Calpastatin ป้องกันการบาดเจ็บ Podocyte ที่เกิดจาก Angiotensin II ผ่านการบำรุงรักษา Autophagy
Mar 17, 2022
สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:ali.ma@wecistanche.com
อิมาเน่ เบญจดา1,3, เบลส โรบิน1,3, โจเอลล์ เปเรซ2, ยานน์ เฉลิมกูร1, แอนนา ชิปองต์1, มารีน คามู1,มาธิลด์ เลมอยน์1, Lea Guyonnet1, เฮเลเน่ ลาซาเรธ1, เอ็มมานูเอล เลตาแวร์นิเยร์2, Carole He´nique1,ปิแอร์-หลุยส์ ทาโรซ์1และ Olivia Lenoir1
1Université de Paris, PARCC, Inserm, ปารีส, ฝรั่งเศส; และ2Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, ปารีส, ฝรั่งเศส
ค่าการทำนายที่ชัดเจนของโปรตีนในปัสสาวะในโรคไตเรื้อรังได้รับการกำหนดอย่างมั่นคง เช่นเดียวกับบทบาทที่ทำให้เกิดโรคของแองจิโอเทนซิน II ที่ส่งเสริมการลุกลามของโรคไตโดยมีสิ่งกีดขวางการกรองไฟในไตที่เปลี่ยนแปลงไป การบาดเจ็บที่โพโดไซต์ และการเกิดแผลเป็นของโกลเมอรูไล ที่นี่เราพบว่าความดันโลหิตสูงที่เกิดจาก angiotensin II เรื้อรังยับยั้งautophagyการไหลออกของ glomeruli ของหนู การลบ Atg5 (ยีนที่เข้ารหัสโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ autophagy) โดยเฉพาะใน podocyte ส่งผลให้เกิด podocytopathy ที่เกิดจาก dangio tensin II ที่เร่งขึ้น อัลบูมินูเรียที่เน้นเสียง และโรคหลอดเลือดตีบตัน สิ่งนี้บ่งชี้ว่า autophagy เป็นกลไกป้องกันที่สำคัญใน podocyte ในสภาวะนี้ Angiotensin-II กระตุ้นกิจกรรม calpain ใน podocytes ยับยั้งautophagyการไหลออก Podocytes จากหนูที่มีการแสดงออกของยีนตัวยับยั้ง calpain ภายนอกคัลปาสแตตินแสดง podocyte ที่สูงขึ้นautophagyที่การตรวจวัดพื้นฐานที่ทนต่อการยับยั้งที่ขึ้นกับ angiotensin II นอกจากนี้ autophagy อย่างยั่งยืนด้วยคัลปาสแตตินความเสียหายของ podocyte ที่ จำกัด และ albuminuria การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าความดันโลหิตสูงมีผลทำให้เกิดโรคต่อโครงสร้างและการทำงานของไต ส่วนหนึ่งจากการกระตุ้นของแคลเพนที่นำไปสู่การปิดกั้นของ autophagy ของ podocyte การค้นพบนี้เผยให้เห็นกลไกดั้งเดิมที่ความดันโลหิตสูงที่เป็นสื่อกลางของ angiotensin II ยับยั้ง autophagy ผ่านการคัดเลือก calpain ที่เกิดจากแคลเซียมซึ่งมีผลที่ตามมาในกรณีที่เกิดความไม่สมดุลโดยคัลปาสแตตินกิจกรรม. ดังนั้นการป้องกันการลดลงของคาลเพนเป็นสื่อกลางในautophagyอาจเป็นกลยุทธ์การรักษาแบบใหม่สำหรับโรคไตที่เกี่ยวข้องกับการทำงานของระบบ renin-angiotensin สูง
คำสำคัญ: แองจิโอเทนซิน II;autophagy; คัลปาสแตติน; ความดันโลหิตสูง พอดไซต์
คำชี้แจงการแปล
ด้วยบทบาทที่สำคัญของ autophagy ในการพัฒนาไตโรค การปรับทางเภสัชวิทยาของautophagyอาจเป็นกลยุทธ์ที่มีแนวโน้มในการป้องกันและรักษาหลายรายไตโรคต่างๆ ในทำนองเดียวกัน พบว่าการออกฤทธิ์ของคาลเพนมากเกินไปใน podocytes มีผลเสียต่อการทำงานของ podocyte ในขณะที่ไม่ได้ระบุกลไกการทำงานที่เป็นอันตราย ในที่นี้ เราแสดงหลักฐานว่าคาลเพนเชื่อมโยงการกระทำที่เป็นอันตรายของแองจิโอเทนซิน II กับการปิดล้อมที่เป็นอันตรายของautophagyใน podocytes และแนะนำว่าการยับยั้ง calpain อาจเป็นเป้าหมายการรักษาที่มีแนวโน้มสำหรับโรค podocyte บางส่วนผ่านการบำรุงรักษา autophagy ของ podocyte
คลิกเพื่อCistanche deserticola ma สำหรับ โรคไตเรื้อรัง
ความดันโลหิตสูงเป็นอันดับสองรองจากโรคเบาหวานซึ่งเป็นสาเหตุสำคัญของโรคเรื้อรังที่ลุกลามไตโรคที่ 1–3 และแม้แต่ความดันโลหิตสูงเพียงเล็กน้อยก็เป็นปัจจัยเสี่ยงที่เป็นอิสระต่อโรคไตระยะสุดท้าย4 การศึกษาทดลองจำนวนมากขึ้นได้เน้นย้ำถึงความสำคัญของพอดไซต์ในการพัฒนาของไตบาดเจ็บ. การสูญเสีย podocytes และการเปลี่ยนแปลงของ microvascular แบบก้าวหน้าปรากฏขึ้นในช่วงต้นโดยที่ไตทำงานลดลงในโรคไตจากความดันโลหิตสูงในการทดลอง5 ในผู้ป่วย การขับถ่ายของ podocytes ที่ทำงานได้ในปัสสาวะแสดงให้เห็นว่าเป็นตัวบ่งชี้ที่ละเอียดอ่อนและเฉพาะสำหรับภาวะครรภ์เป็นพิษ 6,7 และผู้ป่วยที่เป็นโรคไตอักเสบมีนัยสำคัญ ความหนาแน่นของ glomerular podocytes ต่ำกว่า Didไตผู้บริจาค8,9 นอกจากนี้ บทบาทที่ทำให้เกิดโรคของ angiotensin II (AngII) ที่ส่งเสริมการลุกลามของโรคไตนั้นเป็นที่ยอมรับกันดี ไม่เพียงแต่ในภาวะความดันโลหิตสูงเท่านั้น แต่ยังรวมถึงโรคไตหลายชนิดด้วย10–21
ภาวะความดันโลหิตสูงในไตส่งผลให้เกิดการยืดของเส้นเลือดฝอย ความเสียหายของเยื่อบุผนังหลอดเลือด และการกรองโปรตีนในไตที่เพิ่มขึ้นทำให้เกิดการยุบตัวของไตและโรคหลอดเลือดตีบตัน มันยังออกแรงโดยตรงต่อโครงสร้างไต ทำให้เกิดการตอบสนองด้านกฎระเบียบที่ส่งสัญญาณเพื่อชดเชย เรนิน-แองจิโอเทนซิน-อัลโดสเตอโรน (RAAS) ที่เป็นระบบและเป็นระบบที่กระตุ้นกระตุ้นการเจริญเกินปกติและการสังเคราะห์ปัจจัยการซึมผ่านของหลอดเลือด พร้อมกัน podocytes แสดงสัญญาณแคลเซียม 22,23 และปรับเปลี่ยนรูปร่างของพวกเขาตามตัวรับ AngII 1 (AT1) – การกระตุ้นขึ้นอยู่กับ 24–28 กลไกการปรับตัวเหล่านี้จะปรับตัวไม่ได้ในระยะยาว ในที่สุดก็นำไปสู่โรคไต AT1 ไกล่เกลี่ยการมีส่วนร่วมของ RAAS ที่โดดเด่นสำหรับความดันโลหิตและสภาวะสมดุลของเกลือและน้ำ สารยับยั้งเอนไซม์ที่ทำให้เกิด angiotensin-converting และ AT1 blockers ใช้ในการรักษาความดันโลหิตสูงและภาวะหัวใจล้มเหลวในผู้ป่วย ที่น่าสนใจคือ ตัวบล็อคทั้งสองยังแสดงผลการป้องกันต่อไตการทำงาน.
Autophagy แสดงให้เห็นว่าจำเป็นสำหรับการรักษาสภาวะสมดุลของเซลล์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในเซลล์ postmitotic29,30 และโดยเฉพาะอย่างยิ่งใน podocytes31–34ออโตฟาจีเป็นระบบการย่อยสลายที่เกี่ยวข้องกับไลโซโซมสำหรับโปรตีนไซโตพลาสซึมที่มีอายุยืนยาวและออร์แกเนลล์ที่ผิดปกติ 35,36 และเกี่ยวข้องกับการสะสมของโปรตีนและออร์แกเนลล์ในออโตฟาโกโซม การก่อตัวของออโตฟาโกโซมขึ้นอยู่กับการชักนำของยีนหลายชนิดรวมถึง Map1lc3a/b, Beclin 1 และแท็ก 37 มีหลักฐานเพิ่มขึ้นเรื่อยๆ ว่าการผิดปกติของวิถี autophagic มีส่วนเกี่ยวข้องในการเกิดโรคของไตในวัยชราและหลายประการไตโรคต่างๆ เช่น ไตวายเฉียบพลัน โรคไต polycystic อายุมากขึ้น และโรคไตจากเบาหวาน 31,32,38–41
ระเบียบของautophagyใน podocytes สรีรวิทยาและเหนือสิ่งอื่นใดในบริบททางพยาธิวิทยาไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด เมื่อเร็ว ๆ นี้เราได้แสดงให้เห็นว่า autophagy ของ podocyte เป็นอิสระจากเป้าหมายทางกลไกของการควบคุม rapamycin (mTOR) ในสภาวะทางสรีรวิทยา ทำให้เซลล์ประเภทนี้เป็นข้อยกเว้น การกระตุ้นด้วย AT1 กระตุ้นการสังเคราะห์โปรตีนและการหมุนเวียนโปรตีนในเซลล์ ดังนั้นเราจึงให้เหตุผลว่าการกระตุ้น RAAS อาจส่งผลต่อการกระตุ้นการหมุนเวียนของโปรตีนและการสร้างโปรตีน
ในการศึกษานี้ เรามุ่งเน้นไปที่บทบาทของ AngIIsignaling ใน podocyteautophagyระเบียบข้อบังคับ. เราระบุโปรตีเอส calpains ที่กระตุ้นด้วยแคลเซียมซึ่งเป็นสื่อกลางในการปิดกั้นผลเรื้อรังของ AngII ต่อ podocyteautophagy. นอกจากนี้ เราพบว่าสารยับยั้งคาลเพนภายในร่างกายคัลปาสแตตินสามารถป้องกันการยับยั้ง autophagy ที่ขึ้นกับ AngII และการบาดเจ็บของ podocyte ระหว่างความดันโลหิตสูง
การค้นพบนี้เผยให้เห็นกลไกดั้งเดิมโดยที่ความดันโลหิตสูงที่อาศัย AngII ยับยั้งautophagyผ่านการคัดเลือกแคลเพนที่เกิดจากแคลเซียมที่มีผลทำให้เกิดโรคในกรณีที่เกิดความไม่สมดุลจากการทำงานของแคลปาสแตติน
วิธีการ
สัตว์
คัลปาสตาตินหนูเมาส์แปลงพันธุ์ (CSTTg) ถูกจัดเตรียมโดย Dr. E. Letavernier.43 หนูเมาส์ที่มีการหยุดชะงักจำเพาะของ podocyte ของยีน Atg5 (Nphs2.cre Atg5lox/lox) ถูกสร้างขึ้นตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 31 โดยการข้าม Nphs2.cre mice44 กับ Atg5lox/lox mice45 บนพื้นหลัง C57BL6/J หนู Nphs2.cre Atg5lox/lox และหนูเพศผู้กลุ่มควบคุม อายุ 10 ถึง 12 สัปดาห์ ถูกนำมาใช้ในการศึกษานี้ แบบจำลองความดันโลหิตสูงเกิดขึ้นโดยการฉีด sc ของ AngII (Sigma-Aldrich, A9525) ที่ขนาดยา 1 มก./กก./นาที เป็นเวลา 4 ถึง 6 สัปดาห์ผ่านทางปั๊มขนาดเล็กแบบออสโมติก (Alzet Corp, model 2006) ปั๊มถูกฝัง sc ที่ด้านหลังระหว่างสะบักและสะโพก หนูได้รับเกลือเสริม (3 เปอร์เซ็นต์ NaCl) ในอาหาร หนูเมาส์ Atg5lox/lox (ชนิดป่า [WT]) ถูกใช้เป็นตัวควบคุมในการศึกษาทั้งหมด สำหรับเกลือ deoxycorticosterone acetate (DOCA) ที่มีแบบจำลองการลดระดับ nephron หนูเพศผู้ที่โตเต็มวัยได้รับการผ่าตัดไตข้างเดียวด้านซ้าย สองสัปดาห์หลังจากการตัดไต พวกเขาได้รับเม็ด DOC ที่มีการปลดปล่อย 21-วัน (การวิจัยเชิงนวัตกรรมของอเมริกา) ที่ฝัง sc A เม็ดที่สองถูกฝัง 3 สัปดาห์หลังจากการฝังครั้งแรก หนูทุกตัวได้รับ NaCl 0.9 เปอร์เซ็นต์ในน้ำดื่มและเสียชีวิตหลังจากใช้ DOC 6 สัปดาห์ 46 การทดลองดำเนินการตามหลักเกณฑ์ด้านสัตวแพทย์ของฝรั่งเศสและกำหนดโดยประชาคมยุโรปสำหรับการใช้สัตว์ทดลอง (L358-86/ 609EEC) และได้รับการอนุมัติจากกระทรวงวิจัยของฝรั่งเศสและคณะกรรมการจริยธรรมการวิจัยของมหาวิทยาลัยในท้องถิ่น (APAFIS-7646 และ -22373)
การทดลองเพาะเลี้ยงพอดไซต์เบื้องต้น
โพโดไซต์ปฐมภูมิที่แตกต่างกันได้รับการเพาะเลี้ยงตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 47,48 โดยสังเขป คอร์เทกซ์ไตที่เพิ่งแยกได้ใหม่ถูกผสมและย่อยโดยคอลลาเจนเนส I (Gibco, 17100-017) ในสถาบัน Roswell Park Memorial 1640 (Life Technologies, 61870-044) จากนั้นเนื้อเยื่อจะถูกส่งผ่านตัวกรองเซลล์ขนาด 70 มม. และ 40 มม. (BD Falcon, 352340 และ 352350) Glomeruli ซึ่งยึดติดกับตัวกรองเซลล์ขนาด 40 มม. ถูกกำจัดออกด้วยน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS; Life Technologies, 10010023) þ 0.5 เปอร์เซ็นต์ของโบวีนในซีรัมอัลบูมิน (Eurobio, HALALB07-65) ที่ฉีดภายใต้แรงกดดันแล้วล้างสองครั้ง ในพีบีเอส โกลเมอรูลีที่แยกออกมาใหม่ถูกชุบในจานอย่างดี 6-จานดีในสถาบัน Roswell Park Memorial Institute 1640 (Gibco, 61870036) เสริมด้วยซีรัมของลูกวัวในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ และเพนิซิลลิน/สเตรปโตมัยซิน 1 เปอร์เซ็นต์ (Life Technologies, 15140122) เพื่อให้พอดไซต์ออกจากโกลเมอรูลี และเติบโต การเพิ่มคุณค่าของ Podocyte ได้รับการยืนยันโดยการวิเคราะห์ Western blot ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 31,48,49 (รูปเพิ่มเติม S1) Podocytes ถูกเพาะเลี้ยงในกรณีที่ไม่มีอยู่หรือมีอยู่ของ bafilomycin A1 (100 nmol/l, Sigma-Aldrich, B1793) เป็นเวลา 4 ชั่วโมง สำหรับการทดลองอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ โพโดไซต์ปฐมภูมิถูกเคลือบบนฉลากจาน 4 จาน (Dutcher, 055071) จากนั้น Podocytes ได้รับการแก้ไขในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 10 นาทีและผ่านกระบวนการอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์
