขยายตัวของโคลน และการใช้ยีน IGHV ที่เพิ่มขึ้นในกลุ่มผู้ที่ปฏิเสธการปลูกถ่าย
ความต้องการทางคลินิกที่ไม่ได้รับการตอบสนองที่สำคัญในการปลูกถ่ายอวัยวะคือการขาดการคาดการณ์การบาดเจ็บจากการปลูกถ่ายและผลลัพธ์ที่ไม่ดีโดยไม่เป็นอันตราย มีความละเอียดอ่อน และแม่นยำ งานนี้ซับซ้อนโดยข้อเท็จจริงที่ว่ามีหลายปัจจัยที่ส่งผลต่อการอยู่รอดของการรับสินบน36 ในการศึกษานี้ เราพบว่าบุคคลที่มีความเสถียรมีความหลากหลายของรายการเพลงภูมิคุ้มกัน B-cell ที่ลดลงก่อนการปลูกถ่ายเมื่อเปรียบเทียบกับผู้ที่ปฏิเสธอวัยวะ ขั้นตอนต่อไปควรเป็นการแสดงคุณค่าการทำนายของความหลากหลายของรายการเพลง B-cell ให้ตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่ดีกว่าสำหรับการทำนายการปฏิเสธก่อนการปลูกถ่าย และความเป็นไปได้ของการดำเนินการในการดูแลทางคลินิกและตัวเลือกการกดภูมิคุ้มกันก่อนและหลังไตการปลูกถ่าย หากคุณลักษณะนี้เป็นผลมาจากปัจจัยใดๆ ที่ส่งผลต่อการลดลงของความหลากหลายในบุคคลที่มีความมั่นคง เช่น ปัจจัยด้านสิ่งแวดล้อมหรือพันธุกรรม เราไม่เพียงแต่สามารถคาดการณ์การปฏิเสธได้เท่านั้น แต่ยังป้องกันได้ด้วย อันที่จริง การค้นพบล่าสุดแสดงให้เห็นว่าการแปรผันของระบบภูมิคุ้มกันนั้นเกิดจากปัจจัยด้านสิ่งแวดล้อมและพันธุกรรม37,38 ในการศึกษาของเรา เราไม่พบความสัมพันธ์ใดๆ กับลักษณะทางประชากรศาสตร์และทางคลินิกอื่นๆ ของผู้ป่วย (อายุ เพศ เชื้อชาติ การกดภูมิคุ้มกัน แหล่งที่มาของอวัยวะ HLA ไม่ตรงกัน และ ESRD) ในเรื่องนี้ เราจำเป็นต้องมีการวิเคราะห์ใหม่เพื่อยืนยันว่าปัจจัยเฉพาะส่งผลต่อความหลากหลายของรายการเพลงบีเซลล์และผลลัพธ์ของการปลูกถ่ายหรือไม่
การค้นพบที่น่าสนใจอีกประการหนึ่งในการศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่ารายการภูมิคุ้มกันทำงานแตกต่างกันไปตามช่วงเวลา ขึ้นอยู่กับกลุ่มผลลัพธ์ทางคลินิก สำหรับผู้ที่แสดงการปฏิเสธอวัยวะหลังการปลูกถ่าย ความหลากหลายของเซลล์บีในขั้นต้นจะสูงขึ้นและลดลงเมื่อเวลาผ่านไป ในขณะที่แนวโน้มความหลากหลายแบบย้อนกลับจะเห็นได้ในผู้ป่วยที่ไม่เกิดการปฏิเสธหรือการบาดเจ็บจากการต่อกิ่งเรื้อรัง แม้ว่าบุคคลทุกคนจะได้รับการกดภูมิคุ้มกันที่เท่ากันหลังการปลูกถ่าย คำอธิบายที่เป็นไปได้บางประการสำหรับความหลากหลายที่ลดลงในผู้ป่วยที่ได้รับการปฏิเสธอาจเกี่ยวข้องกับข้อเท็จจริงที่ว่าผู้ป่วยเหล่านี้ได้รับการกดภูมิคุ้มกันเพิ่มขึ้นอย่างมากชั่วคราวสำหรับการรักษาการปฏิเสธและจากนั้น จะถูกเก็บไว้บนพื้นฐานที่สูงขึ้น แม้ว่าสิ่งนี้สามารถอธิบายการลดลงของความหลากหลายของบีเซลล์เมื่อเวลาผ่านไป และอธิบายความแตกต่างในช่วง 24 เดือนหลังการปลูกถ่าย แต่ก็ไม่น่าจะเป็นสาเหตุ เนื่องจากความหลากหลายที่ลดลงในกลุ่ม PR คือ
รูปที่ 6 Heatmap และ boxplot สำหรับการวิเคราะห์การใช้ยีน IGHV แผนที่ความร้อนที่แสดงยีน IGHV ที่เลือกเป็นค่านัยสำคัญในนาม (ค่า P < 0.05)="" ที่เวลา="" 0="" (a),="" 6="" (b)="" และ="" 24="" (c)="" สำหรับ="" np="" เทียบกับการประชาสัมพันธ์="" มาตราส่วนสีแดงแสดงถึงการแสดงออกของยีนแต่ละตัวในกลุ่มตัวอย่าง="" แถบด้านบนแสดงผลลัพธ์ทางคลินิกและสาเหตุของ="" esrd="" boxplot="" แสดงนิพจน์="" ighv3-23="" ข้ามจุดเวลาสำหรับ="" np="" เทียบกับ="" pr="" (เวลา="" 0:="" ค่า="" p="0.04" เวลาที่="" 6:="" ค่า="" p="0.003" เวลา="" 24:="" p="" -value="0.02)" (ง)="" แถบภายในกล่องแสดงถึงค่ามัธยฐาน="" กล่องกำหนดช่วงระหว่างควอไทล์="" (iqr)="" และเครากำหนดควอร์ไทล์ที่หนึ่งและสาม="" ±="" 1.5="" ×="" iqr="" ค่า="" p="" ได้มาจากการปรับแบบจำลองการถดถอยเชิงเส้นโดยพิจารณาว่ายีน="" v="" เป็นตัวแปรตามและผลลัพธ์ทางคลินิกเป็นตัวแปรอิสระ="" (n="12" ตัวอย่าง)="">
ยังพบเห็นได้ในช่วง 6 เดือนหลังการปลูกถ่าย ซึ่งเป็นช่วงเวลาที่ผู้ป่วยยังไม่พัฒนาการปฏิเสธ ซึ่งบ่งชี้ว่ากระบวนการทำงานอื่นๆ มีแนวโน้มที่จะมีส่วนร่วม การสังเกตการขยายตัวของโคลนแบบคัดเลือกที่มีโคลนเด่นมากกว่าเฉพาะในผู้ป่วยที่พัฒนาทั้งการปฏิเสธและ/หรือเรื้อรังแบบก้าวหน้าไตการบาดเจ็บจากการปลูกถ่าย เสนอแนะการเลือกที่เกี่ยวข้องทางชีวภาพ การคงอยู่ และการขยายตัวของโคลนบางตัวที่เกี่ยวข้องทางชีวภาพ การคงอยู่ และการขยายตัวของโคลนบางตัวเมื่อเวลาผ่านไป ซึ่งทำให้ความหลากหลายโดยรวมลดลงโดยรวม แม้ว่าเราสามารถตั้งสมมติฐานได้ว่าการขยายตัวของโคลนเหล่านี้น่าจะเชื่อมโยงกับการบาดเจ็บของอัลโลมมูนต่อการปลูกถ่าย หลักฐานโดยตรงที่แสดงว่าการขยายตัวของโคลนเหล่านี้คืออัลโลมมูนจำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมในหลอดทดลองและในสัตว์ทดลอง
