ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและต้านการสร้างเม็ดสีของสารสกัดจากชะเอมที่ผ่านการอบชุบด้วยความร้อน (Wongam, Glycyrrhiza Glabra × G. Uralensis)

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

Min Hye Kang 1,2, Gwi Yeong Jang 1, Yun-Jeong Ji 1, Jeong Hoon Lee 1, Su Ji Choi 1, Tae Kyung Hyun 2,* และHyung Don Kim 1,*

เชิงนามธรรม:เมลานินเป็นเม็ดสีน้ำตาลหรือสีดำที่ช่วยปกป้องผิวจากรังสีอัลตราไวโอเลตและสปีชีส์ออกซิเจนปฏิกิริยา (ROS) อย่างไรก็ตาม การผลิตเมลานินที่มากเกินไปนั้นสัมพันธ์กับเลนทิจีน ฝ้า กระ และมะเร็งผิวหนังชะเอมได้แสดงให้เห็นว่าสารต้านอนุมูลอิสระ, ฤทธิ์ต้านเนื้องอก ต้านเกล็ดเลือด ต้านการอักเสบ และกระตุ้นภูมิคุ้มกัน และใช้เป็นการรักษาธรรมชาติสำหรับผิวไวท์เทนนิ่ง.เรามุ่งที่จะยืนยันศักยภาพของวงศ์อำ ชะเอมพันธุ์ใหม่ที่พัฒนาโดย RuralDevelopment Administration (RDA) เป็นไวท์เทนนิ่งตัวแทนในเครื่องสำอาง นอกจากนี้เรายังตรวจสอบผลของการให้ความร้อนต่อฤทธิ์ทางชีวภาพของชะเอมโดยการเปรียบเทียบสารต้านอนุมูลอิสระและต่อต้านการสร้างเม็ดสีกิจกรรมของสารสกัดจากชะเอมก่อนและหลังการให้ความร้อน (130 ◦C) สารสกัดชะเอมที่ผ่านความร้อน (WH-130) แสดงกิจกรรมการขจัดอนุมูลอิสระที่สูงขึ้นใน ABTS plus (2,20-azino-bis-(3-ethyl benzothiazoline-6-sulfonic กรด) เกลือไดแอมโมเนียม) และ DPPH (2,2-ไดฟีนิล-1-พิคริลไฮดราซิล) นอกจากนี้ WH-130 ยังยับยั้งการสร้างเม็ดสีได้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้นเนื่องจากการปรับลดไทโรซิเนสในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16F10melanoma มากกว่าการให้ความร้อนชะเอมสารสกัด. นอกจากนี้ การอบชุบด้วยความร้อนยังเพิ่มปริมาณฟีนอลิกรวม โดยเฉพาะอย่างยิ่ง isoliquiritigenin, anสารต้านอนุมูลอิสระและต่อต้านการสร้างเม็ดสีส่วนผสมของชะเอมที่ผลิตโดยกรรมวิธีทางความร้อน โดยสรุป WH-130 ซึ่งมีฟีนอลิกที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพเพิ่มขึ้น เช่น ไอโซลิควิริติจีนิน มีศักยภาพในการพัฒนาเป็นผิวหนังใหม่ไวท์เทนนิ่งวัสดุที่ใช้กับเครื่องสำอาง

คำสำคัญ: ต่อต้านการสร้างเม็ดสีกิจกรรม; การรักษาความร้อนชะเอม; เซลล์มะเร็งผิวหนังของหนู (B16F10)

Cistanche เป็นสารต้านอนุมูลอิสระ

1. บทนำ

ชะเอม(สายพันธุ์ Glycyrrhiza) เป็นสมุนไพรยืนต้นที่มีสรรพคุณทางยาในวงศ์ Leguminosae มีการแพร่กระจายไปทั่วเอเชียกลาง จีน รัสเซีย แมนจูเรีย มองโกเลีย และยุโรป [1] ใช้เป็นสารแต่งกลิ่นรสและสารให้ความหวานมานานแล้ว รากแห้งและสโตลอนของชะเอมเทศถูกนำมาใช้รักษาโรคหวัด ไอ หอบหืด อ่อนเพลีย และติดเชื้อในทางเดินหายใจ เนื่องจากฤทธิ์ทางชีวภาพของชะเอม ได้แก่สารต้านอนุมูลอิสระ,ต้านจุลชีพ, ต้านเนื้องอก, ต้านเกล็ดเลือด, ฤทธิ์ต้านการอักเสบและภูมิคุ้มกัน [2,3] สกุล Glycyrrhiza ประกอบด้วยชะเอมประมาณ 22 สายพันธุ์ ได้แก่ G. uralensisFisch, G. glabra L. และ G. inflata Batal

Wongam ซึ่งเป็นพันธุ์ลูกผสมใหม่ของชะเอมเทศ ได้รับการพัฒนาโดย RuralDevelopment Administration เป็นลูกผสมของ Glycyrrhiza glabra x G. uralensis (G. korshinskiGrig) Wongam ให้ผลผลิตสูงและต้านทานโรคได้ดีกว่า G. uralensis มีการศึกษาเกี่ยวกับกิจกรรมทางชีววิทยาของ G. uralensis เป็นจำนวนมาก ในขณะที่การวิจัยที่มีอยู่เกี่ยวกับ Wongam ซึ่งเป็นพันธุ์ใหม่นั้น จำกัดเฉพาะกิจกรรมต่อต้านการแพ้ ดังนั้นจึงจำเป็นต้องตรวจสอบฤทธิ์ทางชีวภาพในวงกว้างของวงศ์งาม

ส่วนประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่สำคัญในชะเอมรากคือ flavonoids และ triterpene saponins รวมทั้ง liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritigenin (ISL) และ glycyrrhizin (หรือ glycyrrhizicacid) [4,5] ISL เป็นฟลาโวนอยด์ที่พบในชะเอมซึ่งแสดงฤทธิ์ทางเภสัชกรรมต่างๆ ได้แก่ ต่อต้านเกล็ดเลือด ต่อต้านการแพ้ ต่อต้านเนื้องอก ต้านการอักเสบและสารต้านอนุมูลอิสระกิจกรรม [6–8]. ISL เป็นผลิตภัณฑ์ไฮโดรไลซิสจาก isoliquiritin ในรากชะเอม มันสามารถยับยั้งการสร้างเม็ดสีผ่านการย่อยสลายของ microphthalmia-associated transcriptionfactor (MITF) โดยการกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณโปรตีนไคเนสที่ควบคุมสัญญาณภายนอกเซลล์ (ERK) ดังนั้น การเสื่อมสภาพของ MITF ยับยั้งการแสดงออกของยีน tyrosinase(TYR) และโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไทโรซิเนส (TRP-1 และ TRP-2) ในเซลล์ SK-MEL-2 [9,10].ISL สามารถยับยั้งการทำงานของโมโนและไดฟีโนเลสของ TYR ของเห็ด เช่นเดียวกับการสร้างธีมในเมลาโนไซต์ [11]

