Aryl Hydrocarbon Receptor ขึ้นอยู่กับ

โปรดติดต่อoscar.xiao@wecistanche.comสำหรับข้อมูลเพิ่มเติม

2.2.6. การปลูกฝัง EC . เบื้องต้นของมนุษย์

EC หลักของมนุษย์ (ลอนซา, โคโลญ, เยอรมนี) ได้รับการเพาะเลี้ยงในตัวกลางที่บุผนังหลอดเลือดสมบูรณ์ (EBM) (ลอนซา, โคโลญ, เยอรมนี) เสริมด้วยไฮโดรคอร์ติโซน 1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร, สารสกัดจากสมองวัว 12 ก./มล., 50 ไมโครกรัม/ ml gentamicin, 10ng/mL human epidermal growth factor, และ 10 เปอร์เซ็นต์ (o/v)fetal calf serum ที่ 37 องศาและ 5 เปอร์เซ็นต์ CO จนถึงขั้นตอนที่สาม หลังจากการแยกออกด้วย 0.05 เปอร์เซ็นต์ (o/o)Trypsin/EDTA (Thermo Scientific, Schwerte, Germany) เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในจานเพาะเลี้ยงขนาด 6 ซม. หรือจานเพาะเลี้ยง 6 หลุม เป็นเวลาอย่างน้อย 18 ชั่วโมงก่อนการถ่ายหรือการบำบัด

กรุณาคลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

2.2.7. การเปลี่ยนแปลงชั่วคราวของ EC

เซลล์ถูกทรานส์เฟกตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [65] โดยสังเขป EC ถูกทรานส์เฟกโดยใช้ SuperFectTransfection Reagent(Qiagen, Hilden, Germany) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต การแสดงออกที่มากเกินไปหรือการล้มลงของ AhR ทำได้หลังจาก 24 หรือ 48 ชั่วโมงตามลำดับ ประสิทธิภาพการถ่ายเมื่อแสดงออกมากเกินไปอยู่ที่ประมาณ 40 เปอร์เซ็นต์

2.2.8. การทดสอบรอยขีดข่วนของ EC

สำหรับการตรวจสอบความสามารถในการเคลื่อนย้ายของ EC การทดสอบบาดแผลถูกดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [66] ในรายละเอียด บาดแผลถูกจัดวางในเซลล์โมโนเลเยอร์ด้วยเครื่องขูดเซลล์ตามแนวติดตาม หลังจากได้รับบาดเจ็บ เซลล์ที่ไม่ยึดติดจะถูกลบออกโดยการล้างอย่างอ่อนโยนซิสแทนเช่ ซัลซ่าสกัดการรักษาเคอร์คูมินทำโดยตรงหลังจากทำแผล เคอร์-ยี่หร่าถูกละลายใน DMSO และใช้ที่ความเข้มข้นสุดท้ายที่ 7.5 ไมโครโมลาร์ การย้าย EC ถูกหาปริมาณโดยการย้อมสีเซลล์ด้วย 5 ug/mL 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(Carl Roth, Karlsruhe, Germany)ใน PBS เป็นเวลา 5 นาทีหลังจากที่เซลล์ได้รับการแก้ไข ด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์ (v/v) เป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ถ่ายภาพโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง Zeiss AxioVision Observer D1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)) โดยใช้กำลังขยาย 200- เซลล์ที่ย้ายเข้าสู่บาดแผลจากเส้นติดตามจะถูกนับโดยอัตโนมัติโดยใช้ฟังก์ชันการวิเคราะห์อนุภาคของ Image]1.52a ]67I หลังจากแยกนิวเคลียสที่ทับซ้อนกัน

Cistanche สามารถต่อต้านริ้วรอย

2.2.9. ภูมิคุ้มกันของEC

EC ถูกตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์ (o/v) เป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง หลังจากการซึมผ่านและการปิดกั้นใน 0.3 เปอร์เซ็นต์ (o/o)Triton-X 100 และ 3 เปอร์เซ็นต์ (o/u) เซรั่มของแพะปกติใน PBS เซลล์ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีของกระต่ายที่ต้าน AhR(1:100, Abcam, Cambridge, สหราชอาณาจักร) หรือ Nrf2 (โคลน D1Z9C, 1:100, Cell Signaling Technology, แฟรงก์เฟิร์ต, เยอรมนี) เจือจางในเซรั่มแพะปกติ 1 เปอร์เซ็นต์ (o/v) ใน PBS ค้างคืนที่ 4 C จากนั้น เซลล์ถูกล้างด้วย PBS และฟักไข่ด้วย Alexa 594-แพะที่ต่อต้านกระต่าย IgG(1:500, Invitrogen, Darmstadt, Germany) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องcistanche ก้านสำหรับการย้อมสีแอคติน เซลล์ถูกบ่มด้วย Alexa FluorTM 488 Phalloidin (1:70, Invitrogen, Darmstadt, Germany) เป็นเวลา 20 นาทีที่อุณหภูมิห้อง นิวเคลียสถูกย้อมทับด้วย DAPI 0.5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรใน PBS เป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้องและเซลล์ถูกติดด้วย ProLong'MDiamond Antifade Mountant (Invitrogen, ดาร์มสตัดท์, เยอรมนี) ภาพเรืองแสงถ่ายโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง Zeiss AxioVision Observer D1 พร้อมกำลังขยาย 400 เท่าหรือ 200 เท่า

2.2.10. qPCR ในเซลล์

RNA ของเซลล์ทั้งหมดถูกแยกออกโดยการรวมการแยกสลายใน TRIzolTM กับการประมวลผลปลายน้ำโดยใช้ RNeasy Mini Kit(Qiagen(Hilden, Germany)) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต การสังเคราะห์ cDNA ดำเนินการโดยใช้ QuantiTect9 Reverse Transcription Kit (Qiagen (Hilden, Germany)) ด้วย 1 ug RNA ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ระดับการถอดรหัสสัมพัทธ์ถูกกำหนดโดย PCR โดยใช้ 2x SYBR③ Green qPCR Master Mix และ Rotor-Gene Q thermal cycler (Qiagen (Hilden, Germany)) การถอดเสียงสำหรับโปรตีนไรโบโซม L32 (rpl32) ถูกใช้เป็นข้อมูลอ้างอิง และการแสดงออกสัมพัทธ์คำนวณโดยวิธี AC [68] คู่ไพรเมอร์ที่ขยายช่วงอินตรอนต่อไปนี้ถูกใช้:ทุน (หมายเลขทะเบียนยีน NM_000499.5):5'-TCGCTACCTACCCAACCCTT-3',5'-TGTGTCAAACCCAGCTCCAA-3';ahr(ยีน เลขทะเบียน NM_001621.5):5'-CGTGGGTCAGATGCAGTACA-3',5'ACCAGGGT-CAAAATTGGGCT3';sod2(หมายเลขทะเบียนยีน NM_000636.4):5'-GCCCTGGAACCTCAC ATCAA -3';5'-AGCAACTCCCCTTTTGGGTTC-3';rpl32(หมายเลขทะเบียนยีน NM_000994.4):5'-GTGAAGCCCAAGATCGTCAA-3',5'-TTGTTGCACATCAGCAGCAC{{ 41}}'.

2.3.หนู

2.3.1.เส้นเมาส์และการผสมพันธุ์

เพศหญิง 8-12-อายุสัปดาห์ ("หนุ่ม")และ 18-อายุเดือน ("แก่")AHR-deficient B6.129-AHRtmlBra/J (Schmidt et al., 1996; อ้างถึง ที่นี่เป็น AHR-KO) หนูได้รับการอบรมเป็น heterozygotes ในสถานเลี้ยงสัตว์ของ IUF เพื่อนร่วมครอกประเภทป่าถูกใช้เพื่อควบคุม หนูได้รับการอบรมและดูแลภายใต้สภาวะที่ปราศจากเชื้อโรคโดยเฉพาะในวงจรแสง-มืด 12/12 ชั่วโมง และได้รับเชาเชามาตรฐาน (ดมกลิ่น"MZ, SNIFF, Soest, เยอรมนี) แบบอิสระ 2.3.2.qPCR ในหนู

RNA ทั้งหมดถูกแยกออกจากเนื้อเยื่ออวัยวะของ WT สามตัวและหนูที่ขาด AHR สามตัวที่มี TriZol[ จากนั้น 400 ng ของ RNA ถูกคัดลอกย้อนกลับโดยใช้ reverse transcriptase M-MLV (Promega, Madison, WI, USA) และไพรเมอร์เฮกซาเมอร์แบบสุ่ม ระดับการแสดงออกของยีนถูกวัดซ้ำกันสำหรับเนื้อเยื่อของหนูเมาส์แต่ละตัวบน Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden, Germany) ในปริมาตรสุดท้าย 15 μL ที่มี 7.5 μL Rotor Gene SybrGreenTM （Biorad, Feldkirchen, Germany）, 1 uM ของไพรเมอร์แต่ละตัว น้ำปราศจาก cDNA และ RNase 1.5 ไมโครลิตร ประสิทธิภาพของไพรเมอร์อยู่ระหว่าง 90 เปอร์เซ็นต์ ถึง 146 เปอร์เซ็นต์ ดูตาราง S2 สำหรับลำดับไพรเมอร์และประสิทธิภาพ ระดับการแสดงออกถูกปรับเทียบเป็นการแสดงออกของ RPS6 เป็นยีนดูแลทำความสะอาดในตัวอย่างเดียวกันโดยใช้ {{13 }}วิธี CT [69].

