บทที่2: Peroxisomes ท่อไตสามารถจ่ายได้สำหรับการทำงานของไตปกติ
Jun 10, 2022
สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม ติดต่อtina.xiang@wecistanche.com
การอภิปราย
เปอร์รอกซิโซมที่มีปริมาณมากในท่อใกล้เคียงพร้อมกับความผิดปกติของไตในผู้ป่วย ZSD ได้แนะนำอย่างยิ่งถึงบทบาทที่สำคัญของเปอร์รอกซิโซมในไต. นอกจากนี้ การแสดงออกของเอนไซม์เปอร์รอกซิโซมที่จำเพาะต่อไตได้สนับสนุนแนวคิดที่ว่าเพอร์ออกซิโซมของไตอาจมีหน้าที่ทางชีววิทยาที่แตกต่างจากในเนื้อเยื่ออื่นๆ บางส่วน (15) เพื่อทดสอบสมมติฐานเหล่านี้ เราได้ตรวจสอบการทำงานของไตในหนูที่ไม่มีเปอร์รอกซิโซมโดยเฉพาะในท่อไต. ในบรรดาโมเดลเมาส์ต่างๆ ที่ใช้ในการศึกษาบทบาทของเปอร์รอกซิโซม เราเลือกหนูที่ยอมให้การยับยั้งทางพันธุกรรมแบบมีเงื่อนไขของ Pex5 ที่เข้ารหัสเปอร์รอกซิโซมไบโอเจเนซิสแฟคเตอร์ PEX5 ที่จำเป็นสำหรับการสร้างเปอร์รอกซีโซม แบบจำลองนี้ได้รับการคัดเลือกเนื่องจาก (i)Pex5-หนูที่เป็นโมฆะแสดงความผิดปกติทางชีวเคมีและการทำงานหลายอย่างที่ชวนให้นึกถึงสิ่งเหล่านั้นที่สังเกตพบในผู้ป่วยที่มี ZSD(11) และ (i) แบบจำลองหนูเมาส์สเปกตรัมขนาดใหญ่ที่มีการระเหยเฉพาะเนื้อเยื่อของ Pex5 ได้รับการวิเคราะห์ (16) ซึ่งช่วยให้เราสามารถเปรียบเทียบผลการทำงานของการขาดสารเปอร์รอกซิโซมในท่อไตกับที่พบในเนื้อเยื่ออื่นๆ ตามที่แสดงให้เห็นโดย Baes et al. Pex5-หนูที่เป็นโมฆะแสดงการชะลอการเจริญเติบโตของมดลูก ความผิดปกติของสมอง และภาวะ hypotonia ที่รุนแรง และเสียชีวิตภายใน 72 ชั่วโมงแรกของชีวิต (11) การวิเคราะห์ทางชีวเคมีเผยให้เห็นลักษณะเด่นหลายประการของ ZSD รวมถึงการลดลงของพลาสมาโลเจนในตับและสมอง และระดับ VLCFA ในพลาสมาที่เพิ่มขึ้นอย่างมาก ไม่พบซีสต์ของเยื่อหุ้มสมองไตในไตของ Pex{{10}}null ที่ P0.5 แต่สังเกตพบการชะลอตัวของการเจริญเติบโตของมดลูกของ glomeruli ไม่ได้ตรวจสอบการปรากฏตัวของเงินฝากแคลเซียมออกซาเลต
คลิกที่นี่เพื่อทำความรู้จักกับประโยชน์ของสมุนไพร cistanche
ในหนูทดลอง cKOm การระเหยของ peroxisomal biogenesis ในท่อไตไม่ก่อให้เกิดฟีโนชนิดที่สำคัญใดๆ ยกเว้น KW และ BW ที่ลดลงในหนูทดลอง cKOm สำหรับทารก และลดอัตราส่วน KW/BW ในหนู cKOm ที่เป็นผู้ใหญ่ ในหนูทดลอง cKOf การตัดออกของอัลลีล Pex5 ที่ไม่สมบูรณ์พร้อมกับผลที่น้อยกว่ามากของการลบ Pex5 ต่อการถอดรหัสของไตและเมตาโบโลม ชี้ให้เห็นว่าเปอร์รอกซิโซมที่ตกค้างบางส่วนอาจยังคงอยู่ในท่อไต อย่างไรก็ตาม,เพศความจำเพาะของการทำงานของ peroxisomal ในไตไม่สามารถตัดออกได้เช่นกัน เราไม่พบความแตกต่างทางสัณฐานวิทยาที่มีนัยสำคัญในไตของหนูเมาส์ cKOm ที่สามารถอธิบายอัตราส่วน KW หรือ KW/BW ที่ต่ำกว่าได้ อย่างไรก็ตาม