สารสกัด Cistanche Deserticola สามารถส่งเสริมการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันได้หรือไม่?

ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Shuangshuang Feng a,1, Xiumei Yang a, Xiang Weng a,1, Bin Wang b, Ailian Zhang a,*

Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, 830046, ซินเจียง, จีน

b Key Lab of Medical Molecular Virology, School of Basic Medical Science, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai, 200032, ประเทศจีน

ความเกี่ยวข้องทางชาติพันธุ์วิทยา:พอลิแซ็กคาไรด์สมุนไพรมีศักยภาพในการเสริมสร้างภูมิคุ้มกันที่ดี สารเสริมเป็นเครื่องมือสำคัญในการพัฒนาวัคซีนที่มีประสิทธิภาพ ในการศึกษาก่อนหน้านี้ของเรา โพลีแซคคาไรด์ที่ละลายน้ำได้ซึ่งสกัดจากป่าCistancheทะเลทรายYC Ma แสดงฤทธิ์กระตุ้นภูมิคุ้มกันที่มีศักยภาพ

จุดมุ่งหมายของการศึกษา:ในการศึกษานี้ โปรไฟล์ภูมิคุ้มกันและประสิทธิภาพของสารสกัดจากน้ำที่ปลูกCistancheทะเลทรายYC Ma (AECCD) บนหนูเมาส์ ICR ที่ต้านโอวัลบูมิน (OVA) ถูกตรวจสอบ ในการทดลองในหลอดทดลอง กลไกการกระตุ้นกระแสตรงที่เป็นไปได้โดย AECCD ถูกประเมิน

วัสดุและวิธีการ:AECCD ถูกสกัดโดยใช้น้ำร้อนหลังจากที่พอลิแซ็กคาไรด์ที่ยังไม่ผ่านกระบวนการตกตะกอนด้วยเอทานอล หนูได้รับการฉีดวัคซีนใต้ผิวหนังด้วย OVA (10 ug ต่อเมาส์) เพียงอย่างเดียวหรือ OVA (10 ug ต่อเมาส์) ตามลำดับที่มี AECCD (200, 400 และ 800 ug ต่อเมาส์) ในวันที่ 1 และ 14 และขนาดและจลนศาสตร์ของ จากนั้นจึงประเมินแอนติบอดีและการตอบสนองที่อาศัยเซลล์

ผลลัพธ์:AECCD กระตุ้นการตอบสนอง IgG ที่รุนแรงและระยะยาวด้วยการตอบสนอง Th1/Th2 แบบผสมและระดับที่ควบคุมเพิ่มขึ้นของไซโตไคน์ที่เกี่ยวข้องกับ Th (CD4 บวก IL-4, CD4 บวก IFN- และ CD8 บวก IFN- ) นอกจากนี้ AECCD ยังกระตุ้นเซลล์ที่แข็งแรงมีภูมิคุ้มกันการตอบสนองมีลักษณะเฉพาะด้วยการเพิ่มจำนวนเซลล์ม้ามที่เพิ่มขึ้นเช่นเดียวกับการตอบสนองของทีเซลล์ที่ถูกกระตุ้น โดยเฉพาะอย่างยิ่ง AECCD ช่วยเพิ่มการเจริญเติบโตของเซลล์เดนไดรต์ (DCs) และยับยั้ง Tregs อย่างมีนัยสำคัญ การทดลองในหลอดทดลอง การทดสอบเบื้องต้นระบุว่า AECCD กระตุ้นการกระตุ้น DC โดยส่งเสริมการเจริญเต็มที่ของฟีโนไทป์ ส่วนไซโตไคน์ และกิจกรรม allostimulatory Toll-like receptor 4 (TLR4) เป็นรีเซพเตอร์ที่จำเป็นสำหรับ DC เพื่อจับ AECCD โดยตรง สารยับยั้ง NF-κB ลดระดับการแสดงออกของ CD40, CD80, CD86 และ MHC-II และการผลิต IFN- , TNF- และ IL-6 ผ่าน DCS

สรุป:ในที่สุด การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่า AECCD สามารถกระตุ้นแอนติเจนที่จำเพาะเจาะจงที่มีศักยภาพและทนทานได้มีภูมิคุ้มกันคำตอบผ่านการกระตุ้นกระแสตรง ซึ่งเกี่ยวข้องกับการควบคุมของตัวทำเครื่องหมายการเจริญเต็มที่และการแสดงออกของไซโตไคน์ผ่านทางวิถี NF-κB ที่เกี่ยวข้องกับ TLR4- การศึกษาระบุว่า AECCD เป็นตัวกระตุ้นภูมิคุ้มกันที่มีศักยภาพ

คำสำคัญ:สารเสริมโพลีแซ็กคาไรด์Cistancheทะเลทราย, อิมมูโนโมดูเลเตอร์, เซลล์เดนไดรต์ รีเซพเตอร์เหมือนโทร 4, เส้นทางการส่งสัญญาณ NF-κB

Cistanche ทะเลทรายสารสกัดส่งเสริมมีภูมิคุ้มกันการตอบสนอง

1. บทนำ

การศึกษาจำนวนมากได้แนะนำว่าสารเสริมสามารถเพิ่มประสิทธิภาพของวัคซีนป้องกันโรคติดเชื้อต่างๆ เช่น HIV, COVID-19, ไข้หวัดใหญ่ และโรคปากเท้าเปื่อย (Cao et al., 2020; Giuseppe et al., 2018) ). Adjuvants สามารถเหนี่ยวนำให้เกิดประเภทต่างๆและขนาดของมีภูมิคุ้มกันคำตอบดังนั้น ตัวเสริมที่ถูกเลือกอย่างเหมาะสมอาจกระตุ้นให้มีภูมิคุ้มกันการตอบสนองจำเป็นสำหรับเชื้อโรคหรือแอนติเจนที่กำหนด (Reed et al., 2013) สารสกัดจากสมุนไพรธรรมชาติมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในชีวิตประจำวันหรือในการดูแลสุขภาพ ในหลายกรณี การแพทย์แผนจีน (TCM) และส่วนประกอบออกฤทธิ์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งสารเสริมที่ได้จาก TCM polysaccharides หลายตัว ช่วยปรับปรุงประสิทธิภาพของวัคซีนได้อย่างมีนัยสำคัญ TCM polysaccharides (Advax™, Astragalus polysaccharide, Ginseng polysaccharide, Lycium barbarum polysaccharide และ Ganoderma lucidum polysaccharide) มีข้อดีหลายประการเหนือ adjuvants อื่นๆ เช่น ความปลอดภัยที่ดีขึ้น ความเข้ากันได้ทางชีวภาพ การเพิ่มภูมิคุ้มกันที่แข็งแกร่ง และการเกิดปฏิกิริยาต่ำ (Li and Wang, 2015; Schiehl และคณะ, 2020). ดังนั้น สารประกอบและสูตรที่มี TCM เป็นพื้นฐานพอลิแซ็กคาไรด์จึงมีศักยภาพในการเป็นสารเสริม

Cistanche ทะเลทรายYC Ma (Roucongrong ในภาษาจีน) เป็นยาจีนโบราณที่บันทึกไว้ในตำรับยาจีนและใช้เป็นยาบำรุงเป็นเวลาหลายร้อยปีในประเทศจีน (Chinese Pharmacopoeia Commission, 1992) การศึกษาทางเภสัชวิทยาสมัยใหม่ได้แสดงให้เห็นการใช้งานทางเภสัชวิทยาและการปรับภูมิคุ้มกันหลายอย่าง (Dong et al., 2007; Fu et al., 2017) ในการศึกษาก่อนหน้านี้ของเรา โพลีแซ็กคาไรด์ดิบที่ได้มาจากป่าCistancheทะเลทรายYC Ma ส่งเสริมการตอบสนองของเซลล์และเซลล์ที่จำเพาะต่อแอนติเจน และควบคุมการเจริญเติบโตของเซลล์เดนไดรต์ (DCs) (Zhang et al., 2018; Zhao et al., 2019) อย่างไรก็ตามป่าCistancheทะเลทรายYC Ma ได้รับการสำรวจและระบุว่าเป็นสัตว์ใกล้สูญพันธุ์มากเกินไปCistancheทะเลทรายYC Ma ได้รับการปลูกในขนาดใหญ่และใช้กันอย่างแพร่หลายในการพัฒนาและการประยุกต์ใช้ทรัพยากร TCM อย่างไรก็ตาม ศักยภาพเสริมของการเพาะปลูกCistancheทะเลทรายYC Ma ยังคงไม่ชัดเจน

DCS เป็นหน่วยงานกำกับดูแลที่จำเป็นต่อโรคติดเชื้อ หลังจากที่ DC ถูกกระตุ้น โมเลกุลของพื้นผิวและไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบบน DC จะมีปฏิกิริยากับตัวรับที่สัมพันธ์กันเพื่อกระตุ้นทีเซลล์และกระตุ้นการตอบสนองที่จำเพาะต่อแอนติเจนและการผลิตไซโตไคน์ที่ควบคุมการปรับตัวมีภูมิคุ้มกันคำตอบ(บันเชโรและสไตน์แมน, 1998). มีรายงานว่าตัวรับที่เหมือนโทร 4 (TLR4) บน DCs ทำหน้าที่เป็นตัวรับโพลีแซ็กคาไรด์ที่สำคัญ (Park et al., 2014; Qi et al., 2016) อันที่จริง พอลิแซ็กคาไรด์จำนวนมากสามารถโต้ตอบโดยตรงหรือโดยอ้อมกับ TLR4 บน DC เพื่อกระตุ้นปัจจัยนิวเคลียร์ปลายน้ำ-คัปปา B (NF-κB) ซึ่งสามารถกระตุ้นการแสดงออกของยีนที่ทำให้เกิดการอักเสบต่างๆ เช่น IFN- , TNF- และ IL{{11 }} และการตอบสนองต่อการอักเสบเพื่อกำจัดเชื้อโรค (Tian et al., 2019; Zhou et al., 2017; Zhu et al., 2013) ดังนั้น DCS และ NF-κB จึงได้รับการศึกษาอย่างกว้างขวางว่าเป็นเป้าหมายที่เป็นไปได้สำหรับการรักษาโรค