2.4.ใน Silico วิเคราะห์

การสร้างแบบจำลองความคล้ายคลึงกันของ CeAhR LBD

แบบจำลองโครงสร้างของ C. elegans AhR LBD (เรซิดิว 267-372) ถูกสร้างขึ้นโดยการสร้างแบบจำลองที่คล้ายคลึงกัน โครงสร้างเอ็กซ์เรย์ของโดเมน PASB ของสมาชิกในครอบครัว bHLH-PAS ที่คล้ายคลึงกันซึ่งมีลำดับความเหมือนกันสูงสุด (ประมาณ 20 เปอร์เซ็นต์) กับ CeAhR PASB ถูกใช้เป็นแม่แบบ: วงจรเอาท์พุตของหัวรถจักร circadian kaput (CLOCK, PDB: 4F3L), โปรตีนที่มีโดเมน PAS ของเส้นประสาท 3(NPAS3, PDB:5SY7), ปัจจัยที่ทำให้เกิดภาวะขาดออกซิเจน 20(HIF2o, PDB:3H82,4ZP4,3F1N) และ lo(HIFlo, PDB:4H6J) ได้โมเดลด้วย MODELLER[70-72]ประโยชน์ของ cistanche tubulosa และผลข้างเคียงโมเดลที่เหมาะสมที่สุดถูกเลือกจาก 10 แบบที่สร้างขึ้น โดยอิงจาก DOPE SCORE ที่ดีที่สุด [73] คุณภาพของแบบจำลองได้รับการประเมินโดยใช้ PROCHECK [74] โครงสร้างรองเกิดจาก DSSPcont [75] ช่องการจับภายใน LBD ที่จำลองมีลักษณะเฉพาะโดยใช้เซิร์ฟเวอร์ CASTp[76] การสร้างภาพโมเดลทำได้โดยใช้ PYMOL[77]

2.5.การวิเคราะห์ทางสถิติ

การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการใน GraphPad Prism (เวอร์ชัน 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA) เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น สำหรับการทดสอบช่วงชีวิต/สุขภาพ การวิเคราะห์ทางสถิติทำได้โดยใช้ OASIS[53] การวิเคราะห์ทางสถิติของข้อมูล microarray ดำเนินการใน R (R Foundation (เวียนนา ประเทศออสเตรีย)) Boxplots ถูกสร้างขึ้นใน GraphPad Prism (เวอร์ชัน 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA) และแสดงค่ามัธยฐาน (บรรทัด) 25-75 เปอร์เซ็นไทล์ที่ (กล่อง) และเปอร์เซ็นไทล์ที่ 10-90 (เครา).

3. ผลลัพธ์

3.1. Curcumin ส่งเสริมช่วงสุขภาพในลักษณะที่ขึ้นอยู่กับ AhR และเป็นอิสระ

การสูญเสีย ahr-1 ส่งเสริมสุขภาพและอายุขัยของ C.elegans ในสภาวะพื้นฐาน[14] และส่งผลเสียต่อลักษณะที่เกี่ยวข้องกับอายุในการตอบสนองต่อมอดูเลเตอร์ AhR ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เช่น benzo[a]pyrene (BaP), UVB แสงและจุลินทรีย์ [25] โพลีฟีนอลในอาหาร เช่น เคอ-ยี่หร่า ก่อตัวเป็นกลุ่มที่สำคัญของโมดูเลเตอร์ AhR ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่มีผลต่ออายุขัยใน C. elegans [78,79] ดังนั้นเราจึงตรวจสอบผลการยืดอายุของเคอร์คูมินสำหรับการพึ่งพา ahr-1 เคอร์คูมินสามารถทำซ้ำได้และขยายอายุขัยและสุขภาพของ C. elegans อย่างมีนัยสำคัญในลักษณะที่ขึ้นกับ ahr-1- (รูปที่ 1A,B) ก่อนหน้านี้ เราได้แสดงให้เห็นว่าการสูญเสีย ahr-1 ยังช่วยยืดอายุในแบบจำลองโรคฮันติงตันและโรคพาร์กินสันด้วย โดยการแสดงออกของกล้ามเนื้อมากเกินไปของโพลีกลูตามีนที่มีแนวโน้มการรวมกลุ่ม (polyQ40) และ -synuclein ( -syn) ตามลำดับ ในขณะที่อยู่ที่ ในขณะเดียวกันก็เพิ่มปริมาณโปรตีนมวลรวม [25] ที่น่าสนใจ การบำบัดด้วยเคอร์คูมินเพิ่มจำนวนของการรวมกลุ่มของ polyQ40 และ -syn ในระดับเดียวกับการสูญเสียการทำงานของ ahr-7 (รูปที่ 1C) เคอร์คูมินยังส่งเสริมอายุขัยและความสามารถในการเคลื่อนที่ในแบบจำลองโรคเหล่านี้ (รูปที่ 1DE) แต่ผลของการสูญเสีย ahr-1 และการเสริมเคอร์คูมินนั้นเป็นส่วนเสริมในพื้นหลัง PolyQ (รูปที่ 1D) ซึ่งเผยให้เห็น AHR-1-ฟังก์ชั่นการป้องกันที่เป็นอิสระ ของเคอร์คูมินอย่างน้อยก็ในพื้นหลังที่ถูกบุกรุกนี้

รูปที่ 1 Curcumin ส่งเสริมสุขภาพใน AHR-1-ลักษณะที่พึ่งพาและเป็นอิสระ กราฟอายุขัย (A) และช่วงสุขภาพ (B) ของไส้เดือนฝอย DMSO หรือ wt และ ahr ที่บำบัดด้วยเคอร์คูมิน เส้นโค้งการเอาตัวรอดแสดงข้อมูลรวมของเวิร์ม/เงื่อนไข 290-300 ตัวในการทดลอง 5 ครั้ง การทดสอบทางสถิติ:การทดสอบอันดับบันทึก, นัยสำคัญ # เทียบกับ DMSO, *ความนัย vs.wt, ค่า Bonferronip<0.05.(c) quantification="" of="" aggregates="" in="" 10-day-old="" polyq;wt="" and="" poly="" air-1="" (left="" panel)="" or="" 7-day-old="" async;wt="" and="" an;ahr-1="" (right="" panel).="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 59-111="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05><0.05 vs.dmso.(d,e)life/health="" span="" of="" polyq;wt="" and="" polyq;ahr-1.survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 180="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,significance="" vs.="" dmso,="" *="" significance="" vs.="" wt,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.2.ugt-45 เป็นสื่อกลางในการต่อต้านริ้วรอยแห่งวัยของ Curcumin และ ahr-1 Depletion