แนวโน้มที่จะลดความกว้างของเซลล์ใกล้เคียงอาจเป็นสาเหตุที่เป็นไปได้ของความแตกต่างนี้ ที่สำคัญ ฟังก์ชัน homeostatic ของไตยังคงอยู่ในหนูเมาส์ cKOm แม้ว่าจะมีการเปลี่ยนแปลงระดับการแสดงออกของโปรตีนที่เข้ารหัสทรานสคริปต์ที่เกี่ยวข้องกับการขนส่งไอออน น้ำ กรดอะมิโน แอนไอออนอินทรีย์และไพเพอร์ ฟอสเฟต เกลือยูเรต และในมัลติลิ-ไกล่เกลี่ยผ่านเยื่อบุผิว ทางเดิน endocytic ของต่อม ข้อสังเกต ทรานสคริปท์ทรานสเฟอร์แบบเข้ารหัสส่วนใหญ่ที่ถูกเข้ารหัสซึ่งแสดงออกมาในท่อใกล้เคียง ในขณะที่ทรานสคริปท์ที่ถูกควบคุมส่วนใหญ่ที่เข้ารหัสทรานสเฟอร์ซึ่งแสดงในส่วนที่ไกลกว่าของเนฟรอน ตัวอย่างเช่น การแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของการถอดรหัส Nkcc2, Clc-Kb, Ncc และ ENaC เสนอแนะการปรับเพิ่มการชดเชยในการดูดกลับโซเดียมหลังส่วนใกล้เคียง การวิเคราะห์แบบบูรณาการของการถอดรหัสของไตและเมตาโบโลมเผยให้เห็นการเปลี่ยนแปลงอย่างลึกซึ้งในวิถีทางของเซลล์ที่หลากหลายที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญของเซลล์ องค์ประกอบของเยื่อหุ้มไขมัน และสภาวะสมดุลของรีดอกซ์ ในไตของหนูเมาส์ cKOm ประมาณ 8 เปอร์เซ็นต์ของ transcriptome และประมาณ 24 เปอร์เซ็นต์ของสารที่ตรวจพบมีระดับที่แตกต่างกันเมื่อเทียบกับหนู Ctrl ตามที่คาดไว้ ทรานสคริปต์และเมแทบอไลต์จำนวนมากเหล่านี้เกี่ยวข้องกับฟังก์ชันเปอร์รอกซิโซมอล พบการลดลงอย่างมากในความอุดมสมบูรณ์ของอีเธอร์ ฟอสโฟลิปิด พลาสมาโลเจนที่สังเคราะห์ในเปอร์รอกซิโซม (~67 เปอร์เซ็นต์ในหนู cKOm และ~50 เปอร์เซ็นต์ในหนู cKOf ผลรวมของพลาสมาโลเจนที่ตรวจพบทั้งหมดแบบไม่ถ่วงน้ำหนัก) พลาสมาโลเจนเป็นฟอสโฟลิปิดของเยื่อหุ้มเซลล์หลักที่มีจำนวนหน้าที่ที่บ่งบอกได้เพิ่มขึ้น ซึ่งรวมถึงความสมบูรณ์ของเมมเบรน การส่งสัญญาณของเซลล์ และการป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระ ในไต พลาสมาโลเจนเป็นตัวแทนของฟอสโฟลิปิดทั้งหมดประมาณ 20 เปอร์เซ็นต์ (17) ดังนั้นจึงแนะนำว่าอย่างน้อย 10 เปอร์เซ็นต์ขององค์ประกอบฟอสโฟลิปิดมีความแตกต่างกันในไตของ cKOm และ cKOf จากกลุ่มควบคุมที่เกี่ยวข้อง การพร่องของพลาสมาโลเจนอาจได้รับการชดเชยด้วยความอุดมสมบูรณ์ที่เพิ่มขึ้นของฟอสฟาติดิลเอธานอลามีน (PEs) ที่คล้ายคลึงกันทางโครงสร้างและโดยฟอสฟาติดิลโคลีน (PCs) ซึ่งแสดงการเสริมสมรรถนะอย่างมากในไตของหนูทั้ง cKOm และ cKOf ข้อสังเกต พบว่ามีการชดเชย PE และ PC เพิ่มขึ้นในไตของผู้ป่วย ZSD (17)