ในการศึกษา ด้วยกลยุทธ์ in vivo (ICR mice) อันดับแรก เราได้ประเมินผลการกระตุ้นภูมิคุ้มกันของสารสกัดในน้ำที่ได้จากการเพาะเลี้ยงCistancheทะเลทรายYC Ma (AECCD) ที่มีขนาดยาต่างกัน (ต่ำ ปานกลาง และสูง) เพื่อกระตุ้น anมีภูมิคุ้มกันการตอบสนองต่อต้าน OVA และอธิบายวิธีในหลอดทดลองเพื่อกระตุ้น DC และเส้นทางที่เกี่ยวข้องกับตัวรับดาวน์สตรีม ด้วยแบบจำลองเมาส์ เราเปิดเผยว่า AECCD ส่งเสริมการตอบสนองของแอนติบอดีในระยะยาวด้วยระดับ IgG และระดับเซลล์ที่เพิ่มขึ้นมีภูมิคุ้มกันการตอบสนอง. ที่สำคัญ AECCD ชักนำไซโตไคน์ที่เกี่ยวข้องกับ Th โดยเฉพาะอย่างยิ่งการผลิต IFN ซึ่งนำไปสู่การตอบสนองของ Th1 ต่อการติดเชื้อ ผลการเหนี่ยวนำมีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการสุกของกระแสตรงที่ปรับปรุงแล้วและ Tregs ที่ลดลง ในทางกลไก AECCD ส่งเสริมการเปิดใช้งาน DC ผ่านเส้นทาง NF-κB ที่เกี่ยวข้องกับ TLR4- โดยสรุป การศึกษายืนยันกิจกรรมเสริมที่มีศักยภาพของ AECCD ในการส่งเสริมการตอบสนองแบบปรับตัว การศึกษาได้วางรากฐานสำหรับการพัฒนาสารเสริมโพลีแซ็กคาไรด์ AECCD

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. รีเอเจนต์

โอวัลบูมิน (OVA), 3-(4, 5-ไดเมทิลไทอะซอล-2-อิล)-2, 5-ไดฟีนิลเตตตราโซเลียม โบรไมด์ (MTT), พอลิมัยซิน บี (PMB), คอนคานาวาลิน A (ConA), lipopolysaccharide (LPS), mitomycin C และ 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) ได้รับจาก Sigma (USA) ซื้อซีรั่มวัวในครรภ์ (FBS) จากอุตสาหกรรมชีวภาพ ชุดนับเซลล์-8 (CCK-8) ซื้อมาจาก Biosharp (ประเทศจีน) คอนจูเกต IgG/IgG1/IgG2a-HRP ของหนูต้านหนูจากแพะมาจาก Southern Biotech (USA) Inject Alum มาจาก Thermo Scientific Pierce (USA) GM-CSF มาจาก Peprotech (สหรัฐอเมริกา) แอนติบอดีที่ติดฉลากเรืองแสง (แอนติ-CD3-PE, แอนติ-CD4-APC, แอนติ-CD8a-FITC, แอนติ-CD44-PE, แอนติ-CD62L-PE, แอนติ-MHCII -FITC/Percp-cy5.5, แอนติ-IL-4-PE, แอนติ–IFN– -PE, แอนติ-CD86-APC, แอนติ-CD40-FITC/PE, แอนติ- CD11c-PE/FITC, แอนติ-CD80-APC), Golgistop, Cytofix/Cytoperm และ Perm/Wash buffer ล้วนมาจาก BD Bioscience (USA) ชุดย้อมสีทีเซลล์ตามข้อบังคับมาจาก eBiosciences (USA) TAK-242 มาจาก MedchemExpress (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) PDTC มาจาก Beyotime Biotechnology (ประเทศจีน) ชุดวิเคราะห์การไหลหลายตัววิเคราะห์มาจาก Biolegend (USA)

2.2. การเตรียม AECCD C. deserticola

(ตัวอย่างใบสำคัญหมายเลข CD10041602) ถูกระบุโดยศาสตราจารย์เจียงเหอ AECCD ได้มาจากการสกัดน้ำ การตกตะกอนของเอทานอล และวิธีการลดโปรตีนด้วยการดัดแปลงเล็กน้อย (Zhang et al., 2018) สั้น ๆ ปลูกฝังCistancheทะเลทรายขั้นแรกถูกสกัดด้วยน้ำหลายครั้ง จากนั้นพอลิแซ็กคาไรด์แบบหยาบถูกตกตะกอนข้ามคืนโดยการเติมเอทานอลตามอัตราส่วนปริมาตร 1:4 จากนั้นพอลิแซ็กคาไรด์แบบหยาบที่ได้รับนั้นถูกลดโปรตีนโดยวิธีเซแวก (Liu et al., 2012) ตรวจพบปริมาณน้ำตาลทั้งหมดเป็นร้อยละ 76.82 โดยวิธีกรดแอนโธรน-ซัลฟิวริก (Dubois et al., 1951)

2.3. การวิเคราะห์สเปกโตรสโกปีอินฟราเรด

เพื่อวัตถุประสงค์ในการวิเคราะห์หมู่ฟังก์ชันอินทรีย์ AECCD ที่มี KBr ถูกกดลงในเม็ดสำหรับการวัดสเปกตรัมอินฟราเรด (IR) สเปกตรัมอินฟราเรดของตัวอย่างถูกกำหนดได้ภายใน 4000–400 cm− 1

Cistancheherbaส่งเสริมมีภูมิคุ้มกันการตอบสนอง

2.4. การทดลองในร่างกาย

2.4.1. การฉีดวัคซีนสัตว์

หนู C57BL/6 เพศเมียและหนู ICR (อายุ 6 สัปดาห์) จากมหาวิทยาลัยการแพทย์ซินเจียง (อุรุมชี ประเทศจีน) ถูกปรับสภาพให้เคยชินเป็นเวลา 3 วัน ขั้นตอนการทดลองทั้งหมดดำเนินการตามข้อบังคับของคณะกรรมการจริยธรรมการทดลองกับสัตว์ของห้องปฏิบัติการทรัพยากรชีวภาพและวิศวกรรมพันธุศาสตร์ที่สำคัญของซินเจียงในมหาวิทยาลัยซินเจียง (BRGE-AE001)

หนูเมาส์ถูกสร้างภูมิคุ้มกันใต้ผิวหนังด้วย OVA เพียงอย่างเดียวหรือ OVA ที่มีความเข้มข้นต่างกันของ AECCD และถูกกระตุ้นในวันที่ 14 ตามกลุ่มต่างๆ ดังต่อไปนี้ (หนู 6 ตัวในแต่ละกลุ่ม): กลุ่มควบคุม (0.9 เปอร์เซ็นต์ของ NaCl), กลุ่ม OVA ( 10 ug OVA), กลุ่ม AECCD-H (AECCD 800 ug), กลุ่ม OVA/ AECCD-L (10 ug OVA, AECCD 200 ug), กลุ่ม OVA/AECCD-M (10 ug OVA, AECCD 400 ug ), กลุ่ม OVA/AECCD-H (10 ug OVA, AECCD 800 ug) และกลุ่ม OVA/Alum (10 ug OVA, Alum100 ug) สูตรผสมวัคซีนใน 100 ไมโครลิตรของ NaCl 0.9 เปอร์เซ็นต์ ถูกฉีดที่ตำแหน่งที่แตกต่างกันสองตำแหน่ง (50 ไมโครลิตรที่แต่ละตำแหน่ง) ในผิวหนังด้านหลังของหนูเมาส์แต่ละตัว หลังจากฉีดวัคซีนแล้ว เก็บตัวอย่างเลือดจาก retro-orbital plexus และได้รับซีรั่มและเก็บไว้ที่ − 80 ◦C สำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติมของการตรวจหา IgG การเพิ่มจำนวนของเซลล์ม้ามและการตรวจหาไซโตไคน์ ชุดย่อยของทีเซลล์ เครื่องหมายพื้นผิว DCs และ Tregs ถูกดำเนินการหลังจากโปรโตคอลการฉีดวัคซีนเดียวกัน

2.4.2. การวิเคราะห์แอนติบอดี

IgG titers ในซีรัมที่ต้าน OVA ถูกกำหนดโดย ELISA ในวันที่ 14, 28, 42 และ 56 หลังจากการฉีดวัคซีนเบื้องต้นที่กล่าวถึงก่อนหน้านี้ (Zhang et al., 2018) IgG1 และ IgG2a ถูกวัดในวันที่ 21 การดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตร/630 นาโนเมตร ได้มาโดยการใช้เครื่องอ่าน (Bio-Rad, USA) ผลลัพธ์ของการตอบสนองของแอนติบอดีถูกแสดงออกเป็น IgG ไทเทอร์ และ IgG1 และไอโซไทป์ของ IgG2a ถูกแสดงออกเป็นการดูดกลืนแสงที่สอดคล้องกัน

2.4.3. การทดสอบการเพิ่มจำนวนเซลล์ม้าม

การสอบวิเคราะห์การงอกขยายของเซลล์ม้ามในหนูเมาส์ถูกดำเนินการด้วยชุดทดสอบ CCK-8 ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ในวันที่ 21 หลังจากการก่อภูมิคุ้มกันครั้งแรก ม้ามถูกแยกออกจากม้ามของหนูที่ถูกสร้างภูมิคุ้มกันและเม็ดเลือดแดงถูกสลายหลังจากการบดเคี้ยว ม้ามโต (1 × 106 เซลล์/หลุม) ถูกกระตุ้นด้วย OVA (10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร), OVA323-339 (10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร), ConA (10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) และ LPS (10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) สำหรับ สองวันและเซลล์ว่างถูกใช้เป็นตัวควบคุม กิจกรรมการเพิ่มจำนวนแสดงเป็นดัชนีการกระตุ้น (SI) ซึ่งคำนวณอัตราส่วนการดูดกลืนแสงของเซลล์ที่ถูกกระตุ้นต่อเซลล์ที่ไม่ถูกกระตุ้นภายใต้ความยาวคลื่น 570/630 นาโนเมตร

2.4.4. การวิเคราะห์ฟีโนไทป์ของ T-lymphocyte ในการระบายต่อมน้ำเหลืองและม้าม

สารแขวนลอยของม้ามโตจากต่อมน้ำเหลืองและม้ามในหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกันนั้นได้มาจากวิธีการที่กล่าวไว้ข้างต้น (Zhang et al., 2018) หลังการล้าง ตัวอย่าง (1 × 106 เซลล์/หลุม) ถูกย้อมเป็นเวลา 30 นาทีด้วยแอนติบอดีสำหรับมาร์คเกอร์ที่พื้นผิว ซึ่งรวมถึงแอนติ-CD3-PE, แอนติ-CD4-APC, แอนติ-CD8a-FITC, แอนติ-CD44-PE และแอนติ-CD62L-PE ระดับของที-ลิมโฟไซต์ถูกตรวจสอบโดยโฟลว์ไซโตเมทรี ผลลัพธ์ของฟีโนไทป์ของ T-lymphocyte ถูกแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของ CD4 บวก T เซลล์ ( เปอร์เซ็นต์ ), CD8 บวก T เซลล์ ( เปอร์เซ็นต์ ), CD44 บวก T เซลล์ ( เปอร์เซ็นต์ ) และ CD62L บวก ( เปอร์เซ็นต์ ) ที เซลล์

2.4.5. การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทริกของระดับไซโตไคน์

สำหรับวัตถุประสงค์ของการวิเคราะห์การย้อมสีไซโตไคน์ภายในเซลล์ เซลล์ลิมโฟไซต์ของม้ามถูกแยกและแปรรูปเป็นสารแขวนลอยแบบเซลล์เดียวในวันที่ 21 หลังจากการสร้างภูมิคุ้มกันครั้งแรก (Zhang et al., 2017) ตัวอย่าง (2 × 106 เซลล์/มล.) ที่ถูกกระตุ้นด้วย OVA (10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ถูกบ่มเป็นเวลา 4 ชั่วโมง ต่อมาเติม Golgistop เป็นเวลา 12 ชั่วโมง จากนั้น ตัวอย่างถูกล้าง, ปิดกั้นและย้อมด้วยแอนติ-CD4-APC หรือแอนติบอดีต้าน CD8a-FITC เป็นเวลา 30 นาที หลังจากการตรึงและการซึมผ่านด้วย Cyto fix/Cytoperm จากนั้นตัวอย่างถูกติดฉลากด้วยแอนติบอดีต้าน IL-4-PE หรือแอนติบอดีต้าน –IFN– -PE วิเคราะห์โฟลว์เพื่อกำหนดระดับของไซโตไคน์

2.4.6. การประมาณการการกระตุ้น DC และเซลล์ Treg ในม้าม

เพื่อตรวจสอบว่า DCs และ Tregs มีบทบาทในการปรับปรุงหรือไม่?มีภูมิคุ้มกันการตอบสนองเทียบกับ OVA ในวันที่ 3 หลังการฉีดวัคซีนครั้งแรก เซลล์เม็ดเลือดขาวม้ามจากหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกันถูกเก็บเกี่ยวเพื่อประเมินการสุกของกระแสตรง (Zhang et al., 2017) เซลล์ถูกบล็อกและบ่มตามลำดับด้วยแอนติ-CD11c-PE/FITC, แอนติ-CD40-PE, แอนติ-CD86-APC, แอนติ-CD80-APC และแอนติ-MHCII- FITC 30 นาที เซลล์ถูกวิเคราะห์โดยโฟลว์ไซโตเมทรี ในวันที่ 21 หลังจากการก่อภูมิคุ้มกันครั้งแรก Tregs ได้รับการทดสอบด้วยชุดการย้อมสีทีเซลล์ควบคุมหนูเมาส์ ม้ามโตถูกย้อมด้วยแอนติ-CD4-FITC สำหรับมาร์คเกอร์ที่ผิวเซลล์ ตามด้วยการย้อมสีภายในเซลล์ด้วยแอนติ-CD25-APC และแอนติ-Foxp3-PE ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ระดับของ CD4 บวก CD25 บวก Foxp3 plus เซลล์ถูกกำหนดหาโดยโฟลว์ไซโตเมทรี

Cistanche ปลูก สารสกัดส่งเสริม anมีภูมิคุ้มกันการตอบสนอง

2.5. การทดลองในหลอดทดลอง

2.5.1. การสร้าง DCs ความมีชีวิตของเซลล์ และระดับเอนโดท็อกซิน

DCs ที่ได้มาจากไขกระดูกของหนูเมาส์ C57BL/6 ได้รับมาตามวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Inaba et al., 1992) โดยย่อ เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงด้วยตัวกลางที่สมบูรณ์ RPMI-1640 (20 ng/mL GM-CSF และ 5 ng/mL IL-4) หลังจากหกวัน เซลล์ที่ถูกระงับทั้งหมดถูกรวบรวมเป็น DC ที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะสำหรับการสอบวิเคราะห์ที่ตามมา เปอร์เซ็นต์ของ CD11c บวก DCs ในเซลล์ที่ไม่เกาะติดกันถูกกำหนดหาเป็น 94 เปอร์เซ็นต์โดยโฟลว์ไซโตเมทรี

ความอยู่รอดของเซลล์ของ DCs และ splenocytes จากหนูเมาส์บน AECCD ถูกตรวจพบด้วยชุด CCK{{0}} ตามคำแนะนำของผู้ผลิต เซลล์จาก DCS และเซลล์ม้ามได้รับและจากนั้นกระตุ้นด้วยความเข้มข้นที่ต่างกันของ AECCD (0, 10, 100, 400, 800 และ 1600 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ความมีชีวิตของเซลล์แสดงเป็นอัตราส่วนของการดูดกลืนแสงของกลุ่มที่บำบัดกับการดูดกลืนแสงของกลุ่มควบคุม) × 100 เปอร์เซ็นต์

เพื่อความมุ่งประสงค์ของการยกเว้นผลของเอนโดทอกซินใน AECCD หลังจาก AECCD (100, 200 และ 400 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) และ LPS (100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ถูกบำบัดก่อนด้วย PMB (100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 60 นาที, DCs (5 × 105 เซลล์/มล.) ถูกบ่มด้วย AECCD ที่บำบัดแล้ว (100, 200 และ 400 ไมโครกรัม/มล.) และ LPS เป็นเวลา 12 ชั่วโมง หลังการรักษาข้างต้น ประเมินระดับของ CD40, CD86, CD80 และ MHCII

2.5.2. การวิเคราะห์ DC ฟีโนไทป์

ระดับของโมเลกุล costimulatory ถูกกำหนดเพื่อประเมินการสุกผ่านการทดลองในหลอดทดลอง ในวันที่หก DCs ถูกบำบัดด้วย AECCD (20, 100, 200 และ 400 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) หรือ LPS (100 นาโนกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 12 ชั่วโมง จากนั้น DCs ถูกย้อมด้วยโมเลกุลพื้นผิวและวิเคราะห์โดยโฟลว์ไซโตเมทรี

2.5.3. การผลิตไซโตไคน์โดย DCs ในหลอดทดลอง

ส่วนลอยเหนือตะกอนของการเพาะเลี้ยงเซลล์ถูกรวบรวมเพื่อวัดระดับของไซโตไคน์โดยใช้ชุดอุปกรณ์ ELISA หรือชุดทดสอบการไหลหลายตัววิเคราะห์ด้วยวิธีการ CBA ขั้นตอนการทดลองทั้งหมดดำเนินการตามคำแนะนำของผู้ผลิต

2.5.4. ปฏิกิริยาลิมโฟไซต์ผสมอัลโลจีนิก (MLR)

ม้ามโตจากหนูเมาส์ BALB/c ได้รับแบบปลอดเชื้อในตัวกลาง RPMI- 1640 (Zhang et al., 2018) C57BL/6 DC ที่เจริญเต็มที่ (ทำให้สุกในการมีอยู่ของความเข้มข้นที่ต่างกันของ AECCD หรือ LPS) ถูกบำบัดก่อนด้วยไมโตมัยซิน ซี 50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร เป็นเวลา 60 นาทีที่ 37 ◦ซ หลังจากการล้าง DCs ถูกผสมกับเซลล์ม้ามตามอัตราส่วน 1:5 หรือ 1:10 เป็นเวลา 2 วัน การเพิ่มจำนวนเซลล์ถูกกำหนดหาโดยการสอบวิเคราะห์ MTT

2.5.5. การทดลองการวางตัวเป็นกลางของสารยับยั้ง

ในการตรวจสอบเส้นทาง NF-κB ที่เกี่ยวข้องกับ TLR4- นั้น DC ที่เก็บรวบรวมถูกโหลดลงบนเพลต 24-หลุม แล้วบำบัดล่วงหน้าด้วย TAK-242 (5 ไมโครโมลาร์) หรือ PDTC (5 ไมโครโมลาร์) ตามลำดับ หลังจากการฟักตัว 1-ชม. เซลล์ถูกกระตุ้นด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ AECCD (100, 200 และ 400 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) หรือ LPS (100 นาโนกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้น ระดับการแสดงออกของโมเลกุลพื้นผิวและไซโตไคน์ในสารเหนือตะกอนของการเพาะเลี้ยงถูกกำหนดหาตามวิธีการที่อธิบายไว้ข้างต้น