ในการค้นหา ahr ปลายน้ำที่เป็นไปได้-1-เอฟเฟคเตอร์ที่ขึ้นกับเคอร์คูมิน เราได้ใช้วิธีการที่ตรงเป้าหมายและเป็นกลาง เราตรวจสอบการแสดงออกของยีนเป้าหมาย AhR ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมแบบคลาสสิกและมุ่งเน้นไปที่ยีน Cyp เนื่องจากเคอร์คูมินเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของ CyplA1 และ CyplB1 ในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม [80,81] อย่างไรก็ตาม การหาปริมาณของ 47 cyps ที่แตกต่างกันใน C.elegans โดย semi-quantitative real-time PCR (qPCR) พบว่ามีเพียง cyp-13B1 เท่านั้นที่ได้รับการควบคุมอย่างมีนัยสำคัญไม่ว่าจะโดย ahr-1 depletion หรือโดย curcumin ในลักษณะที่ขึ้นกับ ahr-1-(รูปที่ S1A-B) ในขณะที่อีกสาม cyps(ie,cyp-13A5, cyp-13A8 และ cyp-42A1) เป็น เพิ่มขึ้นโดยเคอร์คูมินเฉพาะในกรณีที่ไม่มี ahr-1(รูปที่ S1) ข้อมูลเหล่านี้พร้อมกับงานอื่น ๆ [25,82] แนะนำว่า cyps ไม่ใช่เป้าหมายหลักของ CeAhR นอกจากนี้ยังได้รับการสนับสนุนโดยการวิเคราะห์การถอดรหัสของเราในรูปแบบไวด์ไทป์และการกลายพันธุ์ ahr-1 อันที่จริง สอดคล้องกับบทบาทของ AHR-1 ในการกำหนดเซลล์ประสาท [37,38,40,41] การแสดงออกของยีนเปลี่ยนแปลงระหว่างการกลายพันธุ์ของ wild-type และ ahr-1 แสดงให้เห็นถึงการเสริมสมรรถนะในกระบวนการที่เชื่อมโยงกับการพัฒนาของเซลล์ประสาท และความแตกต่างและไม่มีการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญในยีนล้างพิษแบบคลาสสิก (รูปที่ 2A) การวิเคราะห์ qPCR ของยีนที่มีการควบคุมขึ้นและลงมากที่สุดระหว่าง ahr-1(jul45) และ wild-type (atf-2 , K04H4.2, เช่น-46, T20F5.4, ptr-4, dyf-7, clec-209, C01B4.6, C01B4.7, F56A4.3)ส่วนใหญ่ ยืนยันการพึ่งพา ahr-1- ในสภาวะพื้นฐาน (รูปที่ 2B) แต่ไม่มีทั้ง UVB [25] และเคอร์คูมิน (รูปที่ 2C) ที่ส่งผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อการแสดงออกของยีนเหล่านี้ เราสงสัยว่าการแสดงออกที่เปลี่ยนแปลงไปในยีนเหล่านี้ได้รับการอนุรักษ์โดยวิวัฒนาการและประเมินการแสดงออกของพวกมันในเนื้อเยื่อต่างๆ (เช่น สมอง ตับ ลำไส้ และเลือด) ของ 8- และ 18-เดือน-ประเภท wild-type และ หนู AhR KO ยีนบางตัวมีแนวโน้มที่จะแสดงออกเพิ่มขึ้นในหนูที่อายุน้อยกว่า (atf-2 homolog) หรือเก่า (lpr-4/5 homologs) ในลักษณะเฉพาะของเนื้อเยื่อ แต่ไม่มีรูปแบบที่ชัดเจนหรือการเปลี่ยนแปลงที่อนุรักษ์ไว้ สังเกต (รูป S2) ผลลัพธ์เหล่านี้สะท้อนถึงความแตกต่างที่เป็นไปได้เฉพาะสปีชีส์หรือกิจกรรมการถอดรหัส AhR ที่ขึ้นกับเนื้อเยื่อในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่ถูกมองข้ามโดยการวิเคราะห์การถอดรหัสของสัตว์ทั้งตัวใน C. elegans การตรวจสอบอย่างละเอียดของยีนที่แสดงออกอย่างแตกต่างมากที่สุดระหว่าง C. elegans wild-type และ ahr-1(jul45) เปิดเผยว่าการแสดงออกของยีนเหล่านี้จำนวนมากได้รับผลกระทบใน C.elegans ระหว่างอายุและโดยโมดูเลเตอร์ AhR ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมในอาหาร ( เช่น quercetin และ resveratrol) [25] จึงแนะนำบทบาทของ AHR-1 ในการแสดงออกของยีนที่ปรับด้วยโพลีฟีนอล สอดคล้องกับสถานการณ์นี้ ข้อมูล microarray แสดงให้เห็นว่ายีนส่วนใหญ่แสดงออกอย่างแตกต่างเมื่อบำบัดด้วยเคอร์คูมินถูกควบคุมอย่างแท้จริงในลักษณะที่ขึ้นกับ ahr-1- (รูปที่ 2D; ตารางที่ 1)สารสกัดจากซิสทานเช ทูบูโลซ่าจากยีน 47 ยีนที่เปลี่ยนแปลงโดยเคอร์คูมินในสายพันธุ์ไวด์ (43 ขึ้นและ 4 ลงควบคุม) มีเพียง 5 ยีนที่ถูกเหนี่ยวนำโดยเคอร์คูมินใน ahr-1(ju145) ในบรรดายีนที่ควบคุมโดยเคอร์คูมินในลักษณะที่ขึ้นกับ AHR-1-ขึ้นกับ AHR คือเอนไซม์ phase Il และที่น่าสนใจ บางส่วนของพวกเขา (ugt-9 และ ugt-29) ถูกควบคุมในทิศทางเดียวกันโดยเคอร์คูมิน หรือสูญเสีย ahr-1 (ตารางที่ 1) ดังนั้นเราจึงตรวจสอบนิพจน์และ ugts(ugt-45 และ ugt-57) เพิ่มเติมที่แสดงความแตกต่างเมื่อใช้การวิเคราะห์ทางสถิติที่มีข้อจำกัดน้อยกว่าซึ่งไม่ได้รับการแก้ไขสำหรับการเปรียบเทียบหลายรายการ จากยีนที่ตรวจสอบ ugt-45 เพิ่มขึ้นใน ahr-1(ijul45)และโดยการบำบัดด้วยเคอร์คูมิน (รูปที่ 3A,B) นอกจากนี้เรายังสังเกตเห็นการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของยีนล้างพิษบางตัวระหว่างชนิดพันธุ์ป่าและ หนู AhR KO ในลักษณะที่ขึ้นกับเนื้อเยื่อ การแสดงออกที่แตกต่างกันของยีนเหล่านั้นสูงที่สุดในสมอง โดยที่ Ugt2a3 (ugt-9 และ ugt-29 ใน C.elegans) ลดลง และ Hpgds (gst-4 ใน C. elegans) ถูกควบคุมขึ้น (รูปที่ S3A) ไม่มีการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของยีนที่ทดสอบใดๆ ในตัวอย่างตับของหนูทดลอง (รูปที่ S3B)ซึ่งสอดคล้องกับข้อมูล C,elegans ugt-45 murine homolog Ugt3a2 มีแนวโน้มที่การแสดงออกมากเกินไปใน ลำไส้ของหนู Ahr KO (รูปที่ S3C) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ugt-45 RNAi ป้องกันผลกระทบที่เป็นประโยชน์ต่อช่วงชีวิตและสุขภาพที่ส่งเสริมโดยเคอร์คูมิน (รูปที่ 3C,D) หรือ ahr-1 หมด (รูปที่ 3E,F) ซึ่งบ่งชี้ว่าการแทรกแซงทั้งสองอาจอาศัย ร่วมกันปรับสัญญาณปลายน้ำเพื่อกระตุ้นกิจกรรมการต่อต้านริ้วรอยของพวกเขา

รูปที่ 2 ยีนที่ควบคุมโดยความแตกต่างโดยเคอร์คูมินนั้นส่วนใหญ่ควบคุมในลักษณะที่ขึ้นกับ ahr-1-ขึ้น (A) ยีน ontology(GO) เสริมสำหรับกระบวนการทางชีววิทยาหลังจากการหลอมรวมระยะ GO ใน ahr-1 เทียบกับน้ำหนัก (B, C) การแสดงออกของยีนที่ควบคุมโดยขึ้นและลงที่แข็งแกร่งที่สุดระหว่าง wt และ ahr-1 [25] ถูกประเมินโดย qPCR ใน wt vs.ahr-1(B) และ DMSO-vs . ไส้เดือนฝอยที่บำบัดด้วยเคอร์คูมิน (C) Boxplots แสดงข้อมูลจากการทดลอง 3 ครั้ง นิพจน์จะแสดงสัมพันธ์กับ wt ที่บำบัดด้วย DMSO (เส้นประ) การทดสอบทางสถิติ:1-way ANOVA กับการทดสอบการเปรียบเทียบแบบทวีคูณของ Tukey*p-value<0.05 vs.wt.="" (d)venn="" diagram="" of="" differentially="" expressed="" genes="" on="" the="" microarray.="" the="" number="" of="" genes="" that="" were="" differentially="" up-or="" down-regulated="" between="" the="" indicated="" conditions="" is="" shown="" in="" red="" and="" blue,="" respectively.="" the="" numbers="" in="" the="" interchanges="" refer="" to="" the="" genes="" that="" occurred="" in="" both="" comparisons.="" the="" values="" in="" the="" lower="" right="" corner="" show="" the="" number="" of="" genes="" on="" the="" array="" that="" were="" not="" differentially="">

รูปที่ 3.ugt-45 จำเป็นสำหรับการยืดอายุของเคอร์คูมินและการกลายพันธุ์ ahr-1 (A, B) การแสดงออกของยีนถูกประเมินโดย qPCR ใน wt vs.ahr-1(A) และ DMSO- เทียบกับ wt ไส้เดือนฝอยที่บำบัดด้วยเคอร์คูมิน (B) Boxplots แสดงข้อมูลจากการทดลอง 3 ครั้ง นิพจน์จะแสดงสัมพันธ์กับ wt ที่บำบัดด้วย DMSO (ระบุเป็นเส้นประ) การทดสอบทางสถิติ: 2-Way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test, *p-value<0.05vs.wt,><0.05 vs.="" dmso.="" (c,d)effect="" of="" ugt-45="" rnai="" on="" the="" curcumin-mediated="" life/health="" span="" extension="" in="" the="" wt.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" "significance="" vs.="" dmso,*="" significance="" vs.control="" rnai,="" bonferroni=""><0.05.(e,f)effect of="" ugt-45="" rnai="" on="" ahr-1-mediated="" life/healthspan="" extension.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,#="" significance="" vs.="" wt,*="" significance="" vs.="" control="" rnai,="" bonferroni=""><>

3.3. AHR-1 และเคอร์คูมินป้องกันความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันอย่างอิสระ

คุณสมบัติที่เป็นประโยชน์ของโพลีฟีนอลมักจะถูกกำหนดถึงความสามารถในการป้องกันชนิดออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา (ROS)|83,84] เนื่องจาก AhR เกี่ยวข้องกับกระบวนการที่อาศัยความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน [85-87] เราจึงสงสัยว่าเคอร์คูมินอาจส่งผลต่อสรีรวิทยาของสัตว์ผ่านการตอบสนองของสารต้านอนุมูลอิสระที่ควบคุมโดย AhR หรือไม่ เราสังเกตว่าการกลายพันธุ์ของ ahr-1 ทำให้เกิด mitochondrial(mt)ROS มากขึ้น และมีศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียที่ลดลง (รูปที่ 4A,B) พารามิเตอร์ 2 ตัวที่สัมพันธ์กับการมีอายุยืนยาว [88,89] ในขณะที่สอดคล้องกับกระบวนทัศน์ mitohormesis ahr-1(jul45) ให้ mtROS มากกว่าเล็กน้อยและมีอายุยืนยาวขึ้น สัตว์เหล่านี้ไวต่อความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันมากกว่าสัตว์ในธรรมชาติ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ผลกระทบที่เป็นอันตรายที่เหนี่ยวนำโดย juglone และ H2O2 ต่อการกระโดดของสัตว์ การเคลื่อนไหว และการอยู่รอดมีมากขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในชั่วโมง-1(jul45)เมื่อเปรียบเทียบกับชนิดพันธุ์ป่า (รูปที่ 4C-F) ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการพร่องของ AHR-1 มีผลดีต่อมอเตอร์เมติกในสภาวะพื้นฐาน ในขณะที่จำเป็นต้องมีสำหรับการป้องกันความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน ดังนั้นจึงแยกสองพารามิเตอร์ที่เกี่ยวข้องกับอายุออกได้บ่อยครั้ง กล่าวคือ อายุการใช้งานและการต้านทานความเครียด ในทางกลับกัน เคอร์คูมินปรับปรุง H,O และความต้านทานแบบจูกโลนอย่างมีนัยสำคัญทั้งในมิวแทนต์ชนิดไวด์และ ahr-1 กลายพันธุ์ (รูปที่ 4E,F) ซึ่งบ่งชี้ว่าเคอร์คูมินกระตุ้นการตอบสนองต่อสารต้านอนุมูลอิสระที่เป็นอิสระ ahr-1- สอดคล้องกับกฎเกณฑ์ที่แยกกันของอายุขัยและการต้านทานความเครียดออกซิเดชัน การปิดเสียง-45 ugt ไม่ส่งผลต่อความไวต่อความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันทั้งสำหรับการกลายพันธุ์ของ ahr-1 หรือสัตว์ที่ได้รับการบำบัดด้วยเคอร์คูมิน (รูปที่ 4G)cistanche tubulosa บทวิจารณ์ดังนั้น เคอร์คูมินมีผลยืดอายุขัยผ่าน ahr-1 และ ugt-45 แต่ป้องกันความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันผ่านกลไกอิสระของ ahr-1-