การปฏิเสธอย่างเฉียบพลันยังคงเป็นปัจจัยลบที่แข็งแกร่งที่สุดสำหรับการอยู่รอดของการปลูกถ่ายในระยะยาว แม้ว่าจะมีการปรับปรุงอย่างรวดเร็วในการรักษาด้วยภูมิคุ้มกันก็ตาม39,40 การศึกษานี้ยังพบความสัมพันธ์ของการใช้ยีน IGHV บางส่วนกับการปฏิเสธ แม้ว่าควรมีการสำรวจการเชื่อมโยงเชิงสาเหตุในการศึกษาในอนาคต IGHV3-23 เป็นยีนที่น่าสนใจที่สุดในการวิเคราะห์ gDNA เนื่องจากมีการใช้ในผู้ป่วยที่พัฒนาการปฏิเสธในทุกจุดเวลาที่วัดได้อย่างมีนัยสำคัญ เนื่องจากมีการแสดงออกมากเกินไปในสำเนาพันธุ์ถาวรที่ใช้ร่วมกันระหว่างบุคคลและโคลนที่อุดมไปด้วย ปฏิเสธผู้ป่วยใน 24 เดือนหลังการปลูกถ่าย ยีนนี้ยังได้รับการตรวจสอบที่ 24 เดือนหลังการปลูกถ่ายทั้งในไอโซไทป์ของ IgD และ IgM ในการวิเคราะห์ cDNA IGHV3-23 มีความสัมพันธ์อย่างกว้างขวางกับการพยากรณ์โรคที่ไม่ดีในมะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิดลิมโฟซิติกเรื้อรัง41 และได้รับการแสดงว่าลำดับ IGHV3-23 ส่วนใหญ่ยังคงความสามารถในการไกล่เกลี่ยอันตรกิริยาของซูเปอร์แอนติเจน42 ซูเปอร์แอนติเจนของบีเซลล์ถูกผลิตโดยไวรัสและแบคทีเรีย ซึ่งทราบว่าจับกับอิมมูโนโกลบูลินนอกไซต์ซึ่งจับแอนติเจนทั่วไป43 การเผชิญหน้าของบีเซลล์ที่มีซูเปอร์แอนติเจนได้แสดงให้เห็นแล้วว่าสามารถกระตุ้นการเพิ่มจำนวน การกระตุ้น การย้ายถิ่น และการลบ 44 ในการปลูกถ่ายไตมีโอกาสได้รับเชื้อไวรัสและแอนติเจนของแบคทีเรียอย่างต่อเนื่อง ซึ่งเกี่ยวข้องกับสาเหตุของ primary vesicoureteric reflux อันเป็นสาเหตุของ ESRD หรือรองปัสสาวะ reflux ภายหลังการปลูกถ่ายท่อไตเทียม หรือ reflux หลังจากติดเชื้อทางเดินปัสสาวะ ความเสี่ยงของ ซึ่งจะเพิ่มขึ้นเมื่อมีการกดภูมิคุ้มกันแบบเรื้อรังหลังการปลูกถ่าย เราปรับผลการวิเคราะห์หาสาเหตุของภาวะไตวาย ท่ามกลางปัจจัยทางคลินิกและข้อมูลประชากรอื่นๆ ผลลัพธ์ที่กล่าวถึงก่อนหน้านี้ยังคงมีนัยสำคัญแม้ว่าเราจะตระหนักว่าผู้ป่วยที่จำแนกประเภท NP ผิดในการวิเคราะห์ (รูปที่ 6) มีโรค reflux เฉิงและคณะ ก่อนหน้านี้ยังพบว่าโคลนในเนื้อเยื่อชิ้นเนื้อของผู้รับการปลูกถ่ายไตที่แทรกซึมโดยเซลล์บีมียีน IGHV3-23 เด่นกว่าในกลุ่มอื่นๆ45 Grover et al.46 แสดงให้เห็นว่าแอนติบอดีสำหรับยีนเฉพาะนี้ไม่รู้จักแอนติเจน HLA ของผู้บริจาค แต่เป็นเฉพาะสำหรับ E. coli และ Modena et al.47 แสดงให้เห็นว่าภาระของจำนวนแบคทีเรียในปัสสาวะนั้นสูงขึ้นมากในผู้ป่วยที่เป็นโรค interstitial fibrosis และ tubular atrophy มากกว่าพวกที่มีการต่อกิ่งที่ทำงานได้ดี เราขยายผลการค้นพบเหล่านี้ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการใช้ยีน IGHV3-23 นั้นสูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในผู้ป่วยที่ปฏิเสธหลายรายในเลือดส่วนปลาย และอาจเกี่ยวข้องกับแอนติเจนทั่วไปบางตัวในการขับเคลื่อนการปฏิเสธ ในอนาคต การแสดงออกของ IGHV3-23 อาจถูกนำมาใช้เพื่อตรวจสอบการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันต่อการปลูกถ่ายไต.
การขยายการศึกษาของเราโดยใช้การจัดลำดับ cDNA เราสามารถทำซ้ำผลลัพธ์ส่วนใหญ่ของเราในสองไอโซไทป์ (IgM และ IgD) ซึ่งแสดงให้เห็นความหลากหลายก่อนการปลูกถ่ายใน NP ซึ่งเป็นสองสิ่งที่สำคัญที่สุดในการวิเคราะห์ตามยาวโดยมีการขยายตัวและโดดเด่นกว่า โคลนในการวิเคราะห์เครือข่ายและการจำลองยีน IGHV3-23 แอนติบอดีตัวแรกที่ผลิตขึ้นในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกายมักจะเป็น IgM และก้าวหน้าไปอย่างรวดเร็วในการผลิตไอโซไทป์ที่แตกต่างกันทั้งหมด, IgD, IgA, IgG และ IgE แต่ความสนใจเป็นพิเศษนั้นต้องการ IgD isotype48 IgD แสดงร่วมกับ IgM และมี IgD ที่หลั่งออกมาและมีหน้าที่ในเลือด การหลั่งของเยื่อเมือก และบนพื้นผิวของเซลล์ภูมิคุ้มกันโดยกำเนิด เช่น basophils49 Basophils คือเซลล์สีขาวที่ต่อสู้กับไวรัส แบคทีเรีย ปรสิต และเชื้อรา และเกี่ยวข้องกับโรคไตและการปฏิเสธการปลูกถ่าย50 ดังนั้นหลักฐานอื่นที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองของ B-cell ต่อกระบวนการปฏิเสธด้วยไวรัสและแบคทีเรีย
จำเป็นต้องมีการศึกษาในอนาคตเพื่อแสดงให้เห็นว่าการกระตุ้นนี้เกิดจากความแตกต่างในไมโครไบโอมของผู้รับซึ่งมีผลต่อการวินิจฉัยและการรักษา
การศึกษานี้ช่วยให้เราสามารถระบุความเกี่ยวข้องของสำเนาพันธุ์ BCR เหล่านี้บางส่วน ระบุสำเนาพันธุ์ BCR ของความเกี่ยวข้องทางคลินิกกับการปฏิเสธ allograft และแสดงให้เห็นว่ามีความเกี่ยวข้องของสำเนาพันธุ์เหล่านี้ที่มีภูมิคุ้มกันต่างกัน เนื่องจากการเสริมคุณค่าของสำเนาพันธุ์เหล่านี้ในผู้ป่วยที่มี อาณานิคมของทางเดินปัสสาวะก่อนการปลูกถ่ายและความเกี่ยวข้องทางชีวภาพต่อการตอบสนองของเชื้อโรค ความเข้าใจที่ดีขึ้นเกี่ยวกับพฤติกรรมของละครภูมิคุ้มกันในไตการปลูกถ่ายจะไม่สามารถทำได้หากไม่มีการใช้ BCRSeq ร่วมกับการใช้งานไปป์ไลน์การคำนวณและสถิติที่มีประสิทธิภาพ อย่างไรก็ตาม มีข้อจำกัดหลายประการในแนวทางของเราที่ควรทราบ: ประการแรก ขนาดกลุ่มตัวอย่างของเราได้รับการคัดเลือกมาเป็นอย่างดีและค่อนข้างเล็กในกลุ่มผู้ป่วยเด็ก และแม้ว่าเราจะบรรลุถึงความสำคัญทางสถิติในการวิเคราะห์และตรวจสอบในแหล่งข้อมูลที่แตกต่างกันสองแหล่ง จำเป็นต้องมีการวิเคราะห์เพิ่มเติมเพื่อยืนยันผลลัพธ์ของเรา ประการที่สอง ผลลัพธ์ของเราไม่ได้รับการยกเว้นจากอิทธิพลที่อาจมีการสุ่มตัวอย่างทางชีวภาพและทางเทคนิคในการวิเคราะห์ของเรา การวัดความหลากหลายขึ้นอยู่กับประเด็นหลายประการ: ข้อเท็จจริงที่ว่ามีเพียงเศษเสี้ยวของพันล้านเซลล์ในละครเท่านั้นที่แสดงในตัวอย่าง ความแตกต่างในความลึกของการจัดลำดับ และข้อผิดพลาดในการทดลองที่อาจเกิดขึ้นได้ เราได้ควบคุมปัญหาเหล่านี้อย่างครอบคลุม ครั้งแรกในห้องปฏิบัติการ โดยใช้เลือดในปริมาณเท่ากันสำหรับแต่ละตัวอย่างในชุดเดียวกันและครั้งที่สอง โดยคำนวณและทางสถิติ โดยใช้เครื่องมือ recon เพื่อประเมินรายการเพลงโดยรวมและทำการสุ่มตัวอย่างเพื่อควบคุมความลึกของลำดับ และข้อผิดพลาดในการทดลอง ประการที่สาม เราได้ดำเนินการ BCRSeq โดยใช้แหล่งที่มาที่แตกต่างกันสองแหล่ง คือ gDNA และ cDNA การจัดลำดับ gDNA อำนวยความสะดวกในการประมาณการโคลนของลำดับ Ig ที่กำหนด เนื่องจากจำนวนของการอ่านลำดับจะเป็นสัดส่วนกับจำนวนของโมเลกุล gDNA การจัดลำดับ cDNA ให้ค่าประมาณของระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ของลำดับ Ig ต่างๆ ในละคร มีการแสดงให้เห็นว่าสำหรับตัวรับ T-cell การแสดงลักษณะเฉพาะของโคลนที่ทำบน cDNA นั้นไม่ดีเท่าใน gDNA ที่แสดงว่าสัดส่วนสัมพัทธ์ของสำเนาพันธุ์แต่ละตัวแตกต่างกันอย่างมาก15 หรือการติดตามของสำเนาพันธุ์เฉพาะของ HIV นั้นประสบความสำเร็จกับ gDNA เท่านั้น แต่ ไม่ใช่ mRNA51 ประการที่สี่ ผลกระทบของการกดภูมิคุ้มกันอาจเป็นปัจจัยที่ทำให้เกิดความสับสนในการวิเคราะห์ประเภทนี้ ในการศึกษานี้ ตัวอย่างทั้งหมดมาจากการทดลองทางคลินิกซึ่งผู้ป่วยทุกรายได้รับแรงกดภูมิคุ้มกันเท่ากันหลังการปลูกถ่าย อย่างไรก็ตาม เราควบคุมโดยทั้งสองประเภทที่ใช้สเตียรอยด์และปราศจากสเตียรอยด์เพื่อให้แน่ใจว่านี่ไม่ใช่ปัญหา โดยไม่ได้สังเกตความแตกต่างในผลลัพธ์ สุดท้าย กลุ่มประชากรตามรุ่นที่เรานำเสนอคือกลุ่มการปลูกถ่ายในเด็ก ลักษณะทางคลินิกที่ปลูกถ่ายส่วนใหญ่มีความคล้ายคลึงกันในเด็กและผู้ใหญ่ การลดภูมิคุ้มกันและรูปแบบการปกครองที่ใช้มีความคล้ายคลึงกัน creatinine เป็น biomarker ในซีรัมที่สำคัญ การปฏิเสธอย่างเฉียบพลันถูกกำหนดโดยการตรวจชิ้นเนื้อโดยใช้เกณฑ์ Banff และกลไกการปฏิเสธของไตการปลูกถ่ายอวัยวะโดยทั่วไปมีความคล้ายคลึงกัน52 ดังนั้นงานวิจัยส่วนใหญ่ที่ทำในผู้ใหญ่หรือเด็กอาจนำไปใช้กับทั้งสองอย่าง อย่างไรก็ตาม ด้านอื่น ๆ เช่น การไม่ปฏิบัติตาม/ไม่ยึดติดกับการกดภูมิคุ้มกัน, ด้านภูมิคุ้มกัน, โรคไตปฐมภูมิ, ที่นำไปสู่ภาวะไตวาย, มักเกี่ยวข้องกับปัญหาระบบทางเดินปัสสาวะ, และการสร้างภูมิคุ้มกันที่จำเป็นก่อนการปลูกถ่ายอาจแตกต่างกัน ดังนั้นการวิเคราะห์เพิ่มเติมใน ประชากรที่เป็นผู้ใหญ่จะมีความจำเป็นในการสรุปผลการค้นพบเหล่านี้
แม้จะมีข้อจำกัดเหล่านี้ ข้อมูลของเราเปิดเผยว่ามีความหลากหลายก่อนการปลูกถ่ายที่สูงขึ้นในบุคคลที่ปฏิเสธอวัยวะ ซึ่งบ่งบอกถึงแนวโน้มที่จะปฏิเสธ ซึ่งอาจมีผลกระทบในอนาคตในการทำนายความเสี่ยงของการถูกปฏิเสธก่อนการปลูกถ่าย การเลือกกดภูมิคุ้มกัน และการดูแลทางคลินิก การปฏิบัติ หลังจาก 24 เดือนของการติดตามผล ความหลากหลายโดยรวมลดลงเมื่อเวลาผ่านไปพร้อมกับการคงอยู่และการขยายตัวของโคลนบางตัวและการใช้ยีน IGHV หลายตัวที่สูงขึ้นในกลุ่มการปฏิเสธ ซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับแอนติเจนทั่วไปบางตัวในการขับเคลื่อนการปฏิเสธ มีความสนใจเป็นพิเศษสำหรับการใช้ยีน IGHV3-23 ที่เพิ่มขึ้นในกลุ่มผู้ป่วยที่ถูกปฏิเสธ เนื่องจากก่อนหน้านี้มีความเกี่ยวข้องกับไตการปลูกถ่ายและอาจเป็นองค์ประกอบสำคัญในการขับเคลื่อนกระบวนการปฏิเสธ งานนี้นำเสนอการวิเคราะห์ระยะยาวของรายการภูมิคุ้มกัน B-cell ในการปลูกถ่ายอวัยวะที่ส่งเสริมการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อยืนยันการค้นพบเหล่านี้ เนื่องจากอาจมีนัยทางคลินิกในการทำนาย การควบคุม ติดตาม และการรักษาไตการปฏิเสธ
วิธีการ
เรียนออกแบบ. เราศึกษา 81 ตัวอย่างสำหรับ gDNA และ 56 ตัวอย่างที่ตรงกันสำหรับ cDNA ตามยาวที่เวลา 0, 6 และ 24 เดือนจากจำนวนผู้รับเด็กทั้งหมด 27 รายที่ได้รับการตรวจปฐมภูมิไตการปลูกถ่าย อาสาสมัครในการศึกษานี้มาจากการทดลองทางคลินิก (การศึกษาแบบหลายศูนย์ของ SNSO1) โดยสุ่มตัวอย่าง (1:1) ไปสู่ระบบกดภูมิคุ้มกันที่ใช้สเตียรอยด์ในขนาดต่ำแบบดั้งเดิม (สเตียรอยด์ การชักนำ daclizumab มาตรฐานจนถึงเดือนที่สองหลังการปลูกถ่าย และการบำรุงรักษาภูมิคุ้มกันด้วยยาทาโครลิมัส (Prograf, Astellas Pharma) และ MMF (CellCept, Hoffman-La Roche) หรือวิธีกดภูมิคุ้มกันที่ปราศจากสเตียรอยด์ (การชักนำ daclizumab เป็นเวลานานจนถึงเดือนที่ 6 หลังการปลูกถ่าย tacrolimus และ MMF) ทุกวิชาเป็น ลงทะเบียนตามการอนุมัติของ IRB และแจ้งความยินยอม ในการศึกษานี้ ผู้ป่วย 14 รายได้รับระบบการหลีกเลี่ยงสเตียรอยด์ ขณะที่ 13 รายได้รับยาต้านภูมิคุ้มกันแบบสเตอรอยด์53 และไม่มีผู้ป่วยรายใดรายนี้ได้รับการกดภูมิคุ้มกันก่อนการปลูกถ่ายเนื่องจากเป็นเกณฑ์การยกเว้นหนึ่งข้อ ประกอบด้วยคอร์ติโคสเตียรอยด์ทางเส้นเลือด 3 ครั้ง (10 มก./กก.) และการกดภูมิคุ้มกันแบบพื้นฐาน