3. ผลลัพธ์

3.1. FTIR สเปกโตรสโคปี

พีคการดูดกลืนหลักของ AECCD ในรูปที่ 1 คือพีคการดูดซับที่มีลักษณะเฉพาะของโครงสร้างไกลโคซิดิกซึ่งสอดคล้องกับการสั่นสะเทือนแบบยืดของ O–H ที่ 3342.95 ซม.– 1 แถบที่ 2933.54 ซม.– 1 มีลักษณะการดูดกลืนที่อ่อนแอของการสั่นสะเทือนแบบยืด C–H จุดสูงสุดที่ 1657.39 cm− 1 เกิดจากการสั่นของแรงดัดงอของ O–H การดูดซับที่ 141100 cm− 1 ถูกกำหนดให้เป็นการสั่นสะเทือนแบบ O–H หรือ C–H และ C–O พีคที่ 1018.38 cm− 1 ยังระบุการสั่นของแถบไกลโคซิดิก CO และ C–O–C

รูปที่ 1. สเปกตรัม FTIR ของ AECCD

3.2. การตอบสนองของแอนติบอดีในซีรัมจำเพาะต่อ OVA

ซีรั่มจากหนูเมาส์ที่สร้างภูมิคุ้มกันถูกทดสอบเพื่อตรวจหาการมีอยู่ของแอนติบอดีที่สร้างขึ้น (IgG, IgG1 และ IgG2a) ที่ต้าน OVA ดังที่แสดงในรูปที่ 2A ไทเทอร์ IgG ในหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกันด้วย OVA/AECCD-M กระตุ้น IgG ทั้งหมดที่สูงขึ้น (ระดับ: 220,000, 25{{30}}, 000 และ 250000) เทียบกับกลุ่ม OVA (ระดับ: 100,000, 100,000 และ 120,000) และเคยเป็น ใกล้กับกลุ่มสารส้ม (titers: 250,000, 250,000 และ 270,000) ในวันที่ 28, 42 และ 56 หลังการฉีดวัคซีนเบื้องต้น OVA/AECCD-M/H เพิ่มระดับ IgG1 อย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม OVA (P < 0.05)="" และความแตกต่างระหว่างกลุ่ม="" ova/aeccd-m/h="" และกลุ่ม="" alum="" ไม่มีนัยสำคัญ="" (p=""> 0.05) OVA/AECCD-M/H ยังเพิ่มระดับ IgG2a อย่างเห็นได้ชัดเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม OVA และกลุ่ม Alum (รูปที่ 2B และ C) (P < 0.05)="" ระดับ="" igg2a="" ที่เพิ่มขึ้นอาจป้องกันโรคที่ต้องใช้="">มีภูมิคุ้มกันการตอบสนอง.

รูปที่ 2. ไทเทอร์แอนติบอดีจำเพาะต่อ OVA และไอโซไทป์ของ IgG ในซีรัม ตัวอย่างซีรัมถูกรวบรวมหลังจากการสร้างภูมิคุ้มกันเบื้องต้นและบูสเตอร์สำหรับแอนติบอดีที่มี ELISA (A) ไทเทอร์ IgG ของซีรัมที่รวบรวมไว้ได้รับการประเมินในวันที่ 14, 28, 42 และ 56 หลังจากการก่อภูมิคุ้มกันครั้งแรก (B–C) IgG1 และ IgG2a ถูกวัดในวันที่ 21 หลังจากการก่อภูมิคุ้มกันครั้งแรก ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD (n=6) *P < 0.05="" เมื่อเปรียบเทียบกับ="">

3.3. ภูมิคุ้มกันของเซลล์

การเพิ่มจำนวนของเซลล์เม็ดเลือดขาวม้ามถูกตรวจสอบโดยการสอบวิเคราะห์ MTT ภายใต้การกระตุ้นด้วย OVA หรือ OVA{{0}} การวิเคราะห์การงอกขยายเปิดเผยว่า OVA/AECCD-M ทั้งคู่เพิ่มการเพิ่มจำนวนของเซลล์ม้ามอย่างเห็นได้ชัดหลังจากการสัมผัสกับ OVA, OVA323-339, Con A หรือ LPS ที่สัมพันธ์กับกลุ่ม OVA OVA และ OVA323-339 ปรับปรุงการตอบสนองการเพิ่มจำนวนที่สูงกว่าในกลุ่มสารส้มอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 3) (P <>

รูปที่ 3. การเพิ่มจำนวนของเซลล์ม้ามเมื่อทำการรักษาด้วย AECCD ในร่างกาย ม้ามโตถูกกระตุ้นใหม่ด้วย OVA, OVA323-339, ConA หรือ LPS และวัดโดยวิธี MTT ในวันที่ 21 หลังจากการสร้างภูมิคุ้มกันครั้งแรก การเพิ่มจำนวนเซลล์แสดงเป็นดัชนีการกระตุ้น (SI): (A–B) ดัชนีการกระตุ้นของ OVA และ OVA323-339 (C–D) ดัชนีการกระตุ้นของ ConA และ LPS ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD (n=5) *ป<0.05, **p="" <="" 0.01,="" and="" ***p="" <="" 0.001="" compared="" to="" ova;="" #p="" <="" 0.05="" and="" ##p="" <="" 0.01="" compared="" to="" ova/="">

3.4. การกระตุ้นชุดย่อยของทีเซลล์ในการระบายต่อมน้ำเหลืองและม้าม

ต่อมน้ำเหลืองและม้ามจากหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกันถูกเก็บเกี่ยวเพื่อตรวจหาชุดย่อยของทีเซลล์ในวันที่ 21 หลังการฉีดวัคซีนเบื้องต้น เปอร์เซ็นต์ของชุดย่อยของ T เซลล์ (CD4 plus , CD8 plus , CD44 บวก T เซลล์) จากต่อมน้ำเหลืองในกลุ่ม OVA/AECCD-M สูงกว่ากลุ่ม OVA และกลุ่ม Alum อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 4A–D) (P < 0.05).="" เปอร์เซ็นต์ของชุดย่อยของ="" t="" เซลล์="" (cd4="" plus="" ,="" cd8="" plus="" ,="" cd44="" plus="" และ="" cd62l="" บวก="" t="" เซลล์)="" ในม้ามมีค่าสูงกว่ากลุ่ม="" ova="" อย่างมีนัยสำคัญ="" (รูปที่="" 4e–j)="" (p="">< 0.05)="" การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่า="" aeccd="">มีภูมิคุ้มกันการตอบสนอง.

มะเดื่อ 4. ระดับของชุดย่อยทีเซลล์ในการระบายต่อมน้ำเหลืองและม้ามในร่างกาย ในวันที่ 21 หลังการฉีดวัคซีนครั้งแรก เซลล์จากต่อมน้ำเหลืองและม้ามถูกใช้เพื่อตรวจหาชุดย่อยของทีเซลล์โดยโฟลว์ไซโตเมทรี (A–D) เปอร์เซ็นต์ของ CD4 plus , CD8 plus และ CD44 plus T เซลล์ในต่อมน้ำเหลือง (E–J) เปอร์เซ็นต์ของ CD4 plus , CD8 plus , CD44 plus และ CD62L บวกทีเซลล์ในม้าม ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD (n=5) *P < {{10}}.05,="" **p="">< 0.01="" และ="" ***p="">< 0.001="" เมื่อเปรียบเทียบกับ="" ova;="" #p="">< 0.05="" และ="" ##p="">< 0.01="" เมื่อเปรียบเทียบกับ="">

3.5. ไซโตไคน์ที่หลั่งโดยเซลล์ม้ามที่กระตุ้นใหม่ในร่างกาย

'Th1/Th2 cytokines จากม้ามของหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกันถูกกำหนดโดยการย้อมสีภายในเซลล์ในวันที่ 21 หลังการฉีดวัคซีนครั้งแรก ระดับของ CD4 บวก IL-4, CD4 บวก IFN- และ CD8 บวก IFN- ในกลุ่ม OVA/AECCD-M สูงกว่าระดับในกลุ่ม OVA และกลุ่ม Alum อย่างมีนัยสำคัญ (P < 0="" .05,="" รูปที่="" 5).="" ความแตกต่างระบุว่า="" aeccd="" สามารถกระตุ้นการตอบสนองของ="" th1/="" th2="" โดยเฉพาะอย่างยิ่ง="" t-cell="">มีภูมิคุ้มกันการตอบสนอง.

รูปที่ 5. การวิเคราะห์ไซโตไคน์ที่จำเพาะต่อแอนติเจนในทีเซลล์ ในร่างกาย ม้ามโตจากหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกันถูกตรวจสอบในวันที่ 21 หลังจากการก่อภูมิคุ้มกันครั้งแรกโดยการย้อมสีไซโตไคน์ภายในเซลล์ (A) เปอร์เซ็นต์ของ CD4 บวก IL-4 (B–C) เปอร์เซ็นต์ของ CD4 บวก IFN- และ CD8 บวก IFN- ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD (n=5) *P < {{10}}.05="" และ="" **p="">< 0.01="" เมื่อเปรียบเทียบกับ="" ova;="" #p="">< 0.05="" เมื่อเปรียบเทียบกับ="">

3.6. DC ครบกำหนดและ Tregs ในร่างกาย

การเปิดใช้งาน DC สามารถเริ่มต้นภูมิคุ้มกันแบบปรับตัวได้ ผลของ AECCD ต่อการเจริญเต็มที่ของกระแสตรงในหนูเมาส์ที่ถูกสร้างภูมิคุ้มกันได้รับการประเมินในวันที่ 3 หลังจากการก่อภูมิคุ้มกันครั้งแรก OVA/AECCD-M ทำให้เกิดระดับสูงสุดของ CD40, CD80, CD86 และ MHCII บน DC ที่สัมพันธ์กับกลุ่ม OVA และความแตกต่างระหว่าง OVA/AECCD-M กลุ่มและกลุ่มสารส้มมีนัยสำคัญ (รูปที่ 6A–D) (P < 0.05)="" ความถี่ของ="" cd4="" บวก="" cd25="" บวก="" foxp3="" บวก="" tregs="" ในกลุ่ม="" ova/aeccd-m="" ต่ำกว่าในกลุ่ม="" ova="" อย่างมาก="" (รูปที่="" 6e)="" (p="">< 0.05)="" ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า="" aeccd="" สามารถเปิดใช้งาน="" dc="" และลดความถี่="" treg="">