เมแทบอลิซึมของท่อใกล้เคียงส่วนใหญ่อาศัยการออกซิเดชันของกรดไขมัน ซึ่งเป็นลักษณะเฉพาะของ ROS รุ่นสูงที่ผลิตทั้งในไมโตคอนเดรียและเปอร์รอกซิโซม ในหนูทดลอง cKO วิถีทางที่เกี่ยวข้องกับการเสื่อมสลายของกรดไขมัน/การสังเคราะห์ทางชีวภาพได้รับการควบคุมอย่างมาก ซึ่งอาจชี้ให้เห็นถึงการปรับปรุงการชดเชยการผลิตพลังงานยลจากสารตั้งต้นเหล่านี้ เนื่องจากหนึ่งในหน้าที่หลักของเปอร์รอกซิโซมคือการล้างพิษของ ROS เราจึงตั้งสมมติฐานว่าการระเหยของเปอร์รอกซิโซมไบโอเจเนซิสจะทำให้เกิดความเครียดออกซิเดชันในไตของหนู cKO อย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์ระดับโมเลกุลไม่ได้เปิดเผยการเปลี่ยนแปลงในความสามารถของสารต้านอนุมูลอิสระและตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน ความท้าทายกับ HFD ไม่ได้ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในฟีโนไทป์การทำงาน ยกเว้นการเพิ่มขึ้นของปริมาณปัสสาวะและการขับแคลเซียมและปัสสาวะในปัสสาวะในหนูทดลอง cKOm การวิเคราะห์การถอดรหัสและเมตาบอลิซึมแบบบูรณาการทำให้สามารถระบุเส้นทางของกลูตาไธโอนเป็นกลไกการชดเชยที่เป็นไปได้สำหรับการรักษาความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระโดยรวมในเซลล์ท่อไตใกล้เคียงที่ไม่มีเปอร์รอกซิโซม
การลบ Pex5 แบบมีเงื่อนไขในตับของทารกในครรภ์ (12) ในเซลล์ตับอ่อน (18) และในเซลล์ประเภทต่างๆ ของระบบประสาทส่วนกลาง (ทบทวนใน ref.16) ทำให้เกิดการเสื่อมสภาพการทำงานจำเพาะของอวัยวะที่เปลี่ยนแปลงได้ แต่ส่วนใหญ่ร้ายแรง นี่ไม่ใช่กรณีในไต ในการศึกษานี้ เราระบุกลไกการทำงานของไตที่แท้จริงหลายอย่างที่อาจช่วยให้รับมือกับการขาดเปอร์รอกซิโซมได้ เนื่องจากไตเป็นอวัยวะที่มีอัตราการไหลเวียนของเลือดสูง ความเป็นไปได้อีกอย่างหนึ่งอยู่ที่แหล่งกำเนิดภายนอกไตอย่างน้อยส่วนหนึ่งของสารที่ไตไม่สามารถผลิตได้ในกรณีที่ไม่มีเปอร์รอกซิโซม แต่จำเป็นสำหรับการทำงานของไตตามปกติ โดยรวมแล้ว ข้อมูลของเราแนะนำว่าเพอร์ออกซิโซมในท่อไตสามารถจ่ายได้สำหรับการทำงานของไตตามปกติ และการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิสรีรวิทยาในไตของผู้ป่วยที่มี ZSD นั้นมาจากภายนอกไต
วิธีการ
สัตว์. ขั้นตอนที่ใช้เพื่อสร้างเมาส์ Pex5a/la/Pax8-ntTA/LC-1 Cre ถูกอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (13) เมาส์ 3 สายพันธุ์ที่ใช้ในการศึกษานี้เป็นสายพันธุ์แท้ พันธุ์บนพื้นฐานทางพันธุกรรมของเมาส์ C57BL/6J (ห้องปฏิบัติการแจ็คสัน) ก่อนการทดลองทั้งหมด หนูถูกปรับให้เป็น 12-ชั่วโมงแสง/12-รอบมืดชั่วโมง การทดลองทั้งหมดดำเนินการในเวลากลางวัน ZT3(ZT0คือเวลาที่เปิดไฟ และ ZT12 คือเวลาที่ปิดไฟ)