3.4. Nrf2/SKN-1 ไกล่เกลี่ยผลกระทบที่ไม่ขึ้นกับ AhR ของ Curcumin

ในการประเมินค่าครอสทอล์คของ AhR-curcumin เพิ่มเติมในคุณลักษณะที่เกี่ยวข้องกับอายุเพิ่มเติม เราได้วัดความสามารถในการอพยพใน EC หลักของมนุษย์ ซึ่งเป็นลักษณะเด่นสำหรับการทำงานของเรือ ซึ่งลดลงตามอายุ [90] และลดลงโดยการเปิดใช้งาน AhR [14] สอดคล้องกับฤทธิ์การต่อต้านริ้วรอยแห่งการยับยั้ง ahr-1 และเคอร์คูมิน การแสดงออกของ AhR มากเกินไปถูกยับยั้งอย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่เคอร์คูมินเพิ่มขึ้น ความสามารถในการอพยพของ EC หลักของมนุษย์ (รูปที่ 5A) ข้อสังเกต การเหนี่ยวนำความสามารถในการย้ายโดยเคอร์คูมินสามารถเปรียบเทียบได้ในเซลล์ที่ทรานส์เฟกเวกเตอร์ของการแสดงออกของเวกเตอร์หรือ AhR (รูปที่ 5A) อย่างไรก็ตาม การย้ายถิ่นของเซลล์ที่บำบัดด้วยเคอร์คูมินลดลงอย่างมีนัยสำคัญโดยการแสดงออกของ AhR: เคอร์คูมินกระตุ้นในเซลล์ว่างที่ทรานส์เฟกเวกเตอร์ถึง 60 เซลล์ที่ถูกย้ายต่อสนามพลังงานสูง ในขณะที่ AhR แสดงเซลล์มากเกินไปเพียง 25 เซลล์ต่อสนามพลังงานสูง (รูปที่ 5A). ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าผลการอพยพของเคอร์คูมินนั้นถูกปรับโดยกลไกที่ไม่ขึ้นกับ AhR แต่อาจเป็นไปได้ด้วยการลดกิจกรรมของ AhR ต่อไปเราพิจารณาการกระจาย AhR ภายในเซลล์และการแสดงออกของ cVplal ใน EC ของมนุษย์ที่ได้รับการบำบัดด้วยเคอร์คูมิน เคอร์คูมินไม่ส่งผลกระทบต่อการเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ AhR (รูปที่ 5B) หรือการแสดงออกของไซพัล (รูปที่ 5C) ในการค้นหาเส้นทางที่ปรับโดยเคอร์คูมินในลักษณะที่ไม่ขึ้นกับ AhR เราหันกลับไปใช้โพรไฟล์การถอดรหัสของไส้เดือนฝอยเพื่อค้นหาปัจจัยการถอดรหัสที่ควบคุมยีนที่ถูกดัดแปลงอย่างมีนัยสำคัญโดยการสูญเสีย ahr-1 หรือโดยการรักษาเคอร์คูมินในสัตว์ตามธรรมชาติ (ตารางที่ 1 ). ในการค้นหาซิลิโกระบุปัจจัยการถอดรหัสรีดอกซ์ SKN-1 ซึ่งเป็นออร์โธล็อกของ Nrf2 ของมนุษย์ (ปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับปัจจัยนิวเคลียร์อีรีทรอยด์ 2-2) ซึ่งการกระตุ้นโดยเคอร์คูมิน [91] มักถูกรายงานว่าเป็นผู้ไกล่เกลี่ยที่เป็นไปได้ของ ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของมัน [92,93] ดังนั้น ต้นแบบ C.elegans Nrf2/SKN-1-ยีนที่ขึ้นต่อกัน gst-4 จึงมีการแสดงออกมากเกินไปในการกลายพันธุ์ alhr-1 [25] และถูกชักนำโดยเคอร์คูมินในรูปแบบไวด์และมากกว่านั้น ใน ahr-1 กลายพันธุ์ (รูปที่ 5D) นอกจากนี้ เคอร์คูมินยังเพิ่มความคงตัวและการเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ของ Nrf2 ใน EC หลักของมนุษย์ (รูปที่ 5E) และกระตุ้นการแสดงออกของแมงกานีสซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเตส (Sod2) ซึ่งเป็นยีนเป้าหมาย Nrf2 แบบคลาสสิกในเซลล์ที่ทรานส์เฟกด้วยเวกเตอร์ที่ว่างเปล่าหรือในเซลล์ที่ AhR ถูกทำให้เงียบโดย shRNA(รูปที่ 5F) การขาดการเหนี่ยวนำ Sod2 โดย AhR shRNA ใน EC อาจเกิดจากการลดลงบางส่วน (50 เปอร์เซ็นต์) ในการแสดงออก (รูปที่ S3D) ซึ่งอาจไม่เพียงพอต่อการกระตุ้น Nrf2 หรือปัจจัยการถอดรหัสเพิ่มเติม (TF) ซึ่ง ใน C.elegans อาจเห็นด้วยกับการเหนี่ยวนำของ gst-4 [94] เมื่อ AhR หมดลงอย่างสมบูรณ์ ที่น่าสนใจคือ Hpgds ซึ่งเป็นคำคล้ายคลึงกันของ C.elegans gst-4 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในสมองของหนู AhR KO (รูปที่ S3A) แต่ก็ไม่ใช่เป้าหมายของ Nrf2 หลักฐานเพิ่มเติมสำหรับสัญญาณอิสระที่เป็นไปได้ของ Nrf2/SKN-1 ที่ถูกกระตุ้นโดย ahr-1 depletion คือการกระตุ้น gst-4 โดยเคอร์คูมินถูกกดทับโดยผิวหนังโดยสมบูรณ์-7 RNAi ใน C.elegans wild type ในขณะที่ ahr-1 mutants ยังคงกระตุ้นให้เกิด gst-4 แม้ว่าจะมีการสูญเสีย skin-1 (รูปที่ 5G, H) อย่างไรก็ตาม ผิวหนัง-1 RNAi ลดความต้านทานความเครียดออกซิเดชันในทั้งชนิดไวด์และ ahr-1(ju145)(รูปที่ 5I) โดยไม่คาดคิด การปิดเสียงของผิวหนัง-1ไม่ส่งผลต่อการดื้อยาของจูกโลนของสัตว์ที่ได้รับการบำบัดด้วยเคอร์คูมิน (รูปที่ 5I) ข้อมูลของเราเปิดเผยสถานการณ์ที่ซับซ้อนซึ่งเคอร์คูมินส่งเสริมคุณสมบัติการต่อต้านริ้วรอยต่างๆ โดยขึ้นอยู่กับ AhR-dependent หรือ AhR-dependent แต่ Nrf2/SKN-1-ขึ้นอยู่กับสัญญาณ (และเพิ่มเติม)

รูปที่ 4 AHR-1 และเคอร์คูมินป้องกันความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันอย่างอิสระ (A) รูปภาพตัวแทน (ซ้าย) และการหาปริมาณความเข้มของ DSRed (ขวา) ในไส้เดือนฝอยที่ย้อมด้วยสี MitoSOX wt หรือ ahr-1 Boxplots แสดงข้อมูลที่รวบรวมมาจาก 129-135 เวิร์ม/เงื่อนไขใน 3 การทดลอง (B) ศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียได้รับการประเมินโดยการย้อมสี TRME ในไส้เดือนฝอยตามอายุที่ระบุ ภาพตัวแทน (ซ้าย) และการหาปริมาณของการเรืองแสง TMRE (ขวา) ถูกนำเสนอ บ็อกซ์พล็อตแสดงข้อมูลที่รวมกันจากการทดลอง 3 รายการ (C,D) กิจกรรมการปั๊มของคอหอย (C) และการเคลื่อนที่ (D) ของน้ำหนักและ ahr-1 กลายพันธุ์หลังการบำบัดด้วย H2O2 Boxplots แสดงข้อมูลที่รวมกันจาก 39-54(C) หรือ 35-36 เวิร์ม/เงื่อนไข (D) ใน 3-4การทดลอง.*p-value<0.05 vs.wt,$=""><0.05 vs.control="" treatment,="" statistical="" test:="" 1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (e)pharyngeal="" pumping="" of="" curcumin-treated="" nematodes="" after="" h,="" o,="" treatment.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 32="" worms/conditions="" in="" 2experiments.="" *=""><0.05><0.05cur vs.="" dmso="" treatment,="" $=""><0.05 h2o2="" vs.="" control="" statistical="" test:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.(f)influence="" of="" curcumin="" on="" juglone-induced="" toxicity.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 500="" worms/condition="" in="" 20="" experiments.="" *significance="" alhr-1="" vs.wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05.(g) effect="" of="" ugt-45="" rnai="" in="" curcumin-fed="" wt="" and="" ahr-1="" worms.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 150="" worms/condition="" in="" 6experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05. no="" statistical="" significance="" was="" observed="" in="" ugt-45="" vs.="" control="" rnai-treated="">