การทดสอบกิจกรรม Calpain
กิจกรรมคาลเพนภายในเซลล์ถูกกำหนดในโพโดไซต์ปฐมภูมิตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 50–52 เซลล์ทั้งหมด 100000 เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงใน24-จานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหลุมในสถาบัน Roswell Park Memorial Institute 1640 ที่เสริมด้วยทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ เซรั่มน่องและเพนิซิลลิน 1 เปอร์เซ็นต์ / สเตรปโตมัยซิน หลังจากช่วงเวลาเพาะเลี้ยงที่ระบุ ตัวกลางถูกแทนที่ด้วยสารละลายไบคาร์บอเนต Krebs-Ringer HEPES (KRH) (pH 7.4) ที่มี CaCl2 4 มิลลิโมลาร์ โดยมีหรือไม่มีสารยับยั้งคาลเพน 10 มิลลิโมลาร์-1 และบ่มเป็นเวลา 10 นาทีก่อนการเติม ของซับสเตรตคาลเพน 50 มิลลิโมลาร์ N-succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-อะมิโน-4-เมทิลคูมาริน (Sigma-Aldrich, S6510) หลังจากระยะฟักตัว 90- นาที การออกฤทธิ์ของคาลเพนถูกกำหนดโดยความแตกต่างระหว่างการเรืองแสงของ FL (วัดที่การกระตุ้น 360 นาโนเมตรและการปล่อย 430 นาโนเมตร) ที่มีและไม่มีตัวยับยั้งคาลเพน-1
หยดตะวันตก
โพโดไซต์ปฐมภูมิถูกขีดข่วนด้วยบัฟเฟอร์สำหรับทดสอบการตกตะกอนด้วยกัมมันตภาพรังสี 80 มล. ที่มีฟอสฟาเตสและตัวยับยั้งโปรตีเอส วัดความเข้มข้นของโปรตีนด้วย BCA Protein Assay Kit (เมอร์ค ชีวเคมี, 71285) อิเล็กโตรโฟรีส์โปรตีน 20 ไมโครกรัมบนเจลพรีคาสต์ Criterion XT (12 เปอร์เซ็นต์ Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124) โปรตีนถูกถ่ายโอนไปยังเมมเบรนโพลีไวนิลลิดีนไดฟลูออไรด์ (Thermo Fischer Scientific, 88518) หลังจากการปิดกั้นในนม 5 เปอร์เซ็นต์ใน Tris Buffer Saline 0.1 เปอร์เซ็นต์ Tween (TBS-T) เยื่อหุ้มถูกบ่มด้วยโพลีโคลนัลแอนติ-LC3 ของกระต่าย (1:1000, Cell Signaling Technology, 2575), โพลีโคลนัลแอนติ-ATG5 ของกระต่าย (1:2000, เทคโนโลยีการส่งสัญญาณของเซลล์, 2630), โพลีโคลนัลแอนติ–ซีเควสโตโซม 1 ของหนูตะเภา 1 (SQSTM1)/P62 (1:10,000, PROGEN, GP62), โพลิโคลนัลกระต่ายแอนติ–calpain 1 โดเมน IV (1:1000, Abcam, ab39170 ), กระต่าย โพลีโคลนัล แอนติ–calpain 2 ปลายอะมิโน-เทอร์มินอลของโดเมน I (1:1000, Abcam, ab39165), โมโนโคลนัล IgG1 ต้านแคลเพนของหนูเมาส์ (1:1000, เทคโนโลยีชีวภาพซานตาครูซ, sc-32325), กระต่าย แอนติ podocin (1:1000, Abcam, ab50339), แอนติ-เนฟรินของหนูตะเภา (1:500, PROGEN, GP-N2) และโมโนโคลนัลแอนติ-tubulin ของหนู (1:5000, Abcam, ab6160) แอนติบอดี หลังการล้าง เยื่อหุ้มเซลล์ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีที่เชื่อมโยงกับฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดส (1:2000, Cell Signaling Technology, 7074, 7076, 7077) การตรวจจับสัญญาณเฉพาะดำเนินการโดยใช้ ECL Chemiluminescent Kit (Bio-Rad, 170-5070) บนอุปกรณ์ LAS 4000 (ฟูจิ) การวิเคราะห์ความหนาแน่นด้วยซอฟต์แวร์ ImageJ (สถาบันสุขภาพแห่งชาติ) ใช้สำหรับการหาปริมาณ
การวัดความดันโลหิตและการประเมินทางสรีรวิทยา
ความดันโลหิตซิสโตลิกของหนูเมาส์ถูกบันทึกโดยใช้วิธีการผูกหาง (Visitech Systems Inc., BP-2000) ทำการวัด 10 ครั้งจากเมาส์แต่ละตัว จากนั้นจึงหาค่าเฉลี่ย วัดความดันโลหิตซิสโตลิกที่การตรวจวัดพื้นฐาน (อายุ 12 สัปดาห์) และวัดทุกสัปดาห์จนกระทั่งสิ้นสุดระยะเวลาการรักษา หนูทั้งหมดถูกจัดวางในกรงที่มีการเผาผลาญโดยให้ดื่มน้ำได้ฟรีเป็นเวลา 6-ชั่วโมงในการรวบรวมปัสสาวะ ความเข้มข้นของครีเอตินีนในปัสสาวะและยูเรียในพลาสมาถูกวิเคราะห์ด้วยสเปกโตรโฟโตเมตรีโดยใช้วิธีคัลเลอริเมตริก (Olympus, AU400) การขับอัลบูมินในปัสสาวะถูกวัดโดยใช้การทดสอบอิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์เฉพาะสำหรับการหาปริมาณอัลบูมินในปัสสาวะของหนูเมาส์ (Crystal Chem, 80630)
มิญชวิทยา
ไตเก็บเกี่ยวและตรึงในฟอร์มาลินที่มีบัฟเฟอร์ PBS 4 เปอร์เซ็นต์ ส่วนที่ฝังด้วยพาราฟิน (หนา 3- มม.) ถูกย้อมโดย Masson'strichrome เพื่อประเมินสัณฐานวิทยาของไต ความผิดปกติในไตได้รับการจัดลำดับโดยพิจารณาจากการมีอยู่และความรุนแรงของความผิดปกติของส่วนประกอบ รวมถึงโรคไต การขยายตัวของ mesangial การฝ่อหรือการหล่อของท่อ และการเกิดพังผืด ประเมินสัดส่วนของ sclerotic glomeruli โดยการตรวจคนตาบอดอย่างน้อย 50 glomeruli ต่อไตส่วน.
การย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ของไตและพอโดไซต์ปฐมภูมิ
โพโดไซต์ปฐมภูมิแบบตายตัวถูกบล็อกใน TBS-T 3 เปอร์เซ็นต์ของโบวีนซีรัมอัลบูมินและฟักในชั่วข้ามคืนที่ 4 องศาด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิสำหรับหนูตะเภา anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C) และสารต้านกระต่าย - โปรตีนเรืองแสง FL สีเขียว (GFP; 1:500, Abcam, ab290) หลังจากล้าง TBS-T แล้ว แอนติบอดีทุติยภูมิที่คอนจูเกต FL fluorophore-conjugated แอนติบอดีต้านหนูตะเภา IgG AF594-แอนติบอดีคอนจูเกต (JacksonImmunoResearch, 706-585-148) และลาต้านกระต่าย IgG AF488-แอนติบอดีคอนจูเกต ( อินวิโตรเจน, A21206) ถูกนำไปใช้ รูปภาพถูกถ่ายโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง Zeiss 2 ฟุต, ซอฟต์แวร์ AxioCam HRccamera และ Axiovision 4.3
สำหรับฟอร์มาลินตรึงพาราฟินฝังตัว (FFPE)ไต, ส่วน (3 มม.) ถูกกำจัดพาราฟินออกและไฮเดรตและการดึงแอนติเจนถูกดำเนินการในบัฟเฟอร์ซิเตรตที่ให้ความร้อน (pH 6) จากนั้นแบ่งส่วนต่างๆ ให้ซึมผ่านด้วยไทรทัน 0.1 เปอร์เซ็นต์ (Euromedex) และบล็อกใน TBS-T 3% เซรั่มอัลบูมินจากวัวก่อนการฟักตัวของแอนติบอดีข้ามคืนที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เราใช้ยาต้านเนฟรินจากแพะ (1:100, PROGEN, GP -N2), แอนติ-SQSTM1/P62 ของหนูตะเภา (1:1000, PROGEN, GP-62C), แอนติ-GFP ของกระต่าย(1:1000, Abcam, ab290), สารต้าน Podocalyxin ของแพะ (PODXL; 1: 1000, Bio-Techne, AF-1556) และแอนติบอดีต่อต้านกระต่าย–Wilm's Tumor 1 (WT1;1:100, Abcam, ab192) แอนติบอดีรองคือแอนติบอดีที่ควบรวมกัน Alexa488 และ Alexa 568 จาก Invitrogen นิวเคลียสถูกย้อมด้วยสีน้ำเงินโดยใช้ Hoechst ติดตั้งสไลด์โดยใช้สารยึดติดเรืองแสง (Dako, S3023) โฟโตไมโครกราฟถ่ายด้วยโฟโตไมโครสโคป Zeiss Axiophoto และซอฟต์แวร์ Axiovision การหาปริมาณแบบกึ่งอัตโนมัติในฟิจิถูกใช้สำหรับการหาปริมาณของพื้นที่ nephrin-positive และ PODXLþ ต่อส่วนของไตบนอย่างน้อย 30 glomeruli ต่อหนูหนึ่งตัว Podocytenumber ถูกนับเป็นจำนวนของนิวเคลียส WT1þ ต่อส่วนของไตบนอย่างน้อย 30 โกลเมอรูไลต่อหนูเมาส์
ขั้นตอนกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด
คอร์เทกซ์ไตชิ้นเล็กๆ (1 มม.3) ถูกตรึงในเกรดกลูตาราลดีไฮด์ 3 เปอร์เซ็นต์ (Electron Microscopy Sciences) เป็นเวลา 1 ถึง 30 วัน และล้างสามครั้งใน PBS ตัวอย่างถูกโพสต์ฟิกซ์ใน 1 เปอร์เซ็นต์ osmium tetroxide 0.1 M (Electron Microscopy Science) ใน 0.1 M PBS (pH 7.4) และล้างในน้ำ ตัวอย่างถูกทำให้แห้งในเกรดแอลกอฮอล์และโพรพิลีนออกไซด์ 100 เปอร์เซ็นต์ (Electron Microscopy Science) การแทรกซึมของเรซินดำเนินการดังนี้: ผสม Epikote 812 และโพรพิลีนออกไซด์ในอัตราส่วน 1:1 เป็นเวลา 30 นาที ตามด้วยผสม Epikote 812 และโพรพิลีนออกไซด์ในอัตราส่วน 1:2 สำหรับอุณหภูมิห้องข้ามคืน ตัวอย่างถูกฝังในแคปซูลเจลาตินขนาด 4 มม. ใน Epikote 812 100 เปอร์เซ็นต์ และถูกโพลีเมอร์ในเตาอบที่ร้อนถึง 60 องศาเซลเซียส ส่วน Ultrathin ถูกตัดด้วย UFC7 ultramicrotome (Leica MicrosystemsGmbH) และนำไปวางบน Gilder Grids 200 mesh (Electron Microscopy Science) พวกเขาย้อมเคาน์เตอร์ด้วยยูแรนิลอะซิเตต 7 เปอร์เซ็นต์ (การกระจาย LFG) และตะกั่วซิเตรตของเรย์โนลด์ (LFG) ตัวอย่างได้รับการตรวจสอบในกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน JEM1011 (JEOL) ด้วยกล้อง CCD Orius SC1000 (Gatan) ซึ่งทำงานด้วยซอฟต์แวร์ Digital Micrograph (Gatan) เพื่อได้มา
โรคไตซิสทานช์
อาร์เรย์ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสเชิงปริมาณ
โกลเมอรูไลที่แยกออกมาใหม่ถูกแช่แข็งในรีเอเจนต์ QIAzol Lysis (Qiagen) ที่-80 องศา การสกัด RNA ทั้งหมดโดยใช้วิธีฟีนอลได้รับการประมวลผลตามคำแนะนำของผู้ผลิต cDNA ถูกสังเคราะห์โดยใช้ RT2 First Strand Kit (Qiagen, 330401) และปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบเรียลไทม์ (PCR) ถูกดำเนินการโดยใช้ Custom RT2 Profiler PCR Array (Qiagen, CLAM36771C) กับ RT2 SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen, 330502) . เพลต PCR เชิงปริมาณทำงานบนวงจร Applied Biosystems StepOnePlus แต่ละอาร์เรย์มีการควบคุมคุณภาพสำหรับประสิทธิภาพการถอดรหัสย้อนกลับและการปนเปื้อนของ DNA ของจีโนม การวิเคราะห์ PCR เชิงปริมาณดำเนินการโดยใช้ 2-วิธี DDCT ด้วยความช่วยเหลือของศูนย์วิเคราะห์ข้อมูล GeneGlobe (www. Qiagen. com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) และแสดงออก เมื่อพับ Log2 เปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของยีน
ในการวิเคราะห์โปรตีนซิลิโก
ในการทำนายซิลิโกของไซต์ที่มีความแตกแยกคาลเพนด้วย DeepCalpain (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org) และ CaMPDB (http://) calpain.org/) เครื่องมือออนไลน์ ลำดับกรดอะมิโนโปรตีนของหนูเมาส์ได้มาจาก Uniprot (https://www.uniprot.org) ผลลัพธ์จะกลับมาทำงานต่อในตารางเสริม S1 และ S2
การวิเคราะห์ทางสถิติ
กราฟทั้งหมดแสดงถึงค่าส่วนบุคคลและค่าเฉลี่ย±SEM การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism เวอร์ชัน 9 การเปรียบเทียบระหว่าง 2 กลุ่มดำเนินการโดยใช้ parametricStudent t-test เมื่อตัวอย่างผ่านการทดสอบความปกติของ Anderson-Darling และ D'Agostino และการทดสอบ F เพื่อความเท่าเทียมกันของความแปรปรวน มิฉะนั้นจะใช้การทดสอบ Mann-Whitney แบบไม่อิงพารามิเตอร์ เปรียบเทียบระหว่างหลายกลุ่มโดยใช้1-การวิเคราะห์ทางหรือ 2-วิธีของการวิเคราะห์ความแปรปรวนตามด้วยการทดสอบเปรียบเทียบหลายรายการกับการแก้ไขของ Simak ค่าของ P < 0.05="" ถือว่ามีนัยสำคัญ*p="">< 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><>