Pex5bxlo/Pax8-rtTA/LC1 หนูเมาส์เพศผู้หรือเพศเมียที่แปลงพันธุ์สามตัว (ที่อ้างอิงเป็น cKOm และ cKOf) และหนูเมาส์ Pex5l/a (ที่อ้างอิงเป็น Ctrl หรือ Ctrl) ถูกใช้ การรวม Pex5 ในทารกแรกเกิดทำได้โดยเติม DOX ร้อยละ 2 และน้ำตาลซูโครส 2 เปอร์เซ็นต์ในน้ำดื่มของหนูตัวเมียที่ตั้งครรภ์เป็นเวลา 2 สัปดาห์ โดยเริ่มตั้งแต่วันที่ 14 ของการตั้งครรภ์ สำหรับการรวมตัวกันของ Pex5 ในหนูที่โตเต็มวัย DOX และซูโครสถูกเติมลงในน้ำดื่มของหนูอายุ 8- สัปดาห์ โครงสร้างและการทำงานของไตได้รับการประเมิน 4 สัปดาห์หลังจากสิ้นสุดการรักษา DOX ในหนูทดลองอายุ 4-สัปดาห์หรือหนูที่โตเต็มวัย 14-สัปดาห์ หลังจากหย่านมใน 3 สัปดาห์ หนูได้รับอาหารควบคุมมาตรฐานที่มีไขมัน 4.2 เปอร์เซ็นต์ (อาหารควบคุมไขมันต่ำดมกลิ่น) หรือเมื่อกล่าวถึงเป็นเวลา 4 สัปดาห์ด้วย HFD ที่เข้าคู่กันซึ่งมีไขมัน 20.7 เปอร์เซ็นต์ (ส่วนใหญ่เป็น LCFA)
กรงเมตาบอลิซึมและเคมีเลือดและปัสสาวะ หนูถูกขังอยู่ในกรงเมแทบอลิซึม (Tecniplast) การเก็บปัสสาวะดำเนินการหลังจากระยะเวลาการปรับตัว 3-วัน เคมีของปัสสาวะและเลือดได้รับการวิเคราะห์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (19) วัดองค์ประกอบของพลาสมาและปัสสาวะใน Laboratoire Central de Chimie Clinique, Center Hospitalier Universitaire Vaudoise University Hospital (เมืองโลซานน์ ประเทศสวิตเซอร์แลนด์)
กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน. ตัวอย่างไตถูกตัดเป็นชิ้นๆ ประมาณ 1 มม.³ และตรึงในสารละลายกลูตาราลดีไฮด์ (EMS)2.5 เปอร์เซ็นต์ในบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PB,0.1 โมลาร์ pH7.4)(MilliporeSigma) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง(RT) จากนั้นล้างพวกเขา 3 ครั้ง ครั้งละ 5 นาที ในบัฟเฟอร์ PB จากนั้นแก้ไขด้วยส่วนผสมใหม่ของออสเมียม เตตรอกไซด์ 1 เปอร์เซ็นต์ (EMS) กับโพแทสเซียมเฟอร์โรไซยาไนด์ 1.5 เปอร์เซ็นต์ (MilliporeSigma) ใน PB เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ RT จากนั้นตัวอย่างถูกล้าง 3 ครั้งในน้ำกลั่นและถูกทำให้แห้งในสารละลายอะซิโตน (MilliporeSigma) ที่ความเข้มข้นแบบจัดลำดับ (30 เปอร์เซ็นต์ 90 นาที; 70 เปอร์เซ็นต์ 90 นาที; 100 เปอร์เซ็นต์ 120 นาที; 100 เปอร์เซ็นต์ 240 นาที) ตามด้วยการแทรกซึมใน Epon resin(MilliporeSigma) ที่ระดับความเข้มข้นแบบค่อยเป็นค่อยไป (Epon/acetone [1/3; v/v] 4 ชั่วโมง;Epon/acetone [3/1;v/v] 4 ชั่วโมง Epon/acetone [1 /1;v/v] 8 ชั่วโมง; Epon/อะซิโตน [1/1; v/v] 24 ชั่วโมง)และสุดท้ายพอลิเมอไรเซชันเป็นเวลา 48 ชั่วโมงที่ 60 องศาในเตาอบ ส่วนบางเฉียบ 50 นาโนเมตรถูกตัดด้วย Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH) และหยิบขึ้นมาบนตะแกรงทองแดงขนาด 2×1 มม. (EMS) เคลือบด้วยฟิล์มโพลีสไตรีน (MilliporeSigma) ส่วนต่างๆ ถูกโพสต์ด้วยยูแรนิลอะซิเตต (MilliporeSigma)2 เปอร์เซ็นต์ใน H, O เป็นเวลา 10 นาที ล้างหลายครั้งด้วย H, O ตามด้วย Reynolds lead citrate เป็นเวลา 10 นาที และล้างหลายครั้งด้วย H, O