เมลานินซึ่งเป็นเม็ดสีหลักที่สร้างสีผิว ถูกสังเคราะห์ในเมลาโนไซต์ของผิวหนังและเก็บไว้ในออร์แกเนลล์ภายในเซลล์ที่เรียกว่าเมลาโนโซม [12] เม็ดสีเมลานินประกอบด้วยสองประเภท: ยูเมลานินสีน้ำตาลหรือสีดำ และฟีโอเมลานินสีแดงหรือสีเหลือง [12] การสร้างเม็ดสีสามารถเกิดขึ้นได้จากสิ่งเร้าภายนอก ซึ่งรวมถึงรังสีอัลตราไวโอเลต (UV) ชนิดออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา (ROS) และสารเคมี เช่น -ฮอร์โมนกระตุ้นเมลาโนไซต์ ( -MSH) และไอโซบิวทิลเมทิลแซนทีน (IBMX) ซึ่งยกระดับไซคลิก อะดีโนซีน โมโนฟอสเฟต (cAMP) เมลานินปกป้องผิวจากสิ่งเร้าเหล่านี้ ในขณะที่การผลิตมากเกินไปทำให้เกิดรอยดำที่ผิวหนัง ซึ่งอาจนำไปสู่โรคต่างๆ เช่น มะเร็งผิวหนัง [13–17] ผิวไวท์เทนนิ่งมีการใช้สารต่างๆ เช่น กรดโคจิก ไฮโดรควิโนน อาร์บูติน และกรดแอสคอร์บิก ซึ่งเป็นสารยับยั้ง TYR เพื่อรักษารอยดำในผลิตภัณฑ์เครื่องสำอางหลายชนิด [13,18] การสร้างเมลาโนเจเนซิสถูกควบคุมผ่านเส้นทางการส่งสัญญาณที่หลากหลาย และสัญญาณเหล่านี้เชื่อมโยงกับการปรับขึ้นของ MITF การเปิดใช้งาน MITF ส่งเสริมการแสดงออกของ TYR และ TRP (TRP-1, TRP-2) จากนั้น TYR จะเร่งปฏิกิริยาออกซิเดชันของ L-tyrosine ไปเป็น 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) ซึ่งต่อมาถูกออกซิไดซ์เป็น DOPAquinone TRP-2 เปลี่ยนโดปาโครมเป็น 5,6-ไดไฮดรอกซีอินโดล-2-กรดคาร์บอกซิลิก (DHICA)หรือ 56-ไดไฮดรอกซีอินโดล (DHI) สุดท้าย DHICA และ DHI ถูกออกซิไดซ์โดย TRP-1 ทำให้เกิดการสร้างเม็ดสี [19]

กระบวนการทางความร้อนส่งผลต่อคุณสมบัติทางเคมีกายภาพและชีวภาพของสารสกัดจากพืช พวกมันทำลายผนังเซลล์และแยกพันธะโควาเลนต์ ส่งผลให้เกิดการปลดปล่อยสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพ [20,21] การอบชุบด้วยความร้อนของผู้ผลิตเบียร์ใช้สารสกัดจากเมล็ดพืชที่สูงกว่า 130 ◦Cเพิ่มปริมาณฟีนอลิกทั้งหมด (TPC) และระดับฟลาโวนอยด์ทั้งหมด (TFC) โดยเพิ่มกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระที่สอดคล้องกัน [16,20,21] ความร้อนของเปลือกส้มสามารถนำไปสู่การปลดปล่อยสารประกอบฟีนอลิกและเพิ่มขึ้นสารต้านอนุมูลอิสระกิจกรรม [17].

เป้าหมายหลักของเราคือการยืนยันศักยภาพของวงศ์อำในฐานะที่เป็นผิวธรรมชาติไวท์เทนนิ่งวัสดุในเครื่องสำอาง นอกจากนี้ การศึกษานี้ยังมีวัตถุประสงค์เพื่อพิสูจน์ว่าการให้ความร้อนสามารถปรับปรุงฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและต่อต้านการสร้างเม็ดสีของชะเอม. เราตรวจสอบแล้วสารต้านอนุมูลอิสระกิจกรรมร่วมกับ TPC ของสารสกัดวงศ์อ่ำต่อต้านการสร้างเม็ดสีผลของสารสกัด Wongam ได้รับการตรวจสอบโดยฤทธิ์ยับยั้ง TYR และเซลล์เนื้องอกในเมลานินที่มีปริมาณเมลานิน

Cistanche เป็นธรรมชาติผิวไวท์เทนนิ่ง สมุนไพร

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. การเตรียมตัวอย่าง

ตัวอย่างถูกจัดเตรียมตามวิธีการที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ [22]ชะเอม(Wongam, Glycyrrhiza glabra x G. uralensis, ระบุโดย Yun Ji Lee จาก NIHHS, RDA และจดทะเบียนใน Korea Medicinal Resources Herbarium ที่มีหมายเลขบัตรกำนัล MPS006326) ได้รับการปลูกฝังและเก็บเกี่ยวที่ Department of Herbal Crop Research (Eumsung, Chungcheongbuk-do, Korea ) ในปี 2018 และทำให้แห้งที่ 60 ◦C เป็นเวลา 20 ชั่วโมง 10 กก.ชะเอมล้างแล้วและบด 1 กก. หลังจากผสมแล้ว จะได้ตัวอย่าง WC หรือ WH 3 ตัวอย่าง ตามลำดับ ชะเอมบด (5 กรัม) ถูกวางในภาชนะแก้วที่มีน้ำกลั่น 1 มล. และบำบัดในหม้อนึ่งความดัน (จิซิโก โซล ประเทศเกาหลี) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 130 ◦C (WH-130) ชะเอมควบคุมที่ไม่ผ่านการบำบัด (WC , 5 กรัม) และ WH-130 แยกกันโดยใช้เอทานอล 70 เปอร์เซ็นต์ (ตัวอย่าง: ตัวทำละลาย, 1:50, v:v) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง (RT) หลังจากการกรอง สารสกัดถูกระเหยภายใต้สุญญากาศ แห้งเยือกแข็ง และเก็บไว้ที่ −80 ◦C สารสกัดทั้งหมดถูกละลายในไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO) (Sigma, St. Louis, MO, USA) และเมทานอล (Sigma, St. Louis, MO, USA)

2.2. ความมุ่งมั่นของบราวนิ่ง

ดัชนีสีน้ำตาลของชะเอมสารสกัด (WC และ WH-130) ถูกบันทึกโดยอิงตามค่าการดูดกลืนแสงที่ 420 นาโนเมตร (A420) ที่วัดโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท (BioTek,Winooski, VT, USA) ค่าการดูดกลืนแสงที่สูงขึ้นที่ 420 นาโนเมตรสอดคล้องกับดัชนีสีน้ำตาลที่สูงขึ้น [23,24]

2.3. เนื้อหาฟีนอลิกทั้งหมด (TPC)

ตามวิธีการที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ [25] TPC ถูกวัดตามหลักการที่ว่ารีเอเจนต์ของ Folin–Ciocalteu ถูกลดขนาดให้เป็นโครโมฟอร์สีน้ำเงินที่ประกอบด้วยสารเชิงซ้อน แต่ละตัวอย่าง (10 ไมโครลิตร) ถูกผสมกับโซเดียมคาร์บอเนต 2 เปอร์เซ็นต์ (200 ไมโครลิตร) และจากนั้นรีเอเจนต์ของ Folin–Ciocalteu (10 ไมโครลิตร) ของผสมถูกกระตุ้นเป็นเวลา 30 นาทีที่ RT จากนั้น วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 750 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท (BioTek, Winooski, VT, USA) TPC คำนวณจากเส้นโค้งมาตรฐานของกรดแกลลิกและผลลัพธ์ถูกแสดงเป็นค่าเทียบเท่ากรดแกลลิก, mg GAE g−1extract