รูปที่ 5. เคอร์คูมินกระตุ้น Nrf2/SKN-1 ที่ไม่ขึ้นกับ AhR.(A) การทดสอบรอยขีดข่วนในเคอร์คูมิน (cur) หรือ EC ปฐมภูมิของมนุษย์ที่บำบัดด้วย DMSO ที่ทรานส์เฟกด้วยเวกเตอร์เปล่า (EV) หรือเวคเตอร์การแสดงออกสำหรับ มนุษย์ AhR แผงด้านบน: รูปภาพตัวแทน; เส้นประแสดงถึงการเริ่มต้นการย้ายข้อมูล สเกลบาร์: 100 um. แผงด้านล่าง: การหาปริมาณ; boxplots แสดงข้อมูลของ 4-6experiments.Statistical test:1-way ANOVA,*p<0.05><0.05 ys.dmso.(b,c)human="" primary="" ec="" were="" treated="" with="" cur="" or="" dmso.="" (b)representative="" immunostainings:="" ahr="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin="" (green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control="" (-con),="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.scale="" bar:50="" um.(c)="" relative="" capital="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr.="" mean="" expression="" in="" the="" dmso-treated="" controls="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" from="" 7="" experiments.="" (d)pgst-4:gfp="" expression="" in="" dmso-and="" curcumin-treated="" (cur)wt="" and="" alr-1="" worms.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 118-138="" worms/conditions="" in4=""><0.05><0.05 vs.="" dmso="" treatment,="" statistical="" test:1-way="" anova.(e)representative="" immunostaining="" images="" of="" human="" primary="" ec="" treated="" with="" cur="" or="" dmso:="" nrf2="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin(green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control(-="" con)="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.="" scale="" bar:="" 50="" um.(f)="" human="" primary="" ec="" was="" transfected="" with="" an="" empty="" vector(ev)or="" an="" expression="" vector="" for="" an="" shrna="" targeting="" the="" human="" ahr="" transcript="" (shahr).="" relative="" sod2="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr,="" and="" mean="" expression="" in="" the="" ev="" transfected="" cells="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" of="" 7experiments.=""><0.05 vs.="" respective="" control.="" (g,h)="" post-4:gfp="" expression="" in="" dmso-or="" cur-treated="" wt="" and="" ahr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skin-1="" rnai.="" representative="" images(g)="" and="" gst-4-driven="" gfp="" quantification(h)="" are="" shown.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 103-189="" worms/conditions="" in="" 4="" experiments.="" (i)="" juglone="" stress="" survival="" in="" curcumin-="" or="" dmso-treated="" wt="" and="" alhr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skn-1="" rnai.="" kaplan="" meier="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 100="" worms/condition="" in="" 4="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,="" #significance="" curcumin="" vs.="" dmso,="" $="" significance="" skn-1="" vs.="" con="" rnai,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.5. Curcumin และ Pro-Oxidants แสดงผลตรงข้ามกับกิจกรรม AHR-1

สอดคล้องกับผลการต่อต้านริ้วรอยของ AhRexpression/กิจกรรมที่ลดลง ข้อมูลของเราแนะนำว่าเคอร์คูมินอาจยืดอายุของ C.elegans ได้โดยการยับยั้ง AHR-1-เส้นทางที่มีการควบคุมผ่านการลดการแสดงออก/กิจกรรมหรือการกระทำของ AHR-1 บนเส้นทางส่งสัญญาณปลายน้ำทั่วไป ดังนั้นเราจึงพยายามหาปริมาณกิจกรรม AHR-1 ใน C.elegans แต่มีความพยายามหลายครั้งในการประเมินการแสดงออกของ AHR-1 และการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นโดยใช้แอนติบอดี (เทียบกับ AhR ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมหรือแอนติบอดีที่ปรับแต่งเองกับ CeAhR) หรือติดแท็กเรืองแสง ผู้สื่อข่าว (OP562, UL1709, ZG93) ไม่ได้ให้หลักฐานที่มีความหมาย เมื่อพิจารณาว่า AHR-1 เชื่อมโยงกับ XRE ในหลอดทดลอง [35] เราคิดว่าจะใช้การแสดงออกของยีนที่ขับเคลื่อนด้วย XRE เพื่ออ่านข้อมูลสำหรับกิจกรรม AHR-1 ดังนั้นเราจึงหันไปใช้เซลล์ Cos7 ที่มาจากลิง ซึ่งไม่แสดง AhR ภายนอก ดังนั้นจึงไม่แสดงกิจกรรม AhR ภายนอก [95,96] และสามารถใช้ประโยชน์เพื่อตรวจสอบการเหนี่ยวนำ Luciferase ที่ขับเคลื่อนด้วย XRE เพื่อเป็นการอ่านค่า AHR-1 กิจกรรม (Larigot et al.; ส่งพร้อมกับการศึกษานี้) เมื่อเซลล์ Cos7 ถูกทรานส์เฟกร่วมกับเวกเตอร์ซึ่งแสดงออก C.elegans AhR/alr-1, ARNT/aha-1 และโปรโมเตอร์ที่มี XRE ที่ควบคู่กับลูซิเฟอเรสของยีน CYPIA1 ของมนุษย์ [64] AHR{ {27}} แสดงกิจกรรมต่ำในสภาวะพื้นฐาน (ที่ได้รับการบำบัดด้วยยานพาหนะ) ข้อควรทราบ การรักษาด้วยเคอร์คูมินหรืออาหารเสริมอื่นๆ ที่ส่งเสริมการสูงวัยอย่างมีสุขภาพดีใน C.elegans เช่น lutein [97] และ resveratrol [98,99] ยับยั้งการทำงานของ AHR-1 อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 6A-C) ในทางกลับกัน BaP และ leflunomide ซึ่งเป็นตัวกระตุ้น AhR ที่รู้จักในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมไม่ส่งผลต่อกิจกรรมของ AHR-1 (รูปที่ 6A,B) ที่ความเข้มข้นที่เราใช้ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง กิจกรรมของ AHR-1 ถูกยกเลิกในเซลล์ Cos7 ที่ทรานส์เฟกด้วยเวกเตอร์ที่แสดงอัลลีล ahr-1(jul45) แทนที่จะเป็นอัลลีลชนิดพันธุ์ป่า (รูปที่ 6A-C) ซึ่งบ่งชี้ว่า Jul45 เป็นจริง อัลลีลที่สูญเสียการทำงานและความเข้มของลูซิเฟอเรสที่วัดได้นั้นเกิดจาก AHR เชิงหน้าที่-1