ตัวอย่างทั้งหมดที่ใช้ในการศึกษามีการตรวจชิ้นเนื้อ allograft แบบอนุกรมที่เกี่ยวข้อง ซึ่งอ่านโดยนักพยาธิวิทยาส่วนกลาง โดยใช้คะแนนเนื้อเยื่อเชิงปริมาณกึ่งเชิงปริมาณ การปฏิเสธแบบเฉียบพลันทางคลินิกถูกกำหนดให้เป็นเหตุการณ์การปฏิเสธแบบเฉียบพลัน ซึ่งสัมพันธ์กับความผิดปกติของการต่อกิ่ง โดยอิงจากค่าครีเอตินินในซีรัมที่เพิ่มขึ้นมากกว่า 10 เปอร์เซ็นต์จากค่าพื้นฐาน และยืนยันผ่านการอ่านทางพยาธิวิทยาส่วนกลางของการตรวจชิ้นเนื้อตามการจำแนกประเภท Banff ที่ปรับปรุงใหม่23,24 การบาดเจ็บ allograft เรื้อรังถูกกำหนดโดยใช้คะแนนดัชนีความเสียหาย allograft เรื้อรัง (CADI) ผู้ป่วยถูกจำแนกในผลลัพธ์ทางคลินิกสามประการที่กำหนดโดยคะแนน CADI และตอนการปฏิเสธ Non-progressors (NP) มีคะแนน CADI แบบไม่เพิ่มขึ้นต่ำในการตรวจชิ้นเนื้อต่อเนื่องสามครั้งในช่วง 2 ปี โดยไม่มีการปฏิเสธเฉียบพลัน ผู้ป่วยที่ลุกลามโดยไม่มีการปฏิเสธ (PNR) มี CADI สูงกว่า คะแนนในการตรวจชิ้นเนื้อต่อเนื่องเป็นเวลา 2 ปีและเพิ่มขึ้นตามจุดเวลาโดยไม่มีการปฏิเสธและความก้าวหน้าที่มีการปฏิเสธ (PR) มีคะแนน CADI สูงที่เพิ่มขึ้นในการตรวจชิ้นเนื้อต่อเนื่องในช่วง 2 ปีที่มีตอนการปฏิเสธ ผู้ป่วยเหล่านี้ได้รับการคัดเลือกอย่างระมัดระวังจากกลุ่มผู้ป่วยที่ใหญ่กว่า 120 ราย จับคู่กับตัวแปรทางประชากร และสำหรับ NP ทั้งหมด และ PNR ไม่มีหลักฐานการทำลายเนื้อเยื่อชิ้นเนื้อหรือการบาดเจ็บที่ไม่แสดงอาการที่วัดโดยแอนติบอดีจำเพาะผู้บริจาคที่ขาดหายไป ไม่มี HLA หรือ haploidentical graft เนื่องจากเป็นเกณฑ์การยกเว้นสำหรับการลงทะเบียน54 ตัวอย่างทั้งหมดถูกรวบรวมจากโครงการปลูกถ่ายในเด็ก 12 โครงการในสหรัฐอเมริการะหว่างปี 2547 ถึง 2549 ภายใต้โปรโตคอลที่อนุมัติโดย IRB การศึกษานี้ยังได้รับการอนุมัติโดย Human Research Protection Program (HRPP) ของมหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนีย ซานฟรานซิสโก และมหาวิทยาลัยสแตนฟอร์ด เพื่อให้สามารถวิเคราะห์ตัวอย่างไบโอแบงค์ได้ ผู้ป่วย/ผู้ปกครองทุกรายให้ความยินยอมโดยแจ้งข้อมูลเพื่อเข้าร่วมการวิจัย โดยปฏิบัติตามปฏิญญาเฮลซิงกิอย่างเต็มที่ กิจกรรมทางคลินิกและการวิจัยที่รายงานนั้นสอดคล้องกับหลักการของปฏิญญาอิสตันบูลดังที่ระบุไว้ในปฏิญญาอิสตันบูลว่าด้วยการค้าอวัยวะและการท่องเที่ยวเพื่อการปลูกถ่าย
การแยก gDNA และ RNA ตัวอย่างเลือด (4.5 มล.) ถูกเก็บในหลอดด้านบนสีแดงขนาด 5 มล. และบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาทีจนเกิดก้อนขึ้น จากนั้นตัวอย่างถูกหมุนเหวี่ยงที่ 2000 × g เป็นเวลา 5 นาทีโดยใช้โรเตอร์ถังแบบแกว่ง ชั้นบนของซีรั่มถูกย้ายไปยัง cryotube อื่นและก้อนถูกเก็บไว้ในหลอดเดียวกันที่ −80 องศาจนกว่าจะใช้ จีโนม DNA จากลิ่มเลือดครบส่วนถูกสกัดโดยใช้ Clotspin Baskets และ Gentra PuregeneBlood Kit (Qiagen, Valencia, CA)
สำหรับการสกัด RNA จากไตการตรวจชิ้นเนื้อเข็ม (Qiagen, Valencia, CA) และเก็บไว้ที่ −80 องศา ; สกัด RNA ทั้งหมดโดยใช้มาสเตอร์มิกซ์ 790 µl TRIzol และ 10 µl ไกลโคเจน ตัวอย่างเนื้อเยื่อถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน บ่มที่ 15 ถึง 25 องศา เป็นเวลา 5 นาที และเติมคลอโรฟอร์ม 160 ไมโครลิตรสำหรับการแยกเฟส ของผสมถูกบ่มอีกครั้งที่ 25 องศา เป็นเวลา 2 นาที ตามด้วยการหมุนเหวี่ยงที่ 4 องศา และใช้สำหรับการแยกอาร์เอ็นเอโดยใช้ RNeasy Micro Kit (แค็ตตาล็อก Qiagen หมายเลข 4004) ปริมาณและความสมบูรณ์ของอาร์เอ็นเอถูกกำหนดด้วยเทอร์โม Scientific NanoDrop ND-2000 UV–Vis Spectrophotometer และ Agilent Bioanalyzer ตามลำดับ
การจัดลำดับเซลล์บี ได้เตรียมปฏิกิริยา PCR แม่แบบ DNA ของจีโนมแล้ว
จาก 100 gDNA aliquots เพื่อสร้างไลบรารีบาร์โค้ดที่เป็นอิสระต่อตัวอย่าง ใช้ไพรเมอร์แบบมัลติเพล็กซ์กับบริเวณเฟรมเวิร์ก IgH J หรือ FR1 หรือ FR2 ตามการออกแบบ BIOMED-255 'ลำดับบาร์โค้ด' สิบนิวคลีโอไทด์ในไพรเมอร์ถูกใช้เพื่อบ่งชี้เอกลักษณ์ของตัวอย่างและทำซ้ำเอกลักษณ์ของคลังสำหรับปฏิกิริยา PCR แต่ละปฏิกิริยา ทำ PCR ด้วย AmpliTaq Gold (Roche) polymerase ด้วยโปรแกรมต่อไปนี้: 94 องศาเป็นเวลา 5 นาที; 35 รอบ (94 องศาสำหรับ 30 วินาที, 60 องศาสำหรับ 45 วินาที, 72 องศาสำหรับ 90 วินาที); และยืดปลายที่ 72 องศา เป็นเวลา 10 นาที ปฏิกิริยา PCR ที่สองถูกดำเนินการเพื่อให้แน่ใจว่าไลบรารีไม่ถูกขยายไปสู่ความอิ่มตัวก่อนที่จะทำเจลบริสุทธิ์และการจัดลำดับ โดยรวมแล้ว 0.4 ul ของผลิตภัณฑ์ PCR ตัวแรกแต่ละอันสร้างแม่แบบของปฏิกิริยา PCR ที่สองโดยใช้ไพรเมอร์ภายนอกจำเพาะสำหรับลำดับตัวเชื่อมโยง 454; การขยายเสียงดำเนินการโดยใช้โปรแกรม: 94 องศาเป็นเวลา 15 นาที, 12 รอบของ (94 องศาเป็นเวลา 30 วินาที, 60 องศาเป็นเวลา 45 วินาที, 72 องศาสำหรับ 90 วินาที) และการขยายครั้งสุดท้ายที่ 72 องศาเป็นเวลา 10 นาที อัตราความผิดพลาดของ AmpliTaq Gold ควรมีผลกระทบน้อยที่สุดต่อการระบุลำดับที่เกี่ยวข้องกับโคลนหรือการประมาณอัตราการกลายพันธุ์ของโซมาติกในลำดับตามที่กล่าวไว้ในที่อื่น56 cDNA ถูกสังเคราะห์จาก RNA ทั้งหมด 300 ng โดยไพรเมอร์โดย hexamers แบบสุ่ม เทมเพลตถูกขยายโดย PCR โดยใช้ไพรเมอร์ Biomed IGHV ในเฟรมเวิร์ก 1 (FR1) และไพรเมอร์เฉพาะไอโซไทป์ที่อยู่ในเอ็กซอนแรกของบริเวณคงที่ ไพรเมอร์ 18,57 เหล่านี้ยังเข้ารหัสประมาณครึ่งหนึ่งของลำดับตัวเชื่อมโยง