2.4. การกำหนดความจุของสารต้านอนุมูลอิสระ

แอคทิวิตีกำจัดอนุมูลอิสระถูกวัดโดยใช้ 2,20-azino-bis-(3-เอทิลเบนโซไทอะโซลิน 6-กรดซัลโฟนิก) ไดแอมโมเนียมเกลือ (ABTS) ตามวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยมีการดัดแปลงเล็กน้อย [19, 26]. สารละลายไอออนบวกของ ABTS ผลิตโดยผสมโพแทสเซียมเปอร์ซัลเฟต 2.6 mM และ ABTS 7.4 mM และปล่อยให้ทำปฏิกิริยาเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ RT สารละลาย ABTS ถูกเจือจางด้วยน้ำกลั่นเพื่อปรับการดูดกลืนแสงให้อยู่ในช่วง 1.000–1.500 ต่อมา 20 ไมโครลิตรของตัวอย่างถูกทำปฏิกิริยากับ 180 ไมโครลิตรของ ABTS บวกกับสารละลาย ถูกป้องกันจากแสง และของผสมของตัวอย่างและสารละลายถูกบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่ RT วัดค่าการดูดกลืนโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท (BioTek, Winooski, VT, USA) ที่ 735 นาโนเมตร จากเส้นโค้งมาตรฐานของ Trolox ค่าของ Trolox เทียบเท่าสารต้านอนุมูลอิสระความจุ (TEAC) คำนวณและแสดงเป็นมิลลิกรัมของเทียบเท่าโทรลอกซ์ (TE) ต่อกรัมของตัวอย่างแห้ง

2,2-ไดฟีนิล-1-สารละลายหัวรุนแรงพิคริลไฮดราซิล (DPPH) ถูกเตรียมโดยการละลาย0.2 มิลลิโมลาร์ DPPH ลงในเอทานอล 99 เปอร์เซ็นต์ สารละลาย DPPH ถูกเจือจางด้วยน้ำกลั่นเพื่อดูดซับที่ 520 นาโนเมตรที่ 1,000–1500 จากนั้น 50 ไมโครลิตรของตัวอย่างถูกผสมกับสารละลาย DPPH 200 ไมโครลิตรและทำปฏิกิริยาเป็นเวลา 30 นาทีที่ RT หลังจากปฏิกิริยา ค่าการดูดกลืนแสงของของผสมถูกกำหนดหาที่ 520 นาโนเมตร จากกราฟมาตรฐาน Trolox คำนวณ TEAC และแสดงเป็น mg TE ต่อ g ของตัวอย่างแห้ง

2.5. การวิเคราะห์โครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง (HPLC)

ใช้วิธี HPLC ที่ถูกดัดแปลง [22] เนื้อหา ISL ของชะเอมแยกวิเคราะห์โดย HPLC ด้วยเครื่องตรวจจับแสงยูวี (HPLC: 1200 series, Agilent Technologies,Santa Clara, CA, USA; คอลัมน์: SynergiTM, 250 × 4.6 mm, 4 µm, Fusion-RP 8{{40}} Å, Phenomenex, Torrance, CA, USA) เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยตัวทำละลาย A (0.1 เปอร์เซ็นต์ของน้ำฟอร์มิกแอซิดิน) และตัวทำละลาย B (0.1 เปอร์เซ็นต์ของกรดฟอร์มิกในอะซีโตไนไทรล์) โปรแกรมเกรเดียนต์สำหรับเฟสเคลื่อนที่ได้ดำเนินการภายใต้เกรเดียนต์ต่อไปนี้: 0–8 นาที (20–20 เปอร์เซ็นต์ B), 8–30 นาที(20–38 เปอร์เซ็นต์ B), 30–42 นาที (38–50 เปอร์เซ็นต์) B), 42–47 นาที (50–90 เปอร์เซ็นต์ B), 47–53 นาที (90–90 เปอร์เซ็นต์ B), 53–54 นาที (90–20 เปอร์เซ็นต์ B) และ 54–60 นาที (20–20 เปอร์เซ็นต์ B) . อัตราการไหล ความยาวคลื่นที่ตรวจจับ และปริมาตรการฉีดถูกตั้งค่าเป็น 1.0 มล./นาที, 360 นาโนเมตร และ 10 ไมโครลิตรตามลำดับ สารละลายมาตรฐาน ISL ถูกวิเคราะห์ด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันสี่ระดับ (0.05, 0.1, 0.2, 0.4 มก./มล.) เส้นโค้งการปรับเทียบ (y=ขวานบวก b) ใช้เพื่อกำหนดเนื้อหาของ ISL ในสมการถดถอย หมายถึงความเข้มข้นของ ISL (mg mL-1) และ y หมายถึงพื้นที่พีค

2.6. การทดสอบกิจกรรมการยับยั้งไทโรซิเนสของเห็ด

การทดสอบฤทธิ์ยับยั้ง TYR ดำเนินการโดยใช้ชุดตรวจคัดกรองสารยับยั้ง TYR (BioVision, Milpitas, CA, USA) สารสกัดแต่ละชนิด (WC และ WH-130) ถูกละลายใน DMSO จนถึงความเข้มข้นสุดท้ายที่ 250 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร กรดโคจิกที่ใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวกยังถูกเจือจางจนถึง 250 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรใน DMSO โดยสังเขป 20 ไมโครลิตรของสารสกัดหรือกรดโคจิกถูกรวมเข้ากับสารละลายเอนไซม์ TYR 50 ไมโครลิตร หลังจากการบ่มที่ RT เป็นเวลา 10 นาที, 30 ไมโครลิตรของสารละลายซับสเตรต TYR ถูกเติมในแต่ละหลุม ความเข้มข้นสุดท้ายของสารสกัดและกรดโคจิกเท่ากับ50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร จากนั้นวัดความหนาแน่นของแสงของหลุมที่ 510 นาโนเมตรในโหมดจลนศาสตร์เป็นเวลา 1 ชั่วโมงด้วยเครื่องอ่านไมโครเพลท (BioTek, Winooski, VT, USA)

ผง cistanche: ป้องกันการเกิดออกซิเดชัน

2.7. การเพาะเลี้ยงเซลล์

เซลล์มะเร็งผิวหนังชนิดเมลาโนมา B16F10 ได้มาจาก American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) เซลล์ B16F10 ได้รับการเพาะเลี้ยงในตัวกลางของ Dulbecco ดัดแปลง (DMEM) ที่เสริมด้วยซีรัมของทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ (FBS), 100 หน่วย/มล. เพนิซิลลินและ 100 ไมโครกรัม/มล. ของสเตรปโตมัยซิน (Gibco, Grand Island, NY, USA) ในบรรยากาศที่มีความชื้นซึ่งมี 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 ที่ 37 ◦C