รูปที่ 1|Angiotensin II (AngII) D ความดันโลหิตสูงที่เกิดจากอาหารที่มีเกลือสูง (HSD) จะยับยั้งการทำงานของไตautophagy. (a–c) อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ของ Podocalyxin (PODXL; red) และ P62 (สีเขียว) ใน glomeruli (a,a0 ) จากหนูป่า (WT) (b,b0 ) จาก หนู WT หลัง 6 สัปดาห์ของ AngII þ HSD และ (c,c0 ) จากหนู Nphs2.cre Atg5lox/lox แสดงการสะสมของ P62 ในพอดไซต์ระหว่างความดันโลหิตสูงและใน ATG ที่จำเพาะต่อโพโดไซต์{{1{{12 }}}}หนูที่ขาด หัวลูกศรระบุจุดP62þใน WT ใน (a0 ) นิวเคลียสถูกย้อมด้วย Hoechst (สีน้ำเงิน) รูปย่อยที่มีจำนวนเฉพาะแสดงถึงกำลังขยายที่สูงขึ้น แท่ง=50 มม. (d) การหาปริมาณที่เกี่ยวข้องของพื้นที่ P62þ แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของพื้นที่ไต n=4 หนู WT และ n=5 WT ที่มี AngII þ HSD และหนูเมาส์ Nphs2.cre Atg5lox/lox ค่าจะแสดงเป็นแต่ละแปลงและค่าเฉลี่ย±SEM การทดสอบแมนน์-วิทนีย์: *P=0.0159. เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการรับชมภาพนี้ โปรดดูเวอร์ชันออนไลน์ของบทความนี้ที่ www.ไต-international.org
ผลลัพธ์
AngII D ความดันโลหิตสูงที่เกิดจากอาหารที่มีเกลือสูงยับยั้ง podocyte autophagy
Podocytes มีระดับสูงของautophagyในร่างกาย ดังที่แสดงโดยการแสดงออกของ GFP ที่แรงในหนูเมาส์แปลงพันธุ์ที่มีการหลอมรวม GFP กับ LC3 (หนูเมาส์ GFP-LC3) ซึ่งเป็นเครื่องหมายสำคัญของการแตกอัตโนมัติ (รูปที่เสริม S2A) Autophagy เป็นกระบวนการแบบไดนามิกที่มีการสร้าง autophagosomes อย่างต่อเนื่องและการเสื่อมสภาพของ autophagolysosomes การปิดกั้นการสลายตัวของ autophagosomal ด้วยคลอโรควินทำให้เกิดการสะสมของจุด GFPþ ซึ่งบ่งชี้ว่ามีการไหลออกของ autophagic สูงใน podocytes (รูปเสริม S2A และ B) การยืนยันว่าจุดGFPþเป็นออโตฟาโกโซมถูกแสดงโดยการเรืองแสงอิมมูโน FL สองเท่าสำหรับ GFP และ SQSTM1/P62 ซึ่งเป็นโปรตีนพี่เลี้ยงที่ย่อยสลายโดยautophagy(รูปเสริม S2C และ D). อีกครั้ง การรักษาด้วยคลอโรควินทำให้เกิดการสะสมของจุด GFPþ P62þ ซึ่งแสดงให้เห็นถึงการไหลออกของ autophagic ที่สำคัญใน podocytes สุดท้าย autophagic efflux สูงถูกสงวนไว้ ในหลอดทดลอง ดังที่แสดงโดยการแสดงออกของ GFP และ P62 ในพอดไซต์ปฐมภูมิที่แยกได้จากหนูเมาส์ GFP-LC3 และการสะสมของจุด GFPþ และ P62þ อย่างแรงภายใต้การบำบัดด้วย bafilomycin A1 ซึ่งเป็นตัวบล็อกอีกตัวหนึ่งของการย่อยสลาย autophagosomal (รูปที่ S2E–H) .
ความสามารถของความดันโลหิตสูงในการปรับการตอบสนอง autophagic ของ podocyte ได้รับการประเมินในหนูทดลองที่ผสม AngII ด้วยอาหารที่มีเกลือสูง (HSD) เป็นเวลา 6 สัปดาห์และในกลุ่มควบคุมที่ไม่ความดันโลหิตสูง ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 1 AngII þ HSD ทำให้เกิดการสะสมของ P62 ในโกลเมอรูลีด้วยการสร้าง accu mulation อย่างแรงใน podocytes ดังนั้นจึงแนะนำว่า AngII þ HSD มีหน้าที่สร้าง podocyteautophagyการปิดล้อม (รูปที่ 1a–d) ที่น่าสนใจคือ การสะสมของ P62 ใน podocytes นั้นคล้ายคลึงกับที่พบในหนูที่ขาดการตรวจหา autophagy ของ podocyte (หนู Nphs2.cre Atg5lox/lox) ในอีกรูปแบบหนึ่งของความดันโลหิตสูง แบบจำลองเกลือ DOC เรายังสังเกตเห็นการสะสม P62 แบบก้าวหน้าในพอดไซต์ตามระยะเวลาของโรค (รูปที่ S3) เสริม
การลบ Atg5 โดยเฉพาะใน podocytes ส่งผลให้อัลบูมินูเรียเพิ่มขึ้น การสูญเสีย podocyte และการบาดเจ็บของไตในแบบจำลอง AngII D HSD
จากนั้นเราก็ตรวจสอบว่าautophagyการปิดล้อมเฉพาะใน podocytes (หนู Nphs2.cre Atg5lox/lox) ส่งผลต่อการบาดเจ็บของไตในแบบจำลอง AngII þ HSD ก่อนอื่นเรายืนยันว่า Nphs2 หนู Cre Atg5lox/lox มีความดันโลหิตปกติ ปกติไตและไม่มีรอยโรคทางเนื้อเยื่อไตจนถึงอายุ 10 เดือนตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ (รูปที่ S4).32 จากนั้น Atg5lox/lox (WT) และ Nphs2 หนูเมาส์ cre Atg5lox/lox ถูกผสมด้วย AngII ด้วย HSD เป็นเวลา 6 สัปดาห์ ที่สำคัญ ความดันโลหิตซิสโตลิกมีความคล้ายคลึงกันใน 2 กลุ่มหลังการให้สาร AngII ในระหว่างการศึกษา (รูปที่ 2a) แม้ว่าวิธี tail-cuff ที่ใช้ในการวัดความดันโลหิตอาจไม่มีความสามารถในการแก้ไขความแตกต่างของความดันโลหิตเพียงเล็กน้อย การให้สาร AngII กับ HSD เพิ่มอัตราส่วนอัลบูมินต่อครีเอตินีนในปัสสาวะอย่างเห็นได้ชัดในหนูเมาส์ WT และผลกระทบนี้เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในหนูเมาส์ Nphs2.cre Atg5lox/lox (รูปที่ 2b) หนู Nphs2.cre Atg5lox/lox ความดันโลหิตสูงยังแสดงเส้นโลหิตตีบไตเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับ WT littermates (รูปที่ 2c–e) ตามข้อตกลงกับโปรตีนที่วัดได้ การหล่อโปรตีนและการขยายท่อมีความแพร่หลายมากขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในหนูเมาส์ที่มีพ็อดไซต์บกพร่องใน ATG5 (รูปที่ 2f–h)
รูปที่ 2|การลบ Atg5 โดยเฉพาะใน podocytes ส่งผลให้ albuminuria เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญไตการบาดเจ็บและการสูญเสีย podocyte หลังจาก 6 สัปดาห์ของการฉีด angiotensin II (AngII) D high-salt diet (HSD) (a) ความดันโลหิตซิสโตลิกในหนู Atg5lox/lox และ Nphs2.cre Atg5lox/lox หนูระหว่าง 36 วันของ AngII þ HSD n=9 หนูต่อจีโนไทป์ ค่าแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±SEM การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองทาง (ANOVA): ns ใน (b–m) หนูเมาส์ n=10 ต่อจีโนไทป์ ใน (b,g,h,k) ค่าต่างๆ จะแสดงเป็นแผนภาพเดี่ยวและค่าเฉลี่ย±SEM (b) AngII þ HSD (ต่อ)
รูปที่ 2|(ต่อ) ส่งผลให้อัลบูมินูเรียเพิ่มขึ้นอย่างมากใน Nphs2 เมาส์ cre Atg5lox/lox เปรียบเทียบกับหนูควบคุม Atg5lox/lox การวิเคราะห์ความแปรปรวนสองทาง: จีโนไทป์, P=0.013; เวลา P=0.0018 (c–f) ภาพตัวแทนของส่วนที่ย้อมด้วยไตรโครมของโกลเมอรูลีจากกลุ่มควบคุม Atg5lox/lox และหนู Nphs2.cre Atg5lox/lox หลัง 6 สัปดาห์ของ AngII þ HSD บาร์=50 มม. นิ้ว (c,d) บาร์=100 มม. นิ้ว (e,f) (g,h) การเปรียบเทียบ (g) ของสัดส่วนของ sclerotic glomeruli และ (h) ของจำนวนการหล่อแบบท่อต่อสนามด้วยกล้องจุลทรรศน์ การทดสอบ Mann-Whitney: **P=0.0026 ใน (h), ***P=0.0003 ใน (g) (i,j) ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ตัวแทนของการแสดงออกของ Wilm's Tumor 1 (WT1; สีแดง) และ Podocalyxin (PODXL; สีเขียว) ในโกลเมอรูลีจากกลุ่มควบคุม Atg5lox/lox และหนู Nphs2.cre Atg5lox/lox หลัง AngII þ HSD เป็นเวลา 6 สัปดาห์ นิวเคลียสถูกย้อมด้วย Hoechst (สีน้ำเงิน) แท่ง=50 มม. (k) การหาจำนวนเซลล์ WT1þ ต่อส่วนของไต การทดสอบ Mann-Whitney: **P=0.0029 ใน (l,m) ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ที่เป็นตัวแทนของการแสดงออกของ CD44 (สีเขียว) ในโกลเมอรูไลจากกลุ่มควบคุม Atg5lox/lox และหนูเมาส์ Nphs2.cre Atg5lox/lox หลัง AngII þ HSD เป็นเวลา 6 สัปดาห์ นิวเคลียสถูกย้อมด้วย Hoechst (สีน้ำเงิน) แท่ง=50 มม. (n,o) photomicrographs กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านตัวแทนของส่วนของโกลเมอรูไลจากกลุ่มควบคุม Atg5lox/lox และหนูเมาส์ Nphs2.cre Atg5lox/lox หลัง AngII þ HSD เป็นเวลา 6 สัปดาห์ แสดงให้เห็นการหลุดลอกของกระบวนการที่เท้าของโพโดไซต์ (หัวลูกศร) ใน Nphs2 ที่มีความดันโลหิตสูง เมาส์ Cre Atg5lox/lox แท่ง=1 มม. n=3 หนูต่อจีโนไทป์ หากต้องการเพิ่มประสิทธิภาพการรับชมภาพนี้ โปรดดูเวอร์ชันออนไลน์ของบทความนี้ที่ www.kidney-international.org
รูปที่ 3|การแสดงออกของ Calpain และกิจกรรมใน podocytes (a) การวิเคราะห์ Western blot ของการแสดงออกของ calpain-1, calpain-2 และ calpain-4 ใน podocytes ปฐมภูมิ การแสดงออกของ Tubulin ทำหน้าที่เป็นมาตรฐาน (b) กิจกรรมของ Calpain ถูกวัดบนโพโดไซต์ปฐมภูมิที่บำบัดหรือไม่บำบัดด้วยแองจิโอเทนซิน II (AngII; 100 นาโนโมลาร์) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงโดยมีหรือไม่มีคาลเปปติน (10 มิลลิโมลาร์) n=5 การทดลองอิสระ ค่าจะแสดงเป็นแต่ละแปลงและค่าเฉลี่ย±SEM การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA): การบำบัด, P=0.0035 การทดสอบเปรียบเทียบหลายรายการของ Sidak: *P=0.0128 สำหรับ AngII เทียบกับเส้นพื้นฐาน ##P=0.0056 สำหรับ AngII þ calpeptin เทียบกับ AngII (c) กิจกรรมของ Calpain วัดบน podocytes ปฐมภูมิจาก wild-type (WT) หรือคัลปาสแตตินหนูเมาส์แปลงพันธุ์ (CSTTg) ที่บำบัดหรือไม่บำบัดด้วย AngII (100 นาโนโมลาร์) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง n=7 การทดลองอิสระ ค่าจะแสดงเป็นแต่ละแปลงและค่าเฉลี่ย±SEM ANOVA สองทางจับคู่สำหรับการรักษา: จีโนไทป์, P=0.0483 การทดสอบเปรียบเทียบหลายรายการของ Sidak: ***P=0.0009 สำหรับ WT AngII เทียบกับเส้นฐาน *P=0.0420 สำหรับ CSTTg AngII เทียบกับเส้นฐาน #P=0.0424 สำหรับ WT เทียบกับ CSTTg อังII เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการรับชมภาพนี้ โปรดดูเวอร์ชันออนไลน์ของบทความนี้ที่ www.ไต-international.org
จำนวน Podocyte ต่อ glomerulus ลดลงอย่างมีนัยสำคัญใน Nphs2 หนูเมาส์ cre Atg5lox/lox ที่บำบัดด้วย AngII þ HSD (รูปที่ 2i–k) การบาดเจ็บของ Podocyte ในหนู Nphs2.cre Atg5lox/lox ที่มีการให้สาร AngII þ HSD พัฒนาไปสู่ภาวะโกลเมอรูโลสเกลอโรซิสที่โฟกัสและปล้องตามที่แสดงโดยการแสดงออกของเครื่องหมายกระตุ้นการทำงานของเซลล์เยื่อบุผิวข้างขม่อม (PEC) CD44 ในโกลเมอรูไล (รูปที่ 2l และ m) การวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนระบุถึงการเปลี่ยนแปลงที่มีนัยสำคัญที่เกี่ยวข้องกับการขาด ATG5 เมื่อมีการให้สาร AngII แบบเรื้อรังกับ HSD ซึ่งรวมถึงการลดขั้นตอนที่เท้าใน Nphs2 ที่มีความดันโลหิตสูง เมาส์ Cre Atg5lox/lox ในทางตรงกันข้าม พบข้อบกพร่องของโครงสร้างพิเศษเพียงเล็กน้อยใน podocytes จากหนูเมาส์ WT แม้หลังจากผ่านไป 10 สัปดาห์ของการฉีด AngII กับ HSD (รูปที่ 2n และ o) ซึ่งบ่งชี้ว่ากิจกรรม autophagic ของ podocytes จำเป็นสำหรับความต้านทานต่อความเสียหายที่เกิดจาก AngII þ HSD โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์ของเราระบุว่าในรูปแบบ AngII þ HSDautophagyการยับยั้งทำให้อาการบาดเจ็บและการสูญเสียของ podocyte รุนแรงขึ้นและกระตุ้นให้เกิด glomerulosclerosis แบบโฟกัสและปล้องที่ตามมา