Illumina ที่จำเป็นสำหรับการสร้างคลัสเตอร์และการจัดลำดับบนเครื่องมือ MiSeq เอกลักษณ์ของตัวอย่างถูกเข้ารหัสโดยบาร์โค้ดตัวระบุมัลติเพล็กซ์แปดนิวคลีโอไทด์ในแต่ละไพรเมอร์ สำหรับการรู้จำคลัสเตอร์ Illumina นิวคลีโอไทด์แบบสุ่มสี่ตัวถูกเข้ารหัสในไพรเมอร์ทันทีหลังจากลำดับตัวเชื่อมโยง Illumina ในไพรเมอร์ของบริเวณคงที่ ไอโซไทป์ของแอนติบอดีแต่ละตัวสำหรับแต่ละตัวอย่างถูกขยายในปฏิกิริยา PCR ที่แยกจากกัน เพื่อป้องกันการก่อตัวของผลิตภัณฑ์ PCR ไคเมอริกของไอโซไทป์ข้ามไอโซไทป์ PCR ดำเนินการด้วย AmpliTaq Gold (Roche) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต และใช้โปรแกรม 94 องศาเป็นเวลา 7 นาที 35 รอบ (94 องศาเป็นเวลา 30 วินาที 58 องศาเป็นเวลา 45 วินาที 72 องศาเป็นเวลา 120 วินาที) และขั้นสุดท้าย ยืดออก 72 องศา 10 นาที ขั้นตอน PCR ที่สองถูกใช้เพื่อเพิ่มส่วนที่เหลือของตัวเชื่อมโยง Illumina เข้ากับแอมพลิคอน และดำเนินการด้วยชุด Qiagen Multiplex PCR (Qiagen) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยใช้ 0.4 ไมโครลิตรของผลิตภัณฑ์ PCR ตัวแรกเป็นแม่แบบใน ปฏิกิริยา 30 ไมโครลิตร โปรแกรม PCR สำหรับขั้นตอน PCR ที่สองคือ 94 องศาเป็นเวลา 15 นาที 12 รอบ (94 องศาเป็นเวลา 30 วินาที 60 องศาเป็นเวลา 45 วินาที 72 องศาเป็นเวลา 90 วินาที) และการขยายสุดท้ายที่ 72 องศาเป็นเวลา 10 นาที ผลิตภัณฑ์ของปฏิกิริยา PCR แต่ละปฏิกิริยาถูกรวมเข้าด้วยกันในปริมาณที่เท่ากันโดยประมาณ อิเล็กโตรโฟรีสบนเจล agarose และเจลที่สกัดด้วยชุดเครื่องมือ QIAquick (Qiagen) การจัดลำดับปริมาณงานสูงของไลบรารีเทมเพลต DNA ของจีโนมได้ดำเนินการบนแพลตฟอร์ม 454 (Roche) โดยใช้เคมีไททาเนียม การจัดลำดับไลบรารี cDNA ดำเนินการบนเครื่องมือ Illumina MiSeq โดยใช้ 600-ชุดเครื่องมือจัดลำดับวงจร รายการไพรเมอร์ทั้งหมดที่ใช้กับ MiSeq (M154 และ M155) และ 454 Titanium (T7) รวมอยู่ในข้อมูลเสริม 1
การอ่านหาลำดับถูกประมวลผลดังนี้: การอ่านแบบปลายคู่ถูกผสานโดยใช้ FLASH58 โดยที่หลังจากลำดับถูกแยกส่วนและตัดแต่งบาร์โค้ดและลำดับไพรเมอร์ IGHV บริเวณ V, D และ J และจุดเชื่อมต่อ V–D (N1), D–J (N2) ถูกระบุโดยใช้โปรแกรมการจัดตำแหน่ง IgBLAST59 ลำดับถูกกรองเพื่อเอาสิ่งประดิษฐ์ที่ไม่ใช่ IGH ออก ลำดับที่มีการแทรกหรือลบยีน V ลำดับไคเมอริก และลำดับที่ไม่ทำงาน ในระดับตัวอย่าง เราไม่รวมผู้ที่มี<100 clones="" (defined="" by="" same="" v="" and="" j="" segments,="" same="" cdr3="" length,="" and="" 90%="" nucleotide="" identity)="" as="" a="" control="" for="" bad="" quality="" samples.="" after="" quality="" control,="" for="" gdna,="" we="" had="" complete="" longitudinal="" data="" for="" 69="" samples="" at="" times="" 0,="" 6,="" and="" 24="" with="" a="" total="" number="" of="" 327,703="" reads="" (mean="" 4045="" per="" sample).="" for="" cdna,="" we="" had="" complete="" data="" for="" 55="" matched="" samples,="" although="" no="" time="" 0="" samples="" were="" further="" available.="" in="" this="" case,="" we="" had="" isotype-="" specific="" information="" (1,773,330="" reads="" for="" igd="" (31,667="" per="" sample),="" 1,708,227="" reads="" for="" igm="" (30,504="" per="" sample),="" 973,444="" reads="" for="" iga="" (17,383="" per="" sample),="" 139,7345="" reads="" for="" igg="" (24,953="" per="" sample),="" and="" 29,000="" reads="" for="" ige="" (5,178="" per="">
การวิเคราะห์ความหลากหลาย ความหลากหลายวัดจากความสมบูรณ์ของสายพันธุ์โดยพิจารณาจากจำนวนโคลนต่อตัวอย่าง การวัดนี้ไม่ได้พิจารณาถึงความถี่ของแต่ละสปีชีส์ เราจึงใช้แชนนอนเอนโทรปี (H) เพื่อวัดความหลากหลายที่ให้
ข้อมูลเกี่ยวกับการกระจายขนาดของชนิดพันธุ์ในประชากร H ถูกกำหนดเป็น:
โดยที่ N คือจำนวนโคลนที่ไม่ซ้ำกันและ pi คือความถี่ของโคลน i H มีตั้งแต่ 0 (ตัวอย่างที่มีเพียงหนึ่งโคลน) ถึง Hmax ¼ log2N (ตัวอย่างที่มีการกระจายตัวของโคลนอย่างสม่ำเสมอ)
จากนั้น เราใช้แบบจำลองเชิงเส้นตรงทั่วไปเพื่อค้นหาความสัมพันธ์ระหว่างความสมบูรณ์และเอนโทรปีกับผลลัพธ์ทางคลินิก ณ จุดเวลาที่ต่างกัน เราปรับแบบจำลองนี้โดยตัวแปรทางคลินิกทั้งหมดที่แสดงในตารางที่ 1 เพื่อให้แน่ใจว่าลักษณะใด ๆ ของผู้ป่วยเป็นปัจจัยที่ทำให้เกิดความสับสน
ในการสร้างแบบจำลององค์ประกอบตามยาวของข้อมูล เราใช้แบบจำลองผลผสมเชิงเส้นโดยพิจารณาจากแบบจำลองการเติบโตแบบมีเงื่อนไขดังแสดงในรูปที่ 10 เพิ่มเติม ในการใช้แบบจำลองนี้ เราใช้แพ็คเกจ lme4 ใน R โดยพิจารณาจากปฏิสัมพันธ์ระหว่างผลลัพธ์ทางคลินิกกับเวลา พบกับความเชื่อมโยงกับความร่ำรวยและความหลากหลายโดยที่เวลาเป็นผลแบบสุ่ม