2.8. การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์

ความเป็นพิษต่อเซลล์ของชะเอมสารสกัด (WC และ WH-130) ถึงเซลล์ B16F10 ถูกกำหนดหาโดยใช้ MTT [3-(4,5-ไดเมทิลไทอะซอล-2-อิล)-2,{{8 }}diphenyltetrazolium bromide] assay.B16F10 เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงที่ 4 × 103 เซลล์/หลุมในจาน 96-หลุมเป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากนั้น สารสกัดถูกเติมไปยังเซลล์ที่ความเข้มข้น 50, 100 และ 200 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรและบ่มที่ 37 ◦ซ เป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้น สารละลาย MTT ถูกเติมในแต่ละหลุม (500 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) และเพลตถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37 ◦C ตัวกลางในแต่ละหลุมถูกทิ้งและ 100 ไมโครลิตรของ DMSO ถูกเติม หลังจากเขย่าเป็นเวลา 30 นาที วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 540 นาโนเมตรด้วยเครื่องอ่านไมโครเพลท การทดสอบทั้งหมดดำเนินการเป็นสามเท่า

2.9. การวัดปริมาณเมลานินของเซลล์

ปริมาณเมลานินภายในเซลล์ถูกวัดโดยใช้อะเมธอดรุ่นที่แก้ไขเล็กน้อยที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [27] เซลล์เมลาโนมา B16F10 ถูกเพาะในเพลตเพลต 6-หลุมที่มีความหนาแน่น 8 × 104 เซลล์/หลุมและบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ถูกเปิดเผยต่อสารสกัด (WC และ WH-130, 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร), กรดโคจิก (100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) หรือ ISL (10 ไมโครโมลาร์, มิลลิพอร์ ซิกมา, เบอร์ลิงตัน, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา) เป็นเวลา 48 ชั่วโมงใน การมีอยู่ของ 100 ไมโครโมลาร์ 3-ไอโซบิวทิล-1-เมทิลแซนทีน (IBMX) หลังการบำบัด เซลล์ถูกล้างด้วยน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (DPBS) ของ Dulbecco และละลายใน 200 ไมโครลิตรของ 1 N NaOH เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 90 ◦C วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 405 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท

2.10. การทดสอบกิจกรรมเซลล์ไทโรซิเนส

กิจกรรม TYR ภายในเซลล์ถูกวัดโดยใช้รุ่นที่แก้ไขเล็กน้อยของวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [27] เซลล์เมลาโนมา B16F10 (8 × 104 เซลล์/หลุม) ถูกบำบัดด้วยสารสกัด (100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) หรือกรดโคจิก (100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ต่อหน้า 100 ไมโครโมลาร์ IBMX เป็นเวลา 48 ชั่วโมง รวบรวมและล้างด้วย DPBS ตัวอย่างโปรตีนถูกสลายใน 1 เปอร์เซ็นต์ TrionX-100 (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) ด้วยโซเดียม ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 6.8) แล้วหมุนเหวี่ยงที่ 15,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 10 นาที เก็บเศษส่วนเหนือตะกอนและความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดหาโดยใช้ชุดทดสอบกรดบิซินโชนินิก (BCA) (วอลแทม, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา) ของผสมของปฏิกิริยาที่ประกอบด้วยโปรตีน 30 ไมโครกรัม (ปรับเป็น 100 ไมโครลิตรด้วย 1 เปอร์เซ็นต์ Trion X-100) และ 100 ไมโครลิตรของ 10 มิลลิโมลาร์ L-DOPA ถูกเติมลงในแต่ละหลุมของแผ่นหลุม 96-หลุม หลังจากการฟักไข่ที่ 37 ◦C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง โดปาโครมถูกเฝ้าติดตามโดยการวัดการดูดซับที่ 490 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท กิจกรรม TYR คำนวณด้วยสูตรต่อไปนี้:

กิจกรรมของไทโรซิเนส ( เปอร์เซ็นต์ )=(OD405 ของตัวอย่าง/OD405 ของตัวควบคุม) × 100

2.11. ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบเรียลไทม์ (RT-PCR)

ระดับการแสดงออกของ mRNA ของยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสีซึ่งรวมถึง MITF, TYR,TRP-1 และ TRP-2 ถูกกำหนดหาโดยใช้การสอบวิเคราะห์ RT-PCR ที่ดัดแปลง [28] โดยย่อ B16F10 เซลล์ถูกเพาะในเพลต 6-หลุมที่ความหนาแน่น 8 × 104 เซลล์ต่อหลุมและเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้น เซลล์ถูกบำบัดด้วยสารสกัด (100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร), กรดโคจิก (100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) หรือ ISL(10 ไมโครโมลาร์) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง แยกอาร์เอ็นเอทั้งหมดออกจากเซลล์โดยใช้รีเอเจนต์ TRIzol (Ambion,Austin, TX, USA) จากนั้นจึงหาปริมาณความเข้มข้นของ RNA โดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท หลังจากเตรียม cDNA (2 µg) โดยใช้ Reverse Transcriptase Premix Kit (ElpisBiotech, Daejeon, Korea) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต PCR แบบเรียลไทม์ดำเนินการโดยใช้ MITF, TYR, TRP-1, TRP-2 และไพรเมอร์ -actin (ตารางที่ 1, Bioneer, Daejeon, Korea) พร้อมชุดสีเขียว SYBR (ProGEN, Heidelberg, Germany) ในเครื่องมือ PCR แบบเรียลไทม์ CFX96 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ข้อมูลทั้งหมดถูกทำให้เป็นมาตรฐานจนถึงระดับของ -actinmRNA ในฐานะยีนการดูแลทำความสะอาดอ้างอิง

2.12. การเตรียมเซลล์ไลเสตและการวิเคราะห์ Western Blot

เซลล์ B16F10 ถูกเพาะในเพลต 6-หลุมที่ความหนาแน่น 8 × 104 เซลล์ต่อหลุม บ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมงและสัมผัสกับสารสกัด (100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร), กรดโคจิก (100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ) หรือ ISL(10 µM) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง หลังจากล้างด้วย DPBS เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวและสลายในบัฟเฟอร์ Triton X-100 (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) ที่มีโปรตีเอส 1 เปอร์เซ็นต์และค็อกเทลสารยับยั้งฟอสฟาเตส ความเข้มข้นของโปรตีนของไลเซตทั้งเซลล์ถูกวัดโดยใช้ชุดทดสอบ aBCA (วอลแทม, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา) ปริมาณโปรตีนที่เท่ากัน (20 ไมโครกรัม) ถูกโหลดลงบนเจลโซเดียม โดเดซิล ซัลเฟต-โพลีอะคริลาไมด์ 10 เปอร์เซ็นต์ ซึ่งทำงานเป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่ 70 โวลต์ จากนั้น โปรตีนจะถูกถ่ายโอนไปยังเมมเบรนโพลีไวนิลลิดีนฟลูออไรด์ (PVDF) เมมเบรนถูกล้างสามครั้งด้วยน้ำเกลือ Tris-buffered [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl] ที่มี 0.1 เปอร์เซ็นต์ Tween 20 (TBST) และปิดกั้นด้วย 2 เปอร์เซ็นต์ bovine serum albumin (GenDEPOT) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ต่อมา เยื่อหุ้มถูกบ่มข้ามคืนที่ 4 ◦C ด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิ(เจือจาง 1:1000) เป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง MITF, TYR, TRP-1, TPR-2 และ -actin ถูกตรวจพบด้วยแอนติบอดีโพลีโคลนัลแอนติ-MITF ของกระต่าย (Abcam, Cambridge, UK); แอนติบอดีต่อต้าน TYR แพะโพลีโคลนอล (ซานตาครูซ, ดัลลัส, เท็กซัส, สหรัฐอเมริกา); และโมโนโคลนัล antiTRP ของหนูเมาส์-1, แอนติ-TRP-2 และแอนติบอดีต้าน- -แอคตินแอนติบอดี (ซานตาครูซ, ดัลลาส, เท็กซัส, สหรัฐอเมริกา) ตามลำดับ หลังจากนั้นเยื่อจะถูกล้างหลายครั้งด้วย TBST และฟักด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิ (เจือจาง 1:2000) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ได้แก่ IgG ที่ต่อต้านเมาส์ของกระต่าย, IgG ที่ต่อต้านหนูของเมาส์และ IgG ที่ต่อต้านเมาส์ของแพะ (ซานตาครูซ ดัลลาส รัฐเท็กซัส สหรัฐอเมริกา) ตามด้วยการล้างหลายครั้งด้วย TBST ตรวจพบโปรตีนเป้าหมายโดยใช้รีเอเจนต์เคมีลูมิเนสเซนซ์ที่ได้รับการปรับปรุง (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) กับ ChemiDoc Imaging System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) การหาปริมาณแถบโปรตีนดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ (เวอร์ชัน 1.52a สำหรับ Windows; NIH, Rockville, MD, USA) [28]