สรีรวิทยา. สำหรับการวิเคราะห์ทางสรีรวิทยา วิเคราะห์ชิ้นเนื้อไต 3 ชิ้นต่อหนูเมาส์ 15 ไมโครกราฟต่อตัวอย่างที่มีขนาดพิกเซล 4.08 นาโนเมตร โดยใช้การสุ่มตัวอย่างแบบสม่ำเสมออย่างเป็นระบบด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (Philips CM100, Thermo Fisher Scientific) ที่แรงดันไฟฟ้าเร่งความเร็ว 80 kV ด้วยกล้องดิจิตอล TVIPS TemCam-F416 (TVIPS GmbH)
การวิเคราะห์ทรานสคริปโทมิก ข้อมูลการจัดลำดับทั้งหมดเปิดเผยต่อสาธารณะผ่าน NIH Gene Expression Omnibus (หมายเลขภาคยานุวัติ GSE179202) ไลบรารี RNA-Seq ถูกเตรียมโดยใช้ RNA ไตทั้งหมด 200 ng ตามที่อธิบายไว้ใน Nikolaeva et al (19). ใช้รีเอเจนต์ V4 ของคลัสเตอร์ Illumina TruSeq SR Cluster Kit ข้อมูลการจัดลำดับถูกประมวลผลโดยใช้ Mus musculus GRCM38.86 คำอธิบายประกอบของยีน การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการใน R (เวอร์ชัน 3.4.0) การถอดเสียงที่มีจำนวนน้อยถูกกรองออกตามกฎ 1 จำนวนต่อล้าน (CPM) ในตัวอย่างอย่างน้อย 1 ตัวอย่าง ขนาดไลบรารีถูกปรับขนาดโดยใช้การทำให้เป็นมาตรฐานของ TMM และแปลงบันทึกเป็น CPM โดยใช้ voom (20) การวิเคราะห์องค์ประกอบหลักแสดงความแปรปรวนเล็กน้อยระหว่างตัวอย่างที่ทำซ้ำ นิพจน์เชิงอนุพันธ์ระหว่างหนูเมาส์ cKO และ Ctrl ถูกคำนวณในการทดสอบ 1 F โดยใช้ limma (21) ค่า P ถูกปรับตามที่อธิบายไว้ (22) เป็นค่า FDR เพื่อพิจารณาการเปรียบเทียบหลายรายการ โดยใช้ผลลัพธ์ของการถอดเสียงทั้งหมดในตัวผู้และตัวเมีย หรือผลลัพธ์ของผู้ขนส่งที่เลือก หรือการถอดเสียงที่เกี่ยวข้องกับเปอร์รอกซิโซมในเพศชายเท่านั้น การถอดเสียงด้วย FDR<5% were="" considered="" significant.="" comparisons="" of="" expression="" levels="" were="" done="" using="" the="" mean="" fc="" of="" cpm="" in="" cko="" mice="" as="" compared="" with="" ctrl="" mice.="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" individual="" values="" in="" box-and-whisker="" plots,="" individual="" values="" were="" normalized="" between="" 0="" and="" 1.="" a="" weighted="" gsea="" was="" performed="" using="" the="" unfiltered="" transcript="" list="" ranked="" by="" signed="" p-value="" (product="" of="" p-value="" and="" sign="" of="" the="" fc).="" the="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" gsekegg="" function="" from="" the="" r="" package="" cluster="" profile(version="" 3.16.1)(23).="" kegg="" pathway="" collections="" were="" restricted="" to="" gene="" sets="" with="" minimum="" and="" maximum="" sizes="" of="" 10="" and="" 500,="" respectively.="" the="" enrichment="" scores="" were="" normalized="" by="" gene="" set="" size,="" and="" their="" statistical="" significance="" was="" assessed="" by="" permutation="" tests="" (n="">