AngII D HSD กระตุ้นการทำงานของ calpain ใน podocytes ที่ก่อให้เกิดการปิดล้อม autophagy
เนื่องจากพบว่ามีกิจกรรมคาลเพน (i) ถูกกระตุ้นโดย AngII ในเซลล์หลายประเภทและ (ii) เพื่อแยกหลายเซลล์autophagyโปรตีนที่เกี่ยวข้อง 53 เราสงสัยว่าการปิดกั้น autophagy ที่อาศัย AngII þ HSD อาจเนื่องมาจากกิจกรรมคาลเพนที่เกิดจาก AngII ที่เพิ่มขึ้นหรือไม่ ครั้งแรกเราพบว่า podocytes หลักแสดง calpains 3 รูปแบบที่แพร่หลาย (รูปที่ 3a) จากนั้นเราพบว่า AngII กระตุ้นการทำงานของคาลเพนในโพโดไซต์ปฐมภูมิ การเพิ่มขึ้นของกิจกรรมคาลเพนนี้ถูกขัดขวางโดยสารยับยั้งคาลเพนแบบเลือกเฟ้น (รูปที่ 3b) เราใช้เมาส์แบบน็อคอินพร้อมเพิ่มเติมคัลปาสแตตินการแสดงออกของยีน (นำไปสู่กิจกรรมคาลเพนที่ลดลง)43 เพื่อประเมินบทบาทของคาลเพนใน AngII þ HSD เป็นสื่อกลางไตการบาดเจ็บและการปิดกั้น autophagy โพโดไซต์ปฐมภูมิจากหนูเมาส์ CSTTg แสดงแอคติวิตีของคาลเพนที่ลดลงในการตอบสนองต่อ AngII เมื่อเปรียบเทียบกับพอโดไซต์จากหนูเมาส์ควบคุม (รูปที่ 3c) ดังนั้น,คัลปาสแตตินการแสดงออกมากเกินไปใน podocytes ลดการกระตุ้น calpain ที่เป็นสื่อกลางของ AngII
ต่อไปเราประเมินautophagyระดับใน podocytes จากหนู CSTTg เราสร้างหนูเมาส์ CSTTg ด้วยทรานส์ยีน GFP-LC3 LC3-ผู้รายงาน GFP อนุญาตให้นับออโตฟาโกโซมเป็นจุด GFPþ/P62þ P62 จะสะสมเป็นมวลรวมในเซลล์เมื่อมีการปิดกั้นการไหลออกของ autophagic ที่สถานะฐาน เรานับจุด GFPþ P62þ น้อยกว่า (รูปที่ 4a, b และ e) และการสะสม P62 น้อยลง (รูปที่ 4c, d และ f) ในพอดไซต์ของหนู CSTTg GFP-LC3 มากกว่าในพอดไซต์ของหนู GFP-LC3 ปกติ บ่งชี้ว่าการหลั่ง autophagic เพิ่มขึ้นในเซลล์พอดไซท์ของหนูเมาส์ที่มีแคลปาสแตตินมากมาย
รูปที่ 4|การประเมินการไหลออกของ autophagic ใน podocytes ของคัลปาสแตตินหนูเมาส์แปลงพันธุ์ (CSTTg) (a,b) ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ที่เป็นตัวแทนของการแสดงออกของโปรตีน FL เรืองแสงสีเขียว (GFP) (สีเขียว) และ P62 (สีแดง) ในโกลเมอรูลีจากหนูเมาส์ 12- GFP-LC3 และ CSTTg GFP-LC3 อายุหนึ่งสัปดาห์ หัวลูกศรบ่งบอกถึงออโตฟาโกโซมของ GFPþ P62þ (c,d) ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ที่เป็นตัวแทนของการแสดงออกของ P62 (สีเขียว) และ Podocalyxin (PODXL; สีแดง) ในโกลเมอรูลีจากหนูเมาส์ GFP-LC3 และ CSTTg GFP-LC3 อายุ 12-สัปดาห์ รูปย่อยที่มีจำนวนเฉพาะแสดงถึงกำลังขยายที่สูงขึ้น นิวเคลียสถูกย้อมด้วย Hoechst (สีน้ำเงิน) แท่ง=50 มม. (จ) การหาปริมาณของจำนวนจุด LC3þ P62þ ต่อโพโดไซต์ การทดสอบ Mann-Whitney: **P= 0.0065 (f) การหาปริมาณของพื้นที่ P62þ ต่อส่วนของไต การทดสอบแมนน์-วิทนีย์: *P=0.0420. ใน (e,f), n=5 หนูเมาส์ GFP-LC3 และหนูเมาส์ CSTTg GFP-LC3 n=8 ค่าจะแสดงเป็นแต่ละแปลงและค่าเฉลี่ย±SEM เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการรับชมภาพนี้ โปรดดูเวอร์ชันออนไลน์ของบทความนี้ที่ www.ไต-international.org
Autophagic efflux สามารถตรวจสอบได้โดยการวัดการแปลงรูปแบบไซโตพลาสซึมของ LC3, LC3-I เป็น autophagosomal cleaved และ phosphatidylethanolamine– รูปแบบคู่ของ LC3, LC3-II บน Western blot . Podocytes จากหนูเมาส์ CSTTg แสดงการแปลง LC3-I เป็น LC3-II เพิ่มขึ้น และลดการแสดงออกของ P62 ทั้งในที่ที่มีและในกรณีที่ไม่มี bafilomycin A1 (รูปที่ 5a และ b) ซึ่งบ่งชี้ว่า autophagic efflux เพิ่มขึ้นใน podocytes ที่มีการแสดงออกของ calpastatin มากเกินไป ในที่สุด การสะสมของจุด GFPþ P62þ ใน podocytes หลังการให้คลอโรควินมีความสำคัญมากกว่าในหนู CSTTg GFP-LC3 มากกว่าในหนู GFP-LC3 ดังนั้นจึงเป็นการยืนยันว่าคัลปาสแตตินการแสดงออกมากเกินไปทำให้เกิด autophagic efflux ใน podocytes ในร่างกาย (รูปที่ 5c–e) ข้อมูลทั้งหมดของเราแนะนำว่า AngII กระตุ้นการทำงานของคาลเพนในพอดไซต์ นั่นคือautophagyถูกยับยั้งโดย calpain ใน podocytes และการยับยั้งการทำงานของ calpain ภายในโดย calpastatin overexpression ก็เพียงพอที่จะกระตุ้น autophagic efflux ใน podocytes
หนู CSTTg ได้รับการปกป้องจากการบาดเจ็บของ podocyte ที่เกิดจาก AngII D HSD
หนู CSTTg ไม่แสดงอะไรเลยไตการเปลี่ยนแปลงจนถึงอายุอย่างน้อย 12 เดือน (รูปเพิ่มเติม S5) เราวิเคราะห์การบาดเจ็บของ podocyte ในหนูเมาส์ CSTTg ระหว่างการรักษา AngII þ HSD แม้ว่าหนู WT จะเกิดภาวะเกล็ดเลือดอุดตันเล็กน้อยและอาการบาดเจ็บที่เยื่อหุ้มเซลล์หลังจากเป็นโรคความดันโลหิตสูงเป็นเวลา 4 สัปดาห์ ดังที่แสดงโดยการแสดงออกที่ผิดปกติของ podocalyxin และ nephrin หนู CSTTg แสดงรอยโรคของไตที่เส้นโลหิตตีบน้อยลง (รูปที่ 6a และ b) และการแสดงออกของ podocalyxin และ nephrin ที่เก็บรักษาไว้ (รูปที่ 6c–h) . ความแตกต่างดังกล่าวในฟีโนไทป์ของโพโดไซต์ถูกสังเกตพบในระยะที่ความหนาแน่นของนิวเคลียสของโพโดไซต์ไม่แตกต่างกันระหว่าง WT และหนูเมาส์ CSTTg ที่มีความดันโลหิตสูง (รูปที่ 6i–k)
รูปที่ 5|การปิดกั้นการย่อยสลาย autophagosomal ยืนยันการเพิ่มขึ้นของ podocyte autophagic efflux ในคัลปาสแตตินหนูเมาส์แปลงพันธุ์ (CSTTg) (a) การวิเคราะห์ Western blot ของการแสดงออกของ LC3, Sequestosome 1 (SQSTM1)/P62 และ ATG5 ในพอดไซต์ปฐมภูมิจากหนูเมาส์ชนิดพันธุ์ป่า (WT) หรือ CSTTg การแสดงออกของ Tubulin ทำหน้าที่เป็นมาตรฐาน Podocytes ถูกบำบัดหรือไม่บำบัดด้วย bafilomycin A1 (BafA1; 100 nM) เป็นเวลา 4 ชั่วโมงก่อนการเพาะเลี้ยง (b) การหาปริมาณของอัตราส่วน LC{{10}}II/ทูบูลินและ P62/ทูบูลิน หนูเมาส์ n=10 WT และหนูเมาส์ CSTTg n=8 ค่าจะแสดงเป็นแต่ละแปลงและค่าเฉลี่ย±SEM การวิเคราะห์สองทางของความแปรปรวนที่จับคู่สำหรับการบำบัด: สำหรับ LC3-II/ทูบูลิน: จีโนไทป์, P=0.{{30}}008; การรักษา P <0.0001; สำหรับ="" p62/ทูบูลิน:="" จีโนไทป์,="" p="0.0884;" การรักษา="" p=""><0.0001 การทดสอบเปรียบเทียบหลายรายการของ="" sidak:="" สำหรับ="" lc3-ii/tubulin:="" ***p="">< 0.0001="" สำหรับ="" wt="" บวก="" bafa1="" เทียบกับ="" wt="" þ="" bafa1,="" ***="" p="">< 0.0001="" สำหรับ="" csttg="" บวก="" bafa1="" เทียบกับ="" csttg="" þ="" bafa1,="" ##p{="" {34}}.0028="" สำหรับ="" wt="" þ="" bafa1="" เทียบกับ="" csttg="" þ="" bafa1;="" สำหรับ="" p62/ทูบูลิน:="" ***p="">< 0.0001="" สำหรับ="" wt="" บวก="" bafa1="" เทียบกับ="" wt="" þ="" bafa1,="" ***="" p="">< 0.0001="" สำหรับ="" csttg="" บวก="" bafa1="" เทียบกับ="" csttg="" þ="" bafa1="" (c,d)="" ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ที่เป็นตัวแทนของการแสดงออกของโปรตีนเรืองแสง="" fl="" สีเขียว="" (gfp;="" สีเขียว)="" และ="" p62="" (สีแดง)="" ในโกลเมอรูไลจากหนูเมาส์="" gfp-lc3="" และ="" csttg="" gfp-lc3="" อายุ="" 12-="" สัปดาห์="" รูปย่อยที่มีจำนวนเฉพาะแสดงถึงกำลังขยายที่สูงขึ้น="" นิวเคลียสถูกย้อมด้วย="" hoechst="" (สีน้ำเงิน)="" แท่ง="50" มม.="" หนูได้รับการบำบัดด้วยคลอโรควิน="" (cq;="" 80="" มก./กก.)="" 4="" ชั่วโมงก่อนฆ่า="" หัวลูกศรบ่งบอกถึงออโตฟาโกโซมของ="" gfpþ="" p62þ="" (จ)="" การหาปริมาณของจำนวนจุด="" lc3þ="" p62þ="" ต่อโพโดไซต์="" n="5" หนูต่อจีโนไทป์="">±เอสอีเอ็ม Unpaired t-test ด้วย SD ที่เท่ากัน: *P=0.0302 เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการรับชมภาพนี้ โปรดดูเวอร์ชันออนไลน์ของบทความนี้ที่ www.ไต-international.org
รูปที่ 6 |คัลปาสตาตินการแสดงออกที่มากเกินไปจะป้องกันไม่ให้เกิด angiotensin II (AngII) D high-salt diet (HSD) การบาดเจ็บของ podocyte ที่เป็นสื่อกลาง (a,b) ภาพตัวแทนของส่วนที่ย้อมด้วยไตรโครมของโกลเมอรูลีจากหนูป่า (WT) และหนูดัดแปลงพันธุกรรมคาลปาสตาติน (CSTTg) หลัง 6 สัปดาห์ของ AngII þ HSD แท่ง=50 มม. (c,d,f,g) ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์แทนการแสดงออกของ (c,d) Podocalyxin (PODXL) และ (f,g) nephrin (NPHS1) ในหนู WT และ CSTTg หลัง 6 สัปดาห์ของ AngII þ HSD และ (e ,h) การหาปริมาณที่เกี่ยวข้อง แท่ง=50 มม. (i,j) ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ตัวแทนของการแสดงออกของเนื้องอก Wilm's 1 (WT1; สีเขียว) และ PODXL (สีแดง) ในโกลเมอรูลีจากหนูเมาส์ WT และ CSTTg หลังจาก 6 สัปดาห์ของ AngII þ HSD และ (k) การหาปริมาณที่เกี่ยวข้องกันของจำนวน WT1þ เซลล์ต่อส่วนของไต นิวเคลียสถูกย้อมด้วย Hoechst (สีน้ำเงิน) แท่ง=50 มม. ใน (e,h,k) ค่าต่างๆ จะแสดงเป็นแต่ละแปลงและค่าเฉลี่ย±SEM หนูเมาส์ n=9 WT และหนูเมาส์ CSTTg n=7 Unpaired t-test ด้วย SD ที่เท่ากัน: **P=0.0095 ใน (e), *P=0.0249 ใน (h), P=0.7891 ใน (k) เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการรับชมภาพนี้ โปรดดูเวอร์ชันออนไลน์ของบทความนี้ที่ www.ไต-international.org
ในทำนองเดียวกัน หลังจาก 6 สัปดาห์ของความดันโลหิตสูง, หนูเมาส์ GFP-LC3 และ CSTTg GFP-LC3 แสดงอาการบาดเจ็บที่พอดไซต์แต่รอยโรคนั้นเด่นชัดกว่าในหนูเมาส์ GFP-LC3 (รูปที่ 7) อัตราส่วนอัลบูมินต่อครีเอตินีนในปัสสาวะสูงขึ้นในหนูเมาส์ GFP-LC3 หลังจาก 4 สัปดาห์ของ AngII þ HSD (รูปที่ 7a) จำนวน Podocyte ไม่แตกต่างกันระหว่าง 2 genotypes แต่การแสดงออกของ nephrin ลดลงอย่างมีนัยสำคัญมากขึ้นในหนูเมาส์ GFP-LC3 (กลุ่มควบคุม) (รูปที่ 7b–e) สัมพันธ์กับคัลปาสแตติน- การป้องกันโดยอาศัยสื่อกลาง การวิเคราะห์โครงสร้างพิเศษแสดงให้เห็นการหลุดลอกของกระบวนการตีนเป็ดแบบอ่อนและโฟกัสในหนู GFP-LC3 ที่ได้รับการบำบัดด้วย AngII þ HSD โดยสามารถคงสภาพกระบวนการที่เท้าได้ดีกว่าในหนู CSTTg แม้ว่าการหาปริมาณของจำนวนกระบวนการเท้าต่อชั้นใต้ดินของไต ความยาวของเมมเบรน (GBM) ไม่แตกต่างกันทางสถิติ น่าจะเป็นเพราะการบาดเจ็บของพอดไซต์เป็นแบบเฉพาะจุดและแบ่งเป็นส่วนๆ ในแบบจำลองของเรา (รูปที่ 7f–h) ข้อสังเกต แมคโครฟาจและการแทรกซึมของทีลิมโฟไซต์ในไตไม่แตกต่างกันระหว่างกลุ่ม (รูปเสริม S6) เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าคัลปาสแตตินป้องกันการบาดเจ็บ podocyte ที่เกิดจาก AngII þ HSD
การแสดงออกของ Calpastatin มากเกินไปจะคืนค่า autophagic efflux ใน podocytes จากหนูหลังจากการรักษา AngII D HSD