2.13. การวิเคราะห์ทางสถิติ วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ Microsoft Excel 2016 และผลการทดลองทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) ของการวัดอิสระสามค่า การทดสอบ t สองตัวอย่างของนักเรียนใช้เพื่อประเมินความแตกต่างระหว่างกลุ่มควบคุมและกลุ่มตัวอย่าง การวิเคราะห์ทางเดียวของความแปรปรวน (ANOVA) และการทดสอบ Duncan ดำเนินการโดยใช้ Rsoftware (เวอร์ชัน 3.6.3) เพื่อกำหนดความสำคัญของการเปรียบเทียบแต่ละรายการที่ ระดับของ p < 0.05="" (*),="" p="">< 0.01="" (**)="" และ="" p="">< 0.001="" (***)="" วิเคราะห์สหสัมพันธ์โดยใช้="" prism5.02="" (ซอฟต์แวร์="" graphpad,="" ซานดิเอโก,="" แคลิฟอร์เนีย,="">

3. ผลลัพธ์

3.1. ดัชนีบราวนิ่งของสารสกัดจากชะเอมเทศ

ระดับของการเกิดสีน้ำตาลของชะเอมสารสกัดแสดงในรูปที่ 1a ผลลัพธ์เหล่านี้ยืนยันว่าสารสกัดที่ผ่านการอบด้วยความร้อน (WH-130, 0.965 ± 0.025 AU [หน่วยการดูดซับ]) มีค่าดัชนีการเกิดสีน้ำตาลสูงกว่าที่ไม่ผ่านการให้ความร้อนมาก สารสกัด (WC, 0.758 ± 0.005 AU) เราคาดว่าการประมวลผลด้วยความร้อนจะเพิ่มการสร้างเมลาโนดินใน WH-130 และการเปลี่ยนแปลงนี้อาจเชื่อมโยงกับกิจกรรมทางชีวภาพต่างๆ

3.2. ปริมาณฟีนอลิกทั้งหมด (TPC) ของสารสกัดจากชะเอมเทศ

รูปที่ 1b แสดง TPC ของชะเอมสารสกัด เราพบความแตกต่างใน TPC ระหว่าง WC และ WH{{0}} เนื่องจาก WC มี TPC เท่ากับ 12093 ± 0.061 มก. GAE/g สารสกัด ในขณะที่ WH-130มี TPC ที่ 14.098 ± 0.781 มก. GAE/g สารสกัด การอบชุบด้วยความร้อนช่วยเพิ่ม TPC ของสารสกัดจากชะเอมเทศ

3.3. ฤทธิ์ขจัดรากของสารสกัดจากชะเอมเทศ

ดิสารต้านอนุมูลอิสระกิจกรรมของชะเอมสารสกัดถูกนำเสนอในรูปที่ 1c,d. ABTS บวกความสามารถในการกำจัดอนุมูลอิสระสำหรับสารสกัด WH-130 (6.086 ± 0.304 มก. TEAC/gextract) สูงกว่าสารสกัด WC (3.542 ± 0.093 มก. สารสกัด TEAC/g) ในการสอบวิเคราะห์ DPPH มีการสังเกตแนวโน้มที่คล้ายคลึงกัน สารสกัด WH-130 (7.442 ± 0.292 มก. TEAC/g สารสกัด) แสดงกิจกรรมการกำจัดอนุมูล DPPH ที่มากกว่าสารสกัด WC (4.033 ± 0.160 มก. TEAC/gextract) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าการให้ความร้อนสามารถเพิ่มฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดได้

3.4. ปริมาณ Isoliquiritigenin ของสารสกัดจากชะเอมเทศ

ผลการศึกษาพบว่า ปริมาณ ISL ของ WC เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดหลังการอบชุบ (ตารางที่ 2 รูปที่ 2) บ่งชี้ว่าการแปรรูปด้วยความร้อนสามารถส่งผลต่อเนื้อหาของสิ่งนี้สารต้านอนุมูลอิสระและต่อต้านการสร้างเม็ดสีสารประกอบ.

ซิสทานเช ทูโบโลซ่า

3.5. ความมีชีวิตของเซลล์

ดังแสดงในรูปที่ 3ชะเอมสารสกัดไม่ส่งผลต่อความมีชีวิตของเซลล์ที่ 50 หรือ 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรเทียบกับกลุ่มควบคุมที่บำบัดด้วย IBMX ในการรักษา 50 และ 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรของสารสกัดทั้งหมด ความมีชีวิตของเซลล์ยังคงมากกว่า 100 เปอร์เซ็นต์ ดังนั้น การทดลองเพิ่มเติมถูกดำเนินการโดยใช้ความเข้มข้นของสารสกัดจากชะเอมสูงถึง 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร

3.6. ผลของสารสกัดชะเอมต่อการผลิตเมลานินในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16F10 Melanoma

ปริมาณการสร้างสีและเมลานินของเซลล์ B16F10 แสดงในรูปที่ 4a,b.เนื้อหาเมลานินของเซลล์ B16F10 เพิ่มขึ้นถึง 3.4-เท่าด้วยการบำบัดด้วย IBMX ที่สัมพันธ์กับกลุ่มควบคุมที่ไม่ได้รับการรักษา WC และ WH-130 แสดงปริมาณการสร้างเม็ดสีและเมลานินที่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มที่บำบัดด้วย IBMX (รูปที่ 4a,b) ทั้ง WC และWH{{10}} มีปริมาณเมลานินต่ำกว่าเซลล์ที่บำบัดด้วย KA ผลการยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินในเซลล์ B16F10 ที่บำบัดด้วย WH-130 มีค่ามากกว่า WC ปริมาณของเมลานินที่มีอยู่หลังการบำบัดด้วย WC 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรและ WH-130 ลดลงเหลือประมาณ 0 59-เท่าและ 0 51-เท่าตามลำดับของระดับที่บำบัดด้วย IBMX group.ISL (10 µM) และ KA (100 µg/mL) ยับยั้งการผลิตเมลานินเป็น 0.59-เท่าและ 0.67-เท่า ตามลำดับระดับในเซลล์ที่บำบัดด้วย IBMX