การวิเคราะห์เมตาบอลิซึม. เมตาโบไลต์จากตัวอย่างไตที่แช่แข็งถูกระบุโดยโครมาโตกราฟีของเหลวที่มีประสิทธิภาพสูงพิเศษ-tandem mass spectroscopy และหาปริมาณโดยใช้ AUC (Metabolon Inc) ค่าดิบถูกแปลงบันทึกและทำให้เป็นมาตรฐานในแง่ของการนับพื้นที่ดิบ การทดสอบความคมชัด ANOVA แบบสองทางใช้เพื่อระบุชีวเคมีที่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างหนูเมาส์ cKO และ Ctrl ของทั้งสองเพศ ค่า P ถูกปรับตามที่อธิบายไว้ (22) เป็นค่า FDR เพื่อพิจารณาสำหรับการเปรียบเทียบหลายรายการ และเมแทบอไลต์ด้วย FDR<5% were="" considered="" significantly="" modulated.="" for="" log2fc="" calculation,="" missing="" values,="" if="" any,="" were="" replaced="" with="" the="" minimum="" observed="" value="" in="" mice="" of="" the="" same="" sex,="" for="" each="" compound.="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" individual="" values="" in="" box-and-whisker="" plots,="" normalized="" values="" were="" divided="" by="" the="" median="" value="" obtained="" in="" mice="" of="" the="" same="" sex,="" for="" each="">
การวิเคราะห์การถอดรหัสร่วม-เมตาโบโลม. การวิเคราะห์เส้นทางเมแทบอลิซึมแบบบูรณาการซึ่งรวมผลลัพธ์ที่ได้จากการแสดงออกของยีนและการศึกษาเมตาบอลิซึมได้ดำเนินการโดยใช้โมดูลการวิเคราะห์เส้นทางร่วมบนเว็บไซต์ MetaboAnalyst 50 (24) ชื่อผสมของสารเมตาโบไลต์และสัญลักษณ์ยีนอย่างเป็นทางการของการถอดเสียงมีมากหรือน้อยอย่างมีนัยสำคัญ (FDR<0.05), along="" with="" their="" respective="" fcs="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrl="" mice,="" were="" inputs.="" the="" integration="" was="" performed="" using="" kegg="" metabolic="" pathways="" with="" default="" settings(hypergeometric="" test="" for="" overrepresentation="" analysis,="" degree="" centrality="" for="" pathway="" topology="" analysis,="" and="" tight="" integration="" by="" combining="" queries).="" pathways="" with=""><0.1 were="" considered="" significantly="" affected="" in="" ckom="">