เพื่อจัดการกับความจริงที่ว่ามาตรการความหลากหลายอาจได้รับผลกระทบจากปัญหาของสายพันธุ์ที่หายไป (แสดงเพียงเศษเสี้ยวของพันล้านเซลล์ในละคร) และการจัดลำดับและข้อผิดพลาดจากการทดลอง เราได้ดำเนินการสองกลยุทธ์นอกเหนือจากการวิเคราะห์ข้อมูลทั้งหมด อันดับแรก เราใช้เครื่องมือ Recon (การสร้างโคลนโดยประมาณขึ้นใหม่จากตัวเลขที่สังเกตได้) 29 เพื่อจัดการกับปัญหาของสปีชีส์ที่หายไป Recon เป็นวิธีความเป็นไปได้สูงสุดที่ได้รับการดัดแปลงซึ่งแสดงผลความหลากหลายโดยรวมของรายการจากการวัดบนตัวอย่าง Recon แสดงค่าประมาณที่แม่นยำและแข็งแกร่งของชุดการวัดความหลากหลาย ซึ่งรวมถึงความสมบูรณ์และเอนโทรปี ซึ่งช่วยให้สามารถเปรียบเทียบความหลากหลายระหว่างบุคคลได้อย่างมีประสิทธิภาพ ประการที่สอง เราใช้กลยุทธ์การสุ่มตัวอย่างโดยใช้ชุดย่อยแบบสุ่มของการอ่านสำหรับแต่ละตัวอย่างที่เท่ากับขนาดการจัดลำดับที่เล็กที่สุด ตามด้วยการคำนวณใหม่ของการโคลน B-cell เพื่อปรับตามความลึกของการจัดลำดับและจัดการกับข้อผิดพลาดในการทดลองที่อาจเกิดขึ้น สำหรับ gDNA มีตัวอย่างที่มีการอ่านค่าต่ำมาก ( < 1000)="" และเพื่อหลีกเลี่ยงการสูญเสียลำดับจำนวนมากและความเป็นจริงของข้อมูล="" เราได้แยกตัวอย่างทั้งหมด="" 9=""><1000 reads.="" in="" the="" case="" of="" cdna,="" this="" was="" not="" necessary.="" we="" generated="" ten="" random="" subsamples="" to="" account="" for="" possible="" stochastic="" effects="" and="" performed="" the="" diversity="" analysis="" at="" each="" time="" point="" and="" the="" longitudinal="" data="" analysis="" on="" the="" mean="" value="" of="" ten="" independently="" downsampled="" diversity="">
การวิเคราะห์เครือข่าย อัลกอริธึมการสร้างเครือข่ายคล้ายกับที่กำหนดไว้ก่อนหน้านี้ 31 Briefly จุดยอดแต่ละอันแสดงถึงลำดับ B-cell โดยที่ขนาดถูกกำหนดโดยลำดับที่เหมือนกันทั้งหมด ขอบคำนวณโดยใช้คำจำกัดความของโคลน (ส่วน V และ J เดียวกัน ความยาว CDR3 เท่ากัน และความเหมือนกันของนิวคลีโอไทด์ 90 เปอร์เซ็นต์ระหว่าง CDR3) และคลัสเตอร์เป็นตัวแทนของแต่ละโคลนในละคร การวิเคราะห์เสร็จสิ้นโดยใช้แพ็คเกจกราฟใน R โดยใช้เลย์เอาต์_พร้อม_ตัวเลือกกราฟเพื่อสร้างพล็อต
ในการหาปริมาณเครือข่าย เราคำนวณดัชนี Gini สำหรับขนาดจุดยอดและขนาดคลัสเตอร์ Gini Index เป็นตัวชี้วัดความไม่สม่ำเสมอที่ใช้อย่างกว้างขวางในการวัดการกระจายความมั่งคั่ง มันวัดความไม่เท่าเทียมกันระหว่างค่าของการกระจายความถี่ เราใช้ฟังก์ชัน Gini จากแพ็คเกจเดียวใน R เพื่อคำนวณค่าสัมประสิทธิ์จินีสำหรับขนาดจุดยอดและการกระจายขนาดคลัสเตอร์ ค่าสัมประสิทธิ์จินีของศูนย์แสดงความเท่าเทียมกันที่สมบูรณ์แบบและค่าสัมประสิทธิ์จินีของ 1 แสดงความไม่เท่าเทียมกันสูงสุด
การวิเคราะห์โคลน เพื่อศึกษาสำเนาพันธุ์เฉพาะที่เกี่ยวข้องกับผลลัพธ์ทางคลินิก เราได้สร้างเมทริกซ์ที่มีโคลนทั้งหมดที่มีอยู่ในตัวอย่างมากกว่าหนึ่งตัวอย่าง (จำนวนทั้งหมด=118,223) โดยตัวอย่างทั้งหมดในแต่ละจุดเวลา จากนั้นเราศึกษาความเชื่อมโยงกับผลลัพธ์ทางคลินิกของโคลนแต่ละตัวที่กำหนดตัวแปรหนึ่งตัวต่อหนึ่งโคลนว่ามีอยู่/ไม่มีอยู่ สุดท้าย เราใช้การทดสอบที่แน่นอนของฟิชเชอร์เพื่อพิจารณาความสำคัญในตาราง 2 × 3 สำหรับแต่ละโคลนในแต่ละจุดเวลา เรายังศึกษาโคลนนิ่งการคงอยู่ที่กำหนดโดยโคลนเหล่านั้นที่อยู่ในช่วงเวลามากกว่าหนึ่งจุดในแต่ละบุคคล จากนั้น เพื่อพิจารณาความแตกต่างโดยผลลัพธ์ทางคลินิก เราใช้แบบจำลองเชิงเส้นที่กำหนดจำนวนโคลน (เพื่อวัดความแตกต่างในการคงอยู่) และจำนวนการนับของแต่ละโคลน (เพื่อวัดการขยายตัวของโคลน) และผลลัพธ์ทางคลินิกดังนี้ ตัวทำนายอิสระ
การวิเคราะห์การใช้ยีน IGHV ในการศึกษายีน IGHV เราประเมินการใช้ยีน IGHV ต่อตัวอย่าง เนื่องจากจำนวนครั้งที่ยีนแต่ละตัวถูกใช้ทำให้เป็นมาตรฐานด้วยจำนวนโคลนเพื่อหลีกเลี่ยงการแสดงยีน IGHV บางตัวมากเกินไป สำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติ เราได้กรองยีนเหล่านั้นด้วยการแสดงออกที่ต่ำมาก (การใช้ IGHV/โคลน < {{0}}.05)="" อย่างน้อย="" 10="" เปอร์เซ็นต์ของกลุ่มตัวอย่าง="" โดยรวมแล้ว="" เราวิเคราะห์ยีน="" ighv="" 27="" ยีนที่สอดคล้องกับ="" 63="" ตัวอย่าง="" จากนั้น="" เราใช้แบบจำลองเชิงเส้นเพื่อค้นหายีนที่เกี่ยวข้องกับผลลัพธ์ทางคลินิกในแต่ละช่วงเวลา="" และแก้ไขผลลัพธ์เหล่านี้โดยการทดสอบหลายครั้งโดยใช้="" benjamini="" และ="" hochberg="" fdr="">< 0.05="" เราปรับแบบจำลองนี้ด้วยตัวแปรทางคลินิกทั้งหมดที่แสดงในตารางที่="" 1="" เพื่อให้แน่ใจว่าลักษณะใด="" ๆ="">
สรุปการรายงาน ข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับการออกแบบการวิจัยมีอยู่ในสรุปรายงานการวิจัยธรรมชาติที่เชื่อมโยงกับบทความนี้
อ้างอิง
1.Cai, J.& Terasaki, PI การตรวจติดตามแอนติบอดีหลังการปลูกถ่ายและ HLA 1. (การระบุอีพิโทปของแอนติบอดี Curr.Opin.Immunol. 20,602-606(2008)
2. Sigdel, TKet al.Non-HLA แอนติบอดีต่อ immunogenic epitopes ทำนายวิวัฒนาการของการบาดเจ็บ allograft ของไตเรื้อรัง เป็น. ซ. Nephrol.23,750-763 (2012)
3. Li, L.et al. การแปลเป็นภาษาท้องถิ่นและความเกี่ยวข้องทางคลินิกของแอนติบอดี MICA หลังการปลูกถ่ายไต การปลูกถ่าย 89,312-319(2010).