จากนั้น เราจึงพยายามตรวจสอบว่าเคอร์คูมินลดกิจกรรมของ AHR-1 โดยการผูกมัดโดยตรงหรือการปรับทางอ้อม จนถึงปัจจุบัน ยังไม่มีการระบุลิแกนด์ของ C.elegans AHR-1 และเนื่องจากไม่มีข้อมูลที่มีอยู่เกี่ยวกับ LBD เราจึงทำการวิเคราะห์ในซิลิโกเพื่ออธิบายลักษณะเฉพาะ ไอโซฟอร์ม AHR-1 สองตัว, la และ 1b, ถูกจัดตำแหน่งและแม้ว่าความยาวต่างกัน, ลำดับโดเมน PASB ของพวกมันเหมือนกัน ลำดับนี้จึงถูกจัดแนวกับโดเมน PASB ของ Drosophila melanogaster และกับ AhR สองตัวจากสัตว์มีกระดูกสันหลังซึ่งแบบจำลองโครงสร้างได้ถูกสร้างขึ้นก่อนหน้านี้ ได้แก่ หนูเมาส์ (Mus musculus)[100] และ zebrafish (Danio rerio)[101] (รูปที่ 6D). การจัดตำแหน่งแสดงให้เห็นความแตกต่างที่ชัดเจนระหว่างสปีชีส์ที่มีลักษณะเฉพาะหลักของการลบลำดับการถอดเปลือกของสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลังในบริเวณที่แปรผันได้มากที่สุดในโดเมน PAS ซึ่งสอดคล้องกับความยืดหยุ่นของภูมิภาค รวมถึงมัดเป็นเกลียว (C , D , E เกลียว) และลูปสั้นที่เชื่อมต่อ องค์ประกอบเหล่านี้(รูปที่ 6D,E) การลบเหล่านี้สามารถลดพื้นที่ว่างในช่องผูกของ AhR เหล่านี้ได้ จากนั้นเราสร้างแบบจำลอง 3 มิติของ AHR-1 PASB โดยการสร้างแบบจำลองที่คล้ายคลึงกัน โมเดลนี้นำเสนอการพับ PAS ทั่วไป แต่มี Do helix ที่สั้นกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับ AhR อื่นๆ อย่างไรก็ตามโพรงภายในมีลักษณะเฉพาะบางประการ มันมีสารตกค้างที่ไม่ชอบน้ำมากกว่าและถูกตัดให้สั้นลงครึ่งหนึ่งโดยโซ่ด้านข้างบางส่วน โดยเฉพาะอย่างยิ่ง H365 และ H274 ต้องเผชิญกับและสามารถสร้างพันธะไฮโดรเจนที่อยู่ตรงกลางของโพรง ยิ่งไปกว่านั้น สายด้านข้าง Y332, L363 และ L302 สามารถขวางช่อง ซึ่งลดพื้นที่ภายในที่มีให้สำหรับลิแกนด์ (รูปที่ 6E) ช่องขนาดเล็กและถูกตัดทอนนี้มักจะไม่อนุญาตให้มีการจับกันของแกนด์ขนาดใหญ่ (เช่น TCDDor เคอร์คูมิน) คล้ายกับแบบจำลองโครงสร้าง AHR-1 แบบจำลองของ zebrafish zfAhRla แสดงให้เห็นว่าช่อง LBD ถูกตัดให้สั้นลงเมื่อเทียบกับพาราล็อกที่มีผลผูกพัน TCDD zfAhR1b และ zfAhR2 [101] ลิแกนด์ขนาดเล็กและยืดหยุ่นได้ เช่น เลฟลูโนไมด์ จับและกระตุ้น zfAhRla แต่ความเข้มข้นของเลฟลูโนไมด์ที่เราทดสอบไม่ได้กระตุ้น AHR-1 ในระบบเซลล์ Cos7 ของเรา (รูปที่ 6B) จากนั้นเราสงสัยว่าการกลายพันธุ์ในกรดอะมิโนที่รับผิดชอบช่องเล็ก ๆ ของ LBD อาจทำให้ลิแกนด์แบบคลาสสิกกระตุ้น CeAhR ได้หรือไม่ เรซิดิว CeAhR L363 (รูปที่ 6D) สอดคล้องกับ A375 ใน mAhRb-Iand V375 ในมาดริด และเรซิดิวนี้มีผลกระทบสำคัญต่อการจับลิแกนด์ [102] ในทำนองเดียวกัน T386 ของ zfAhRla(รูปที่ 6D) ที่จับคู่กับ A375 ใน mAhRb-1 และ A386 ใน zfAhR1b และ zfAhR2 มีส่วนทำให้ขาดการเชื่อมโยง TCDD ของ zfAhRla และเมื่อกลายพันธุ์เป็นอะลานีน จะคืนค่าความไวของ TCDD เมื่อ Y296H เช่นกัน แนะนำ [101] กรดอะมิโน Y296 เป็นฮิสติดีนใน C.elegans(H274) แล้ว ดังนั้นเราจึงกลายพันธุ์เฉพาะลิวซีนที่ตำแหน่ง L363 ในเวกเตอร์ CeAhR เป็นอะลานีน (L363A)(รูปที่ 6D,E ที่ระบุโดยลูกศร) ยิ่งกว่านั้น เรากลายพันธุ์ฮิสทิดีนในบริเวณใกล้เคียงที่ตำแหน่ง H365 เป็นกลูตามีน (H365Q) ซึ่งเป็น Q377 ในหนู (รูปที่ 6D, E ระบุด้วยลูกศร) เนื่องจากมีแนวโน้มว่าจะสร้างพันธะไฮโดรเจนกับ H274 และอาจมีส่วนทำให้เกิดโพรงเล็กๆ ของ AHR{ {49}} (รูปที่ 6E) จากนั้นเราทดสอบว่าลิแกนด์ AhR ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมส่งผลต่อกิจกรรม AHR-1 หรือไม่ เมื่อ L363 และ H365 กลายพันธุ์ อย่างไรก็ตาม การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ แทนที่จะฟื้นฟูการตอบสนองต่อลิแกนด์ซีโนไบโอติกเช่นเดียวกับในปลาเซบราฟิช [101] ได้ยกเลิกแม้กระทั่งกิจกรรม AHR พื้นฐาน-1 ที่คล้ายกับอัลลีล Ju145 (รูปที่ 6F) ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นความแตกต่างที่ชัดเจนระหว่าง LBD ของ C.elegans และ zebrafish แต่แสดงว่า LBD เป็นพื้นฐานสำหรับกิจกรรม AHR พื้นฐาน-1 ร่วมกับการศึกษาก่อนหน้านี้ [35,38,82] ผลลัพธ์ของเราแนะนำว่า AHR-1 ไม่น่าจะเกี่ยวข้องกับการตอบสนองทรานส์แอคติเวชันที่เกิดจากซีโนไบโอติกแบบคลาสสิก ซึ่งอาจไม่เกี่ยวข้องกับ ahr-1-ที่ได้รับการควบคุม อายุทางสรีรวิทยา แทน, สารประกอบที่ได้มาจากพืชอาจแสดงผลกระทบที่อนุรักษ์ไว้อย่างน้อยก็บางส่วนผ่านการปราบปรามของ AHR-1-วิถีทางที่ถูกมอดูเลต โมเดล 3 มิติของเราแนะนำว่าเคอร์คูมินไม่ปรับกิจกรรม AHR-1 โดยการผูก LBD ดังนั้น การยับยั้งการทำงานของ AHR-1 โดยเคอร์คูมินอาจเนื่องมาจากฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ สอดคล้องกับความเป็นไปได้นี้ และความไวที่เพิ่มขึ้นของการกลายพันธุ์ของ C.elegans ahr-1 ต่อความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน เราพบว่ากิจกรรมของ AHR-1 เพิ่มขึ้นอย่างแท้จริงโดยสารกระตุ้น ROS กล่าวคือ เซลล์ Cos7 ที่บำบัดด้วยโปรออกซิแดนท์ rotenone แสดงกิจกรรมของ AhR ที่เพิ่มขึ้นเมื่อทำการทรานส์เฟกด้วย C.elegans หรือ murine AhR แต่ไม่ใช่เมื่อทำการทรานส์เฟกด้วยอัลลีล jul45 หรืออัลลีลที่มีการกลายพันธุ์ของ LBD (รูปที่ 6G,H)

โดยรวม ในขณะที่การกระตุ้น CeAhR ช่วยป้องกันความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในช่วงต้นชีวิต การแสดงออกที่ลดลงจะต่อต้านความชราและทำหน้าที่เป็นสื่อกลางในการต่อต้านริ้วรอยที่เป็นประโยชน์ของเคอร์คูมิน (รูปที่ 7) ดังนั้นเคอร์คูมินจึงอาจช่วยปรับสมดุลการเปิดใช้งานรีดอกซ์ TF ในลักษณะที่ขึ้นกับบริบทและเวลา และสนับสนุนการปราบปราม AhR โดยตรงผ่านผลของสารต้านอนุมูลอิสระและ/หรือผ่านการกระตุ้น Nrf2/SKN-1 (หรือ TF อื่น ๆ ) ซึ่งอาจพร้อมกัน ไกล่เกลี่ยกิจกรรมต่อต้านริ้วรอยของเคอร์คูมิน

รูปที่ 6 เคอร์คูมินและโปรออกซิแดนท์มีผลตรงกันข้ามกับการออกฤทธิ์ของ AHR-1 (AC) การประเมินการออกฤทธิ์ของ AHR-1 หลังการบำบัดด้วยสารประกอบที่ระบุในเซลล์ Cos7 ที่ทรานส์เฟกด้วย wt AHR-1(wt) หรือ AHR-1 ที่นำพาการกลายพันธุ์ของจุด ju145(ju145) และ AHA-1 รวมทั้งลูซิเฟอเรสที่เหนี่ยวนำด้วย XRE Boxplots แสดงข้อมูลของการทดลอง 3-5.* p-value<0.05><0.05 vs.="" dmso/etoh,="" statistical="" test:="" 2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (d)="" alignment="" of="" the="" lbds="" from="" c.elegans,="" drosophila,="" and="" zebrafish="" ahrs.="" the="" color="" scheme="" for="" residues:="" red,="" acidic;="" blue,="" basic;="" purple,="" polar;="" yellow,="" cys;="" brown,="" aromatic;="" green,="" hydrophobic;="" orange,="" ser,="" thr;="" gray,="" pro;="" white,="" gly.="" (e)="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" to="" the="" ceahr="" pasb="" are="" indicated="" on="" top(light="" gray="" bars="" for="" helices="" and="" dark="" gray="" bars="" for="" β-strands)="" and="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" asterisks="" mark="" the="" amino="" acids="" likely="" contributing="" to="" the="" inability="" of="" ceahr="" to="" bind="" big="" ligands.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" the="" investigation="" of="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).i3dmodels="" of="" the="" ceahr="" (left)="" and="" the="" mahr="" (right)="" pasb="" domains="" were="" obtained="" by="" homology="" modeling,="" shown="" in="" a="" cartoon="" representation.="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" are="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" the="" colored="" internal="" area="" (blue="" for="" ceahr="" and="" yellow="" for="" mahr)defines="" the="" molecular="" surface="" of="" the="" binding="" cavity="" identified="" by="" castp.="" in="" the="" car="" model,="" the="" amino="" acids="" protruding="" into="" the="" binding="" cavity="" (asterisks="" in="" panel="" d)="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" blue="" sticks.="" the="" mahr="" amino="" acids="" corresponding="" to="" those="" displayed="" in="" the="" ceahr="" model,="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" yellow="" sticks.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" studying="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).="" (f)="" ahr="" activity="" in="" bap-or="" mnf-treated="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" an="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365o="" mutations="" (lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr),="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt,"=""><0.05 vs.dmso.(g)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" ahr-1(either="" wt="" or="" ju145)="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.*=""><0.05vs.wt, #=""><0.05 vs.="" dmso.(h)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365q="" mutations(lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr).boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt/ahr-1,="" #="" p-value=""><0.05 vs.="">

รูปที่ 7 แบบจำลองที่เสนอของเส้นทางการส่งสัญญาณ AHR-1 ในการตอบสนองของ C.elegan ต่อโปรและสารต้านอนุมูลอิสระ ในสภาวะ "ปกติ" (แผงตรงกลาง) AHR-1 เปิดใช้งานโดย ROS ภายในเซลล์ สิ่งนี้นำไปสู่การหลั่งของพี่เลี้ยงจาก cytosolic AHR-1 และการเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ที่ตามมาของ AHR-1 ในนิวเคลียส AHR-1 จะสร้างเฮเทอโรไดเมอร์ด้วย AHR นิวเคลียร์ทรานสโลเคเตอร์ (AHA{ {7}})และจับกับ XRE ของยีนเป้าหมาย ซึ่งจะทำให้ระดับ ROS ภายในเซลล์ลดลง ในสภาวะเหล่านี้ การสูญเสียฟังก์ชัน ahr-1 จะทำให้อายุขัยเพิ่มขึ้น เมื่อมีสารต้านอนุมูลอิสระ(แผงด้านซ้าย) ความเข้มข้นของ ROS ภายในเซลล์จะต่ำทำให้ AHR-1 อาศัยอยู่ในไซโตพลาสซึมซึ่งผูกมัดด้วยปัจจัยร่วม การยับยั้งกิจกรรม AHR พื้นฐาน-1 นำไปสู่อายุขัยที่เพิ่มขึ้น ในการปรากฏตัวของโปรออกซิแดนท์ (แผงด้านขวา)AHR-1 ถูกกระตุ้นโดย ROS ที่มากเกินไป ซึ่งส่งผลให้เกิดการเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ การก่อตัวของ AHR-1-AHA-1 เฮเทอโรไดเมอร์ และการเริ่มต้นของ การถอดรหัสยีนเป้าหมาย ใน ahr-1 KO การล้างพิษที่ลดลงของ ROS ผ่านยีนเป้าหมายที่เหนี่ยวนำโดย AHR-1- นำไปสู่การสะสมของ ROS และทำให้ ahr-1 KO อ่อนแอ