สุดท้ายเราก็สงสัยว่าคัลปาสแตติน-ไกล่เกลี่ยการป้องกันไตในแบบจำลอง AngII þ HSD ที่เกี่ยวข้องกับการบำรุงรักษา autophagy ใน podocytes ที่น่าสนใจคือ การสะสม P62 ที่เกิดจาก AngII þ HSD ใน podocytes ได้รับการป้องกันใน CSTTg และ GFP-LC3 CSTTg หนูเมาส์ (รูปที่ 8a–d) ซึ่งบ่งชี้ว่า calpastatin ป้องกันการปิดล้อมของ podocyteautophagy. ข้อสังเกต จำนวนของการติดฉลากจุด GFPþ P62þ ของ autophagosomes มีความคล้ายคลึงกันใน podocytes จาก GFP-LC3 และ GFP-LC3 CSTTg ที่มีความดันโลหิตสูง ดังนั้นแนะนำว่า AngII þ HSD ทำให้เกิดการชะลอตัวของ podocyte autophagic efflux มากกว่าการจับกุมโดยสมบูรณ์ (รูปที่ 8e– กรัม)
ในการทำนายซิลิโกของบริเวณรอยแยกคาลเพนในโปรตีนโพโดไซต์
เราใช้เครื่องมือซิลิโกหลายอย่างในการทำนายเป้าหมายคาลเพนที่เป็นไปได้ในพอดไซต์ (ตารางเสริม S1 และ S2) ฐานข้อมูลออนไลน์สามฐานข้อมูลถูกเปรียบเทียบ: GPS-CCD,54 CaMPDB,55 และ DeepCalpain.56 ในการวิเคราะห์ด้วยซิลิโกพบว่ามีโปรตีน podocyte, nephrin และ podocin หลายตัวซึ่งสามารถแยกออกได้โดย calpains ดังนั้น,คัลปาสแตติน- การป้องกันไตที่เป็นสื่อกลางอาจเชื่อมโยงกับการลดลงของกิจกรรมของเอนไซม์คาลเพน ส่งผลให้การย่อยสลายโปรตีนพอดไซต์บางตัวลดลง
นอกจากนี้ อย่างน้อย 3autophagyโปรตีนที่เกี่ยวข้องเป็นเป้าหมายโดยตรงของคาลเพ็ง ATG5 ถูกตัดขาดโดยคาลเพน ทำให้เกิดการรบกวนในรูปแบบเชิงซ้อนของ ATG12-ATG5 57,58 การบริหารให้สารยับยั้งคาลเพน ในร่างกาย ยังป้องกันการแตกแยกของโปรตีน autophagy Beclin-1.59 ในการวิเคราะห์ซิลิโคของ ตำแหน่งความแตกแยกสมมุติฐานบนโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ autophagy สนับสนุนสมมติฐานที่ว่า calpain สามารถควบคุม autophagy ผ่านความแตกแยกของเอนไซม์ของโปรตีน autophagy
การทำงานของไตและไต
การแสดงออกของ mRNA ของเอนโดพลาสมิกเรติคิวลัม (ER) และเครื่องหมายความเครียดออกซิเดชันในโกลเมอรูไลจากหนูที่ได้รับการบำบัดด้วย AngII บวก HSD
เราประเมินความเครียดเอนโดพลาสมิกเรติคิวลัม (ER) และความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันโดย PCR เชิงปริมาณในโกลเมอรูไลระหว่างการบำบัดด้วย AngII þ HSD (ตารางที่ 1) ที่การตรวจวัดพื้นฐาน เราไม่ได้สังเกตเห็นการเปลี่ยนแปลงใดๆ ในการแสดงออกของ mRNA ของยีนที่วิเคราะห์แล้วในโกลเมอรูลีจากหนูเมาส์ WT และ Nphs2.cre Atg5lox/lox (รูปที่ S7) เพิ่มเติม หลังจาก 6 สัปดาห์ของความดันโลหิตสูง glomeruli จาก Nphs2 หนู Cre Atg5lox/lox แสดงโปรไฟล์ mRNA ที่แตกต่างกันของยีนของความเครียด ER และวิถีความเครียดออกซิเดชันด้วยการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของ Sod1, Prdx1, Atf4, Gpx1 และ Hsp90b1 เมื่อเทียบกับ WT glomeruli จึงแนะนำว่าautophagyการพร่องใน podocytes สนับสนุนความเครียด ER ที่เกิดจาก AngII þ HSD และความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน ในทางกลับกัน โกลเมอรูไลจากหนูเมาส์ CSTTg นำเสนอการปรับลดยีนหลายตัวของความเครียด ER และวิถีความเครียดออกซิเดชัน รวมทั้งการแสดงออกของยีนโปรอะพอพโทซิสที่ลดลง (รูปที่ 9)
เมื่อนำมารวมกันแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าคัลปาสแตตินการแสดงออกมากเกินไปสามารถป้องกันการบาดเจ็บของไตโดยการลด ER ที่เกิดจาก AngII þ HSD และความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน
อภิปรายผล
ในการศึกษานี้ เราแสดงให้เห็นว่าในภาวะความดันโลหิตสูงที่เกิดจาก AngII þ HSD นั้น autophagy ของ podocyte จะลดลงอย่างเห็นได้ชัด นอกจากนี้ หนูที่มีการลบ Atg5 จำเพาะของ podocyte มีแนวโน้มที่จะเกิดภาวะเกล็ดเลือดต่ำที่เกิดจาก AngII þ HSD และการสูญเสีย podocyte ซึ่งแสดงให้เห็นว่าautophagyใน podocytes ช่วยป้องกันการพัฒนาของโรคไตจากความดันโลหิตสูงโดยเน้นถึงบทบาทที่สำคัญของ autophagy ในการบาดเจ็บของ podocyte ที่เกิดจาก AngII þ HSD ไม่ค่อยมีใครรู้จักเกี่ยวกับสิ่งเร้าภายนอกเซลล์ที่ควบคุม autophagy ของเซลล์ และผลลัพธ์เหล่านี้ได้ให้ความกระจ่างเกี่ยวกับระเบียบทางพยาธิสรีรวิทยาของการ autophagy ของ podocyte โดย AngII
ในโรคไตของมนุษย์ส่วนใหญ่ การหลุดลอกของกระบวนการ podocyte foot เป็นจุดเด่นของการบาดเจ็บของไตที่นำไปสู่โปรตีนในปัสสาวะ Autophagy มีแนวโน้มที่จะมีบทบาทสำคัญในการรักษาการทำงานของ podocyte เนื่องจากเซลล์ที่มีความแตกต่างในระยะสุดท้ายเหล่านี้แสดงอัตราที่สูงของautophagyแม้จะไม่มีความเครียด การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่า AngII ส่งเสริม autophagy ผ่านการสร้างสายพันธุ์ออกซิเจนปฏิกิริยาในสายเซลล์ podocyte ของหนูที่เป็นอมตะตามเงื่อนไข60 การผลิตออกซิเจนในปฏิกิริยาเป็นสาเหตุทั่วไปของ autophagy ในเซลล์หลายประเภท และสาเหตุของความคลาดเคลื่อนดังกล่าวกับการค้นพบของเราคือ ไม่ชัดเจน ต่างจากการศึกษาหลังนี้ เราใช้โพโดไซต์ที่เพาะเลี้ยงเบื้องต้นของหนูซึ่งรักษาการแสดงออกของโพโดซินและเนฟรินและแนวทางในร่างกายไม่ใช่สายเซลล์ของหนู เรายืนยันรายงานก่อนหน้านี้ว่า podocytes postmitotic มีองค์ประกอบที่สูงผิดปกติautophagy. การวัดปริมาณ LC3-II ที่เพิ่มขึ้นหลังการกระตุ้นด้วย AngII โดยมีหรือไม่มีสารยับยั้ง lysosomal เป็นสิ่งจำเป็นเพื่อตรวจสอบว่าการไหลออกของ autophagic เพิ่มขึ้นหรือถูกบล็อกหรือไม่ การศึกษาก่อนหน้านี้ละเลยปรากฏการณ์นี้60
รูปที่ 7 |คัลปาสตาตินการแสดงออกที่มากเกินไปช่วยป้องกันการบาดเจ็บของ podocyte ที่เกิดจากอาหารที่มีเกลือสูง (HSD) ของ angiotensin II (AngII) D ในหนูทดลองที่มีโปรตีนเรืองแสง FL สีเขียว (GFP)–LC3 (a) AngII þ HSD ส่งผลให้อัลบูมินูเรียเพิ่มขึ้นอย่างมากในหนูเมาส์ GFP-LC3 เมื่อเปรียบเทียบกับหนูเมาส์ GFP-LC3 ของ CSTTg (แคลปาสแตตินดัดแปลงพันธุกรรม) n=8 ถึง 13 หนูต่อจีโนไทป์ ค่าจะแสดงเป็นแต่ละแปลงและค่าเฉลี่ย±SEM การวิเคราะห์ความแปรปรวนสองทาง: จีโนไทป์, P=0.0429; เวลา P=0.0165 การทดสอบเปรียบเทียบหลายรายการของ Sidak: *P=0.0453 สำหรับ GFP-LC3 เทียบกับ CSTTg GFP-LC3 หนูในวันที่ 28 (b,c) ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์แทนการแสดงออกของ Wilm's Tumor 1 (WT1; สีเขียว) และ nephrin (NPHS1) (สีแดง) ในโกลเมอรูไลจากหนูเมาส์ GFP-LC3 และ CSTTg GFP-LC3 18-สัปดาห์หลัง 6 สัปดาห์ของการฉีด AngII þ HSD นิวเคลียสถูกย้อมด้วย Hoechst (สีน้ำเงิน) แท่ง=50 มม. การหาปริมาณของ (d) พื้นที่ NPHS1þ ต่อส่วนของไตและ (e) จำนวนเซลล์ WT1þ ต่อส่วนของไตในหนูเมาส์ GFP-LC3 และ CSTTg GFP-LC3 อายุ 18- สัปดาห์หลัง 6 สัปดาห์ของการให้ยา AngII þ HSD n=19 หนูเมาส์ GFP-LC3 และหนูเมาส์ CSTTg GFP-LC3 n=25 ค่าจะแสดงเป็นแต่ละแปลงและค่าเฉลี่ย±SEM Unpaired t-test ด้วย SD ที่เท่ากัน: **P=0.0010 in (d), P= 0.1158 in (e) (f,g) ภาพกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านของโกลเมอรูไลจากหนู GFP-LC3 และ CSTTg GFP-LC3 หลัง 6 สัปดาห์ของ AngII þ HSD หัวลูกศรบ่งบอกถึงการหลุดลอกของกระบวนการที่เท้า แท่ง=1 มม. (h) การหาปริมาณของจำนวนกระบวนการที่เท้าต่อไมโครเมตรของเมมเบรนชั้นใต้ดินของไต (GBM) n=3 หนูต่อจีโนไทป์ ค่าจะแสดงเป็นแต่ละแปลงและค่าเฉลี่ย SEM แต่ละพล็อตแสดงจำนวนเฉลี่ยของ podocytes ต่อไมโครเมตรของ GBM ต่อ 1 ความยาวต่อเนื่องของ GBM Unpaired t-test ด้วย SD ที่เท่ากัน: P=0.7512 เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการรับชมภาพนี้ โปรดดูเวอร์ชันออนไลน์ของบทความนี้ที่ www.ไต-international.org
ในที่นี้ เราใช้แบบจำลองความดันโลหิตสูงโดยพิจารณาจากการกระจายของ AngII และ HSD Podocytes แสดงตัวรับ AT1 และสัมผัสกับเปปไทด์ที่ถูกกรองอย่างอิสระเช่น AngII.13,16,26,61–65 สันนิษฐานว่าผลกระทบ renoprotective ที่สังเกตได้ของการยับยั้ง RAAS อาจเป็น - อย่างน้อยบางส่วน - เนื่องจากการปิดกั้นของ podocyte- RAAS เฉพาะ ในทำนองเดียวกัน การศึกษาใน vivo ยืนยันผลของ AngII ต่อการบาดเจ็บของ podocyte และการกำหนดเป้าหมายยีนเฉพาะของ podocyte ของ AT1 แสดงให้เห็นว่าการกระตุ้นตัวรับ AT1 ใน glomerulus ในการทดลอง lupus nephritis นั้นเพียงพอที่จะเร่งไตได้รับบาดเจ็บในกรณีที่ไม่มีความดันโลหิตสูง66,67 Calpain-mediatedautophagyการควบคุมที่ผิดปกติในแบบจำลองของเราอาจเชื่อมโยงกับการส่งสัญญาณ AngII-AT1 โดยตรงบน podocytes หรือเป็นผลมาจากความดันโลหิตสูง เราอาจให้คำตอบล่วงหน้าสำหรับคำถามนี้ แท้จริงแล้ว ในแบบจำลองเกลือ DOC เรายังพบการสะสมของ P62 ในพอดไซต์จากหนูที่มีความดันโลหิตสูง (รูปที่ S3) เสริม สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าการปิดล้อม autophagy เกิดขึ้นใน podocytes ในแบบจำลองนี้ ซึ่งควรจะเป็นอิสระจาก AngII.68 การศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับการประเมินอาการบาดเจ็บของ podocyte ที่เกี่ยวข้องกับกิจกรรมของ calpain และ autophagic efflux ในหนูที่ขาด AT1 ใน podocytes อย่างเลือกสรรจะต้องพิจารณาว่ากฎระเบียบดังกล่าว ของ autophagy ของ podocyte ขึ้นอยู่กับผลกระทบโดยตรงหรือโดยอ้อมของ AngII
รูปที่ 8 |คัลปาสตาตินการแสดงออกมากเกินไปจะป้องกันไม่ให้เกิด angiotensin II (AngII) D อาหารที่มีเกลือสูง (HSD)autophagyการปรับลดใน podocytes (a,b) ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ที่เป็นตัวแทนของการแสดงออกของ P62 (สีเขียว) และ Podocalyxin (PODXL; สีแดง) ในโกลเมอรูลีจากโปรตีนเรืองแสง FL สีเขียว (GFP)–LC3 และ CSTTg (คัลปาสแตตินแปลงพันธุ์) หนูเมาส์ GFP-LC3 หลัง 6 สัปดาห์ของ AngII þ HSD รูปย่อยที่มีจำนวนเฉพาะแสดงถึงกำลังขยายที่สูงขึ้น นิวเคลียสถูกย้อมด้วย Hoechst (สีน้ำเงิน) แท่ง=50 มม. (c,d) การหาปริมาณของพื้นที่ P62þ ต่อส่วนของไต หนูเมาส์ n=9 ชนิดพันธุ์ป่า (WT) และหนู CSTTg n=7 ใน (c) และหนูเมาส์ GFP-LC3 n=16 และหนู CSTTg GFP-LC3 n=16 ใน (ง) ค่าจะแสดงเป็นแต่ละแปลงและค่าเฉลี่ย±SEM การทดสอบ Mann-Whitney: **P=0.0033 ใน (c), **P=0.0011 ใน (d) (e,f) ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ที่เป็นตัวแทนของการแสดงออกของ GFP (สีเขียว) และ P62 (สีแดง) ในโกลเมอรูไลจากหนูเมาส์ GFP-LC3 และ CSTTg GFP-LC3 หลัง 6 สัปดาห์ของ AngII þ HSD รูปย่อยที่มีจำนวนเฉพาะแสดงถึงกำลังขยายที่สูงขึ้น หัวลูกศรบ่งบอกถึงออโตฟาโกโซมของ GFPþ P62þ (g) การหาจำนวนจุด LC3þ P62þ ต่อโพโดไซต์ n=11 หนูเมาส์ GFP-LC3 และหนูเมาส์ CSTTg GFP-LC3 n=16 ค่าจะแสดงเป็นแต่ละแปลงและค่าเฉลี่ย±SEM Unpaired t-test ด้วย SD ที่เท่ากัน: P=0.1014 เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการรับชมภาพนี้ โปรดดูเวอร์ชันออนไลน์ของบทความนี้ที่ www.ไต-international.org