4. Lamb, KE,Lodhi, S.& Meier-Kriesche, H.-U. การอยู่รอดของไตในระยะยาวในสหรัฐอเมริกา: การประเมินใหม่ที่สำคัญ แอมเจ การปลูกถ่าย 11, 450-462(2011).
5. สำนักทะเบียนวิทยาศาสตร์ของผู้รับการปลูกถ่าย ดูได้ที่: https://rtr. ปลูกถ่าย.hrsa.gov/annual_reports/2012/Default.aspx.(เข้าถึง:24th พฤษภาคม 2018)Pineda, S. et al. แอนติเจนที่ไม่เข้ากันไม่ได้ของนวนิยายที่ไม่ตรงกัน
6. ปรับปรุงความสามารถในการทำนายความเสี่ยงต่อการปฏิเสธโดยอาศัยแอนติบอดีในการปลูกถ่ายไต ด้านหน้า. อิมมูนอล 8,1687(2017).
7. Valuiskikh, A.Baldwin, WM& Fairchild, ความคืบหน้า RLRecent และมุมมองใหม่ในการศึกษาการตอบสนองของ T เซลล์ต่อ allografts แอมเจ การปลูกถ่าย 10, 117-1125 (2010)
8. Zarkhin, V, Chalasani, G.& Sarwal, MM หยินและหยางของเซลล์บีในการปฏิเสธการรับสินบนและความอดทน การปลูกถ่าย Rev.24,67-78(2010).
9. Georgiou, G.et al. คำมั่นสัญญาและความท้าทายของการจัดลำดับปริมาณงานสูงของรายการแอนติบอดีบวก แนท. เทคโนโลยีชีวภาพ.32,158-168(2014)
10. Schroeder, HW ความคล้ายคลึงและความแตกต่างในการพัฒนาและการแสดงออกของละครหนูและแอนติบอดีของมนุษย์ กำลังพัฒนา คอมพ์ อิมมูนอล 30,119-135(2549).
11. Yaari, G.& Kleinstein, SH แนวทางปฏิบัติสำหรับการวิเคราะห์ลำดับเพลงของตัวรับ B-cell จีโนม Med.7,121(2015).
12. Shugay, M. et al. VDJtools: การรวมหลังการวิเคราะห์ของละครรีเซพเตอร์ทีเซลล์ PLOS คอมพิวเตอร์ ไบโอล.11, e1004503 (2015).
13. Alachkar, H.et al. การกำหนดลักษณะเชิงปริมาณของละคร T-cell และ biomarkers ในการปฏิเสธการปลูกถ่ายไต BMC Nephrol.17,181(2016) 14. มอร์ริส H.et al. การติดตาม T เซลล์ที่ตอบสนองต่อผู้บริจาค: หลักฐานการลบโคลนในผู้ป่วยปลูกถ่ายไตที่อดทน วิทย์. แปล ม.7,2772ral0 (2015).
15. Dziubianau, M.et al. การวิเคราะห์รายการเพลง TCR โดยการจัดลำดับยุคหน้าช่วยให้สามารถวินิจฉัยความแตกต่างที่ซับซ้อนของพยาธิสภาพที่เกี่ยวข้องกับทีเซลล์ได้ เป็น. J.Transplant.13,2842-2854 (2013).
16. Palanichamy, A.et al. บีเซลล์ที่สลับคลาสอิมมูโนโกลบูลินสร้างแกนภูมิคุ้มกันที่แอคทีฟระหว่าง CNS และบริเวณรอบนอกในหลายเส้นโลหิตตีบ วิทย์. แปล Med.6, 248ra106-248ra106(2014)
17. Strauli, NB& Hernandez, RD การอนุมานทางสถิติของการตอบสนองต่อแอนติบอดีต่อวัคซีนไข้หวัดใหญ่ จีโนมเมด 8,60(2016).
18. Roskin, KM และคณะ ลำดับ IgH ในภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่องทั่วไปเผยให้เห็นการพัฒนาและการเลือกเซลล์ B ที่เปลี่ยนแปลงไป วิทย์. แปล Med.7,302ra135 (2015).
19.Massart, A. , Ghisdal, L. , Abramowicz, M.& Abramowicz, D. ความอดทนในการผ่าตัดปลูกถ่ายไตและ biomarkers ที่เกี่ยวข้อง คลินิก ประสบการณ์ อิมมูนอล.189,138-157(2017).
20. Beausang, JFet al.B cell repertoires ในผู้ป่วยปลูกถ่ายไตที่ไวต่อ HLA ที่ได้รับการบำบัดด้วย desensitization แปล Med.15, 9(2017).
21. Ferdman, J. et al. การขยายตัวและโซมาติกไฮเปอร์มิวเทชันของโคลนบีเซลล์ในการปลูกถ่ายไตของมนุษย์ที่ถูกปฏิเสธ การปลูกถ่าย 98766-772(2014)
22. วอลเมอร์, C. et al. การตรวจสอบการกดภูมิคุ้มกันที่เกิดจากเภสัชวิทยาโดยการจัดลำดับรายการเพลงเพื่อตรวจหาการปฏิเสธการปลูกถ่ายหัวใจในผู้ป่วยที่ปลูกถ่ายหัวใจ: การศึกษาความแม่นยำในการวินิจฉัยแบบพิสูจน์แนวคิด PLOS Med 12,e1001890 (2015).
23. Solez, K. et al.Banff'05 รายงานการประชุม: การวินิจฉัยแยกโรคของการบาดเจ็บ allograft เรื้อรังและการกำจัดโรคไตเรื้อรัง allograft (CAN) เป็น. เจ. Transplant.7,518-526(2007). การลดภูมิคุ้มกันในการปลูกถ่ายไต: ถึงเวลาที่จะต้องพิจารณาว่าเป็นการรักษามาตรฐานหรือไม่Kidney Int.76,825-830 (2009)
28. Legendre, C. et al. ผลลัพธ์สามปีในผู้ป่วยปลูกถ่ายไตที่สุ่มเลือกให้กดภูมิคุ้มกันที่ปราศจากสเตียรอยด์หรือถอนสเตียรอยด์ด้วยไมโคฟีโนเลตโซเดียมและไซโคลสปอรินที่เคลือบลำไส้: การศึกษาแบบอินฟินิตี้ เจ. การปลูกถ่าย.2014,1-8(2014).
