เห็นได้ชัดว่าไม่มี BMAL1-ขึ้นอยู่กับกล้ามเนื้อโครงร่าง-ไตข้ามพูดคุยในหนู

สูตรสมุนไพรสำหรับ โรคไตเรื้อรัง

คำหลัก: ยีนนาฬิกาเซอร์คาเดียน; การทำงานของไต สรีรวิทยาเชิงบูรณาการ

1. บทนำ

จังหวะการเต้นของหัวใจมีความโดดเด่นในกระบวนการทางสรีรวิทยาส่วนใหญ่ การควบคุมจังหวะเหล่านี้ส่วนหนึ่งควบคุมโดยนาฬิกาส่วนกลางที่อยู่ในนิวเคลียสเหนือสมองของสมอง แต่นาฬิการอบโลกส่วนปลายยังมีอิทธิพลต่อจังหวะในการทำงานทางสรีรวิทยาด้วย [1] นาฬิกาโมเลกุลประกอบด้วยวงจรป้อนกลับการถอดเสียง-การแปล โดยสรุป โปรตีนแกนกลาง aryl-hydrocarbon-receptor-nuclear-translocator-likeโปรตีน (ARNTL; หรือ BMAL1) และวงจรเอาท์พุตของหัวรถจักร circadian kaput (CLOCK) ควบคุมการถอดรหัสของยีน Period และ Cryptochrome ในทางบวก; โปรตีนระยะเวลา (PER) และ Cryptochrome (CRY) ตอบสนองต่อและยับยั้งการทำงานของ BMAL1/CLOCK (ตรวจสอบใน [2,3]) การหยุดชะงักของกระบวนการที่ควบคุมโดย circadian มีความสัมพันธ์กับโรคหลายอย่าง รวมถึงโรคหลอดเลือดหัวใจและไต [4,5] จนถึงปัจจุบัน การพูดคุยข้ามระบบอวัยวะต่างๆ หลังจากการหยุดชะงักของวงจรชีวิตแบบกำหนดเป้าหมายยังไม่เป็นที่เข้าใจกันดีนัก การศึกษาครั้งนี้มุ่งเน้นไปที่การลบโปรตีนนาฬิกาแกนหลัก BMAL1 ในกล้ามเนื้อโครงร่างและการขยายสาขาที่อาจเกิดขึ้นจากการหยุดชะงักของนาฬิกานี้มีต่อไต

เมาส์รุ่น BMAL{2}}inducible-knockout (iMS-BMAL1 KO) เฉพาะกล้ามเนื้อโครงร่าง ได้รับการอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ว่ามีลักษณะคล้ายกับที่พบในอายุที่มากขึ้น หนูเหล่านี้มีการเดินที่เปลี่ยนแปลงไป ความคล่องตัวลดลง กล้ามเนื้ออ่อนแรง และการดูดซึมกลูโคสบกพร่อง [6,7] โรคไตมีความหมายเหมือนกันกับความชรา เนื่องจากความชุกของโรคไตจะเพิ่มขึ้นตามอายุ [8] คุณลักษณะอีกประการหนึ่งที่รายงานในหนู iMS-BMAL1 KO ก็คือพวกมันแสดงการกลายเป็นปูนเอ็นที่เพิ่มขึ้น [6] บทบาทของไตในความสมดุลของกรดเบสและสภาวะสมดุลของแร่ธาตุเชื่อมโยงสุขภาพกระดูกกับโรคไตโดยตรง ดังนั้นเราจึงตั้งสมมติฐานว่าหนู iMS-BMAL1 KO อาจเป็นแบบจำลองของโรคไต