4. การอภิปราย

เดิมที AhR ถูกค้นพบในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมสำหรับกิจกรรมการตอบสนองของสิ่งมีชีวิตที่เกิดจากการจับตัวของสารพิษในสิ่งแวดล้อมหรือลิแกนด์ภายในร่างกาย แต่ตัวดัดแปลงที่ไม่ได้อาศัยการจับลิแกนด์ก็มีอยู่เช่นกัน แต่มีการตรวจสอบน้อยกว่ามาก C.elegans เป็นตัวแทนของสิ่งมีชีวิตที่มีรูปแบบเฉพาะในการตรวจสอบกิจกรรมของ AhR ที่ไม่ขึ้นกับการตอบสนองของสิ่งมีชีวิตแบบคลาสสิก เนื่องจาก CeAhR ไม่ได้ผูกลิแกนด์ AhR ต้นแบบ [35,39] เมื่อใช้แบบจำลองนี้ เราระบุฟังก์ชันอนุรักษ์เชิงวิวัฒนาการสำหรับ AhR ในกระบวนการชรา [14] และแสดงให้เห็นว่าโมดูเลเตอร์ AhR ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมบางตัว (เช่น แบคทีเรีย Bal และ UVB) ส่งผลต่อพารามิเตอร์การแก่ชราผ่าน AHR-1 ใน ลักษณะขึ้นอยู่กับบริบท [25]. ในที่นี้ เราได้ติดตามผลการค้นพบครั้งก่อนของเราด้วยการตรวจสอบเชิงกลไกของคุณสมบัติการแก่ชราที่ควบคุมโดย AhR ในทุกสายพันธุ์ด้วยโพลีฟีนอลเคอร์คูมินในอาหาร การวิเคราะห์แบบรวม ในร่างกาย ในหลอดทดลอง และในซิลิโกของเราเผยให้เห็นสถานการณ์ใหม่และซับซ้อน: ในขณะที่เคอร์คูมินส่งเสริมคุณสมบัติการต่อต้านวัยในไส้เดือนฝอยและ EC หลักของมนุษย์ อย่างน้อยก็ส่วนหนึ่งในลักษณะที่ขึ้นกับ AhR ผลของสารต้านอนุมูลอิสระในทั้งสองสายพันธุ์ขึ้นอยู่กับ บนกลไกที่ไม่ขึ้นกับ AhR แต่โดยหลักแล้ว Nrf2/SKN-1 ขึ้นอยู่กับกลไก

เราแสดงให้เห็นเป็นครั้งแรกว่าเคอร์คูมินชะลอความชราทางสรีรวิทยาของ C.elegans ในลักษณะที่ขึ้นกับ AHR-1- ในการค้นหา ahr ปลายน้ำที่เป็นไปได้-1-เอฟเฟคเตอร์ที่ขึ้นกับเคอร์คูมิน เราใช้วิธีการที่ตรงเป้าหมายและไม่เอนเอียง และพบว่ายีนควบคุมที่แตกต่างกันส่วนใหญ่ในการรักษาด้วยเคอร์คูมินนั้นควบคุมในลักษณะที่ขึ้นกับ AHR-1- นอกจากนี้ ยีนจำนวนมากเหล่านี้แสดงรูปแบบการแสดงออกที่คล้ายคลึงกันใน AHR-1-สัตว์ที่หมดฤทธิ์และบำบัดด้วยเคอร์คูมิน ซึ่งบ่งชี้ว่าเคอร์คูมินส่งเสริมการยืดอายุขัยผ่านการปราบปรามของกิจกรรม AHR-1 น่าแปลกที่ทั้งเป้าหมายและการวิเคราะห์การถอดรหัสไม่ได้ระบุถึงบทบาทที่สำคัญสำหรับยีนเป้าหมาย AhR แบบคลาสสิกเช่นถ้วยซึ่งพบว่าส่วนใหญ่มีการแสดงออกน้อยกว่าในเซลล์ประสาท (Larigot et al.; ส่งพร้อมกับการศึกษานี้) ที่น่าสนใจ การค้นพบเหล่านี้อาจบ่งชี้ว่าทรานสคริปโตมิกส์ของสัตว์ทั้งตัวอาจปกปิดผลกระทบที่จำเพาะต่อเซลล์ประสาทของ AhR ในกรณีเฉพาะนี้ผ่านยีน cps เราพบว่าในบรรดายีนที่แสดงออกอย่างแตกต่าง ยีนจำนวนมากอยู่ในระยะที่สอง-เอนไซม์ล้างพิษ เช่น ลำไส้-45 ซึ่งเพิ่มขึ้นจากการพร่องของ ahr-1 ทั้งคู่ (และในสมองของหนู AhR KO) และการบำบัดด้วยเคอร์คูมินเพื่อยืดอายุขัย ในทางกลับกัน การบำบัดด้วยเคอร์คูมินและการสูญเสีย ahr-1 ได้เพิ่มการแสดงออกของเอนไซม์ล้างพิษระยะที่สองอีกตัวหนึ่งคือ GST-4 ผ่านกลไกที่แตกต่างกัน: ตัวเดิมอาศัย ในขณะที่ตัวหลังส่วนใหญ่ไม่ขึ้นกับ Nrf2/ SKN-1 ซึ่งเป็น TF รีดอกซ์คลาสสิกที่ชักนำ GST-4 ตามความเครียดออกซิเดชันใน C.elegans [103] ยิ่งกว่านั้น ในขณะที่เคอร์คูมินกระตุ้น Nrf2/SKN-1-การตอบสนองที่ขึ้นกับ C.elegans (การแสดงออกของ GST-4) และ EC หลักของมนุษย์ (การแสดงออกของ Sod2 และความสามารถในการเคลื่อนย้าย) มันยังปกป้อง C.eleans จากความเครียดออกซิเดชันใน SKN-1-ลักษณะอิสระ ใน C.elegans เคอร์คูมินไม่สามารถยืดอายุขัยในผิวหนังที่ป่วยหนักได้-1(zu67) กลายพันธุ์ [104] ในขณะที่ GST-4 สามารถเหนี่ยวนำให้เกิด SKN-1-ในลักษณะอิสระโดยการส่งสัญญาณ EGF [94] และครอสทอล์คระหว่างวิถี EGF และ AhR ถูกรายงานในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม [105]

ที่น่าสนใจและตรงกันข้ามกับสายพันธุ์ธรรมชาติ เราสังเกตเห็น AHR-1-ผลที่เป็นอิสระของเคอร์คูมินต่อสุขภาพในแบบจำลองไส้เดือนฝอยสำหรับโรคฮันติงตันและพาร์กินสันตามลำดับ ในสายพันธุ์เหล่านี้ การบำบัดด้วยเคอร์คูมินเพิ่มจำนวนของการรวมกลุ่มของโปรตีนในระดับเดียวกับการขาด AHR-1 ซึ่งบ่งชี้ถึงผลในการป้องกันของการรวมตัวของโปรตีนเองและ/หรือการกระตุ้นเคอร์คูมินของวิถีที่ป้องกันการรวมตัวของโปรตีนอย่างเป็นอิสระจาก/ ชั่วโมง-1 หมดลง อิทธิพลของเคอร์คูมินต่อการรวมกลุ่มของโปรตีนเป็นที่ถกเถียงกันอยู่: แสดงให้เห็นว่าสามารถยับยั้งการสร้างไฟบริลแต่ยังจับสปีชีส์พรีไฟบริลลาร์/โอลิโกเมอริกของโปรตีนอะไมลอยด์เจนิก ซึ่งจะช่วยเร่งการรวมตัวของโปรตีนและลดความเป็นพิษต่อระบบประสาทโดยรวม [106] ที่น่าสังเกตคือ คาเฟอีนซึ่งป้องกันคุณสมบัติต่างๆ ของความชราของระบบหัวใจและหลอดเลือด [66,107] ยังป้องกันอัมพาตที่เกิดจาก A โดยไม่ทำให้มวลรวม A ลดลง แต่ผ่านการกระตุ้นเส้นทางที่ขึ้นกับ Nrf2/SKN-1-ซึ่งขึ้นกับ [108] เป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องประเมินว่าผลการป้องกันที่เกิดจากเคอร์คูมินหรือการสูญเสียทั้งหมด-1ในแบบจำลองโรค C.elegans นั้นเป็นสื่อกลางโดยกลไกที่ส่งเสริมการกำจัดสปีชีส์ oligomeric/pre-fibrillar ออกเป็นกลุ่มที่เป็นพิษน้อยกว่าและ/หรือโดย การกระตุ้นกลไกอื่นๆ เช่น Nrf2/SKN-1 ซึ่งอาจป้องกัน proteotoxicity พร้อมกันได้ ข้อสังเกต เอนไซม์ล้างพิษอาจมีทั้ง XRE และ ARE (องค์ประกอบที่ตอบสนองต่อสารต้านอนุมูลอิสระ) และมีการอธิบายการทำงานร่วมกันระหว่างการส่งสัญญาณที่ควบคุมด้วย Nrf2/ARE และ AhR/XRE [109] ดังนั้นจึงเป็นเรื่องที่น่าสนใจที่จะชี้แจงว่าเคอร์คูมินส่งเสริมผลการต่อต้านริ้วรอยที่เป็นประโยชน์แตกต่างกันอย่างไรผ่านความสมดุลระหว่างการส่งสัญญาณที่ควบคุมโดย Nrf2 และ AhR