ตารางที่ 1|อาร์เรย์ PCR Profiler RT2 แบบกำหนดเอง
Calpain-1 และ calpain-2 เป็นโปรตีเอสกระตุ้นการอักเสบที่แพร่หลาย ซึ่งกิจกรรมถูกควบคุมโดยคัลปาสแตตินสารยับยั้งเฉพาะของพวกมัน อันที่จริง calpastatin คัดเลือกยับยั้ง calpains และไม่มีโปรตีเอสอื่น ๆ จนถึงปัจจุบัน การเปิดใช้งาน Calpain เชื่อมโยงกับ .เมื่อเร็ว ๆ นี้ไตการบาดเจ็บในบริบททางพยาธิวิทยาหลายประการ69,70 พบว่าช่อง C6 ที่มีศักยภาพของตัวรับแคลเซียมแชนเนลขนส่งช่อง C6 กระตุ้นคาลเพน-1ในพอโดไซต์ผ่านการกระตุ้น Ca2þ/แคลซินูริน ไตของผู้ป่วยที่มี glomerulosclerosis แบบโฟกัสและปล้องมีการแสดงออกของช่อง C6 ที่มีศักยภาพของตัวรับชั่วคราวเพิ่มขึ้น กิจกรรมของ calpain และ calcineurin เพิ่มขึ้น และลดการแสดงออกของ calpain target talin-1 ซึ่งมีความสำคัญต่อความเสถียรของโครงร่างโครงร่างของ podocyte 71 ช่องศักยภาพของตัวรับชั่วคราว C6 ยังจับกับคาลเพนโดยตรง-1 และคาลเพน-2 ปฏิสัมพันธ์นี้มีความสำคัญต่อการควบคุมความแตกแยกของตาลิน-1 และการควบคุมการเคลื่อนที่ของพอดไซต์72
หนูดัดแปรพันธุกรรมแสดงออกมากเกินไปคัลปาสแตตินได้รับการปกป้องจากการเปลี่ยนแปลงของหลอดเลือดและการอักเสบที่ขึ้นกับ AngII73; ต่อต้านการอักเสบในรูปแบบของโรคไตอักเสบ,43 ภาวะติดเชื้อ,74 หรือการปฏิเสธ allograft75; และต่อการอักเสบที่เกี่ยวข้องกับอายุ 76 ยังไม่มีการสำรวจอาการบาดเจ็บของ Podocyte ในหนูเหล่านี้ เพลเทียร์และคณะ แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกที่มากเกินไปของคัลปาสแตตินป้องกันการอักเสบของหลอดเลือดในช่องท้องที่ขึ้นกับ AngII ในไต43 ดังนั้นการป้องกันไตในหนู CSTTg อาจเป็นสื่อกลางได้อย่างน้อยบางส่วนโดยกลไกต้านการอักเสบ เราประเมินการแทรกซึมของมาโครฟาจและลิมโฟไซต์ในแบบจำลองของเรา และไม่พบความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในไตการอักเสบระหว่าง CSTTg และหนูควบคุมเมื่อวิเคราะห์ globalไตการแทรกซึมของเม็ดเลือดขาว (รูปเสริม S6)
Calpain มีส่วนเกี่ยวข้องเมื่อเร็ว ๆ นี้ในการควบคุม autophagy (ทบทวนเมื่อเร็ว ๆ นี้ใน Weber et al.53) ด้วยคุณสมบัติที่น่าสนใจและมีคุณสมบัติป้องกันทางชีวภาพของการยับยั้ง calpain ในบริบทของโรคเบาหวานผ่านการฟื้นฟูautophagy.77 ในที่นี้ เรารายงานว่า calpain ยับยั้งผ่านคัลปาสแตตินการแสดงออกที่มากเกินไป (i) ป้องกันการบาดเจ็บของ podocyte ระหว่างความดันโลหิตสูงและ (ii) ฟื้นฟู autophagy ใน podocytes ซึ่งเน้นถึงบทบาทที่เป็นอันตรายของการกระตุ้น calpain ในช่วงความดันโลหิตสูงผ่านการยับยั้งautophagy.
โปรตีน ATG เกือบทั้งหมดแสดงให้เห็นว่าถูกแยกโดยแคลเพน ในหลอดทดลอง 78 ที่นี่เราตั้งสมมติฐานว่าautophagyการบำรุงรักษาในหนูเมาส์ CSTTg ที่มีความดันโลหิตสูงถูกสื่อกลางโดยการยับยั้งคาลเพน เพื่อสนับสนุนสมมติฐานของเรา เราแสดงให้เห็นว่าพอดไซต์จาก CSTTg มีกิจกรรมคาลเพนที่ลดลงเมื่อถูกท้าทายด้วย AngII ในหลอดทดลอง (รูปที่ 3c) เราพบว่าระดับโปรตีน ATG5 เพิ่มขึ้นใน podocytes จากหนูเมาส์ CSTTg ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ calpastatin มากเกินไปช่วยป้องกันความแตกแยก ATG5 ที่อาศัย calpain ในบริบทนี้ (รูปที่ 5a) ในทางตรงกันข้ามก็แสดงให้เห็นแล้วว่าคัลปาสแตติน-การยับยั้งคาลเพนที่เป็นสื่อกลางอาจเป็นอิสระจากการยับยั้งการทำงานของโปรตีเอส79 ดังนั้นเราจึงไม่สามารถยกเว้นการควบคุม autophagy โดย calpastatin ที่ไม่ขึ้นกับกิจกรรมของ calpain enzymatic
โดยสรุป การค้นพบนี้เผยให้เห็นบทบาทที่ไม่เคยรู้จักมาก่อนของคัลปาสแตตินในการควบคุมของโพโดไซต์autophagyและเป็นผู้นำในการศึกษากลยุทธ์การรักษาแบบใหม่เพื่อเพิ่มอัตราการรอดชีวิตของ podocyte ระหว่างโรคไตจากความดันโลหิตสูง
การเปิดเผยข้อมูล
ผู้เขียนทั้งหมดประกาศว่าไม่มีผลประโยชน์ที่แข่งขันกัน
กิตติกรรมประกาศ
งานนี้ได้รับการสนับสนุนจาก Institut National de la Santé Et de la recherche Médicale (Inserm) และ Université de Paris IB ได้รับการสนับสนุนจากการคบหาระดับบัณฑิตศึกษาจากMinistère de l'EducationNationale, de la Recherche et de la Technologie OL ได้รับทุนจาก European Foundation for the Study of Diabetes (EFSD) ที่ได้รับการสนับสนุนจาก EFSD/Novo Nordisk Program for DiabetesResearch ในยุโรป และเงินช่วยเหลือจาก Société Francophone duDiabète (SFD) BR และ CH ได้รับทุนจาก Initial Grant 107037 จาก European Research Council และ European Union (P-LT) YS ได้รับการสนับสนุนจากทุนมิตรภาพจาก Fondation de France
ขอขอบคุณ Elizabeth Huc, Nicolas Perez, Corina Suldac และทีม ERIU970 (Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, France) ที่ให้ความช่วยเหลือในการดูแลและจัดการสัตว์ Nicolas Sorhaindo การวัดผลทางชีวเคมี (ICB-IFR2, Laboratoire de Biochimie,Hôpital Bichat , ปารีส, ฝรั่งเศส) และ Alain Schmitt และ Jean-Marc Massefor กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (Institut Cochin, Paris, France) เราขอขอบคุณ Morgane Le Gall (ศูนย์โปรตีนโคชิน 3P5 ปารีส ฝรั่งเศส) สำหรับความช่วยเหลือในการวิเคราะห์ซิลิโค เรารับทราบการสนับสนุนด้านการบริหารจาก Véronique Oberweis, Bruno Pillard และ Cyrille Mahieux (Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, France)
วัสดุเสริม
ไฟล์เสริม (PDF)
รูปที่ S1 การเพาะเลี้ยง podocyte ปฐมภูมิแสดงเครื่องหมายของ podocyte การวิเคราะห์ Western blot ของการแสดงออกของเครื่องหมาย podocyte NPHS1 และ NPHS2 ในการเพาะเลี้ยง podocyte ปฐมภูมิจากหนูเมาส์ WT และ CSTTg Tubulin (TUBA) ทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมการโหลด ตัวแทนของหนูเมาส์ n=4 ต่อจีโนไทป์
รูปที่ S2 ระดับฐานสูงของ podocyteautophagy. (A, B) รูปภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ที่เป็นตัวแทนของการแสดงออกของ GFP (สีเขียว) และ NPHS1 (สีแดง) ในโกลเมอรูไลจากหนูเมาส์ GFP-LC3 ที่บำบัดหรือไม่ใช้ CQ (80มก./กก.) 4 ชั่วโมงก่อนการฆ่า หัวลูกศรแสดง GFPþ autophagosomes (C,D) รูปภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ที่เป็นตัวแทนของการแสดงออกของ GFP (สีเขียว) และ P62 (สีแดง) ในโกลเมอรูไลจากหนูเมาส์ GFP-LC3 ที่บำบัดหรือไม่ใช้ CQ (80 มก./กก.) 4 ชั่วโมงก่อนการฆ่า หัวลูกศรแสดงออโตฟาโกโซมของ GFPþ P62þ (A–D) (0 ) แสดงถึงกำลังขยายที่สูงขึ้น นิวเคลียสถูกย้อมด้วย Hoechst (สีน้ำเงิน) บาร์=50 มม. N=4 หนูเมาส์ต่อสภาวะ (E–H) ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ตัวแทนของการแสดงออกของ GFP (สีเขียว) และ P62 (สีแดง) ในพอดไซต์ปฐมภูมิจากหนูเมาส์ GFP-LC3 ที่บำบัด (F, H) หรือไม่ (E, G ) ร่วมกับ Bafifilomycin A1 (100 นาโนโมลาร์) เป็นเวลา 4 ชั่วโมง N=5 หนูต่อเงื่อนไข
รูปที่ S3 P62 สะสมใน podocytes ในรูปแบบ DOC-salt ของความดันโลหิตสูง (A–C) รูปภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ที่เป็นตัวแทนของการแสดงออกของ P62 (สีเขียว) และ PODXL (สีแดง) ในโกลเมอรูลีจากหนูเมาส์ WT หลังจาก 2 ถึง 6 สัปดาห์ของแบบจำลองเกลือ DOC (0 ) แสดงถึงกำลังขยายที่สูงขึ้น นิวเคลียสถูกย้อมด้วย Hoechst (สีน้ำเงิน) แท่ง ¼ 50 มม. (D) การหาปริมาณพื้นที่ P62 ต่อพื้นที่ podocyte ( เปอร์เซ็นต์ ) หนู N=5–6 ตัวต่อเงื่อนไข การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว: เวลา P=0.0059 การทดสอบเปรียบเทียบแบบพหุคูณของ Sidak: D42 กับ D14 **P=0.0055 D28 เทียบกับ D14 P=0.8590
รูปที่ S4 Podocyteautophagyจ่ายได้สำหรับการพัฒนา podocyte (A) ความดันโลหิตซิสโตลิก (B) อัตราส่วนอัลบูมินต่อครีเอตินินในปัสสาวะ และ (C) ระดับยูเรียไนโตรเจนในเลือดในหนู Atg5lox/lox และ Nphs2.cre Atg5lox/lox N=5–6 หนูต่อจีโนไทป์ ค่าจะแสดงเป็นแปลงและหมายถึงแต่ละแปลง±เอสอีเอ็ม การทดสอบ Mann-Whitney: P=0.7273 (A), P=0.4286 (B) และ P=0.6623 (C) (D–E) ภาพตัวแทนของส่วนที่ย้อมด้วยไตรโครมของ glomeruli จากหนู Atg5lox/lox และ Nphs2.cre Atg5lox/lox (F–G) รูปภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ที่เป็นตัวแทนของการแสดงออกของ PODXL (สีเขียว) และ WT1 (สีแดง) ในหนู Atg5lox/lox และ Nphs2.cre Atg5lox/lox นิวเคลียสถูกย้อมด้วย Hoechst (สีน้ำเงิน) (D–G) บาร์=50 มม. หนู N ¼ 6 ต่อจีโนไทป์ (H–I) photomicrographs ที่เป็นตัวแทนของส่วนกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านของโกลเมอรูลีจากหนู Atg5lox/lox และ Nphs2.cre Atg5lox/lox บาร์=1 มม. N=3 หนูต่อจีโนไทป์
รูปที่ S5คัลปาสตาตินการแสดงออกมากเกินไปไม่ส่งผลกระทบไตทำหน้าที่พื้นฐาน (A) ยูเรียไนโตรเจนในเลือดและ (B) ระดับอัลบูมินในพลาสมาในหนูเมาส์ 12-GFP-LC3 และ CSTTg GFP-LC3 อายุ 12-สัปดาห์ N=5 GFP-LC3 และ N=6 CSTTg GFP-LC3 ค่าจะแสดงเป็นแปลงและหมายถึงแต่ละแปลง±เอสอีเอ็ม การทดสอบ Mann-Whitney: P=0.6623 (A) และ P=0.9307 (B) (C,D) ภาพแทนของส่วนที่ย้อมด้วยไตรโครมของโกลเมอรูลีจากหนูเมาส์ GFP-LC3 และ CSTTg GFP-LC3 (E–H) ภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ที่เป็นตัวแทนของการแสดงออกของ PODXL (E, F) และ NPHS1 (G, H) ในหนูเมาส์ GFP-LC3 และ CSTTg GFP-LC3 (C–H) บาร์=50 มม. (I, J) การหาปริมาณที่เกี่ยวข้องของพื้นที่ PODXL และ NPHS1 ต่อส่วนของไต N=5 GFP-LC3 และ N=6 CSTTg GFP-LC3 ค่าจะแสดงเป็นแปลงและหมายถึงแต่ละแปลง±เอสอีเอ็ม การทดสอบ Mann-Whitney: P=0.1898 (A) และ P=0.8413 (B)
การทำงานของไตและไต
รูปที่ S6คัลปาสตาตินการแสดงออกมากเกินไปไม่ส่งผลต่อการอักเสบของไตทั่วโลก อิมมูโนฮิสโตเคมีที่เป็นตัวแทนของการแสดงออกของ F4/80 (A, B) และ CD3 (D–E) ในหนูเมาส์ GFP-LC3 และ CSTTg GFP-LC3 หลัง 6 สัปดาห์ของ Angiotensin II þHSD บาร์=200 มม. (C, F) การหาปริมาณที่เกี่ยวข้องของพื้นที่ F4/80 และ CD3 ต่อไตส่วน. หนูเมาส์ N=7 CSTTg GFP-LC3 และ N=8 GFP-LC3 ค่าจะแสดงเป็นแต่ละแปลงและหมายถึง SEM การทดสอบ Mann-Whitney: P=0.3969 (C) P= 0.3357 (F)
รูปที่ S7 Podocyteautophagydeficiency does not induce ER stress or oxidative stress in young adults at baseline. qPCR analysis of the mRNA expression of genes of the ER stress, oxidative stress, and apoptosis pathway by Qiagen qPCR array in glomeruli from WT and Nphs2.cre Atg5lox/lox mice (A) and WT and CSTTg mice (B). N=4 mice per genotype. For Nox3, Ct >33.