ผลลัพธ์นี้แสดงว่าผ่านการอบชุบด้วยความร้อนชะเอมสารสกัด (WH-130) สามารถยับยั้งการผลิตเมลานินได้อย่างมีประสิทธิภาพมากกว่าสารสกัดที่ไม่ผ่านความร้อน (WC) นอกจากนี้ เราสังเกตว่าการรักษาด้วยสารสกัด WH-130 ที่ 25, 50 และ 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (รูปที่ 4c) ส่งผลให้ปริมาณเมลานินของเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16F10 ลดลงตามความเข้มข้น เมื่อรวมกันแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการให้ความร้อนช่วยปรับปรุงต่อต้านการสร้างเม็ดสีกิจกรรมของสารสกัดจากชะเอม

3.7. ผลของสารสกัดจากชะเอมต่อกิจกรรมไทโรซิเนส

3.7.1. กิจกรรมเห็ดไทโรซิเนส

ผลกระทบของชะเอมสารสกัดในกิจกรรม TYR ของเห็ดแสดงไว้ในรูปที่ 5a เรายืนยันว่าผลของสารสกัด (WC และ WH-130) ต่อการเกิดออกซิเดชันของสารตั้งต้นโดยเห็ด TYR เกิดขึ้นในสภาวะที่ปราศจากเซลล์ ที่ 50 ไมโครกรัม/มล. สารสกัด WC ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ถึง 81.33 เปอร์เซ็นต์ ในขณะที่ WH-130 ยับยั้งการทำงานของ TYR เป็น 65.95 เปอร์เซ็นต์ของ EClevel ในขณะเดียวกัน กรดโคจิก (KA) ซึ่งเป็นตัวยับยั้ง TYR ทำให้เกิดการยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ถึง 47.09 เปอร์เซ็นต์ของระดับ EC การยับยั้งการออกฤทธิ์ของ TYR ในชะเอมที่ผ่านความร้อน (WH-130) นั้นมากกว่าในชะเอมที่ไม่ผ่านการให้ความร้อน (WC)

3.7.2. กิจกรรมเซลล์ไทโรซิเนส

ดังที่แสดงในรูปที่ 5b กิจกรรม TYR ของเซลล์ที่บำบัดด้วย IBMX เพิ่มขึ้นเป็น 233 เปอร์เซ็นต์ เทียบกับกลุ่มควบคุมที่ไม่ได้รับการรักษา (100 เปอร์เซ็นต์ ) WC ลดกิจกรรม TYR เป็น 82.17 เปอร์เซ็นต์ เมื่อเทียบกับกลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย IBMX สารสกัด WH-130 ยับยั้งการทำงานของ TYR ของเซลล์ถึง 59.88 เปอร์เซ็นต์เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ที่ได้รับการรักษาด้วย IBMX KA ลดกิจกรรม TYR ของเซลลูลาร์ลงเหลือ 74.07 เปอร์เซ็นต์ของระดับในเซลล์ที่บำบัดด้วย IBMX ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าสารสกัดจากชะเอม (WC และ WH-130) ยับยั้งการทำงานของ TYR และ WH-130 มีฤทธิ์ในการยับยั้ง TYR มากกว่า WC และ KA

ต่อไป เราตรวจสอบความสัมพันธ์ระหว่างเนื้อหา TPC, ISLสารต้านอนุมูลอิสระกิจกรรมและกิจกรรมต่อต้านการสร้างเม็ดสี (ตารางที่ 3) TPC มีความสัมพันธ์เชิงบวกกับเนื้อหา ISL (0.827) เช่นเดียวกับกิจกรรมการกำจัดอนุมูล ABTS plus และ DPPH (0.886 และ 0.896 ตามลำดับ) ในขณะที่ TPC มีความสัมพันธ์ผกผันกับปริมาณเมลานิน (–0.859) เนื้อหา ISL มีความสัมพันธ์เชิงบวกกับกิจกรรมการกำจัดอนุมูลอิสระของ ABTS plus และ DPPH (0.977 และ 0.985 ตามลำดับ) ในขณะที่เนื้อหา ISL มีความสัมพันธ์แบบผกผันกับ TYRactivity (–0 834) และเนื้อหาเมลานิน (–0.995) ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ (ABTS plus และ DPPH) มีความสัมพันธ์แบบผกผันกับกิจกรรม TYR (–{{20}}.879 และ –0.856 ตามลำดับ) และปริมาณเมลานิน (–0 974 และ –0.984 ตามลำดับ) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าสารประกอบฟีนอลิกเช่น ISL ในชะเอมมีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับสารต้านอนุมูลอิสระและต่อต้านการสร้างเม็ดสีกิจกรรมของสารสกัดจากชะเอม

3.8. ผลของสารสกัดจากชะเอมเทศต่อการแสดงออกของ mRNA ของยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสี

เราตรวจสอบการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสีในเซลล์ B16F10 เพื่ออธิบายผลกระทบของสารสกัดจากชะเอมต่อการสร้างเม็ดสี ทั้ง WC และ WH-130 ระงับการแสดงออกของ mRNA ของ MITF, TYR, TRP-1 และ TRP-2 (รูปที่ 6) WC ยับยั้งการแสดงออกของ mRNA ของ MITF, TYR, TRP-1 และ TRP-2 ถึงระดับ 0.{{10}}เท่า, 0.{ {12}}พับ 0.71-พับ และ 0.65-เท่า ตามลำดับ ของสิ่งเหล่านั้นในเซลล์ที่บำบัดด้วย IBMX WH-130 ยับยั้งการแสดงออกของ mRNA ของ MITF, TYR, TRP-1 และ TRP{{20}} ถึง 0.43-เท่า, {{33 }}.60-เท่า, 0.62-เท่า และ 0.49-เท่า ตามลำดับ ของระดับกลุ่มที่บำบัดด้วย IBMX สารสกัด WH{{30}} มีฤทธิ์ยับยั้งการแสดงออกของ mRNA ได้ดีกว่าสารสกัด WC ISL ยังระงับการแสดงออกของ MITF, TYR, TRP-1 และ TRP-2 (0.42-เท่า, 0.59-เท่า, 0.68-เท่า และ 0.44-เท่า ตามลำดับ สัมพันธ์กับเซลล์ที่บำบัดด้วย IBMX) ในกลุ่มที่บำบัดด้วย WH-130- ขอบเขตของการแสดงออกของ mRNA ที่ลดลงของยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเมลาโนเจเนซิสนั้นมากกว่าในกลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย WC ซึ่งบ่งชี้ว่าชะเอมสารสกัดยับยั้งการสร้างเมลาโนเจเนซิสผ่านการยับยั้งการถอดรหัสยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสีและการให้ความร้อนช่วยปรับปรุงต่อต้านการสร้างเม็ดสีกิจกรรมของสารสกัดจากชะเอม

3.9. ผลของสารสกัดชะเอมต่อการแสดงออกของโปรตีนของยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสี

ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 7b การบำบัดด้วย WC และ WH-130 ลดระดับการแสดงออกของโปรตีนของ MITF, TYR, TRP-1 และ TRP-2 อย่างมีนัยสำคัญ ระดับการแสดงออกของ MITF, TYR,TRP-1 และ TRP-2 ถูกระงับในเซลล์ที่บำบัดด้วย WC (0.79-เท่า, 0.{{9 }}พับ {{10}}}.89-พับและ 0.67-เท่า ตามลำดับ สัมพันธ์กับเซลล์ที่บำบัดด้วย IBMX) WH-130 แสดงระดับการแสดงออกของโปรตีนที่ลดลงของ MITF, TYR, TRP-1 และ TRP-2 ({{20}}}.74-เท่า, {{24 }}.73-พับ 0.80-พับ และ {{30}}}.48-เท่า ตามลำดับ สัมพันธ์กับเซลล์ที่บำบัดด้วย IBMX) . ISL ลดระดับการแสดงออกของโปรตีนของ MITF, TYR และ TRP-2 (0.76-เท่า, 0.83-เท่าและ 0.41-เท่า ตามลำดับ สัมพันธ์กับที่บำบัดด้วย IBMX เซลล์). WH-130 ยับยั้งการแสดงออกของโปรตีนของยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสีได้รุนแรงกว่า WC แสดงให้เห็นว่าชะเอมสารสกัดยับยั้งการสร้างเมลาโนเจเนซิสด้วยการยับยั้งการแปลยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสีและการบำบัดด้วยความร้อนช่วยปรับปรุงต่อต้านการสร้างเม็ดสีกิจกรรมของสารสกัดจากชะเอม

แป้ง cistanche ผิวขาว

4. การอภิปราย

ผลการศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าการอบชุบด้วยความร้อนของชะเอมส่งผลต่อ TPC ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ และต่อต้านการสร้างเม็ดสีกิจกรรม. WH-130 มีดัชนีการเกิดสีน้ำตาลและค่า TPC ที่สูงกว่า WC สภาพการประมวลผล รวมทั้งอุณหภูมิและความดัน ส่งผลต่อองค์ประกอบของตัวอย่าง [29]. การให้ความร้อนสามารถส่งเสริมปฏิกิริยา Maillard ซึ่งเชื่อมโยงกับการผลิตเมลานอยด์ [23] เมลานอยด์มีผลทางชีวภาพบางอย่างรวมถึงสารต้านอนุมูลอิสระ, ฤทธิ์ต้านเนื้องอก และลดความดันโลหิต รวมทั้งการปรับระดับน้ำตาลในเลือด [30] สารประกอบเหล่านี้เป็นโมเลกุลขนาดใหญ่สีน้ำตาลโพลีเมอร์ที่เกิดขึ้นจากปฏิกิริยา Maillard จากอันตรกิริยาระหว่างน้ำตาลและกรดอะมิโนที่อุณหภูมิสูง [21] ดังนั้นยิ่งมีเมลานอยด์ในสารสกัดที่ให้ความร้อนมาก ดัชนีการเกิดสีน้ำตาลก็จะยิ่งสูงขึ้น สีของสารสกัดจากชะเอมที่ไม่ผ่านความร้อน (WC) มีสีน้ำตาลอ่อน แต่ค่อยๆ เข้มขึ้นด้วยอุณหภูมิสูง (130 องศา) กระบวนการให้ความร้อนยังสามารถทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงบางอย่างในโครงสร้างทางเคมีของสารประกอบฟีนอลิก และทำให้ผนังเซลล์ของพืชแตกตัว ปล่อยสารฟีนอล ซึ่งนำไปสู่กิจกรรมต้านอนุมูลอิสระ [31] ดังนั้นปริมาณฟีนอลิกของสารสกัดจากชะเอมจึงสามารถเพิ่มขึ้นได้ด้วยการอบชุบด้วยความร้อน [21] รายงานก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าการใช้ความร้อนของน้ำผึ้งช่วยเพิ่มการสร้างเมลาโนดิน และระดับของการเกิดสีน้ำตาลใกล้เคียงกับกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระที่เพิ่มขึ้น [24] ดังนั้น WH-130 จึงมีความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระที่สูงกว่า WC ในการทดสอบ ABTS plus และ DPPH radical-scavenging ซึ่งมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในการพิจารณาฤทธิ์ต้านการเกิดอนุมูลอิสระของตัวอย่างโดยพิจารณาจากความสามารถในการถ่ายโอนอิเล็กตรอนหรืออะตอมไฮโดรเจน [32]

ธรรมชาติที่พบบ่อยที่สุดสารต้านอนุมูลอิสระและสารต้านการสร้างเม็ดสีเป็นฟีนอล Tricin และ 9-กรดไฮดรอกซีออคทาเดคาดีโนอิกถูกระบุว่าเป็นฟีนอลหลักในข้าวฟ่างสองสี นอกจากนี้ ส่วนประกอบเหล่านี้ยังแสดงให้เห็นสารต้านอนุมูลอิสระและฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีโดยการยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนส [19] นอกจากนี้ กรด p-coumaric ซึ่งเป็นสารประกอบแอนแอกทีฟของ Sasa quelpaertensis Nakai ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าสารประกอบนี้ยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนสอย่างรุนแรงและลดการผลิตเมลานินในเซลล์มะเร็งผิวหนัง [27] จากการวิจัยก่อนหน้านี้ ISL ซึ่งเป็นสารประกอบฟลาโวนอยด์ที่รู้จักกันดีในผลิตภัณฑ์ไฮโดรไลซิสของรากชะเอมเทศ [6–8] แสดงฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและต่อต้านการสร้างเม็ดสีโดยการยับยั้งการทำงานของ TYR การขนส่งเมลาโนโซมและการเหนี่ยวนำการเสื่อมสภาพของเมลานิน [10,31] ดังนั้นเราจึงมุ่งเน้นไปที่เนื้อหา ISL ของสารสกัดและการกระทำของ ISL ในกลไกที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสี ISL ถูกใช้เป็นยารักษาโรคสำหรับโรคต่างๆ อันเนื่องมาจากกิจกรรมทางชีวภาพมากมาย รวมทั้งฤทธิ์ต้านการอักเสบ ต้านจุลชีพ สารต้านอนุมูลอิสระ ต้านมะเร็ง ภูมิคุ้มกัน ตับและหัวใจ [33] ในการศึกษานี้ เนื้อหา ISL ที่สูงขึ้นถูกวัดเป็น WH-130 มากกว่าในห้องสุขา รอยดำบนผิวหนังเกี่ยวข้องกับความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน มีรายงานว่าสารกำจัดอนุมูลอิสระมีบทบาทสำคัญในการปราบปรามรอยดำ [17,34] ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการอบชะเอมด้วยความร้อนสามารถปรับปรุงกิจกรรมการขจัดอนุมูลอิสระและต่อต้านการสร้างเม็ดสีกิจกรรมผ่านการเพิ่มระดับของสารต้านอนุมูลอิสระฟีนอลิกเช่น ISL ตามวรรณกรรมก่อนหน้านี้ มี glabrene, glabridin, glabrol, liquiritigenin ในชะเอม (Glycyrrhiza uralensis, G. glabra) ซึ่งแสดงการยับยั้งไทโรซิเนส ดังนั้น สารประกอบเหล่านี้อาจมีผลกระทบต่อฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสี [10,11,15,35] การศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับพวกเขามีความสำคัญในการอธิบายฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีของชะเอมเทศ

การสังเคราะห์เมลานินถูกควบคุมโดย TYR, TRP-1, TRP-2 (dopachrome tautomerase) และ MITF (รูปที่ 8) TYR ซึ่งเป็นไกลโคโปรตีนที่มีทองแดงทำหน้าที่เป็นตัวจำกัดอัตราและมีบทบาทสำคัญในการผลิตเมลานิน TYR เร่งปฏิกิริยาไฮดรอกซิเลชันของไทโรซีนเป็น 3,4-ไดไฮดรอกซีฟีนิลอะลานีน (DOPA) TYR ยังกระตุ้นการเกิดออกซิเดชันของ DOPA เป็น dopaquinone และการเปลี่ยน dopaquinone เป็น dopachrome จากนั้นโดปาโครมจะถูกแปลงเป็นไดไฮโดร-อินโดลิซีน (DHI) หรืออินโดล 5,6-ควิโนน-2-คาร์บอกซิลิซิด (DHICA) [36–38] ในเส้นทางนี้ TRP-2 จะเร่งการเปลี่ยนโดปาโครมเป็น DHICA ซึ่งถูกออกซิไดซ์โดย TRP-1 เพื่อสร้างยูเมลานิน MITF เป็นปัจจัยการถอดรหัสเฉพาะที่มีบทบาทสำคัญในการสร้างเมลาโนเจเนซิสในฐานะตัวควบคุมหลักของการแสดงออกของ TYR, TRP-1 และ TRP-2 (รูปที่ 8) [28,37] ตัวกระตุ้นทางเคมีของการสร้างเมลาโนเจเนซิสคือ3-ไอโซบิวทิล-1-เมทิลแซนทีน (IBMX) ซึ่งเพิ่มกิจกรรมของ TYR ผ่านวิถีการส่งสัญญาณของแคมป์ [13] IBMX เพิ่มความเข้มข้นของแคมป์ภายในเซลล์โดยการยับยั้งcAMP phosphodiesterase ระดับแคมป์ที่เพิ่มขึ้นจะกระตุ้นโปรตีนไคเนส A (PKA) และ PKA ที่กระตุ้นจะปรับปรุงกิจกรรมและการแสดงออกของโปรตีนการจับที่เกี่ยวข้องกับแคมป์ (CREB) [39] CREB เชื่อมโยงกับโปรโมเตอร์ MITF ซึ่งนำไปสู่การควบคุมยีน MITF ที่เพิ่มขึ้น การเปิดใช้งาน MITF ส่งเสริมการแสดงออกของ TYR และ TRP [13,19] ดังนั้น การปรับลด MITF ทำให้เกิดรอยดำ

สารสกัดจากชะเอมอุ่น (WH-130) ยับยั้ง TYR ของเห็ดและการทำงานของ TYR ของเซลล์ได้อย่างมีประสิทธิภาพมากกว่าสารสกัดจากชะเอมที่ไม่ผ่านการให้ความร้อน (WC) การยับยั้ง TYRactivity ของเซลล์ในสารสกัดจากชะเอมอาจเกิดจากการปรับลด TYR ผลลัพธ์เหล่านี้เชื่อมโยงกับเนื้อหาเมลานินของเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16F10 ในเซลล์ B16F10 การบำบัดด้วย WH-130 ยับยั้งการผลิตเมลานินที่เกิดจาก IBMX ได้ดีกว่าการบำบัดด้วยห้องสุขา ยิ่งไปกว่านั้น WH 130 ปรับลดการถอดรหัสและการแปลเครื่องหมายที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสี (MITF, TYR, TRP-1, TRP-2) ในเซลล์ B16F10 ในระดับที่มากกว่า WC เครื่องหมายเหล่านี้อาจส่งผลโดยรวมต่อต้านการสร้างเม็ดสีกิจกรรม [40].

ความร้อนของชะเอมสารสกัดเพิ่มความอุดมสมบูรณ์ของสารต้านอนุมูลอิสระฟีนอลิกเช่น ISL และการเพิ่มขึ้นนี้เชื่อมโยงกับการเพิ่มขึ้นสารต้านอนุมูลอิสระกิจกรรม (ABTS plus และ DPPH) สารสกัดจากชะเอมอุ่น (WH-130) ยังแสดงฤทธิ์การยับยั้งที่เพิ่มขึ้นของ TYR และการสังเคราะห์เมลานินลดลง มีแนวโน้มใหม่ในการพัฒนาธรรมชาติวัสดุเนื่องจากศักยภาพด้านความปลอดภัย ชะเอมถูกนำมาใช้ในครีมเครื่องสำอางสำหรับรอยดำ [41] เราแสดงให้เห็นศักยภาพของวงศ์อำในฐานะคนใหม่ผิวขาวใสตัวแทนสำหรับใช้ในเครื่องสำอางและยืนยันว่าการอบชุบด้วยความร้อนสามารถปรับปรุงศักยภาพได้

Glycyrrhiza uralensis Fischer (ชะเอมเทศ) มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและป้องกันแสงยูวีในไฟโบรบลาสต์ที่ผิวหนังของมนุษย์ [22] อย่างไรก็ตาม การศึกษาเปรียบเทียบระหว่างวงศ์อ้ม (ชะเอม) กับพันธุ์พื้นเมืองอื่นๆ จำเป็นต้องดำเนินการในภายหลัง นอกจากนี้ ควรทำการศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับส่วนประกอบที่ไม่ระบุชื่อ เช่น กลาเบรน กลาบริดิน ของ Wongam ที่เกี่ยวข้องกับฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีผิวด้วยวิธีการที่เหมาะสม จำเป็นต้องตรวจสอบผลเสริมฤทธิ์กันหรือเป็นปฏิปักษ์ระหว่างสารประกอบฟีนอลหลังการวิเคราะห์องค์ประกอบในสารสกัดจากชะเอม [40] เพื่อตรวจสอบว่าสารเหล่านี้ออกฤทธิ์อย่างไรกับสารต้านอนุมูลอิสระและกลไกการต่อต้านการสร้างเม็ดสี, การถ่ายโอนอะตอมของไฮโดรเจนหรือระบบถ่ายโอนอิเล็กตรอนเดี่ยวและเส้นทางการส่งสัญญาณโปรตีนไคเนสที่กระตุ้นด้วยไมโตเจนควรได้รับการประเมิน [32,37]

5. สรุปผลการวิจัย

ในการศึกษานี้ เราได้ศึกษาศักยภาพของสารสกัดวงศ์อ่ำ พันธุ์ใหม่ของชะเอม, เป็นไวท์เทนนิ่งตัวแทนสำหรับใช้ในเครื่องสำอางและผลของการให้ความร้อนต่อฤทธิ์ทางชีวภาพ สารสกัด Wongam (WC และ WH-130) แสดงฤทธิ์กำจัดอนุมูลอิสระสูงและยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินในเมลาโนไซต์ที่เกิดจาก IBMX โดยการยับยั้งการทำงานของ TYR การรักษาความร้อนเพิ่มขึ้นสารต้านอนุมูลอิสระและฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีของวงอ่ำ เป็นผลให้ WH-130 แสดงสารต้านอนุมูลอิสระที่เหนือกว่าและต่อต้านการสร้างเม็ดสีกิจกรรมมากกว่าห้องสุขา ผลลัพธ์ของเราแนะนำว่าสารสกัด Wongam ที่ผ่านการอบชุบด้วยความร้อน (WH-130) เป็นสารลดการสร้างเม็ดสีที่มีฤทธิ์ในการลดเม็ดสี โดยอาจนำไปใช้ในความผิดปกติของรอยดำที่ผิวหนังต่างๆ รวมถึงจุดสีน้ำตาล กระ และฝ้า และแสดงให้เห็นว่าการแปรรูปด้วยความร้อนสามารถใช้เพื่อปรับปรุง ฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีของชะเอมเทศ

ประโยชน์ของ cistanche tubolosa: ผิวขาวใส