เป้าหมายของการศึกษาครั้งนี้คือเพื่อตรวจสอบว่าการหยุดชะงักของนาฬิกาในกล้ามเนื้อโครงร่างทำให้เกิดความผิดปกติของไตหรือไม่ การลบ BMAL1 ในกล้ามเนื้อโครงร่างทำให้เกิดเครื่องหมายการอักเสบในไตเพิ่มขึ้น อย่างไรก็ตาม การทำงานของไตหรือมิญชวิทยาของไตไม่ได้รับผลกระทบจาก iMS-BMAL1 KO ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าผลที่ตามมาจากการหยุดชะงักของนาฬิกาในกล้ามเนื้อโครงร่างทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในไตเพียงเล็กน้อยภายใต้สภาวะที่ทดสอบ

2. วัสดุและวิธีการ

สัตว์. แบบจำลองเมาส์ที่ใช้ในการศึกษานี้สร้างขึ้นโดยใช้ floxed exon 8 BMAL1 หนู [9] ข้ามกับหนู Cre-recombinase เฉพาะกล้ามเนื้อโครงร่าง (แอกตินโครงกระดูกมนุษย์–Cre) Cre ถูกกระตุ้นโดยการฉีดทามอกซิเฟน (ผลิตในเอธานอล 15% ในน้ำมันเมล็ดทานตะวัน) 5 สัปดาห์ก่อนการศึกษา (2 มก./วัน; 5 วัน ip.) เพื่อสร้าง iMS BMAL1 KO กระสายยา (เอธานอล 15% ในน้ำมันเมล็ดดอกทานตะวัน) หนูเมาส์ที่ถูกฉีด Cre+ ถูกใช้เป็นตัวควบคุม การศึกษาหนูตัวเมียบริสุทธิ์ที่อายุ 17–19 สัปดาห์ และหนูอายุที่ศึกษาที่อายุ 13–14 เดือน การทดลองทั้งหมดดำเนินการโดยสถาบันสุขภาพแห่งชาติเพื่อการดูแลและการใช้สัตว์ทดลอง และได้รับอนุมัติและติดตามโดยคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ประจำสถาบันมหาวิทยาลัยฟลอริดา และคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ประจำสถาบันการบริหารทหารผ่านศึกฟลอริดาตอนเหนือ/เซาท์จอร์เจีย หนูถูกเลี้ยงไว้ในอุณหภูมิ (20–26 ◦C) และควบคุมความชื้น 12:12 ชม. ในห้องปั่นจักรยานสว่างถึงมืด หนูได้รับสิทธิ์ในการเข้าถึงน้ำโดยไม่จำกัดและโปรตีนหนูมาตรฐาน 18% (หมายเลข 2918, Harlan Teklad/Envigo, Madison, WI, USA) เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น

การศึกษากรงเมตาบอลิซึม กลุ่มหนูตัวผู้จำนวน 5 ตัว (กลุ่มควบคุม 5 ตัวและ KS-BMAL1 KO 5 ตัว) ได้รับการดูแลในกรงเมตาบอลิซึมเพื่อเก็บปัสสาวะและติดตามการบริโภคอาหาร/น้ำ [10] มีการเตรียมและใช้อาหารเจลแบบผง (Envigo Teklad Custom Diet) ที่มีวุ้น 1% ตลอดคอลเลกชันกรงเมตาบอลิซึม หนูมีเวลา 3 วันในการปรับตัวให้เข้ากับกรงเมตาบอลิซึมก่อนเริ่มการเก็บตัวอย่างด้วยอาหารควบคุม ({{10}}.25% NaCl; 0.6% K; Envigo 99131) หลังจากบันทึกหนึ่งวันด้วยอาหารควบคุม จากนั้นหนูจะได้รับการรักษาด้วยอาหารที่มีโพแทสเซียมไม่เพียงพอ (0.25% NaCl; 0.0001% K; Envigo 99134) เป็นเวลาห้าวัน เก็บตัวอย่างปัสสาวะทุกๆ 12 ชั่วโมงเมื่อสิ้นสุดช่วงกลางวันและกลางคืน (เวลา Zeitgeber 0 และ 12) บันทึกปริมาณปัสสาวะ การรับประทานอาหาร และการดื่มน้ำ ความเข้มข้นของอิเล็กโทรไลต์ในปัสสาวะวัดด้วยเครื่องวัดเปลวไฟ (Cole-Parmer Model 2655- 00, Vernon Hills, IL, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต หนูถูกการุณยฆาต และเนื้อเยื่อถูกเก็บที่ไซต์เกเบอร์ เวลาที่ 6

องค์ประกอบของร่างกาย องค์ประกอบของร่างกายถูกวัดปริมาณในหนูตัวผู้ที่มีสติก่อนและห้าวันหลังจากการให้อาหารที่ไม่มีโพแทสเซียม ทำการวัดที่ Zeitgeber เวลา 4–6 โดยใช้เครื่องวิเคราะห์องค์ประกอบร่างกายด้วยคลื่นสนามแม่เหล็กเชิงปริมาณ EchoMRI (Echo Medical Systems, ฮูสตัน, เท็กซัส, สหรัฐอเมริกา) [11]

โปรโตคอลขั้นสูงเฟส หนูตัวผู้อายุหลายกลุ่มแยกกันถูกเลี้ยงโดยลำพังในกรงที่มีล้อวิ่งซึ่งสามารถเข้าถึงอาหารเชาเชา (หมายเลข 2918, Harlan Teklad) และน้ำได้โดยไม่จำกัด กรงถูกเก็บไว้ในกล่องควบคุมแสงซึ่งมีการแลกเปลี่ยนอากาศคงที่ (Actimetrics, Wilmette, IL, USA) ตารางการส่องสว่างได้รับการบำรุงรักษาตามรอบแสงและความมืด 12:12 ชม. โดยใช้แหล่งกำเนิดแสง LED สีเขียว (~200 ลักซ์) หลังจากหนึ่งสัปดาห์ของการตรวจวัดพื้นฐาน วงจรความมืดดำเนินไป 7 ชั่วโมง และหนูถูกคงไว้ตามตารางวงจรมืด-สว่าง 12:12 ชั่วโมงใหม่นี้เป็นเวลาหนึ่งสัปดาห์ กระบวนการนี้ถูกทำซ้ำเป็นครั้งที่สองเพื่อสร้างระยะล่วงหน้า 14-h หนูถูกการุณยฆาตในเวลา Zeitbeger 2 ในกลุ่ม 2-3 ตัว และเก็บเนื้อเยื่อ 7-10 วันหลังจากสัปดาห์ที่สองของระยะล่วงหน้า

ความจำเพาะของการรวมตัวกันใหม่ เพื่อยืนยันความจำเพาะของการรวมตัวกันใหม่ของ Bmal1 เราได้เสร็จสิ้น PCR โดยใช้ DNA จีโนมของกล้ามเนื้อโครงร่าง 40 ng และไพรเมอร์สำหรับอัลลีลที่รวมตัวกันใหม่และไม่ได้รวมตัวกันใหม่ (ไพรเมอร์ fwd: ACTGGAAGTAACTTTATCAAACTG, ไพรเมอร์รอบ: CTGACCAACTTGCTAACAATTA, ไพรเมอร์รีคอมบิเนชัน: CTCCTAACTTG GTTTTTGTCTGT) ไพรเมอร์เดินหน้าและถอยหลังสำหรับอัลลีล Bmal1 ที่ถูกฟล็อกแล้วให้ผลลัพธ์ 431-bp ไพรเมอร์ส่งต่อตัวที่สอง 50 -CTCCTAACTTGGTTTTTGTCTGT-30 ถูกรวมไว้เพื่อตรวจจับผลิตภัณฑ์ที่รวมตัวใหม่ ซึ่งแสดงแถบที่ 572 bp ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยา PCR ทำงานบนเจล agarose 1.7% และการระบุแถบจีโนมและแถบเฉพาะการรวมตัวกันอีกครั้งยืนยันว่าสัตว์ที่ได้รับการรักษาด้วยทามอกซิเฟนทั้งหมดนั้นเป็น KO เฉพาะเนื้อเยื่อตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า [7,12]

อิมมูโนวิทยา. ในระหว่างการดมยาสลบด้วยไอโซฟลูเรนแบบสูดดม ไตด้านขวาจะถูกรวบรวมและผ่าครึ่งตามขวางทันที จากนั้นเก็บในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ที่มีคามาเดต-ไลซีน-2% เป็นเวลาประมาณ 48 ชั่วโมงที่ 4 °C จากนั้นของไหลถูกเปลี่ยนเป็น PBS เพื่อเตรียมการสำหรับการแปรรูป ตัวอย่างไตจากสัตว์แต่ละตัวถูกฝังไว้ในพาราฟิน และส่วนที่หนา 4- ไมโครเมตรถูกตัดและติดตั้งบนกระจกสไลด์ ส่วนต่างๆ ถูกย้อมด้วยฮีมาทอกซิลินและอีโอซินหรือย้อมด้วยซับสเตรตโครโมเจนิกของไดอะมิโนเบนซิดีน (เวคเตอร์) 3,30 - เพื่อกำหนดเป้าหมาย BMAL1 (การส่งสัญญาณเซลล์ D2L7G; 1:3000; RRID: AB_2728705, Danvers, MA, สหรัฐอเมริกา) ส่วนต่างๆ ถูกสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง (Nikon E600 ที่ติดตั้งกล้องดิจิตอล Nikon DXM1200F, เมลวิลล์, นิวยอร์ก, นิวยอร์ก, สหรัฐอเมริกา) ตัวระบุกลุ่มถูกลบออกจากแต่ละสไลด์และตรวจสอบการแสดงออกของ BMAL1 หรือสไลด์ถูกให้คะแนนสำหรับการบาดเจ็บของท่อโดยใช้เกณฑ์ต่อไปนี้: เปอร์เซ็นต์ของ tubules ที่แสดงสัญญาณของเนื้อร้ายของ tubular, การขาดเส้นขอบของแปรง, การขยายของ tubular และการก่อตัวของโปรตีน

บ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิต่อต้านกระต่ายจากมะรุม-เปอร์ออกซิเดส-คอนจูเกต หลังจากการล้างเพิ่มเติมด้วย TBS-T เป็นเวลา 30 นาที การตรวจจับถูกดำเนินการโดยใช้รีเอเจนต์ SignalFire ECL (เทคโนโลยีการส่งสัญญาณเซลล์) ด้วยเวลาเปิดรับแสง 30 วินาทีสำหรับการสร้างภาพ ดำเนินการวัดความหนาแน่นโดยใช้ฟิจิ และปริมาณโปรตีนถูกทำให้เป็นมาตรฐานกับการย้อมสีปอนโซ

การตรวจภูมิคุ้มกันแบบมัลติเพล็กซ์ บริเวณเยื่อหุ้มสมองและไขกระดูกถูกผ่าจากไตครึ่งหนึ่งในหนูตัวผู้อายุมาก เนื้อเยื่อถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันใน 300 ไมโครลิตร (คอร์เทกซ์) หรือ 250 ไมโครลิตร (ไขกระดูก) ของบัฟเฟอร์ (ค็อกเทลตัวยับยั้งโปรตีเอส–ฟอสฟาเตส 1% (เทอร์โมไซแอนติฟิค) 1% 1 โมลาร์ เอทิลีนไดเอมีนเตตราอะซิติกแอซิด, 0.1% ทวีน 20 ในฟอสเฟต- น้ำเกลือบัฟเฟอร์) ความเข้มข้นของโปรตีนสำหรับแต่ละตัวอย่างถูกกำหนดโดย BCA (Pierce, Thermo Scientific) โฮโมจีเนตถูกวัดซ้ำกันสำหรับสารวิเคราะห์ที่เลือกโดยใช้ชุดตรวจอิมมูโนแอสเสย์มัลติเพล็กซ์เชิงพาณิชย์ (MCYTOMAG-70K, MBNMAG-41K และ MKI1MAG-94K; EMD MilliporeSigma ของ cat# บน MILLIPLEX® เครื่องวิเคราะห์ 3.1 ระบบ xPONENT (Luminex 200, Austin, TX, USA) พร้อมการวิเคราะห์ข้อมูลผ่านซอฟต์แวร์ MILLIPLEX Analyst CV เฉลี่ยในการตรวจวิเคราะห์คือ<5% and the average inter-assay CVs were <15%. The data were converted from pg/mL to pg/mg, using the previously determined protein concentrations. 