ตาราง S1 ในการเตรียมซิลิโกของบริเวณแตกแยกคาลเพน ตำแหน่งความแตกแยกของ Calpain ถูกทำนายในโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ podocyte และที่เกี่ยวข้องกับ autophagy ด้วย GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org), CaMPDB (HTTP:// calpain.org) และ DeepCalpain Predict (http://deepcalpain Cancerbio. info/help.php). ไฟล์เสริม (Excel)
ตารางเสริม S2 ไฟล์ฉบับสมบูรณ์ของไซต์ซิลิโกที่แตกแยก ตำแหน่งความแตกแยกของ Calpain ถูกทำนายในที่เกี่ยวข้องกับ podocyte และautophagyโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ GPS-CCD (http://ccd. biocuckoo.org), CaMPDB (http://calpain.org) และ DeepCalpain Predict (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php) ไซต์ความแตกแยกของการคาดการณ์จะกลับมาทำงานต่อสำหรับโปรตีนแต่ละตัวสำหรับ GPS-CCD และ DeepCalpain Predict
ข้อมูลอ้างอิง
1. Coresh J, Selvin E, Stevens LA และอื่น ๆ ความชุกของโรคเรื้อรังไตโรคในประเทศสหรัฐอเมริกา จามา. 2007;298:2038–2047.
2. Collins AJ, Vassalotti JA, Wang C และอื่น ๆ ใครควรเป็นเป้าหมายในการตรวจคัดกรอง CKD? ผลกระทบของโรคเบาหวาน ความดันโลหิตสูง และโรคหลอดเลือดหัวใจ Am J ไต Dis. 2009;53:S71–S77.
3. Chang TI, Li S, Chen SC และอื่น ๆ ปัจจัยเสี่ยงสำหรับ ESRD ในบุคคลที่มี GFR โดยประมาณที่เก็บรักษาไว้ทั้งที่มีและไม่มีอัลบูมินูเรีย: ผลลัพธ์จากโครงการประเมินค่าไตล่วงหน้า (KEEP) Am J ไต Dis. 2013;61:S4–S11.
4. Hsu CY, McCulloch CE, Darbinian J และอื่น ๆ ความดันโลหิตสูงขึ้นและความเสี่ยงต่อโรคไตวายเรื้อรังระยะสุดท้ายในอาสาสมัครที่ไม่มีโรคไตที่การตรวจวัดพื้นฐาน แพทย์ฝึกหัด 2005;165:923–928.
5. Nagase M, Shibata S, Yoshida S และอื่น ๆ การบาดเจ็บของ Podocyte อยู่ภายใต้ glomerulopathy ของหนูที่เป็นโรคความดันโลหิตสูง Dahl และกลับกันโดย aldosterone blocker ความดันโลหิตสูง 2549;47:1084–1093.
6. Garovic VD, Wagner SJ, Turner ST และอื่น ๆ การขับถ่าย podocyte ในปัสสาวะเป็นเครื่องหมายสำหรับภาวะครรภ์เป็นพิษ แอม เจ ออบสเตต นรีแพทย์ 2007;196, 320.e321–e327.
7. Craici IM, Wagner SJ, Bailey KR, และคณะ Podocyturia ถือกำเนิดจากโปรตีนในปัสสาวะและลักษณะทางคลินิกของภาวะครรภ์เป็นพิษ: การศึกษาในอนาคตระยะยาว ความดันโลหิตสูง 2013;61:1289–1296.
8. Wang G, Lai FM, Kwan BC และอื่น ๆ การสูญเสีย Podocyte ในภาวะไตเสื่อมจากความดันโลหิตสูงของมนุษย์ แอม เจ ไฮเปอร์เทนส์. 2552;22:300–306.
9. Wang G, Kwan BC, Lai FM และอื่น ๆ การแสดงออกภายในไตของ miRNAs ในผู้ป่วยโรคไตความดันโลหิตสูง แอม เจ ไฮเปอร์เทนส์. 2010;23:78–84.
10. Ruggenenti P, Perna A, Gherardi G และอื่น ๆ โรคไตวายเรื้อรังที่มีโปรตีน: ผลลัพธ์และการตอบสนองต่อการรักษาในกลุ่มที่คาดหวังของผู้ป่วย 352 รายที่มีรูปแบบการบาดเจ็บของไตที่แตกต่างกัน Am J ไต Dis. 2000;35:1155–1165.
11. Fukuda A, Wickman LT, Venkatareddy MP และอื่น ๆ การสูญเสีย podocyte ถาวรที่ขึ้นกับ Angiotensin II จากโกลเมอรูไลที่ไม่เสถียรทำให้เกิดการลุกลามของระยะสุดท้ายไตโรค. ไตอินเตอร์ 2012;81:40–55.
12. Tuncdemir M, Ozturk M. ผลของตัวรับ angiotensin-II บล็อกเกอร์ต่อความเสียหายของ podocyte และการตายของเซลล์ไตในหนูทดลองของโรคไตที่เกิดจากเบาหวาน streptozotocin แอคตา ฮิสโตเคม. 2011;113:826–832.
13. Nijenhuis T, Sloan AJ, Hoenderop JG และอื่น ๆ Angiotensin II มีส่วนทำให้เกิดการบาดเจ็บของ podocyte โดยการเพิ่มการแสดงออกของ TRPC6 ผ่านเส้นทางการส่งสัญญาณตอบรับเชิงบวกที่อาศัย NFAT แอม เจ ปทุม. 2011;179:1719–1732.
14. กลุ่มศึกษา EUCLID การทดลองแบบสุ่มที่ควบคุมด้วยยาหลอกของไลซิโนพริลในผู้ป่วยภาวะความดันโลหิตปกติที่เป็นเบาหวานขึ้นอยู่กับอินซูลินและภาวะปกติในปัสสาวะปกติหรือไมโครอัลบูมินูเรีย มีดหมอ 1997;349:1787–1792.
15. de Zeeuw D, Remuzzi G, Parving HH และอื่น ๆ โปรตีนในปัสสาวะ เป้าหมายสำหรับการป้องกัน renoprotection ในผู้ป่วยโรคไตจากเบาหวานชนิดที่ 2: บทเรียนจาก RENTAL ไตอินเตอร์ 2004;65:2309–2320.
16. Benigni A, Gagliardini E, Remuzzi G. การเปลี่ยนแปลงในการเลือกระดับการดัดของไตที่เกิดจาก angiotensin II บ่งบอกถึงความผิดปกติของ podocyte และการจัดเรียงโปรตีนของไดอะแฟรมกรีดใหม่ เซมิน เนโฟรล. 2004;24:131–140.
17. วัง แอล, แฟลนเนอรี พีเจ, สเปอร์นีย์ อาร์เอฟ การแสดงคุณลักษณะของชนิดย่อยของรีเซพเตอร์ angiotensin II ใน podocytes เจแล็บคลินิก 2546;142:313–321.
18. Langham RG, Kelly DJ, Cox AJ และอื่น ๆ โปรตีนในปัสสาวะและการแสดงออกของโปรตีนไดอะแฟรมช่อง podocyte, เนฟริน, ในโรคไตจากเบาหวาน: ผลของการยับยั้งเอนไซม์ที่ทำให้เกิด angiotensin เบาหวาน. 2002;45:1572–1576.
19. Nakamura T, Ushiyama C, Suzuki S และอื่น ๆ ผลของสารยับยั้งเอนไซม์ที่ทำให้เกิด angiotensin-converting, angiotensin II receptor antagonist และแคลเซียม antagonist ต่อ podocytes ปัสสาวะในผู้ป่วย IgA nephropathy แอม เจ เนโฟรล. 2000;20:373–379.
20. Henger A, Huber T, Fischer KG และอื่น ๆ Angiotensin II เพิ่มกิจกรรมแคลเซียมในเซลล์ในเซลล์ของหนูในวัฒนธรรม ไตอินเตอร์ 1997;52: 687–693.
21. Praga M, Hernandez E, Montoyo C และอื่น ๆ ผลประโยชน์ระยะยาวของการยับยั้งเอนไซม์ที่ทำให้เกิด angiotensin ในผู้ป่วยที่มีโปรตีนในปัสสาวะ Am J ไต Dis. 1992;20:240–248.
22. Nitschke R, Henger A, Ricken S และอื่น ๆ Angiotensin II เพิ่มกิจกรรมแคลเซียมภายในเซลล์ใน podocytes ของ glomerulus ที่ไม่บุบสลายไตอินเตอร์ 2000;57:41–49.
23. Gloy J, Henger A, Fischer KG และอื่น ๆ Angiotensin II ปรับการทำงานของเซลล์ของ podocytes ไต Int Suppl. 1998;67:S168–S170.
24. Miceli I, Burt D, Taraba E และอื่น ๆ การยืดกล้ามเนื้อช่วยลดการแสดงออกของเนฟรินผ่านกลไกที่ขึ้นกับ angiotensin II-AT(1) ในเซลล์พอดไซต์ของมนุษย์: ผลของ rosiglitazone แอม เจ ฟิสิออล รีนัล ฟิสิออล 2010;298:F381–F390.
25. Endlich N, Endlich K. การยืด การตึง และการยึดเกาะ—กลไกการปรับตัวของโครงร่างโครงร่างโครงร่างของแอกตินในพอดไซต์ Eur J เซลล์ ไบโอล. 2006;85:229–234.
26. Durvasula RV, Petermann AT, Hiromura K และอื่น ๆ การกระตุ้นระบบ angiotensin เนื้อเยื่อท้องถิ่นใน podocytes โดยความเครียดทางกล ไตอินเตอร์ 2004;65:30–39.
27. Riser BL, Cortes P, Heilig C และอื่น ๆ แรงยืดแบบวัฏจักรคัดเลือกขึ้นเพื่อควบคุมการเปลี่ยนแปลงปัจจัยการเจริญเติบโต-ไอโซฟอร์มเบต้าในเซลล์ mesangial ของหนูที่เพาะเลี้ยง แอม เจ ปทุม. 1996;148:1915–1923.
28. Kretzler M, Koeppen-Hagemann I, Kriz W. ความเสียหายของ Podocyte เป็นขั้นตอนสำคัญในการพัฒนาของ glomerulosclerosis ในหนูที่มีความดันโลหิตสูง จดหมายเหตุ Virchows 1994;425:181–193.
29. Jung HS, Chung KW, Won Kim J, และคณะ การสูญเสีย autophagy จะทำให้มวลเซลล์เบต้าของตับอ่อนลดลงและทำงานด้วยภาวะน้ำตาลในเลือดสูงที่เป็นผลลัพธ์ Metab ของเซลล์ 2008;8:318–324.