การย้อมสี. การย้อมสีของโครงสร้างไตทั่วโลก การสะสมของแคลเซียมออกซาเลต หรือการสะสมไขมันที่เป็นกลางบนชิ้นไตตามขวางที่มีความหนา 5 ไมโครเมตร ยกเว้นการย้อมสีไขมันที่เป็นกลาง หนูถูกวางยาสลบ และไตซ้ายของพวกมันถูกถ่ายผ่านเส้นเลือดใหญ่ในช่องท้องด้วยสารละลายพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% ก่อนการเก็บเนื้อเยื่อ สำหรับการวิเคราะห์โครงสร้างไตทั่วโลก ชิ้นไตที่ฝังในพาราฟินถูกกำจัดพาราฟิน เติมน้ำ ย้อมด้วย H&E อบแห้ง และติดตั้งใน ROTI Histokitt(Carl Roth GmbH) ไขมันเป็นกลางถูกย้อมในชิ้นไตที่ฝังอยู่ในสารประกอบ OCT (เนื้อเยื่อ-เต็ก) โดยใช้สารละลายออยเรดโอ สิ่งสะสมแคลเซียมออกซาเลตถูกย้อมตามวิธีการที่บรรยายไว้โดยพิซโซลาโต (25) โดยสังเขป ไตชิ้นที่ฝังในพาราฟินถูกกำจัดพาราฟินและคืนน้ำ จากนั้นจุ่มลงในสารละลาย 1:1 ของซิลเวอร์ไนเตรต 5 เปอร์เซ็นต์โดยน้ำหนักและไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 30 เปอร์เซ็นต์ และวางไว้ใต้หลอดไฟ 60 วัตต์เป็นเวลา 30 นาที สไลด์ถูกล้างอย่างทั่วถึงในน้ำกลั่นและย้อมทับด้วย Nuclear Fast Red (MilliporeSigma) จากนั้นทำให้แห้งก่อนติดตั้งในโรตี ฮิสโตกิต. ไตชิ้นตามยาวจากหนูเมาส์ที่ได้รับการรักษาด้วยอาหารที่ทำให้เกิดโรคไตที่เกิดจากแคลเซียมออกซาเลต (แคลเซียม 1.5 เปอร์เซ็นต์และไฮดรอกซีโพรลีน 1.5 เปอร์เซ็นต์ผสมในอาหารมาตรฐานเป็นเวลา 3 สัปดาห์) ทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมแคลเซียมออกซาเลตในไตในเชิงบวก วิเคราะห์ผลลัพธ์โดยใช้เครื่องสแกนสไลด์ Zeiss AxioScan.Z1 ที่กำลังขยาย 100 เท่าหรือ 200 เท่า
การทดสอบ ELISA และ Trolox4-HNE ถูกวัดโดยใช้ Lipid Peroxidation(4-HNE)Assay Kit จาก Abcam (ab238538) ความจุของสารต้านอนุมูลอิสระทั้งหมดและไม่มีเอนไซม์ถูกประเมินโดยชุดทดสอบ Trolox จาก Abcam (ab65329)
สถิติ. ข้อมูลทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SEM การทดสอบทางสถิติและเกณฑ์สำหรับนัยสำคัญได้อธิบายไว้ในคำอธิบายภาพหรือส่วนวิธีการที่เหมาะสม การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้แพ็คเกจ R หรือซอฟต์แวร์ GraphPad Prism เวอร์ชัน 8.2.1 การทดสอบทั้งหมดเป็นแบบ 2 ทาง
อนุมัติการเรียน. การทดลองกับสัตว์ทั้งหมดดำเนินการตามแนวทางการดูแลสัตว์ของสวิส ซึ่งสอดคล้องกับแนวทางการดูแลสัตว์ของสถาบันสุขภาพแห่งชาติ และอนุมัติโดย cantonal สวิส (Canton de Vaud) และหน่วยงานสัตวแพทย์ของรัฐบาลกลาง (อนุญาต 31827 ถึง DF) (Direction genérale de P'agriculture, de la viticulture et des Affairs vetérinaires, Epalinges, สวิตเซอร์แลนด์)
การเผยแพร่ก่อนหน้า: ส่วนหนึ่งของงานนี้ถูกส่งเป็นบทคัดย่อไปยังการประชุมประจำปี 2021 ของ American Society of Nephrology (4 พฤศจิกายน 2021.https://www.asn-online.org/education/kidney-week/2021 /program-abstract.aspx?controlId=3605774)