29. Kaplinsky, J.& Arnaout, R.Robust ประมาณการความหลากหลายของภูมิคุ้มกันและภูมิคุ้มกันโดยรวมจากการวัดปริมาณงานสูงในตัวอย่าง แนท. Commun.7, 11881(2016).
30. สเติร์น, JNHet al. เซลล์ B ที่มีสมองหลายเส้นโลหิตตีบเติบโตเต็มที่ในต่อมน้ำเหลืองที่ปากมดลูกที่ระบายออก วิทย์. แปล Med.6,248ra107 (2014).
31. แบชฟอร์ด-โรเจอร์ส, RJMet al. คุณสมบัติของเครือข่ายที่ได้มาจากการจัดลำดับเชิงลึกของรายการรีเซพเตอร์บีเซลล์ของมนุษย์ซึ่งระบุถึงประชากรบีเซลล์ จีโนม Res.231874-1884 (2013)
32. Sarwal พบอัล. ความแตกต่างระดับโมเลกุลในการปฏิเสธการปลูกถ่ายไตเฉียบพลัน
ระบุโดยการทำโปรไฟล์ DNA microarray N.Engl.J. Med.349,125-138(2003). 33.Zarkhin, V.,Lovelace, PA,Li, L.,Hsieh,S.-C.& Sarwal, MMphenotypic การประเมินกลุ่มย่อย b-cell หลังจาก rituximab สำหรับการรักษาภาวะไตวายเฉียบพลันในผู้ป่วยเด็ก การปลูกถ่าย 91,1010-1018 (201)
34. Clatworthy, MR & Targeting, B. Cells และแอนติบอดีในการปลูกถ่ายAmm เจ. Transplant.11,1359-1367 (2011).
35. Dijke,EIet al.Bcells ในการปลูกถ่ายJ. การปลูกถ่ายปอดหัวใจ.35,704-710(2016).
36 Nankivell, BJ& Kuypers, DRDการวินิจฉัยและการป้องกันการสูญเสีย allograft ไตเรื้อรัง มีดหมอ 378,1428-1437(2011).
37. Patin, E. et al. ความแปรปรวนตามธรรมชาติในพารามิเตอร์ของเซลล์ภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดนั้นถูกขับเคลื่อนโดยปัจจัยทางพันธุกรรม ณัฐ.อิมมูนอล.19,302-314(2018). 38. Liston, A.& กอริส,A. ที่มาของความหลากหลายในภูมิคุ้มกันของมนุษย์. อิมมูนอล 19,209-210(2018).
39. Meier-Kriesche, H.-U, Schold, JD, Srinivas, TR& Kaplan,B.ขาดการปรับปรุงในการอยู่รอดของ allograft ไต แม้จะมีอัตราการปฏิเสธเฉียบพลันลดลงอย่างเห็นได้ชัดในยุคล่าสุด Am.J. การปลูกถ่าย4,378-383 (2004)
40 Keith, DS, Vranic, G.& Nishio-Lucar, A. การทำงานของกราฟต์และผลลัพธ์ระยะกลางของการปลูกถ่ายไตดีขึ้นในทศวรรษที่ผ่านมา: การวิเคราะห์ฐานข้อมูลการปลูกถ่ายไตของสหรัฐอเมริกา การปลูกถ่าย โดยตรง 3,el66 (2017)
41. Bomben, R. et al. การแสดงออกของยีน IGHV3-23 ที่กลายพันธุ์ในมะเร็งเม็ดเลือดขาวลิมโฟซิติกเรื้อรังระบุชุดย่อยของโรคที่มีลักษณะทางคลินิกและทางชีววิทยาที่แปลกประหลาด คลินิก มะเร็ง Res. 16,620-628(2010).
42. Levinson, AI, Kozlowski, L, Zheng, Y.& Wheatley, L. B-cell superantigens: คำจำกัดความและผลกระทบที่อาจเกิดขึ้นต่อการตอบสนองของภูมิคุ้มกัน คลินิกภูมิคุ้มกัน.15, 26S-36S(2538.
43. Silverman, GJ& Goodyear, CSA model B-Cell superantigen และ immunobiology ของ B lymphocytes คลินิกภูมิคุ้มกัน.102,117-134(2002).
44. Silverman, GJ& Goodyear, CSสร้างการป้องกัน B-cell: บทเรียนจาก superantigen ของ Staphylococcal แนท. รายได้ Immunol.6,465-475(2549). 45. Cheng, J.et al. กลุ่ม B-cell นอกมดลูกที่แทรกซึมเข้าไปในไตของมนุษย์ที่ปลูกถ่ายนั้นเป็นโคลน Proc. นัท แอ๊ด. วิทย์. 108,5560-5565 (2011).
46. โกรเวอร์ RKet al. costimulatory immunogen LPS กระตุ้น B-Cell โคลนที่แทรกซึมเข้าไปในไตของมนุษย์ที่ปลูกถ่าย Proc. นัท แอ๊ด. วิทย์. สหรัฐอเมริกา 109 6036-6041(2012)
47,Modena,BDet al. การเปลี่ยนแปลงของประชากรไมโครไบโอมในปัสสาวะมีความสัมพันธ์ในการปลูกถ่ายไตกับการเกิดพังผืดคั่นระหว่างหน้าและการฝ่อของท่อที่บันทึกไว้ในการตรวจชิ้นเนื้อในระยะเริ่มแรก เป็น. เจ. Transpl.17,712-723 (2017).
48. Chen, K.& Cerutti, A. ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับปริศนาของอิมมูโนโกลบูลิน D. Immunol รายได้ 237,160-179 (2010).
49. เฉิน K. et al. อิมมูโนโกลบูลินดีช่วยเพิ่มการเฝ้าระวังภูมิคุ้มกันโดยการเปิดใช้งานโปรแกรมต้านจุลชีพ โปรอักเสบและกระตุ้นเซลล์บีในเบโซฟิล แนท. อิมมูนอล 10, 889-898(2552).
50. Mack, M.& Rosenkranz, AR Basophils และแมสต์เซลล์ในการบาดเจ็บของไตKidneyInt.76,1142-1147 (2009)
51. นิกสัน, DFet al. การติดตามระดับโมเลกุลของไวรัสภูมิคุ้มกันบกพร่องของมนุษย์
สำเนาพันธุ์ T-cell ที่เป็นพิษต่อเซลล์เฉพาะของ nef แสดงความคงอยู่ของ DNA ตัวรับ T-cell จำเพาะของโคลน แต่ไม่พบ mRNA ภายหลังการรักษาด้วยยาต้านไวรัสแบบผสมผสานในระยะแรกๆ อิมมูนอล Lett.66,219-228(1999).
52. Dharnidharka, VR, Fiorina, P.& Harmon, การปลูกถ่าย WEKidney ในเด็ก.N.Engl. เจ เมด 371,549-558(2014).
53. Sarwal, MMet al. การหลีกเลี่ยงสเตียรอยด์อย่างสมบูรณ์นั้นมีประสิทธิภาพและปลอดภัยในเด็กที่ปลูกถ่ายไต: การทดลองแบบสุ่มหลายศูนย์พร้อมการติดตามผลเป็นเวลาสามปี Am.J.Transplant.12,2719-2729(2012).
24. Solez, K. et al.Banff 07 การจำแนกพยาธิสภาพของ allograft ของไต: การอัปเดตและทิศทางในอนาคต Am.J.Transplant.8,753-760 (2008)
54. Li, L et al. การกดภูมิคุ้มกันที่ปราศจากสเตียรอยด์ตั้งแต่ปี 2542:129 การปลูกถ่ายไตในเด็กโดยให้การปลูกถ่ายไตอย่างยั่งยืนและให้ผลดีต่อผู้ป่วย แอมเจ ทรานส์พี. 9, 1362-1372(2552).
25. Chaudhuri, A.et al. ผลกระทบทางคลินิกของภูมิคุ้มกันทางร่างกายในการปลูกถ่ายไตในเด็ก. เป็น. Soc.Nephrol.24,655-664 (2013).