วิธีการที่รวมกันของเราแสดงให้เห็นว่าเคอร์คูมินยับยั้งการทำงานของ AHR-1 ในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม มีข้อเสนอแนะว่าผลการยับยั้ง AhR ของเคอร์คูมินนั้นอาศัยการจับกับ LBD โดยตรง [110] หรือการยับยั้งโปรตีนไคเนส C ที่ฟอสโฟรีเลต AhR[79] การศึกษาอื่นระบุว่ากิจกรรมการถอดรหัสของ AhR ขึ้นอยู่กับสถานะรีดอกซ์ของเซลล์และโครงสร้างโครมาติน ซึ่งทั้งคู่ได้รับอิทธิพลจากเคอร์คูมิน[111] แม้ว่า AHR-1 จะไม่จับ TCDD แต่จะจับกับ XRE ในหลอดทดลอง [36] แต่การศึกษาอย่างเป็นระบบ การระบุถึงศักยภาพของโพลีอะโรมาติกไฮโดรคาร์บอน หรือลิแกนด์ AhR ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมอื่นๆ ในการปรับ AHR-1 ส่วนใหญ่หายไปเนื่องจาก ขาดเครื่องมือที่เหมาะสมในการประเมินว่า การศึกษาของเราพยายามที่จะเติมช่องว่างนี้และใช้ประโยชน์จากเซลล์ Cos7 ที่แสดง AHR-1 ควบคู่ไปกับการทดสอบ luciferase (Larigot et al.; ส่งพร้อมกับการศึกษานี้) และในการสร้างแบบจำลองซิลิโกของ C. elegans LBD เปิดเผยว่าเคอร์คูมินยับยั้ง AHR กิจกรรม -1 แต่ไม่น่าจะเกิดจากการผูก LBD โดยตรง การทดสอบในหลอดทดลองที่ใช้ในการศึกษาของเรายืนยันว่า CeAhR ไม่ได้เปิดใช้งานผ่านการส่งสัญญาณซีโนไบโอติกแบบคลาสสิก อย่างไรก็ตาม มันจะไม่เปิดเผยกิจกรรมเนื่องจากการผูกมัดของ AhR กับลำดับ DNA นอกเหนือจาก XRE "แบบคลาสสิก" ที่พบใน CYP1A1 เช่น XRE ที่ตอบสนองต่อโพลีฟีนอล (เควอซิติน) ที่พบใน PON1 [112,113] การสร้างภูมิคุ้มกันใน EC หลักของมนุษย์ยังโต้แย้งกับเคอร์คูมินที่กระตุ้นการเคลื่อนย้ายนิวเคลียร์ AhR ซึ่งควบคู่ไปกับผลการส่งเสริมของความสามารถในการอพยพในเซลล์ที่มีการแสดงออกของ AhR อาจบ่งชี้ว่าเคอร์คูมินยับยั้งกิจกรรมของ AhR

เราเสนอว่าผลการยับยั้งของเคอร์คูมิน แทนที่จะอาศัยการจับกับ AhR เกี่ยวข้องกับความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระ ซึ่งอาจเกี่ยวข้องจริงๆ หรือขึ้นอยู่กับการกระตุ้นของ Nrf2/SKN-1 สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม AhR ถูกกระตุ้นโดย ROS ผ่านการดัดแปลงออกซิเดชันที่ไม่ขึ้นกับ LBD [85] แต่ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นว่าการเหนี่ยวนำการทำงานของ AHR-1 โดยโปรออกซิแดนท์โรทีโนนต้องการ LBD กลไกทางอ้อมของการกระตุ้น AhR ที่เป็นสื่อกลางด้วย ROS คือการก่อตัวของลิแกนด์ FICZ ของ AhR[114] ที่มีศักยภาพ อย่างไรก็ตาม FICZ เป็นโมเลกุลระนาบขนาดใหญ่ที่ตามแบบจำลองซิลิโกของเรา จะไม่พอดีกับ AHR-1 LBD ในขณะที่กลไกที่แน่นอนโดยที่กิจกรรม AHR-1 ได้รับการส่งเสริมโดย ROS และยับยั้งโดยเคอร์คูมิน (ไม่ว่าจะผ่านการดับ ROS โดยตรงหรือโดยอ้อมผ่านการกระตุ้นของ Nrf2 หรือยีนควบคุมสารต้านอนุมูลอิสระอื่นๆ) ยังคงมีอยู่ สิ่งนี้ได้รับการสนับสนุนอย่างมากจากเรา การค้นพบ: AHR-1 ถูกกระตุ้นโดย rotenone และการกลายพันธุ์ของ ahr-1 แสดง mtROS มากขึ้น ลดศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรีย และไวต่อ H, O และ juglone มากกว่า เช่นเดียวกับ UVB และ BaP [25] ซึ่งทั้งคู่ผลิต ROS[115,116] ในบริบทนี้ เป็นที่น่าสนใจที่จะสังเกตว่าการกลายพันธุ์ ahr-1 แสดงการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยของหน้าที่ของไมโตคอนเดรีย ซึ่งคล้ายกับของไมโตฮอร์เมซิส [117 สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าการสูญเสียทั้งหมด -1 (และเคอร์คูมินที่เป็นไปได้โดยการยับยั้ง AHR-1) อาจส่งเสริมช่วงสุขภาพผ่านความเครียดของไมโตคอนเดรียเล็กน้อย ซึ่งทราบกันดีว่าช่วยยืดอายุขัยของ C.elegan ผ่านยีนการล้างพิษที่ปรับในทำนองเดียวกันในยีนอื่นๆ{ {20}} กลายพันธุ์ [118,119] นอกจากนี้ ไม่ว่า Nrf2/SKN-1 และไมโตคอนเดรียจะมีบทบาทในการปรับกิจกรรม AHR-1 ระหว่างการบำบัดด้วยเคอร์คูมินหรือไม่ ก็มีความเป็นไปได้ที่น่าสนใจที่ยังคงต้องตรวจสอบ

โดยรวมแล้ว การใช้ประโยชน์จากคุณสมบัติหลายอย่างที่เสนอโดยไส้เดือนฝอย C.elegans สำหรับการศึกษาในร่างกาย เราขอแนะนำว่าหน้าที่ของบรรพบุรุษของ AhR อาจอยู่ในการควบคุมของเอนไซม์ phase-ll- ที่เกี่ยวข้องกับสารต้านอนุมูลอิสระมากกว่าการตอบสนองของซีโนไบโอติก ตรงกันข้ามกับผลกระทบที่เป็นอันตรายที่เกิดจาก ROS ระดับสูง ผลประโยชน์ที่ส่งเสริมโดยการขาด AhR อาจได้รับการไกล่เกลี่ยโดยความเครียดจากไมโตคอนเดรียที่ไม่รุนแรงและ/หรือการผลิต ROS ที่ไม่รุนแรง (ไมโตฮอร์โมน) ซึ่งอาศัย Nrf2/SKN-1 ด้วย นอกจากนี้เรายังมีหลักฐานที่ชัดเจนสำหรับการทำงานร่วมกันระหว่างเคอร์คูมินและ AhR การยับยั้งเคอร์คูมินของการส่งสัญญาณ AhR นั้นได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างมีวิวัฒนาการ และไม่น่าจะมีการไกล่เกลี่ยโดยการผูกมัดกับ AhR LBD แต่ผ่านคุณสมบัติการขจัด ROS ของเคอร์คูมินหรือการกระตุ้น Nrf2/SKN-1 เส้นทางการส่งสัญญาณ Nrf2 สามารถเปิดใช้งานได้โดยเคอร์คูมินในรูปแบบต่างๆ [91] สุดท้าย ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นว่าเคอร์คูมินส่งเสริมผลการต่อต้านริ้วรอยในลักษณะที่เป็นอิสระในทั้ง C.elegans (การแสดงออกของ GST ที่เพิ่มขึ้น-4 และการต้านทานความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน) และ EC หลักของมนุษย์ (การแสดงออกของ Sod2 ที่เพิ่มขึ้นและความสามารถในการเคลื่อนย้าย ) ซึ่งสามารถอธิบายผลกระทบเพิ่มเติมของเคอร์คูมินและการสูญเสียฟังก์ชัน AHR-1 ต่อช่วงสุขภาพของสัตว์ที่แสดงออก polyQ

5. สรุปผลการวิจัย

โดยสรุป จากการผสมผสานแบบดั้งเดิมของ silico, vitro และ in vivo เราแสดงให้เห็นว่าในขณะที่การกระตุ้น CeAhR ช่วยป้องกันความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในช่วงต้นชีวิต การแสดงออกที่ลดลงของมันจะต่อต้านริ้วรอยและทำหน้าที่เป็นสื่อกลางในการต่อต้านริ้วรอยที่เป็นประโยชน์ของเคอร์คูมิน (ภาพที่7) . ดังนั้นเคอร์คูมินจึงอาจช่วยในการปรับสมดุลการทำงานของปัจจัยการถอดรหัสต่างๆ ที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองต่อการล้างพิษ/สารต้านอนุมูลอิสระ (ยับยั้ง AhR และกระตุ้น Nrf2) ในสภาวะที่สิ่งเหล่านี้เปลี่ยนแปลง (เพิ่ม AhR และลด Nrf2/SKN-1) เช่น ความชราหรือ ความผิดปกติที่เกี่ยวข้องกับอายุ งานของเราเพิ่มระดับความซับซ้อนให้กับกิจกรรมแบบมัลติฟังก์ชั่นและเฉพาะบริบทที่มีอยู่มากมายของ AhR โดยมีผลกระทบที่สำคัญต่อสุขภาพร่างกายและอายุขัย นอกจากนี้ยังเปิดประตูสู่การศึกษาเพิ่มเติมโดยใช้ระบบไส้เดือนฝอยเพื่อค้นหาและตรวจสอบการทำงานของบรรพบุรุษของ AhR ซึ่งมีโอกาสน้อยที่จะระบุในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม

บทความนี้คัดมาจาก Antioxidants 2022, 11, 613 https://doi.org/10.3390/antiox11040613 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants