Apocynin ช่วยแก้ไขความเสียหายของอัณฑะที่เกิดจากโมโนโซเดียมกลูตาเมตโดยสิ่งกีดขวางอัณฑะในเลือดที่บกพร่องและพารามิเตอร์ความเครียดออกซิเดชันⅠ

เชิงนามธรรม:

ความเป็นมา: การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาผลของอะโพไซนิน (APO) ต่อระดับฮอร์โมน สิ่งกีดขวางอัณฑะในเลือด และไบโอมาร์คเกอร์ออกซิเดชันในโมโนโซเดียมกลูตาเมต (MSG) ที่เหนี่ยวนำให้อัณฑะเสื่อม วิธีการ: หนูแรทเพศผู้ Sprague Dawley (150–200 กรัม; n=32) ถูกสุ่มออกเป็นสี่กลุ่ม: กลุ่มควบคุม, APO, MSG และ MSG บวก APO กลุ่ม MSG และ MSG บวก APO ถูกบริหารให้โดยผงชูรส (120 มก./กก.) เป็นเวลา 28 วัน

คลิกเพื่อ cistanche สมุนไพรสำหรับฮอร์โมนเพศชาย

ยิ่งไปกว่านั้น กลุ่ม APO และ MSG บวก APO ได้รับ APO (25 มก./กก.) ในช่วงห้าวันสุดท้ายของการทดลอง การบริหารทั้งหมดผ่านทางปาก ในที่สุด การวิเคราะห์ทางชีวเคมีได้ดำเนินการตามการตรวจหาฮอร์โมนเพศชาย ฮอร์โมนกระตุ้นรูขุมขน (FSH) ลูทิไนซิงฮอร์โมน (LH) มาลอนไดอัลดีไฮด์ (MDA) กลูตาไธโอน (GSH) และซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเทส (SOD) รวมทั้งแสงและการส่งผ่าน การตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน การประเมินค่าสเปิร์ม ZO-1, occludin, NOX-2 และ TUNEL immunohistochemistry ได้รับการประเมิน

ผลลัพธ์: ผงชูรสเพิ่มทั้งระดับความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและการตายของเซลล์ การเพิ่มจำนวนเซลล์ลดลง และทำให้เกิดการเสื่อมของสัณฐานวิทยาของอัณฑะ รวมถึงในแผงกั้นอัณฑะในเลือด การบริหาร apocynin กลับค่าพารามิเตอร์ทางสัณฐานวิทยาและชีวเคมีที่เสื่อมลงทั้งหมดในกลุ่ม MSG บวก APO สรุป: อะโพไซนินได้รับการพิจารณาเพื่อป้องกันการเสื่อมของอัณฑะโดยการรักษาความสมบูรณ์ของเกราะป้องกันเลือดอัณฑะด้วยระดับฮอร์โมนและสารออกซิแดนท์/สารต้านอนุมูลอิสระที่สมดุล

คำสำคัญ: ผงชูรส; อะโพไซนิน; NOX-2; สิ่งกีดขวางเลือดอัณฑะ โครงสร้างพิเศษ

1. บทนำ

กรดแอล-กลูตามิกที่ใช้กันอย่างแพร่หลายเป็นสารเติมแต่ง เกิดขึ้นตามธรรมชาติในอาหารหลากหลายชนิด และเป็นที่มาของสารเพิ่มรสชาติ โมโนโซเดียมกลูตาเมต (MSG) [1] อาหารแปรรูปหลายชนิดมีผงชูรสเป็นสารเติมแต่ง โดยการบริโภคเฉลี่ยต่อวันในประเทศอุตสาหกรรมในยุโรปอยู่ที่ 0.3 ถึง 1.0 กรัม [2]. แม้ว่าการบริโภคผงชูรสจะถือว่าปลอดภัยโดยองค์กรด้านความปลอดภัยของอาหาร แต่ก็ยังมีข้อสงสัยในการศึกษาทางคลินิกและพรีคลินิกหลายชิ้น โดยเฉพาะการสัมผัสเป็นเวลานาน หน้าที่ทางสรีรวิทยาของกลูตาเมตคือคุณสมบัติในการส่งสารสื่อประสาทในระบบประสาทส่วนกลาง โดยเป็นสารตั้งต้นของสารเมแทบอไลต์ เช่น กลูตาไธโอน [1]

การบริโภคผงชูรสในระยะยาวมีผลเสียต่อระบบสืบพันธุ์เพศชาย การศึกษาพบว่าการบริโภคผงชูรสในระยะยาวจะลดจำนวนสเปิร์มในเพศชายและส่งผลต่อโครงสร้างทางสัณฐานวิทยาของตัวอสุจิและอัณฑะ [3] งานวิจัยส่วนใหญ่ที่อ้างถึงก่อนหน้านี้มุ่งเน้นไปที่ความเป็นพิษของผงชูรสในหนูที่ปริมาณ 2,000–8,000 มก./กก. ของน้ำหนักตัว ซึ่งไม่น่าเป็นไปได้อย่างยิ่งสำหรับมนุษย์ในระดับนี้ [4]

การแปลง Allometric โดย Shin et al [5] แสดงให้เห็นว่าขนาดยานี้เทียบเท่ากับ 120 มก./กก. ของน้ำหนักตัวในหนูแรท มีตัวรับกลูตาเมตจำนวนมากในอวัยวะสืบพันธุ์และสเปิร์ม ทำให้ไวต่อการกระตุ้นความเสียหายจากกลูตาเมตส่วนเกินในร่างกาย สิ่งนี้ทำให้ระบบสืบพันธุ์เป็นเป้าหมายบ่อยครั้งสำหรับความเสียหายที่เกิดจากกลูตาเมต นอกจากนี้ ความเป็นพิษของกลูตาเมตยังเป็นที่รู้กันว่าทำลายแกนไฮโปทาลามิก-ต่อมใต้สมอง-อวัยวะสืบพันธุ์โดยตรง ซึ่งนำไปสู่ความไม่สมดุลของสภาวะสมดุลในการสืบพันธุ์ [6]

ผงชูรสส่งผลให้เกิดความเสียหายจากปฏิกิริยาออกซิเดชั่น (เพิ่ม lipid peroxidation และกิจกรรมของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระลดลง) และการเปลี่ยนแปลงของสเปิร์มที่แสดงออกโดยจำนวนสเปิร์มต่ำและความผิดปกติทางสัณฐานวิทยา [3] ดังนั้นเราจึงศึกษาผลกระทบของการบริโภคผงชูรสทางปากต่อหนู เมื่อพวกมันกินในปริมาณปานกลางที่อนุมานโดยตรงจากการบริโภคประจำวันของมนุษย์ ผลของปริมาณผงชูรสนี้ต่อสัณฐานวิทยาของอัณฑะของหนูถูกสังเกตในการศึกษาเชิงทดลองด้วย [3,7]

การผลิตมากเกินไปของสายพันธุ์ออกซิเจนปฏิกิริยา (ROS) ทำให้เกิดความเครียดออกซิเดชันและการตายของเซลล์ เนื่องจากโครงสร้างปฏิกิริยา อนุมูลอิสระสามารถโต้ตอบกับไขมัน กรดนิวคลีอิก และโปรตีน และมีผลเสียต่อร่างกาย [8] ความเครียดออกซิเดทีฟซึ่งเกิดจาก ROS เป็นที่รู้จักกันว่ามีบทบาทสำคัญในภาวะมีบุตรยากในเพศชาย [9] การศึกษาพบว่า NADPH oxidase (NOX) เป็นหนึ่งในแหล่งที่มาหลักของ ROS [10] ROS ที่มากเกินไปและความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชั่นในระบบสืบพันธุ์เพศชายทำให้ความเข้มข้นของสเปิร์ม การเคลื่อนไหว และสัณฐานวิทยาเปลี่ยนแปลงในทางลบ สเปิร์มที่เสื่อมและค่าสเปิร์มที่บกพร่องจะนำไปสู่การมีบุตรยาก [11] ROS ทำให้ผู้ชายมีบุตรยากเนื่องจากความเสียหายของ DNA ในตัวอสุจิ [12] ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดทีฟทำให้ความสมบูรณ์ของพลาสมาเมมเบรนของสเปิร์มลดลงและทำให้เกิดความจุในระยะแรก

เป็นผลให้ความสามารถในการปฏิสนธิของตัวอสุจิลดลงและเกิดภาวะมีบุตรยาก [13] Apocynin (APO) ที่สกัดจากรากของพืช Apocynum cannabinum เป็นที่ทราบกันว่ามีประสิทธิภาพในการยับยั้ง NOX [14] ฤทธิ์ต้านการอักเสบของ APO แสดงให้เห็นในการศึกษาทดลองหลายชิ้น [15] การกระตุ้น NOX เกิดขึ้นจากการย้ายส่วนประกอบของไซโตซิลิกไปยังเยื่อหุ้มเซลล์ [16,17] APO ทำหน้าที่เป็นตัวยับยั้งการคัดเลือกของการผลิต ROS โดยทำหน้าที่กับกิจกรรม NOX ในนิวโทรฟิลของมนุษย์ที่แอคทีฟ

อย่างไรก็ตาม APO ไม่ส่งผลต่อการทำลายเซลล์หรือกลไกอื่นของการตายของภายในเซลล์ [18,19] ไอโซฟอร์มของ NOX แสดงออกในเซลล์ต่างๆ และมีหน้าที่ทางสรีรวิทยาที่แตกต่างกัน NOX-2 เป็นไอโซฟอร์มของ NOX ซึ่งมีอยู่ในอีโอซิโนฟิล มาโครฟาจ และนิวโทรฟิล [20] มีการเชื่อมต่อเซลล์สร้างอสุจิและเซลล์ Sertoli ความสัมพันธ์แบบไดนามิกนี้ถูกควบคุมโดยทางแยกที่แน่นและทางแยกที่มีช่องว่าง [21] รอยต่อที่แน่นระหว่างเซลล์ Sertoli มีความสำคัญต่อการสร้างและการทำงานของ Blood-Testis Barrier (BTB)

โครงสร้างของ BTB รวมถึงจุดแยกแน่น เดสโมโซม เบสเอคโทพลาสมิกเฉพาะทาง และจุดแยกช่องว่าง จุดเชื่อมต่อที่แน่นหนาของแหล่งกำเนิดเยื่อบุผิวเป็นลักษณะเฉพาะของเยื่อหลายโมเลกุลที่มีโปรตีนเยื่อหุ้มเซลล์รวมหลายตัว เช่น zonula occludens-1 (ZO-1) และ occludin [21] Occludins เป็นหนึ่งในโมเลกุลที่มีส่วนทำให้เกิดรอยต่อแน่น โปรตีน Zonula occludens เช่น zonula occludens-1 (ZO-1), ZO-2 และ ZO-3 เป็นโปรตีนสำคัญที่เกี่ยวข้องกับโครงสร้างนี้ Occludin, ZO-1 และ ZO-3 โต้ตอบกับโครงร่างโครงร่างของเซลล์แอกติน โปรตีน ZO-3 เกี่ยวข้องกับโดเมนไซโตพลาสซึมของ ZO-1 และ occludin [22]

ความเครียดออกซิเดชันเกิดขึ้นเมื่อมีสารต้านอนุมูลอิสระไม่เพียงพอต่ออนุมูลอิสระ การลดลงของการทำงานของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ เช่น ระดับซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเทส (SOD) และกลูตาไธโอน (GSH) ทำให้เกิดความเสียหายจากปฏิกิริยาออกซิเดชันเพิ่มขึ้น [23] Malondialdehyde (MDA) ซึ่งเป็นพารามิเตอร์ของความเสียหายของเยื่อหุ้มเซลล์ บ่งชี้ถึงความหนาแน่นของการโจมตีของอนุมูลอิสระในเซลล์ที่ทำปฏิกิริยาและเมแทบอลิซึมของอนุมูลอิสระในร่างกาย SOD ที่ลดลงและ MDA ที่เพิ่มขึ้นจะกระตุ้นความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและทำให้เซลล์เสียหาย ส่งผลให้เซลล์ตาย [24] การศึกษาระบุว่า NOX-2 เป็นแหล่งที่มาของ ROS [20,25] APO ซึ่งเป็นสารยับยั้ง NOX-2 ที่มีศักยภาพ [26] อาจมีประสิทธิภาพในการยับยั้ง NOX-2 เพื่อป้องกันความเสียหายของเนื้อเยื่อเนื่องจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน

การบริหารให้ APO อาจมีผลการรักษาต่อพารามิเตอร์ความเครียดออกซิเดชันและความเสียหายทางจุลพยาธิวิทยา การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อประเมินผลของผงชูรสต่อความเสียหายของเนื้อเยื่ออัณฑะ การเพิ่มจำนวนเซลล์ การตายของเซลล์ และความเครียดออกซิเดชันที่ระบุโดยการแสดงออกของ NOX-2 และต่อสิ่งกีดขวางของอัณฑะในเลือด นอกจากนี้ การศึกษายังมีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบว่าอะโพไซนินสามารถปรับปรุงผลกระทบต่อพารามิเตอร์เหล่านี้ทั้งหมดได้หรือไม่

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. การออกแบบการทดลอง

การศึกษาเชิงทดลองนี้ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมของสัตว์ทดลองแห่งมหาวิทยาลัย Acibadem Mehmet Ali Aydinlar (ACU-HADYEK หมายเลขการอนุมัติ: HDK2020/39) ในการศึกษานี้ 8-หนูเผือกเพศผู้พันธุ์ Sprague Dawley (n=32) อายุหนึ่งสัปดาห์ถูกขังไว้ในกรงที่มีอุณหภูมิ 22 ± 2 ◦C และแสง/มืดมาตรฐาน (12:12 ชั่วโมง) รอบ หนูถูกเลี้ยงด้วยอาหารสัตว์มาตรฐานโดยไม่มีข้อจำกัดเป็นเวลา 28 วันของช่วงทดลอง การวิจัยนี้ดำเนินการตามแนวทางและข้อบังคับของ ARRIVE (การวิจัยสัตว์: การรายงานการทดลองในสัตว์ทดลอง) ในการศึกษานี้ หนูแรทเพศผู้ Sprague Dawley (n=8 ในแต่ละกลุ่ม) ถูกสุ่มแบ่งเป็นกลุ่มควบคุม 4 กลุ่ม ได้แก่ APO, MSG และ MSG บวก APO ให้น้ำกลั่น (1 มล.) แก่หนูกลุ่มควบคุมทางปากเป็นเวลา 28 วัน กลุ่ม MSG และ MSG plus APO ได้รับการบริหารให้ 120 มก./กก. MSG ทางปากเป็นเวลา 28 วันติดต่อกัน [4] กลุ่ม APO และ MSG บวก APO ได้รับการบริหารให้ APO 25 มก./กก. ทางปากทางปากในช่วง 5 วันสุดท้ายของการทดลอง [27] วิเคราะห์น้ำหนักของหนูในกลุ่มทดลองทุกสัปดาห์ หลังจากการดมยาสลบด้วยไอโซฟลูเรน หนูถูกสังเวย ตัวอย่างเลือด รวมทั้งตัวอย่างเนื้อเยื่ออัณฑะและหลอดน้ำอสุจิ ถูกนำมาใช้สำหรับการประเมินทางชีวเคมีและกล้องจุลทรรศน์

2.2. การวัดความเข้มข้นของฮอร์โมนเทสโทสเตอโรนในซีรั่ม FSH และ LH

วัดความเข้มข้นของเทสโทสเตอโรนในซีรั่ม ฮอร์โมนกระตุ้นรูขุมขน (FSH) และลูทิไนซิงฮอร์โมน (LH) โดยใช้ชุดทดสอบอิมมูโนซอร์เบนต์ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ELISA) หนูเทสโทสเตอโรน (หมายเลขแค็ตตาล็อก: EA0023Ra, ELISA kit Bioassay Technology Laboratory), Rat FSH (แค็ตตาล็อกหมายเลข: EA0015Ra, Bioassay Technology Laboratory, Shanghai, China) และ Rat LH ELISA (แคตตาล็อกหมายเลข: EA0013Ra, Bioassay Technology Laboratory) ถูกนำมาใช้สำหรับ การวิเคราะห์ระดับฮอร์โมนตามขั้นตอนของชุดคิท ผลลัพธ์ของฮอร์โมนเพศชายได้รับเป็น nmol/L และ FSH และ LH ได้รับเป็น mIU/L

2.3. การวัดระดับ MDA, GSH และ SOD ของลูกอัณฑะ

ระดับ MDA ถูกกำหนดโดยใช้ชุดเครื่องมือเชิงพาณิชย์ (E-BC-K025-M, Elabscience, Houston, TX, USA) MDA หนึ่งในผลิตภัณฑ์ย่อยสลายของ lipid peroxidation ทำปฏิกิริยากับกรด Thiobarbituric (TBA) เพื่อสร้างสารประกอบเชิงซ้อนสีชมพูที่มีการดูดซึมสูงสุด 532 นาโนเมตร ระดับ MDA ในเนื้อเยื่อคำนวณเป็น nmol/g การวิเคราะห์ GSH ในเนื้อเยื่ออัณฑะดำเนินการตามวิธีของ Beutler [28] หลักการของวิธีการนี้ขึ้นอยู่กับความจริงที่ว่า GSH ในหลอดวิเคราะห์ทำปฏิกิริยากับกรดไนโตรเบนโซอิก 5,50 -ไดไทโอบิส-2- (DTNB) เพื่อให้ได้สีเหลือง ความเข้มแสงของสีนี้อ่านได้ในสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ที่ความยาวคลื่น 410 นาโนเมตร โฮโมจีเนตของเนื้อเยื่อถูกหมุนเหวี่ยงและสารละลาย TCA 10 เปอร์เซ็นต์ถูกเติมไปยังส่วนเหนือตะกอนที่ได้รับ ผสมและหมุนเหวี่ยงอีกครั้งเพื่อทำให้โปรตีนตกตะกอน ส่วนลอยเหนือตะกอนที่มีสีสว่างถูกนำมาใช้สำหรับการวิเคราะห์ GSH ความเข้มของสีที่เกิดขึ้นในตัวอย่างที่เก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาทีถูกอ่านที่ 410 นาโนเมตรในสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ และระดับ GSH ใน µmol/g ในเนื้อเยื่อถูกกำหนดโดยใช้เส้นโค้งมาตรฐานกลูตาไธโอน กิจกรรม SOD ถูกกำหนดโดยใช้ Sigma SOD Determination Kit (E-BC-K019-M, Elabscience, Houston, TX, USA) อ่านค่าการดูดซับที่ 450 นาโนเมตร หลังจากบ่มกิจกรรม SOD ด้วยสารละลายที่ทำงานด้วยเอนไซม์ ระดับ SOD ในเนื้อเยื่อคำนวณเป็น IU/g

2.4. จำนวนสเปิร์ม การเคลื่อนที่ และสัณฐานวิทยา

ตัวอย่างเนื้อเยื่อของหลอดน้ำอสุจิจากหนูถูกใส่ในสารละลาย Earle's Balanced Salts ด้วยสารละลายบัฟเฟอร์ Hepes และประมวลผลเพื่อวิเคราะห์จำนวนสเปิร์ม การเคลื่อนที่ และสัณฐานวิทยาตามการศึกษาก่อนหน้า [27] โดยสังเขป ตัวอย่างเนื้อเยื่อ epididymis ของหนูถูกถ่ายโอนไปยังสารละลาย Earle's Balanced Salts โดยเพิ่มสารละลาย Hepes buffer เข้าไปหลังจากการผ่า ใช้วิธีการไล่ระดับความหนาแน่นตามปกติเพื่อประเมินสเปิร์มมาโตซัว ส่วนลอยถูกเอาออก และเม็ดถูกเจือจางด้วยตัวกลางล้างตัวอสุจิ (SAGE, Newcastle upon Tyne, UK) และปั่นแยก จากนั้นนำเม็ดมาเจือจางด้วยสารเตรียมสเปิร์ม (SAGE, UK) เม็ดพลาสติกขนาด 10 µm ใช้ในการนับสเปิร์มมาโตซัวในห้องนับ Macler (เครื่องมือแพทย์ Sefi ที่เมืองไฮฟา ประเทศอิสราเอล) โดยใช้โฟโตไมโครสโคปเพื่อนับ สำหรับการประเมินทางสัณฐานวิทยา มีการเตรียมสเมียร์แล้วย้อมโดยใช้ชุด Diff-Quick (Medion Diagnostics, Grafelfing, มิวนิก, เยอรมนี) ในแต่ละสไลด์ ตรวจสเปิร์มมาโตซัว 100 ตัวที่กำลังขยาย 100 เท่าด้วยโฟโตไมโครสโคป (Zeiss A1 Axio Scope, Oberkochen, Germany) เพื่อประเมินสัณฐานวิทยาของสเปิร์ม

2.5. การประมวลผลเนื้อเยื่อสำหรับกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง

เนื้อเยื่ออัณฑะได้รับการแก้ไขด้วยสารละลาย Bouin สำหรับการตรวจทางเนื้อเยื่อตามปกติ สำหรับการตรวจทางอิมมูโนฮิสโตเคมี เนื้อเยื่ออัณฑะได้รับการแก้ไขด้วยสารละลายพาราฟอร์มัลดีไฮด์ (PFA) 4 เปอร์เซ็นต์ หลังจากการตรึง เนื้อเยื่อจะเข้าสู่ขั้นตอนการฝังพาราฟิน [29] Haematoxylin และ eosin (H&E) ถูกนำไปใช้กับส่วนต่าง ๆ สำหรับการประเมินทางเนื้อเยื่อตามปกติ ปฏิกิริยาของกรด-ชิฟฟ์ (PAS) เป็นระยะถูกนำมาใช้เพื่อเปิดเผยโครงสร้างของเยื่อฐานของท่อเซมินิเฟอรัส หลอด Seminiferous ในส่วนอัณฑะที่ย้อมด้วย H&E ได้รับคะแนนตามพารามิเตอร์การให้คะแนนทางจุลพยาธิวิทยาของ Johnsen ที่แก้ไขแล้ว [30,31] นอกจากนี้ วัดความหนาของเยื่อบุผิวของท่อเซมินิเฟอร์รัส 100 ท่อในทุกส่วนโดยใช้โปรแกรม Image J (ซอฟต์แวร์ Image J, สถาบันสุขภาพแห่งชาติ)

2.6. Terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL) อิมมูโนเคมี

วิธีการ Terminal deoxynucleotidyl Transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) ถูกนำไปใช้กับส่วนของเนื้อเยื่ออัณฑะตามคู่มือการใช้งานของชุดอุปกรณ์ที่ผู้ผลิตกำหนด (ApopTag Plus, In Situ Apoptosis Detection Kit, S7101, Merck Millipore, Darmstadt, Germany) โดยสังเขป หลังจากลดพาราฟินและคืนน้ำแล้ว ส่วนต่างๆ จะถูกล้างใน PBS แล้วอุ่นในเตาไมโครเวฟในซิเตรตบัฟเฟอร์ หลังจากทำให้เย็นลง โปรตีเนส K (20 ไมโครกรัม/มล.) ถูกหยดลงบนส่วนของเนื้อเยื่อ ชิ้นส่วนถูกล้างในน้ำกลั่นและแช่ในสารละลายที่เตรียมด้วยไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 3 เปอร์เซ็นต์ หลังจากล้างด้วย PBS แล้ว ให้วางผ้าอนามัยแบบคงตัวขนาด 10 µL บนส่วนนี้เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง จากนั้น เอ็นไซม์ 10 µL Tdt ถูกหยด และส่วนต่างๆ ถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37 ◦ซ บัฟเฟอร์หยุดล้างถูกหยดเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง หลังจากล้างด้วย PBS หยดสารต่อต้านดิจอกซิจีนิน 13 ไมโครลิตรลงบนส่วนต่างๆ หลังจากบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที ส่วนต่างๆ ถูกล้าง 4 ครั้งเป็นเวลา 2 นาทีใน PBS จากนั้น สารละลาย 13 µL 3,3'-ไดอามิโนเบนซิดีน (DAB) ถูกหยด จากนั้นจึงเขย่าส่วนต่างๆ ด้วยน้ำกลั่น สำหรับการย้อมสีที่ตัดกัน ส่วนต่างๆ ถูกแช่ในสารละลาย Mayer hematoxylin (JT Baker, Center Valley, PA, USA) หลังจากล้างน้ำกลั่นแล้วส่วนจะถูกติดตั้งด้วยอิตาเลี่ยน ส่วนต่างๆ ถูกถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบแสง (Zeiss A1 Axio Scope, Oberkochen, Germany) ดัชนีอะพอพโทซิสถูกประเมินโดยการหารจำนวนทั้งหมดของท่ออัณฑะด้วยจำนวนของท่อเซมินิเฟอรัสที่มีเซลล์ TUNEL-positive 3 เซลล์ขึ้นไป [32]

2.7. แอนติเจนนิวเคลียร์ของเซลล์เพิ่มจำนวน (PCNA) อิมมูโนฮิสโตเคมี

ส่วนต่างๆ อยู่ภายใต้ PCNA immunohistochemistry เพื่อกำหนดจำนวนของเซลล์เพิ่มจำนวนและดัชนีการเพิ่มจำนวน หลังจาก deparaffinization และ rehydration แล้ว ส่วนต่างๆ จะถูกประมวลผลสำหรับ PCNA immunohistochemistry ตามที่อธิบายไว้ในการศึกษาก่อนหน้า [32] โดยสังเขป ส่วนต่างๆ ถูกเก็บไว้ในสารละลายไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 3 เปอร์เซ็นต์ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) เป็นเวลา 20 นาที ชิ้นส่วนถูกทำให้ร้อนในเตาไมโครเวฟที่ 200 W ในบัฟเฟอร์ ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (Sigma-Aldrich, USA) เป็นเวลา 20 นาที หลังจากล้างด้วย PBS 3 ครั้ง นำชิ้นส่วนไปแช่ในสารละลายสกัดกั้นซีรั่มแพะ 5 เปอร์เซ็นต์ (Invitrogen, Waltham, MA, USA) เป็นเวลา 10 นาที จากนั้น แอนติบอดีต่อต้าน PCNA ของกระต่ายหลัก (หมายเลขแคตตาล็อก: SY12-07, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) (1:50) ถูกนำมาใช้ ชิ้นส่วนถูกเก็บไว้ในห้องที่มีความชื้นที่อุณหภูมิ 4 ◦C ข้ามคืน และล้าง 3 ครั้งด้วย PBS ครั้งละ 5 นาที แอนติบอดีทุติยภูมิจากแพะที่มีฉลากไบโอติน (หมายเลขแคตตาล็อก: A16100, Invitrogen, Waltham, MA, USA) (1:500) ถูกทิ้งลงบนส่วนต่างๆ และเก็บไว้ที่ 37 ◦C เป็นเวลา 30 นาที Streptavidin peroxidase (Invitrogen, Waltham, MA, USA) ถูกปลูกฝังลงในส่วนและทิ้งไว้ 10 นาที หลังจากการล้าง 3 ครั้งด้วย PBS ชิ้นส่วนถูกแช่ใน 330 -ไดอะมิโนเบนซิดีน (DAB) โครโมเจน (สารตั้งต้น DAB 1 มล. บวกโครโมเจน DAB 30 µL) เป็นเวลา 5 นาที หลังจากล้างด้วยน้ำกลั่น ส่วนต่างๆ จะถูกย้อมด้วยสารละลายเฮมาทอกซิลินของเมเยอร์เพื่อการย้อมสีที่ตัดกัน จากนั้นติดตั้งส่วนต่างๆ ด้วยกลีเซอรอลเจลาตินของ Kaiser (หมายเลขแคตตาล็อก: 1.09242, Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) ชิ้นส่วนเหล่านี้ถูกตรวจสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง (A1 Axio Scope, Oberkochen, Zeiss, Germany) เพื่อกำหนดดัชนีการเพิ่มจำนวน จำนวนเซลล์ PCNA-positive ใน 20 หลอดในแต่ละส่วนถูกหารด้วยจำนวนเซลล์ทั้งหมด [32]

2.8. อิมมูโนฮิสโตเคมีของ ZO-1 และ Occludin

ส่วนเนื้อเยื่อคงที่ PFA ร้อยละ 4 ถูกลดพาราฟินและคืนสภาพด้วยสารละลายแอลกอฮอล์ จากนั้นแช่ส่วนต่างๆ ในสารละลายไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 3 เปอร์เซ็นต์ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) เป็นเวลา 20 นาทีเพื่อสกัดกั้นเอนไซม์ภายนอก หลังจากล้างด้วย PBS ส่วนต่างๆ จะถูกทำให้ร้อนในไมโครเวฟที่ 200 W ในบัฟเฟอร์ EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ชิ้นส่วนถูกทำให้เย็นเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง และเก็บไว้ 3 ครั้ง ครั้งละ 5 นาทีใน PBS ตามด้วย 10 นาทีในซีรั่มแพะบัฟเฟอร์ 10 เปอร์เซ็นต์ (Invitrogen, USA) ส่วนนี้ได้รับการรักษาด้วยสารต้าน ZO ของกระต่าย-1 (หมายเลขแคตตาล็อก: 61-7300, Invitrogen, Waltham, MA, USA) และสารต่อต้านการอุดตันของกระต่าย (1:100) (หมายเลขแค็ตตาล็อก: {{18} }, Invitrogen, Waltham, MA, USA) แอนติบอดี (ข้ามคืน ที่อุณหภูมิบวก 4 ◦C) หลังจากล้าง 3 ครั้งใน PBS เป็นเวลา 5 นาที แอนติบอดีทุติยภูมิที่มีฉลากไบโอติน (หมายเลขแคตตาล็อก: 65-6140, Invitrogen, Waltham, MA, USA) (1:1000) ถูกทิ้งลงบนส่วนต่างๆ หลังจากแช่ใน PBS 3 ครั้งและ 5 นาที สเตรปตาวิดิน-เปอร์ออกซิเดส (Invitrogen, Waltham, MA, USA) ถูกนำไปใช้กับส่วนต่างๆ หลังจากล้างใน PBS แล้ว AEC Single/Plus Chromogen (Abcam, Cambridge, UK) ถูกทิ้งลง และส่วนต่างๆ ถูกเขย่าด้วยน้ำกลั่นและติดตั้งด้วยกลีเซอรอลเจลาตินของ Kaiser (หมายเลขแคตตาล็อก: 1.09242, Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) ส่วนต่างๆ ถูกถ่ายภาพโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง (A1 Axio Scope, Oberkochen, Zeiss, Germany) ความเข้มของปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันของทั้ง ZO-1 และ occludin คำนวณโดยใช้โปรแกรม Image J (ซอฟต์แวร์ 1.44, National Institutes of Health)