มะเดื่อ 6. ผลกระทบของ AECCD ต่อการเจริญเติบโตของกระแสตรงและ Tregs ในร่างกาย ม้ามโตจากหนูเมาส์ ICR ถูกใช้เพื่อตรวจหาโมเลกุลที่ควบคุมการจำลองร่างกายบน DC และ Tregs ในวันที่ 3 หรือ 21 หลังจากการก่อภูมิคุ้มกันครั้งแรก (A–D) เปอร์เซ็นต์ของ CD40, CD86, CD80 และ MHCII บน CD11c บวก DC (E) เปอร์เซ็นต์ของ CD4 บวก CD25 บวก Foxp3 บวก Tregs ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD (n {{10}}) *P < 0.05="" และ="" **p="">< 0.01="" เมื่อเปรียบเทียบกับ="" ova;="" #p="">< 0.05="" และ="" ##p="">< 0.01="" เมื่อเปรียบเทียบกับ="">

3.7. การวิเคราะห์ความเป็นพิษต่อเซลล์และการปนเปื้อนของเอนโดทอกซิน

หลังการบำบัดด้วย AECCD ที่มีความเข้มข้นต่างกันเป็นเวลา 2 วัน เซลล์จาก DCS และเซลล์ม้ามของหนูเมาส์ถูกใช้เพื่อกำหนดหาความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เป็นไปได้ด้วยชุดอุปกรณ์ CCK-8 ไม่มีการตอบสนองการเพิ่มจำนวนที่ยับยั้งที่มีนัยสำคัญในความมีชีวิตของเซลล์ของ DC และเซลล์ม้ามเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 7A–B) (P > 0.05) ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงว่า AECCD ที่ความเข้มข้น 10–1600 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรไม่มีความเป็นพิษต่อเซลล์ที่มีนัยสำคัญต่อ DC และเซลล์ม้ามเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม (P > 0.05) ดังนั้น ความเข้มข้นของ AECCD ในการทดลองที่ตามมาถูกตั้งค่าให้ต่ำกว่า 1600 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร

เพื่อแยกการแทรกแซงของการปนเปื้อนเอนโดทอกซินในผลกระทบของ AECCD ต่อการกระตุ้นกระแสตรง มีการใช้ PMB ซึ่งเป็นยาปฏิชีวนะที่รู้จักกันอย่างแพร่หลายเนื่องจากฤทธิ์ทำให้เป็นกลางของ LPS เพื่อแยกการปนเปื้อนเอนโดทอกซิน (มอร์ริสันและจาคอบส์, 1976) ตามที่แสดงไว้ในรูปที่ 7C–F, CD40, CD80, CD86 หรือระดับการแสดงออกของ MHC-II ใน DC ที่บำบัดด้วย AECCD ต่อหน้า PMB ไม่แสดงการเปลี่ยนแปลงที่มีนัยสำคัญ ( พี > 0.05) อย่างไรก็ตาม การลดลงอย่างมากของระดับการแสดงออกของ CD40, CD80 CD86 และ MHC-II ถูกสังเกตพบใน DC ที่บำบัดด้วย LPS ต่อหน้า PMB (P < 0.001)="" ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า="" aeccd="">

รูปที่ 7. ความเป็นพิษต่อเซลล์และผลกระทบของ PMB ต่อการเจริญเต็มที่ของ DC ที่เหนี่ยวนำโดย AECCD (A–B) DCS และเซลล์ม้ามของหนูเมาส์ถูกเพาะเลี้ยงในการมีอยู่ของ AECCD เป็นเวลา 2 วันเพื่อกำหนดหาความอยู่รอดของเซลล์ด้วยวิธี MTT (C–F) DC ถูกบ่มเป็นเวลา 12 ชั่วโมงด้วย AECCD หรือ LPS ที่บำบัดก่อนในการมีอยู่/ไม่มี PMB เป็นเวลา 60 นาที เปอร์เซ็นต์ของ CD40, CD80, CD86 และ MHCII บน CD11c บวก DC ถูกกำหนดหา ข้อมูลถูกนำเสนอด้วยวิธี ± SD (n =3) **P < 0.01="" และ="" ***="" p="">< 0.001="" เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มที่มี="">

3.8. การเจริญเติบโตของฟีโนไทป์และการกระตุ้นการทำงานของ DCs ในหลอดทดลอง

จากการทดลองการสร้างภูมิคุ้มกันข้างต้น การเจริญเต็มที่ของฟีโนไทป์ของ DCs ถูกสำรวจเพิ่มเติมหลังจากการบำบัดด้วย AECCD ในหลอดทดลอง ในวันที่ 6 DCs ที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะถูกกระตุ้นด้วยความเข้มข้นที่กำหนดของ AECCD หรือ LPS เพื่อวิเคราะห์โมเลกุลของพื้นผิว การเจริญเต็มที่ของเซลล์ที่เหนี่ยวนำโดย AECCD มีลักษณะเฉพาะโดยการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเปอร์เซ็นต์ของ CD40, CD80 CD86 และ MHC II ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา (P < 0.001,="" รูปที่="" 8a–d)="" การเจริญเต็มที่ของฟีโนไทป์ที่คล้ายคลึงกันของ="" dc="" ยังถูกสังเกตหลังจากการกระตุ้นด้วย="" 100="" ng/ml="" lps="" ข้อมูลการวิเคราะห์พบว่า="" aeccd="">

จากผลลัพธ์ข้างต้น AECCD ได้ปรับปรุงการเจริญเติบโตของฟีโนไทป์ของ DC เพื่อที่จะสังเกตผลของ AECCD ต่อฟังก์ชัน DC ในหลอดทดลอง ความสามารถของ DC ที่ได้รับการบำบัดด้วย AECCD ในการกระตุ้นการเพิ่มจำนวนทีเซลล์ที่เป็นสารก่อมะเร็งใน MLR ที่อัตราส่วน DC-splenocyte ที่ 1:5 หรือ 1:10 คือ สอบสวน DC ที่บำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ AECCD ทำให้เกิดการเพิ่มจำนวนทีเซลล์ที่มีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับ DC ที่ไม่ผ่านการบำบัด (รูปที่ 8E–F) (P < 0.001)="" การสุกของกระแสตรงสามารถกระตุ้นการผลิตไซโตไคน์ได้="" ถัดไป="" เหนือตะกอนของ="" dc="" ที่บำบัดด้วย="" aeccd="" หรือ="" lps="" ถูกตรวจพบโดยชุด="" elisa="" ระดับของ="" il-12="" และ="" tnf-="" ในส่วนลอยเหนือตะกอนของ="" dc="" เพิ่มขึ้นอย่างมากในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา="" (p="">< 0.001,="" รูปที่="">

รูปที่ 8 การเจริญเติบโตของฟีโนไทป์และการกระตุ้นการทำงานของ DCs เมื่อได้รับการรักษาด้วย AECCD ในหลอดทดลอง (A–D) ในวันที่ 6, DCs ถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นที่กำหนดของ AECCD หรือ LPS เป็นเวลา 12 ชั่วโมง เซลล์ถูกย้อมด้วยแอนติบอดีและกำหนดหาโดยโฟลว์ไซโตเมทรี ความเข้มของการเรืองแสงเฉลี่ย (MFI) ของ CD40, CD80, CD86 และ MHCII บน CD11c บวก DC (E–F) C57BL/6 DC ที่บำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ AECCD หรือ LPS ถูกผสมกับเซลล์ม้ามจาก BALB/c หนูเมาส์ที่อัตราส่วน 1:5 หรือ 1:10 ใน MLR เป็นเวลา 2 วัน การเพิ่มจำนวนเซลล์ถูกกำหนดหาโดยการสอบวิเคราะห์ MTT (G–H) ส่วนลอยเหนือตะกอนการเพาะเลี้ยงของ DC ถูกตรวจสอบสำหรับ IL-12 และ TNF-a โดยชุดเครื่องมือ ELISA ข้อมูลถูกนำเสนอด้วยวิธี ± SD (n =3) *P < 0.05,="" **p="">< 0.01="" และ="" ***p="">< 0.001="" เมื่อเปรียบเทียบกับ="" dc="" ที่ไม่ผ่านการบำบัด="" #p="">< 0.05="" เมื่อเปรียบเทียบกับ="">

3.9. TLR4 รีเซพเตอร์สำหรับ AECCD บน DCs

DCS สามารถเริ่มต้นการส่งสัญญาณของเซลล์โดยตัวรับเมมเบรน ถึงกำหนดบทบาทของ TLR4 ในการเข้าร่วมในการเจริญเต็มที่ของกระแสตรงที่บำบัดด้วย AECCD หลังจากการบำบัดล่วงหน้าด้วยตัวยับยั้ง TLR4 TAK-242 กระแสตรงถูกกระตุ้นด้วยความเข้มข้นที่กำหนดของ AECCD จากนั้นสถานะการกระตุ้นของ DC จะถูกตรวจสอบโดยโฟลว์ไซโตมิเตอร์ . ระดับการแสดงออกของไซโตไคน์ในส่วนลอยเหนือตะกอนของวัฒนธรรมถูกวิเคราะห์โดยชุดทดสอบการไหลของสารวิเคราะห์หลายตัว การเพิ่มการควบคุมของ CD40, CD80, CD86 และ MHC-II ที่เหนี่ยวนำโดย AECCD ถูกยับยั้งอย่างมีนัยสำคัญโดยการปิดกั้นวิถีทาง TLR4 (P < 0.01,="" รูปที่="" 9a–d)="" นอกจากนี้="" เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมที่ไม่ได้รับการรักษา="" การบล็อก="" tlr4="" ด้วย="" tak-242="" มีผลยับยั้งการผลิต="" ifn-="" ,="" tnf-="" และ="" il-6="" อย่างมีนัยสำคัญ="" (p="">< 0.01,="" รูปที่="" 9e–g)="">