30. Ebato C, Uchida T, Arakawa M และอื่น ๆออโตฟาจีมีความสำคัญในสภาวะสมดุลของเกาะเล็กเกาะน้อยและการชดเชยมวลเบตาเซลล์ที่เพิ่มขึ้นเพื่อตอบสนองต่ออาหารที่มีไขมันสูง Metab ของเซลล์ 2008;8:325–332.
31. Lenoir O, Jasiek M, Henique C, และคณะ เซลล์บุผนังหลอดเลือดและ autophagy ของ podocyte ทำงานร่วมกันป้องกันจากโรคเบาหวานที่เกิดจาก glomerulosclerosis ออโต้ฟาจี 2015;11:1130–1145.
32. Hartleben B, Godel M, Meyer-Schwesinger C และอื่น ๆ Autophagy ส่งผลต่อความไวต่อโรคไตและรักษาสภาวะสมดุลของ podocyte ในหนูที่มีอายุมากขึ้น เจ คลิน อินเวสท์ 2010;120:1084–1096.
33. Sato S, Kitamura H, Adachi A และอื่น ๆ autophagy สองประเภทใน podocytes ในตัวอย่างชิ้นเนื้อไต: การศึกษา ultrastructural เจ Submicrosc Cytol Pathol. 2549;38:167–174.
34. Asanuma K, Tanida I, Shirato I และอื่น ๆ MAP-LC3 ซึ่งเป็นเครื่องหมาย autophagosomal ที่มีแนวโน้มจะได้รับการประมวลผลในระหว่างการสร้างความแตกต่างและการกู้คืนของ podocytes จาก PAN nephrosis FASEB J. 2003;17:1165–1167.
35. Mizushima N, Levine B, Cuervo AM และอื่น ๆออโตฟาจีต่อสู้กับโรคด้วยการย่อยตัวเองของเซลล์ ธรรมชาติ. 2008;451:1069–1075.
36. Yang L, Li P, Fu S และอื่น ๆ autophagy ตับบกพร่องในโรคอ้วนส่งเสริมความเครียด ER และทำให้เกิดการดื้อต่ออินซูลิน Metab ของเซลล์ 2010;11:467–478.
37. Xie Z, Klionsky ดีเจ การก่อตัว autophagosome: เครื่องจักรหลักและการดัดแปลง แนท เซลล์ ไบโอล. 2007;9:1102–1109.
38. Kume S, Thomas MC, Koya D. Nutrient sensing, autophagy และโรคไตจากเบาหวาน โรคเบาหวาน. 2012;61:23–29.
39. Kume S, Uzu T, Maegawa H และอื่น ๆ Autophagy: เป้าหมายการรักษาแบบใหม่สำหรับไตโรคต่างๆ คลินิก Exp Nephrol. 2012;16:827–832.
40. Huber TB, Edelstein CL, Hartleben B และอื่น ๆ บทบาทใหม่ของautophagyในการทำงานของไต โรค และอายุ ออโต้ฟาจี 2012;8:1009–1031.
41. Weide T, ฮูเบอร์ TB ผลกระทบของ autophagy ต่อการแก่ของไตและโรค ความละเอียดของเนื้อเยื่อเซลล์ 2011;343:467–473.
42. Bork T, Liang W, Yamahara K, และคณะ Podocytes รักษาระดับ autophagy ในระดับสูงโดยไม่ขึ้นกับสัญญาณ mtor ออโต้ฟาจี 2020;16:1932– 1948.
43. Peltier J, Bellocq A, Perez J และอื่น ๆ การกระตุ้นและการหลั่ง Calpain ส่งเสริมการบาดเจ็บของไตในไตอักเสบจากการทดลอง: หลักฐานจากคัลปาสแตติน- หนูดัดแปรพันธุกรรม เจ แอม ซ็อก เนโฟรล 2549;17:3415–3423.
44. Moeller MJ, Sanden SK, Soofifi A และอื่น ๆ การแสดงออกเฉพาะของ Podocyte ของ Cre recombinase ในหนูที่ดัดแปลงพันธุกรรม ปฐมกาล 2003;35:39–42.
45. Hara T, Nakamura K, Matsui M และอื่น ๆ การปราบปราม autophagy พื้นฐานในเซลล์ประสาททำให้เกิดโรคเกี่ยวกับระบบประสาทในหนู ธรรมชาติ. 2006;441: 885–889.
46. Lazareth H, Henique C, Lenoir O และอื่น ๆ tetraspanin CD9 ควบคุมการย้ายถิ่นและการเพิ่มจำนวนของเซลล์เยื่อบุผิวข้างขม่อมและความก้าวหน้าของโรคไต แนท คอมมูน. 2019;10:3303.
47. Bollee G, Flamant M, Schordan S และอื่น ๆ ตัวรับปัจจัยการเจริญเติบโตของผิวหนังส่งเสริมการบาดเจ็บของไตและภาวะไตวายในโรคไตวายเรื้อรังที่มีความก้าวหน้าอย่างรวดเร็ว นัท เมด. 2011;17:1242–1250.
48. Lenoir O, Milon M, Virsolvy A และอื่น ๆ การกระทำโดยตรงของ endothelin-1 ต่อ podocytes ส่งเสริมภาวะไตเสื่อมจากเบาหวาน เจ แอม ซ็อก เนโฟรล 2014;25:1050–1062.
49. Henique C, Bollee G, Lenoir O และอื่น ๆ อีรีทรอยด์แฟกเตอร์นิวเคลียร์ 2-ปัจจัยที่เกี่ยวข้อง 2 ขับเคลื่อนการแสดงออกจำเพาะของพอดไซต์ของรีเซพเตอร์ที่ถูกกระตุ้นด้วยเปอร์รอกซิโซม proliferator g ซึ่งจำเป็นสำหรับความต้านทานต่อ GN เสี้ยววงเดือน เจ แอม ซ็อก เนโฟรล 2016;27:172–188.
50. Perez J, Dansou B, Herve R และอื่น ๆ Calpains ที่ปล่อยออกมาโดย T ลิมโฟไซต์ตัดกับ TLR2 เพื่อควบคุมการแสดงออกของ IL-17 เจ อิมมูนอล 2016;196:168–181.
51. Raimbourg Q, Perez J, Vandermeersch S และอื่น ๆ คาลเพ็ง/คัลปาสแตตินระบบมีบทบาทตรงกันข้ามในการเจริญเติบโตและการแพร่กระจายของมะเร็งผิวหนังระยะลุกลาม ป.ล. หนึ่ง 2013;8:e60469.
52. Letavernier B, Zafrani L, Nassar D และอื่น ๆ Calpains มีส่วนช่วยในการซ่อมแซมหลอดเลือดในรูปแบบที่ก้าวหน้าอย่างรวดเร็วของ glomerulonephritis: บทบาทที่เป็นไปได้ของการทำให้เป็นภายนอก หลอดเลือดแดง Thromb Vasc Biol 2012;32:335–342.
53. Weber JJ, Pereira Sena P, Singer E และอื่น ๆ ฆ่านกโกรธสองตัวด้วยหินก้อนเดียว:autophagyกระตุ้นโดยการยับยั้ง calpains ในโรคเกี่ยวกับระบบประสาทและอื่น ๆ Biomed Res Int. 2019;2019:4741252.
54. Liu Z, Cao J, Gao X และอื่น ๆ GPS-CCD: โปรแกรมคำนวณแบบใหม่สำหรับการทำนายตำแหน่งรอยแยกคาลเพน ป.ล. หนึ่ง 2011;6:e19001.
55. duVerle D, Takigawa I, Ono Y และอื่น ๆ CaMPDB: ทรัพยากรสำหรับการสลายโปรตีนคาลเพนและการมอดูเลต ข้อมูลจีโนม 2010;22:202–213.
56. Liu ZX, Yu K, Dong J และอื่น ๆ การทำนายที่แม่นยำของตำแหน่งที่แตกแยกคาลเพนและความผิดปกติที่เกิดจากการกลายพันธุ์ในมะเร็ง ยีนด้านหน้า 2019;10: 715.
57. Yousefifi S, Perozzo R, Schmid I และอื่น ๆ ความแตกแยกที่เกิดจาก Calpain ของ Atg5 จะเปลี่ยน autophagy เป็น apoptosis แนท เซลล์ ไบโอล. 2006;8:1124–1132.
58. Xia HG, Zhang L, Chen G และอื่น ๆ การควบคุม autophagy พื้นฐานโดย calpain1 mediated cleavage ของ ATG5ออโตฟาจี. 2010;6:61–66.
59. Russo R, Berliocchi L, Adornetto A และอื่น ๆ ความแตกแยกของ Calpain-mediated ของ Beclin-1 และการลดการควบคุม autophagy หลังการบาดเจ็บที่จอประสาทตาขาดเลือดในร่างกาย เซลล์ตาย Dis. 2011;2:e144.
60. Yadav A, Vallabu S, Arora S และอื่น ๆ ANG II ส่งเสริมautophagyในพอดไซต์ Am J Physiol เซลล์ Physiol. 2010;299:C488–C496.
61. แฟลนเนอรี พีเจ, สเปอร์นีย์ อาร์เอฟ การเปลี่ยนแปลงของตัวรับปัจจัยการเจริญเติบโตของผิวหนังโดย angiotensin II ใน glomerular podocytes เนฟรอน เอ็กซ์พี เนฟรอล 2006;103:e109–e118.
62. Harrison-Bernard LM, Navar LG, Ho MM และอื่น ๆ การแปลตำแหน่งอิมมูโนฮิสโตเคมีของตัวรับ ANG II AT1 ในหนูตัวเต็มวัยไตโดยใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดี แอม เจ ฟิสิโอล 1997;273:F170–F177.
63. Liebau MC, Lang D, Bohm J และอื่น ๆ การแสดงออกทางหน้าที่ของระบบ renin angiotensin ใน podocytes ของมนุษย์ แอม เจ ฟิสิออล รีนัล ฟิสิออล 2006;290:F710–F719.
64. Pavenstadt H. Franz Volhard Award 2000: การส่งสัญญาณ angiotensin II ใน podocyte ไตความดันโลหิต Res. 2000;23:156–158.
65. Wennmann DO, Hsu HH, Pavenstadt H. ระบบ renin-angiotensin aldosterone ใน podocytes เซมิน เนโฟรล. 2012;32:377–384.
66. Jia J, Ding G, Zhu J, และคณะ การให้สาร Angiotensin II ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของ nephrin และการตายของเซลล์ podocyte แอม เจ เนโฟรล. 2008;28:500– 507.
67. Crowley SD, Vasievich MP, Ruiz P และอื่น ๆ Glomerular type 1 angiotensin receptors ช่วยเพิ่มอาการบาดเจ็บที่ไตและการอักเสบในโรคไตอักเสบจากภูมิต้านทานผิดปกติของหนู เจ คลิน อินเวสท์ 2552;119:943–953.
68. เพลง K, Stuart D, Abraham N และอื่น ๆ การเก็บเรนินในท่อไม่ได้เป็นสื่อกลางสำหรับความดันโลหิตสูงจากเกลือ DOCA หรือการบาดเจ็บของไต ป.ล. หนึ่ง 2016;11: e0159872.
69. Liu Z, Ji J, Zheng D และอื่น ๆ บทบาทการป้องกันของ endothelial calpain knockout ในภาวะเฉียบพลันที่เกิดจากไลโปโพลีแซคคาไรด์ไตการบาดเจ็บโดยการลดทอนของเส้นทาง p38-iNOS และการผลิต NO/ROS Exp โมลเมด 2020;52:702– 712.
70. Seremwe M, Schnellmann RG, Bollag WB. กิจกรรมของ Calpain-10 รองรับการผลิตอัลโดสเตอโรนที่เกิดจาก angiotensin II ในแบบจำลองเซลล์ต่อมหมวกไต glome rulosa วิทยาต่อมไร้ท่อ 2015;156:2138–2149.
71. Verheijden KAT, Sonneveld R, Bakker-van Bebber M, และคณะ โปรตีเอสคาลเพนที่ขึ้นกับแคลเซียม-1เชื่อมโยงกิจกรรมของ TRPC6 กับการบาดเจ็บของโพโดไซต์ เจ แอม ซ็อก เนโฟรล 2018;29:2099–2109.
72. ชาวนา LK, Rollason R, Whitcomb DJ และอื่น ๆ TRPC6 จับและกระตุ้นคาลเพน โดยไม่ขึ้นกับกิจกรรมของช่องสัญญาณ และควบคุมโครงร่างโครงกระดูกของพอดไซต์ การยึดเกาะของเซลล์ และการเคลื่อนที่ เจ แอม ซ็อก เนโฟรล 2019;30: 1910–1924.
73. Letavernier E, Perez J, Bellocq A และอื่น ๆ การกำหนดเป้าหมายระบบ calpain/calpastatin เป็นกลยุทธ์ใหม่เพื่อป้องกันการเปลี่ยนแปลงของหัวใจและหลอดเลือดในภาวะความดันโลหิตสูงที่เกิดจาก angiotensin II Circ Res. 2008;102:720–728.
74. Zafrani L, Gerotziafas G, Byrnes C และอื่น ๆคัลปาสตาตินควบคุมภาวะติดเชื้อจากจุลินทรีย์หลายชนิดโดยจำกัดการปลดปล่อยอนุภาคโปรโคแอกกูแลนต์ Am J Respir Crit Care Med. 2012;185:744–755.
75. Letavernier E, Dansou B, Lochner M และอื่น ๆ บทบาทที่สำคัญของความสมดุลของ calpain/ calpastatin ในการปฏิเสธ allograft แบบเฉียบพลัน เออ เจ อิมมูนอล 2011;41: 473–484.
76. Hanuna G, Mesnard L, Vandermeersch S, และคณะ การยับยั้ง calpain เฉพาะช่วยปกป้องไตต่อการอักเสบ ตัวแทนวิทย์. 2017;7:8016.
77. Ong SB, Lee WH, Shao NY และอื่น ๆ การยับยั้ง Calpain ฟื้นฟูautophagyและป้องกันการแตกตัวของไมโตคอนเดรียในแบบจำลอง iPSC ของมนุษย์ของการเกิดเบาหวานขึ้นที่ต้นไลโอพาที ตัวแทนเซลล์ต้นกำเนิด. 2019;12:597–610.
78. นอร์แมน เจเอ็ม โคเฮน จีเอ็ม แบมป์ตัน ET ความแตกแยกในหลอดทดลองของโปรตีนสูงโดยโปรตีเอสการตายของเซลล์ ออโต้ฟาจี 2010;6:1042–1056.
79. De Tullio R, Averna M, Pedrazzi M และอื่น ๆ กฎเกณฑ์เชิงอนุพันธ์ของคอมเพล็กซ์ calpain-calpastatin โดยโดเมน L ของคัลปาสแตติน. ไบโอชิม ไบโอฟิส แอคตา 2014;1843:2583–2591.