การแยกไมโตคอนเดรียของไตและการตรวจการหายใจ เนื้อเยื่อเยื่อหุ้มสมองไตสดถูกผ่าจากหนูหลังการก้าวหน้าระยะ ไมโตคอนเดรียถูกแยกได้โดยใช้ชุดแยกไมโตคอนเดรียสำหรับเนื้อเยื่อ (#ab110169; Abcam, Waltham, MA, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ความเข้มข้นของโปรตีนของการเตรียมไมโตคอนเดรียถูกกำหนดโดยใช้ชุดทดสอบโปรตีน BCA (เพียร์ซ, เทอร์โมไซแอนทิฟิค) การหายใจแบบไมโตคอนเดรียของไอโซเลทถูกกำหนดซ้ำกันในห้องไซโลกราฟที่ปรับเทียบก่อนหน้านี้ ซึ่งคงไว้ที่อุณหภูมิ 37 ◦C (Oroboros O2K; Oroboros Instruments, Innsbruck, ออสเตรีย) ที่มีบัฟเฟอร์การหายใจ (MiR05; 0.5 มิลลิโมลาร์ EGTA, 3 มิลลิโมลาร์ MgCl2·6H2O, กรดแลคโตไบโอนิก 60 มิลลิโมลาร์, ทอรีน 20 มิลลิโมลาร์, KH2PO4 10 มิลลิโมลาร์, HEPES 20 มิลลิโมลาร์, D-ซูโครส 110 มิลลิโมลาร์ และ 1 g/L ปราศจากกรดไขมัน BSA, pH 7.1) [13] ความเข้มข้นของออกซิเจนของบัฟเฟอร์สำหรับการหายใจถูกคงไว้ระหว่างความอิ่มตัวของอากาศ (~200 ไมโครโมลาร์) และ 50 ไมโครโมลาร์ อัตราการใช้ออกซิเจน (OCR; ρmol O2 / s / mg โปรตีนไมโตคอนเดรีย) วัดโดยใช้โปรโตคอลสารตั้งต้น - ตัวยับยั้ง - ตัวยับยั้ง - การไตเตรท (SUIT) ต่อไปนี้ (ความเข้มข้นของรีเอเจนต์ที่ระบุไว้ในวงเล็บถือเป็นที่สิ้นสุดภายในห้อง): (1) การรั่วไหล (L ) ประเมินการหายใจหลังจากการกระตุ้นวงจร TCA ด้วยสารตั้งต้นที่เชื่อมโยงกับ NADH ไพรูเวต (5 mM), มาเลท (2 mM) และกลูตาเมต (10 mM) เพื่อรองรับการไหลของอิเล็กตรอนผ่านคอมเพล็กซ์ I (CI) ของระบบขนส่งอิเล็กตรอน (ETS; E ); (2) ออกซิเดชั่นฟอสโฟรีเลชั่น (OXPHOS; P) ถูกกระตุ้นด้วยอะดีโนซีนไดฟอสเฟต (ADP; 2.5 mM) และบันทึกเป็น PCI; (3) การเติมซัคซิเนต (10 mM) รองรับการไหลของอิเล็กตรอนมาบรรจบกันผ่านคอมเพล็กซ์ I และ II ของ ETS (PCI+II); (4) ประเมินคุณภาพของการเตรียมไมโตคอนเดรียโดยการทดสอบความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มชั้นนอกของไมโตคอนเดรียโดยการเติมไซโตโครม c (10 µM); (5) ตัวแยกคาร์บอนิล ไซยาไนด์ 4-(ไตรฟลูออโรเมทอกซี) ฟีนิลไฮดราโซน (FCCP; 0.5 ไมโครลิตรของขั้นตอนของสารละลายสต็อค 0.1 มิลลิโมลาร์) ถูกไตเตรตแบบขั้นตอนจนกระทั่งถึงการหายใจแบบแยกสูงสุดและบันทึกเป็นความจุ ETS สูงสุด (ECI+ ครั้งที่สอง); (6) การเติมโรทีโนน (0.5 µM) ยับยั้งเชิงซ้อน I ของ ETS และ OCR ที่เหลือถูกบันทึกเป็นความจุ ETS สูงสุดที่รองรับโดยซับสเตรต II เชิงซ้อน (ECII); (7) การเติมแอนติมัยซิน A (2.5 µM) ยับยั้งคอมเพล็กซ์ III ของ ETS และด้วยเหตุนี้การขนส่งอิเล็กตรอนทั้งหมดไปยัง IV เชิงซ้อน และ OCR ที่เหลือถูกบันทึกเป็นปริมาณการใช้ออกซิเจนที่ไม่ใช่ไมโตคอนเดรีย (ROX) ที่ตกค้าง และลบออกจาก OCR ก่อนหน้าทั้งหมด ; (8) จากนั้นกระตุ้นการใช้ออกซิเจนอีกครั้งด้วยการเติม N,N,N0 ,N0 -เตตระเมทิล-พี-ฟีนิลีนไดเอมีน ไดไฮโดรคลอไรด์ (TMPD; 0.5 มิลลิโมลาร์; เมื่อมีแอสคอร์เบต (2 มิลลิโมลาร์) เพื่อหลีกเลี่ยงการเกิดออกซิเดชันอัตโนมัติที่ไม่สามารถควบคุมได้ ของ TMPD) เป็นซับสเตรตเทียมสำหรับรีดิวซ์ไซโตโครม c; (9) อัตราการเกิดออกซิเดชันพื้นหลังทางเคมีเมื่อมี TMPD/ แอสคอร์เบตได้รับการประเมินโดยการเติมโซเดียมเอไซด์ที่เป็นสารยับยั้ง IV เชิงซ้อน (100 มิลลิโมลาร์) และถูกลบออกจากฟลักซ์ก่อนหน้านี้ ส่งผลให้เกิดความสามารถสูงสุดของการออกฤทธิ์ของไซโตโครม c ออกซิเดส (ECIV) ข้อมูลปริมาณการใช้ออกซิเจนได้รับและวิเคราะห์โดยใช้ DatLab เทียบกับ 7.4 (เครื่องมือ Oroboros) อัตราส่วนการควบคุมฟลักซ์ (FCR) ถูกคำนวณตามปริมาณการใช้ออกซิเจนที่สภาวะการหายใจที่กำหนดใดๆ ที่สัมพันธ์กับความจุ ETS สูงสุด (ECI+II)

โฟลว์ไซโตเมทรี เนื้อเยื่อปอดถูกย่อย และการวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทริกได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [14]

การวิเคราะห์ทางสถิติ ข้อมูลกราฟิกจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SEM การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองทางพร้อมการวัดซ้ำเมื่อเป็นไปได้ ถูกนำมาใช้เพื่อวิเคราะห์ความแตกต่างระหว่างสี่กลุ่ม การทดสอบเปรียบเทียบพหุคูณของ Sidak ใช้เพื่อเปรียบเทียบกลุ่มเมาส์กับกลุ่มการรักษา การทดสอบของนักเรียนใช้เพื่อเปรียบเทียบทั้งสองกลุ่ม การวิเคราะห์ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism เวอร์ชัน 9.2 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)

นัยสำคัญทางสถิติถูกกำหนดเป็น p < 0.05

บริการสนับสนุนของ Wecistanche:

อีเมล:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/โทรศัพท์:+86 15292862950