รูปที่ 9 การเปิดใช้งานการส่งสัญญาณ TLR4 ใน DC ที่ได้รับการรักษาด้วย AECCD หลังจากที่ DC ที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะได้รับการบำบัดด้วย AECCD ในกรณีที่ไม่มีหรือมีอยู่ของ TAK-242 เป็นเวลา 12 ชั่วโมง การเจริญเต็มที่ของฟีโนไทป์ถูกตรวจสอบโดยโฟลว์ไซโตมิเตอร์และระดับของไซโตไคน์ในสารลอยเหนือตะกอนนั้นใช้วิธี CBA (A–D) เปอร์เซ็นต์ของ CD40, CD80, CD86 และ MHCII บน CD11c บวก DCs (E–G) ระดับของ IFN- , TNF- และ IL-6 ข้อมูลถูกนำเสนอด้วยวิธี ± SD (n=3) **P < 0.01="" และ=""><0.001 compared="" to="" the="" group="" with="">

3.10. การเปิดใช้งาน DC โดย AECCD ผ่าน TLR4-เส้นทาง NF-κB ที่เกี่ยวข้อง

เพื่อตรวจสอบว่าการแสดงออกของโมเลกุลพื้นผิวและไซโตไคน์ของ DC ที่ได้รับการบำบัดด้วย AECCD นั้นถูกควบคุมโดย NF-κB หลังจาก DC ที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะที่ปรับสภาพด้วย PDTC ตัวยับยั้ง NF-κB ถูกกระตุ้นด้วย AECCD เป็นเวลา 12 ชั่วโมง ระดับการแสดงออกของโมเลกุล costimulatory และไซโตไคน์ถูกวัดโดย ไซโตมิเตอร์การไหล ระดับของ CD40, CD80 CD86 และ MHC-II ที่เหนี่ยวนำโดย AECCD ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมที่ไม่ได้รับการรักษาโดยการปิดกั้นเส้นทาง NF-κB ด้วยตัวยับยั้งที่สอดคล้องกัน (P < 0.001,="" รูปที่="" 10a–d)="" ในเวลาเดียวกัน="" การแสดงออกของ="" ifn-="" ,="" tnf-="" และ="" il-6="" ยังถูกยับยั้งอย่างมีนัยสำคัญโดย="" pdtc="" (p="">< 0.05,="" รูปที่="">

รูปที่ 10. การมีส่วนร่วมของ NF-κBในการเปิดใช้งาน DC ที่เกิดจาก AECCD DC ถูกบำบัดด้วย AECCD ในกรณีที่ไม่มีหรือมี PDTC เป็นเวลา 24 ชั่วโมง (A–D) เปอร์เซ็นต์ของ CD40, CD80, CD86 และ MHCII บน CD11c บวก DC ถูกกำหนดหาโดยโฟลว์ไซโตเมทรี (E–G) ระดับของ IFN- , TNF- และ IL-6 ใน supernatant ถูกกำหนดโดยวิธี CBA ข้อมูลถูกนำเสนอเป็นค่าเฉลี่ย ± SD (n=3)*P < 0.05,="" **p="">< 0.01="" และ="" ***p="">< 0.001="" เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มที่มี="">

4. การอภิปราย

ปัจจุบัน โพลีแซ็กคาไรด์หลายชนิดจาก TCM ได้รับการตรวจสอบว่าเป็นสารเสริมสำหรับวัคซีนสำหรับมนุษย์และสัตว์ (Sun et al., 2018; Rey- Ladino et al., 2011) ในการศึกษานี้ ผลของการปรับภูมิคุ้มกันของ AECCD และกลไกการกระตุ้นหลักของ DCs ได้รับการตรวจสอบ ในร่างกาย และ ในหลอดทดลอง โดยชุดการทดลองเพื่อประเมินการปรับตัวมีภูมิคุ้มกันการตอบสนองต่อต้าน OVA และสถานะการเปิดใช้งานของ DCS การทดลองในร่างกายแสดงให้เห็นว่า AECCD ส่งเสริมการผลิตไอโซไทป์ของ IgG และ IgG ที่จำเพาะต่อ OVA อย่างน่าทึ่ง การเพิ่มจำนวนของเซลล์ม้ามที่เพิ่มขึ้น และการกระตุ้นทีเซลล์และไซโตไคน์ที่เหนี่ยวนำ (IL-4/IFN-) อย่างน่าทึ่ง นอกจากนี้ AECCD ยังปรับปรุงการเจริญเติบโตของกระแสตรงและแสดง Tregs ที่ลดลง การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าการทำงานของ AECCD เป็น adjuvant ที่มีประสิทธิภาพนั้นเกิดขึ้นได้โดยการส่งเสริมการสุกของกระแสตรงและการยับยั้ง Tregs การทดลองในหลอดทดลองบ่งชี้ว่า AECCD ส่งเสริมการเจริญเติบโตของฟีโนไทป์ของ DCs ส่วนไซโตไคน์ และกิจกรรม allostimulatory ผ่านเส้นทาง NF-κB ที่เกี่ยวข้องกับ TLR4- ผลการทดลองเหล่านี้บ่งชี้ว่า AECCD มีศักยภาพที่สำคัญในการเป็นตัวกระตุ้นภูมิคุ้มกัน

สารเสริมแต่ละตัวมีลักษณะภูมิคุ้มกันเฉพาะตัวต่อแอนติเจนที่แตกต่างกัน ซึ่งบ่งชี้ว่าสารเสริมมีศักยภาพในการประยุกต์ใช้กับโรคต่างๆ ประการแรก คุณสมบัติเสริมของการบริหารร่วมกันของ AECCD กับ OVA ได้รับการทดสอบโดยพิจารณาถึงผลกระทบต่อการปรับตัวมีภูมิคุ้มกันการตอบสนองในหนู การศึกษาจำนวนมากแสดงให้เห็นว่ากิจกรรมกระตุ้นภูมิคุ้มกันเป็นสัดส่วนโดยตรงกับขนาดยาภายในช่วงที่กำหนด (Li et al., 2020; Reed et al., 2020; Zhang et al., 2017) ในทำนองเดียวกัน ในการศึกษา การวิเคราะห์แอนติบอดีและไอโซไทป์เปิดเผยว่า AECCD ในช่วงขนาดยาที่แน่นอนเพิ่มการตอบสนองของ IgG, IgG1 และ IgG2a ที่จำเพาะต่อ OVA และขนาดปานกลางของ AECCD คือขนาดยาที่เหมาะสมที่สุด ในการทดลองต่อมา เราตรวจสอบผลการกระตุ้นของ AECCD เป็นหลักในขนาดปานกลางที่เหมาะสม ขนาดปานกลางของ AECCD เพิ่มการตอบสนองของ splenocyte proliferation ในหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกันอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งบ่งชี้ว่า AECCD ส่งเสริมเซลล์มีภูมิคุ้มกันคำตอบต่อต้าน OVA ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า AECCD ช่วยเพิ่มทั้งทางร่างกายและระดับเซลล์มีภูมิคุ้มกันคำตอบซึ่งมีความเกี่ยวข้องกับศักยภาพเสริม
การออกฤทธิ์ของทีเซลล์อย่างเป็นรูปธรรมอาจเอื้อต่อการขจัดโรค ระหว่างมีภูมิคุ้มกันการตอบสนอง, ทีเซลล์ที่ถูกกระตุ้นอาจไปถึงเนื้อเยื่อน้ำเหลืองทุติยภูมิ ซึ่งรวมถึงม้ามและต่อมน้ำเหลือง (Steinman, 2012) AECCD ขนาดปานกลางช่วยปรับปรุงประสิทธิภาพของวัคซีนได้อย่างมีประสิทธิภาพ เนื่องจากสามารถเพิ่มการตอบสนองของเซลล์ CD4, CD8, CD44 และ CD62L อย่างมีนัยสำคัญในการระบายต่อมน้ำเหลืองและม้าม เซลล์ CD8 T ที่ถูกกระตุ้นเป็นสื่อกลางในการกำจัดเชื้อโรคโดยการคัดหลั่ง IFN- เซลล์ CD4 T ที่งอกขยายถูกสร้างความแตกต่างไปเป็นเซลล์ Th1 และเซลล์ Th1 เซลล์ Th1 หลั่ง Th1 cytokine เพื่อกระตุ้นการเพิ่มจำนวนเม็ดเลือดขาวและเซลล์ Th2 หลั่ง Th2 cytokine เพื่อเพิ่มการผลิตแอนติบอดี (Seder et al., 2008) ในการศึกษา ระดับของ CD4 บวก IL-4, CD4 บวก IFN- และ CD8 บวก IFN- เพิ่มขึ้นโดย AECCD ที่ขนาดยาปานกลาง AECCD ทำให้เกิดการตอบสนอง Th1 / Th2 ที่สมดุลและกำกับมีภูมิคุ้มกันการตอบสนองโดยการเปลี่ยนเครือข่ายไซโตไคน์

สารเสริมควรกระตุ้นภูมิคุ้มกันเฉพาะและควบคุมผลลัพธ์ของมีภูมิคุ้มกันการตอบสนองโดยการควบคุมสถานะ DCs ในหลายจุด (Carrera Silva et al., 2013) การแสดงออกของโมเลกุลพื้นผิวบน DC เป็นตัวบ่งชี้ที่สำคัญสำหรับการประเมินการสุกของกระแสตรง และโดยทั่วไปมีความสัมพันธ์กับความแตกต่างของ T ลิมโฟไซต์ (Steinman, 2012) ในการศึกษานี้ AECCD ได้ปรับปรุงการแสดงออกของโมเลกุล costimulatory และอำนวยความสะดวกในการเจริญเต็มที่ของ DC เมื่อใช้เป็นตัวเสริมกับ OVA นี่อาจเป็นวิธีหนึ่งที่ AECCD ส่งเสริมการสร้างร่างกายและเซลล์มีภูมิคุ้มกันคำตอบ. ในขณะเดียวกัน AECCD ยังลดความถี่ของ CD4 บวก CD25 บวก Foxp3 บวก Tregs ซึ่งให้ภูมิคุ้มกันที่สมดุลหลังการฉีดวัคซีน ผลลัพธ์ของเราสนับสนุนการค้นพบล่าสุดว่าพอลิแซ็กคาไรด์หลายชนิดจาก TCM เป็นตัวควบคุมการสุกของกระแสตรง (Bo et al., 2019; Li et al., 2015; Zhu et al., 2016)