2.9. ZO-1, Occludin และ NOX-2 การวิเคราะห์อิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์

ชิ้นส่วนถูกเก็บไว้ในไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 3 เปอร์เซ็นต์และล้างด้วย PBS จากนั้น ส่วนต่างๆ ถูกบ่มด้วยกระต่าย anti-ZO-1(1:100) ZO-1(หมายเลขแค็ตตาล็อก: 61-7300, Invitrogen, Waltham, MA, USA), กระต่าย anti occludin (1 :100) (หมายเลขแคตตาล็อก: 71-1500, Invitrogen, USA) และแอนติบอดีหลักที่ต้าน NOX ของกระต่าย-2 (1:100) (แค็ตตาล็อก: NBP2-41291, Novus, BioTechne, มินนิโซตา สหรัฐอเมริกา) สไลด์ถูกล้างด้วย PBS จากนั้นบ่มด้วย AF 488 (หมายเลขแค็ตตาล็อก: ab150077, Abcam, USA) ที่ติดป้ายแอนติบอดีทุติยภูมิของแพะ (1:1000) หลังจากที่ชิ้นส่วนถูกล้างด้วย PBS เป็นครั้งสุดท้าย พวกเขาถูกประกอบเข้าด้วยกันด้วยสารละลาย 406- diamino-2-phenyl idol (DAPI) (หมายเลขแค็ตตาล็อก: ab104139, Abcam, Boston, MA, USA) ส่วนนี้ถูกถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ (กล้องจุลทรรศน์ Zeiss Axio Scope.A1 พร้อมอุปกรณ์ต่อพ่วงเรืองแสง Zeiss AxioCam MRc 5) ความเข้มของการเรืองแสงในส่วนที่ถ่ายภาพคำนวณโดยใช้โปรแกรม Image J (ซอฟต์แวร์ Image J, National Institutes of Health)

2.10. การประมวลผลเนื้อเยื่อสำหรับกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน

ตัวอย่างเนื้อเยื่ออัณฑะได้รับการแก้ไขด้วยสารละลายกลูตาราลดีไฮด์ 2.5 เปอร์เซ็นต์แบบบัฟเฟอร์ (ใน 0.1 M PBS, pH 7.2) และประมวลผลสำหรับการเตรียมด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านตามปกติตามโปรโตคอลที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้ [32] วิเคราะห์ส่วนต่างๆ ภายใต้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (TALOS L 120 C, Thermo Scientific Fisher, Eindhoven, The Netherlands)

2.11. การวิเคราะห์ทางสถิติ

วิเคราะห์ข้อมูลด้วยการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวและการทดสอบเปรียบเทียบหลายรายการของ Tukey ด้วย p < 0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญ การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้ Graph Pad Prism 8.0 (San Diego, CA, USA)

Cistanche เพิ่มฮอร์โมนเพศชายอย่างไร?

Cistanche เป็นสมุนไพรที่ใช้ในการแพทย์แผนจีนเพื่อเพิ่มพลังงาน ความใคร่ และความมีชีวิตชีวาโดยรวม เป็นที่เชื่อกันว่า Cistanche อาจเพิ่มระดับฮอร์โมนเพศชายโดยการยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ที่เรียกว่าอะโรมาเตส ซึ่งจะแปลงฮอร์โมนเพศชายเป็นฮอร์โมนเอสโตรเจน Cistanche ยังพบว่าเพิ่มการผลิตฮอร์โมน luteinizing (LH) ในร่างกาย LH มีบทบาทสำคัญในการควบคุมการผลิตฮอร์โมนเพศชายในอัณฑะ โดยการเพิ่มระดับ LH, Cistanche อาจเพิ่มการผลิตฮอร์โมนเพศชายทางอ้อม นอกจากนี้ Cistanche ยังมีสารพฤกษเคมีหลายชนิด เช่น echinacoside และ acteoside ซึ่งมีคุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระ สารประกอบเหล่านี้อาจช่วยปกป้องอัณฑะและอวัยวะสืบพันธุ์อื่นๆ จากความเสียหายจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน ซึ่งจะช่วยปรับปรุงการทำงานและเพิ่มการผลิตฮอร์โมนเพศชาย โดยรวมแล้ว กลไกที่แน่นอนโดยที่ Cistanche เพิ่มระดับฮอร์โมนเทสโทสเตอโรนนั้นยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างสมบูรณ์ แต่น่าจะเป็นผลมาจากการยับยั้งอะโรมาเตส เพิ่มการผลิต LH และให้การสนับสนุนสารต้านอนุมูลอิสระแก่ระบบสืบพันธุ์

ยังมีต่อ...

Merve Acikel-Elmas 1,*, Salva Asma Algilani 1, Begum Sahin 1, Ozlem Bingol Ozakpinar 2, Mert Gecim 2, Kutay Koroglu 3 และ Serap Arbak 1

1 ภาควิชาจุลวิทยาและคัพภวิทยา, คณะแพทยศาสตร์, มหาวิทยาลัย Acibadem Mehmet Ali Aydinlar, Icerenkoy Mah., Kayisdagi Cad. เลขที่ 32 Atasehir อิสตันบูล 34752 ตุรกี

2 ภาควิชาชีวเคมี คณะเภสัชศาสตร์ Marmara University, Basibuyuk Yolu, 4/A, Basibuyuk, Istanbul 34854, Turkey

3 Department of Histology and Embryology, School of Medicine, Marmara University, Basibuyuk Yolu No. 9 D:2, Maltepe, Istanbul 34854, Turkey