การเปิดใช้งานของการปรับตัวมีภูมิคุ้มกันคำตอบโดยพอลิแซ็กคาไรด์แอดจูแวนต์เป็นสื่อกลางโดยหลักผ่านการจดจำโดยตัวรับจำเพาะของ DCs (Akira, 2004) DCs ที่เปิดใช้งานผ่านเส้นทางที่เกี่ยวข้องกับ TLR4-สามารถหลั่งสารกระตุ้นภูมิคุ้มกันต่างๆ เป็นตัวกลางที่สำคัญต่อการติดเชื้อ (Akira, 2007) ดังนั้น ในการทดลองครั้งต่อๆ มา เราจึงสำรวจเบื้องต้นเกี่ยวกับกลไกระดับโมเลกุลของผลกระตุ้นของ AECCD ต่อ DCs ในหลอดทดลอง เพื่อที่จะสังเกตความเป็นพิษต่อเซลล์ของ AECCD ความอยู่รอดของเซลล์ของ DCs และเซลล์ม้ามจากหนูจะถูกกำหนดในตอนแรก AECCD ที่ 10–1600 ug/mL ไม่แสดงความเป็นพิษต่อเซลล์ต่อ DC และเซลล์ม้าม ในการแยกแยะการปนเปื้อนของ LPS เราได้เตรียม AECCD ล่วงหน้าด้วย PMB ระดับการแสดงออกของ CD40, CD80 CD86 และ MHC-II ใน DC ที่บำบัดด้วย AECCD ไม่ได้ลดลง แต่ PMB ยับยั้งการแสดงออกของโมเลกุล costimulatory ใน DC ที่บำบัดด้วย LPS อย่างมีประสิทธิผล นี่แสดงให้เห็นว่า AECCD ปราศจากการปนเปื้อนของเอนโดทอกซิน ถัดไป สถานะการเปิดใช้งานของ DC ถูกสำรวจเพิ่มเติม คล้ายกับ DC ที่บำบัดด้วย LPS ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา DC ที่บำบัดด้วย AECCD เพิ่มระดับของ CD40, CD80 CD86 และ MHC II รวมทั้งการผลิตของไซโตไคน์ที่มีการอักเสบซึ่งเป็น พารามิเตอร์ของการเจริญเติบโตตามหน้าที่ของ DC ใน MLR ความสามารถในการงอกขยายของทีเซลล์ที่เป็นอัลโลเจนีกถูกประเมินผลใน DC ที่บำบัดด้วย AECCD AECCD สามารถไพรม์และกระตุ้นทีเซลล์ allogeneic ขั้นแรก DCs ได้รับการบำบัดล่วงหน้าด้วย Mitomycin C แล้วจึงล้างอย่างทั่วถึงเพื่อเอารีเอเจนต์นี้ออก ดังนั้นผลกระทบของ AECCD ต่อ DCs ไม่น่าจะเกิดจากกิจกรรมการกลายพันธุ์ ข้อมูลการทดลองเปิดเผยว่า DCs การเจริญเติบโตของฟีโนไทป์และการกระตุ้นการทำงานอาจเกิดจากการกระตุ้นจาก AECCD

พอลิแซ็กคาไรด์ TCM จำนวนหนึ่งอาจกระตุ้นการสุกของ DCs ผ่าน TLR4 NF-κBในฐานะสมาชิกของเส้นทางปลายน้ำที่เกี่ยวข้องกับ TLR4- มีบทบาทสำคัญในการควบคุมการเจริญเติบโตทางฟีโนไทป์และการทำงานของ DC และกระตุ้นการแสดงออกของยีนต่างๆ ที่เกี่ยวข้องมีภูมิคุ้มกันคำตอบ(Qi et al., 2016; Re and Strominger, 2001; Wei et al., 2016; Zhu et al., 2013) จากการทดลองในหลอดทดลอง เราพบว่า AECCD ส่งเสริมการเจริญเติบโตของกระแสตรงและ TAK-242 (ตัวยับยั้ง TLR4) และ PDTC (ตัวยับยั้ง NF-κB) ลดระดับการแสดงออกของ CD40, CD80, CD86 และ MHC -II และระดับการหลั่งของ IFN- , TNF- และ IL-6 ใน DC ที่ได้รับการรักษาด้วย AECCD การค้นพบนี้บ่งชี้ว่า TLR4 และ NF-κB เกี่ยวข้องกับการกระตุ้น DC และการหลั่งไซโตไคน์ที่เกิดจาก AECCD ผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องกับการศึกษาที่รายงานก่อนหน้านี้เนื่องจาก AECCD เป็นสารเสริมที่ปรับปรุงการกำหนดเป้าหมายแอนติเจนบน DCs

โดยสรุป ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่า AECCD ทำให้เกิดการตอบสนองที่คงทนและ Th1/Th2 โดยเฉพาะอย่างยิ่ง T-cell ที่เป็นสื่อกลางมีภูมิคุ้มกันการตอบสนองต่อต้าน OVA AECCD เปิดใช้งาน DCs ผ่านทางเส้นทาง NF-κB ที่เป็นสื่อกลางของ TLR4- ซึ่งช่วยเสริมการผลิตเครื่องกระตุ้นภูมิคุ้มกันและการเพิ่มจำนวน T เซลล์ allogeneic อาจใช้ AECCD เป็นตัวเสริมที่มีประสิทธิภาพในการพัฒนาวัคซีน อย่างไรก็ตาม จะทำการวิเคราะห์ส่วนประกอบที่แม่นยำเพื่อพิจารณาว่าส่วนประกอบใดใน DC ที่เปิดใช้งาน AECCD โดยมุ่งเน้นที่กลไกเกี่ยวกับวิธีที่ AECCD กระตุ้นการสร้างภูมิคุ้มกัน รวมถึงการเพิ่มประสิทธิภาพของสูตรผสมเสริมและเส้นทางการบริหารวัคซีน เราจะสำรวจเพิ่มเติมเกี่ยวกับส่วนประกอบภูมิคุ้มกันและคุณสมบัติเสริมเฉพาะของ AECCD เพื่อจุดประสงค์ในการออกแบบวัคซีนเสริมที่มีประสิทธิภาพเพื่อต่อต้านโรคติดเชื้อ

Cistanche ประโยชน์ของ Deserticolaส่งเสริมและมีภูมิคุ้มกันการตอบสนอง

ผลงานของผู้เขียน

การได้มา การวิเคราะห์ และการตีความข้อมูล: Shuangshuang Feng, Xiumei Yang, Xiang Weng เขียนแบบร่างต้นฉบับ: Shuangshuang Feng, Xiang Weng

การจัดหาเงินทุน:เอเลี่ยน จาง.

ตรวจสอบ:เอเลี่ยน จาง.

วิธีการ:เอเลี่ยน จาง, บิน หวาง.

การกำกับดูแล:เอเลี่ยน จาง.

ประกาศความสนใจการแข่งขัน

ผู้เขียนไม่มีส่วนได้เสียที่เกี่ยวข้องกับการศึกษานี้

รับทราบ

งานนี้ได้รับการสนับสนุนโดยมูลนิธิวิทยาศาสตร์ธรรมชาติแห่งชาติของจีน [ให้ทุนหมายเลข 31960164 และ 31660259] ผู้ให้ทุนไม่มีบทบาทในการออกแบบการศึกษา การรวบรวมข้อมูล และการวิเคราะห์ การตัดสินใจจัดพิมพ์ การเตรียมการ หรือต้นฉบับ

ผู้เขียนขอขอบคุณ Prof. Xingguo Zheng และ Jiang He (อุรุมชี ประเทศจีน) ที่กรุณาให้วัสดุและการระบุตัวตน

อ้างอิง

Akira, S. , 2004. ครอบครัวตัวรับค่าผ่านทาง: โครงสร้างและหน้าที่. เซมิน. อิมมูนอล 16, 1–2.

Akira, KS, 2007. ส่งสัญญาณไปยัง NF-κBโดยตัวรับค่าผ่านทาง เทรนด์โมล เมดิ. 18, 156–163.

Banchereau, J. , Steinman, RM, 1998. เซลล์ Dendritic และการควบคุมภูมิคุ้มกัน ธรรมชาติ 392, 245–252.
Bo, R. , Liu, Z. , Zhang, J. , Gu, P. , Ou, N. , Sun, Y. , Hu, Y. , Liu, J. , Wang, D. , 2019 กลไกของ Lycium barbarum polysaccharides liposomes ในการกระตุ้นเซลล์เดนไดรต์ของหนู คาร์โบไฮเดรต โพลีม. 205, 540–549.
Cao, P. , Wu, S. , Wu, T. , Deng, Y. , Zhang, Q. , Wang, K. , Zhang, Y. , 2020 บทบาทสำคัญของโพลีแซคคาไรด์จากยาจีนโบราณ - คลีนซิ่งปอด และยาต้มล้างพิษจากการระบาดของโควิด-19 คาร์โบไฮเดรต โพลีม. 240,m116346
Carrera Silva, EA, Chan, PY, Joannas, L., Errasti, AE, Gagliani, N., Bosurgi, L., Jabbour, M., Perry, A., Smith-Chakmakova, F., Mucida, D., Cheroutre, H. , BurstynCohen, T. , Leighton, JA, Lemke, G. , Ghosh, S. , Rothlin, CV, 2013. มาจากเซลล์ T
โปรตีน S ประกอบการส่งสัญญาณตัวรับ TAM ในเซลล์เดนไดรต์เพื่อควบคุมขนาดของมีภูมิคุ้มกันการตอบสนอง. ภูมิคุ้มกัน 39, 160–170.
คณะกรรมการเภสัชตำรับจีน พ.ศ. 2535 มาตรฐานยาของกระทรวงสาธารณสุขจีน ยาสมุนไพรจีน เล่มที่ 1 สื่อคณะกรรมการเภสัชตำรับจีน ปักกิ่ง พี. 1.

Dong, Q. , Yao, J. , Fang, J. , Ding, K. , 2007. ลักษณะโครงสร้างและฤทธิ์ทางภูมิคุ้มกันของพอลิแซ็กคาไรด์สกัดเย็นสองชนิดจากCistancheทะเลทรายวายซี หม่า. คาร์โบไฮเดรต ความละเอียด 342 (10), 1343–1349.
Dubois, M. , Gilles, K. , Hamilton, JK, Rebers, PA, Smith, F. , 1951. วิธีการสีสำหรับการกำหนดน้ำตาล ธรรมชาติ 168, 167.
Fu, Z. , Fan, X. , Wang, X. , Gao, X. , 2018.CistanchesHerba: ภาพรวมของคุณสมบัติทางเคมี เภสัชวิทยา และเภสัชจลนศาสตร์ เจ. เอธโนฟาร์มาคอล. 219, 233–247.
Giuseppe, DG, Rino, R. , Didierlaurent, AM, 2018. Correlates of adjuvanticity: การทบทวน adjuvants ในวัคซีนที่ได้รับอนุญาต เซมิน. อิมมูนอล 39, 14–21.
Inaba, K. , Inaba, M. , Romani, N. , Aya, H. , Deguchi, M. , Ikehara, S. , Muramatsu, S. , Steinman, RM, 1992. การสร้างเซลล์เดนไดรต์จำนวนมากจากเมาส์ การเพาะเลี้ยงไขกระดูกเสริมด้วยปัจจัยกระตุ้นอาณานิคมแกรนูโลไซต์/มาโครฟาจ เจ. เอ็กซ์พี. เมดิ. 176, 1693–1702.
Li, P. , Wang, F. , 2015. Polysaccharides: ผู้สมัครของ adjuvants วัคซีนที่มีแนวโน้ม ดิสคอฟเธอ 9, 88–93.
Li, X. , Zhao, R. , Li, H. , De, Z. , Wu, H. , 2012. Deproteinization ของ polysaccharides จาก stigma maydis โดยวิธี Sevag โฆษณา มาเตอร์ ความละเอียด 340, 416–420.
Li, J. , Li, J. , Zhang, F. , 2015. ผลภูมิคุ้มกันของยาสมุนไพรจีนต่อการสุกและการทำงานของเซลล์เดนไดรต์ เจ. เอธโนฟาร์มาคอล. 171, 184–195.
Li, T. , Zhang, L. , Jin, C. , Xiong, Y. , Cheng, YY, Chen, K., 2020 สารสกัดจากดอกทับทิมควบคุมการงอก ความแตกต่าง และการตายของเซลล์ 3T3- แบบสองทิศทาง เซลล์ L1 ผ่านการควบคุมการแสดงออก PPAR ที่มีสื่อกลางโดยเส้นทางการส่งสัญญาณ PI3K-AKT ไบโอเมด เภสัช. 131, 110769.
Morrison, DC, Jacobs, DM, 1976. การผูกมัดของ polymyxin B กับไขมัน A ส่วนหนึ่งของ lipopolysaccharides ของแบคทีเรีย อิมมูโนเคมี 13, 813–818.
Park, MJ, Ryu, HS, Kim, JS, Lee, HK, Kang, JS, Yun, J., Kim, SY, Lee, MK, Hong, JT, Kim, Y., 2014. Platycodon grandiflorum polysaccharide กระตุ้นเซลล์เดนไดรต์ การเจริญเติบโตผ่านการส่งสัญญาณ TLR4 เคมีอาหาร. ท็อกซิคอล 72, 212–220.
Qi, C. , Guo, Y. , Zhou, W. , Zhang, Y., 2016. พอลิแซ็กคาไรด์ที่กระตุ้นภูมิคุ้มกันที่เกี่ยวข้องกับตัวรับโทร 4- ที่เกี่ยวข้อง: โครงสร้างหลัก ความสัมพันธ์ของกิจกรรม และแบบจำลองการโต้ตอบที่เป็นไปได้ คาร์โบไฮเดรต โพลีม. 149, 186–206.
Re, F. , Strominger, JL, 2001. Toll-like receptor 2 (TLR2) และ TLR4 กระตุ้นเซลล์เดนไดรต์ของมนุษย์อย่างแตกต่าง เจ. ไบโอล. เคมี. 276, 37692–37699.
Reed, SG, Orr, MT, Fox, CB, 2013. บทบาทสำคัญของสารเสริมในวัคซีนสมัยใหม่ แนท. เมดิ. 19, 1597–1608.
Reed, SG, Tomai, M., Gale, MJ, 2020. ขอบเขตใหม่ในการพัฒนาวัคซีนเสริม สกุลเงิน ความคิดเห็น อิมมูนอล 65, 97–101.
Rey-Ladino, J. , Ross, AG, Cripps, AW, Mcmanus, DP, Quinn, R. , 2011 ผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติและการค้นหาสารเสริมวัคซีนชนิดใหม่ วัคซีน 29, 6464–6471
Schijns, V., Fernandez ´ Ejada, A., Barjaktarovi, A., Bouzalas, I., Lavelle, EC, 2020. การมอดูเลตของมีภูมิคุ้มกันคำตอบใช้ adjuvants เพื่ออำนวยความสะดวกในการฉีดวัคซีนรักษาโรค อิมมูนอล รายได้ 296, 169–190.
Seder, RA, Darrah, PA, Roederer, M., 2008. คุณภาพของทีเซลล์ในหน่วยความจำและการป้องกัน: นัยสำหรับการออกแบบวัคซีน แนท. รายได้อิมมูนอล 8, 247–258.
Steinman, RM, 2012. การตัดสินใจเกี่ยวกับเซลล์เดนไดรต์: อดีต ปัจจุบัน และอนาคต อันนุ. รายได้อิมมูนอล 30, 1–22.
Sun, B. , Yu, S. , Zhao, D. , Guo, S. , W, X. , Zhao, K. , 2018. โพลีแซคคาไรด์เป็นวัคซีนเสริม วัคซีน 36, 5226–5234.
Tian, ​​H. , Liu, Z. , Pu, Y. , Bao, Y. , 2019 ผลกระทบของภูมิคุ้มกันที่กระทำโดยโพลีแซ็กคาไรด์ของ Poria Coco ผ่านการส่งสัญญาณ TLR4 / TRAF6 / NF-κB ในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย ไบโอเมด เภสัช. 112, 108709.
Wei, W. , Xiao, HT, Bao, WR, Ma, DL, Leung, CH, 2016 TLR-4 อาจไกล่เกลี่ยเส้นทางการส่งสัญญาณของการแสดงออกของไซโตไคน์ที่เกิดจาก Astragalus polysaccharide RAP ของเซลล์ RAW264.7 เจ. เอธโนฟาร์มาคอล. 179, 243–252.
Zhang, A. , Yang, Y. , Wang, Y. , Zhao, G. , Yang, X. , Wang, D. , Wang, B. , 2017. สารสกัดน้ำเสริมจาก Artemisia rupestris L. ปรับปรุงมีภูมิคุ้มกันคำตอบผ่านเส้นทางส่งสัญญาณ TLR4 วัคซีน 35, 1037–1045
Zhang, A. , Yang, X. , Li, Q. , Yang, Y. , Zhao, G. , Wang, B. , Wu, DC, 2018 กิจกรรมกระตุ้นภูมิคุ้มกันของโพลีแซคคาไรด์ที่สกัดด้วยน้ำจากCistancheทะเลทรายเป็นพืชเสริมในหลอดทดลองและในร่างกาย โพล หนึ่ง 13, e0191356.
Zhao, B. , Lian, J. , Wang, D. , Li, Q. , Zhang, A. , 2019. การประเมินสารสกัดน้ำของCistancheทะเลทรายเป็นโพลีแซ็กคาไรด์เสริมสำหรับวัคซีนป้องกันไข้หวัดใหญ่ตามฤดูกาลในหนูวัยผู้ใหญ่ อิมมูนอล เลตต์. 213, 1–8.
Zhou, L. , Liu, Z. , Wang, Z. , Yu, S. , Long, T. , Zhou, X. , Bao, Y. , 2017 Astragalus polysaccharides ออกแรงกระตุ้นภูมิคุ้มกันผ่าน TLR4-สื่อกลาง MyD88-เส้นทางการส่งสัญญาณขึ้นอยู่กับ ในหลอดทดลอง และในร่างกาย ตัวแทนวิทย์-UK 7, 44822.
Zhu, J. , Zhang, Y. , Shen, Y. , Zhou, H. , Yu, X. , 2013. Lycium barbarum polysaccharides ก่อให้เกิดตัวรับ Toll-like 2- และ 4- ฟีโนไทป์ที่เป็นสื่อกลางและการทำงาน การเจริญเติบโตของเซลล์ dendritic murine โดยการกระตุ้น NF-κB มล. เมดิ. ตัวแทน 8, 1216–1220.
Zhu, N., Lv, X., Wang, Y., Li, J., Liu, Y., Lu, W., Yang, L., Zhao, J., Wang, F., Zhang, LW, 2016 . การเปรียบเทียบผลภูมิคุ้มกันของพอลิแซ็กคาไรด์จากสมุนไพรธรรมชาติสามชนิดและการดูดซึมของเซลล์ในเซลล์เดนไดรต์ อินเตอร์ เจ. ไบโอล. แมคโครโมล 93, 940–951.