ผลของสารสกัดใบและไฟโตเคมิคอลจากมะกอกซีลอน (Elaeocarpus Serratus) ในแบบจำลองม้าลาย

ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Chi-Ya Huang 1, I-Hsuan Liu 2, Xiang-Zhe Huang 1, Hui-Jen Chen 1, Shang-Tzen Chang 1, Mei-Ling Chang 3, Yu-Tung Ho 1 และ Hui-Ting Chang 1*

เชิงนามธรรม:ดิการสร้างเม็ดสีฤทธิ์ยับยั้งในปลาม้าลาย (Danio rerio) และสารต้านไทโรซิเนสกิจกรรมของเอทานอลสารสกัดและไฟโตเคมิคอลจากใบมะกอกซีลอน (Elaeocarpus serratus Linn.) ได้รับการตรวจสอบในการศึกษานี้ ในบรรดาสารสกัดจากใบและเศษส่วนที่ละลายน้ำได้ 4 ส่วน เอทิลอะซิเตทที่ละลายน้ำได้แสดงแอนติไทโรซิเนสที่ดีที่สุดและการเกิด antimelanogenesisกิจกรรม. กรดฟีนอล 1 ชนิด กรดแกลลิคาซิด และฟลาโวนอยด์ 2 ชนิด ได้แก่ ไมริซิตินและดีบุก หมายถึง แยกได้จากเศษย่อยที่ออกฤทธิ์ผ่านการแยกวิเคราะห์ด้วยไบโอแอสเซย์ โครงสร้างของพวกเขาได้รับการอธิบายโดยอิงจากการวิเคราะห์ทางสเปกโตรสโกปี 1D และ 2D NMR, FTIR, UV และ MS สารประกอบเหล่านี้มีนัยสำคัญสารต้านไทโรซิเนสกิจกรรมไม่ว่าจะใช้ L-tyrosine หรือ L-DOPA เป็นสารตั้งต้น mearnsentin แสดงกิจกรรมที่เหมาะสมที่สุด ในการศึกษาเอ็นไซม์คิเนติก กรดแกลลิกและเมียร์เซตินเป็นตัวยับยั้งชนิดที่แข่งขันกับไทโรซิเนสของเห็ด และไมริซิตินทำหน้าที่เป็นชนิดผสมไทโรซิเนสสารยับยั้ง ใบไม้สารสกัดและส่วนที่ละลายน้ำได้ของเอทิลอะซิเตตแสดงประสิทธิภาพในการยับยั้งการสร้างเมลานินในตัวอ่อนของปลาม้าลาย เมียร์นเซตินยังมีฤทธิ์ต้านไทม์แลนเจเนซิสที่มีแนวโน้มดี ซึ่งเหนือกว่ากลุ่มควบคุมเชิงบวกอาร์บูติน. ผลการศึกษาพบว่าสารสกัดจากใบมะกอกซีลอนและสารพฤกษเคมีโดยเฉพาะมีร์นเซตินมีศักยภาพที่จะใช้เป็นการเกิด antimelanogenesisและส่วนผสมเพื่อผิวขาว

คำสำคัญ: ฤทธิ์ต้านการเกิดมะเร็ง Elaeocarpus serratus; เมลานิน; สารยับยั้งไทโรซิเนส; ปลาม้าลาย

Herba cistanchesยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนส

1. บทนำ

เมลานินมีบทบาทสำคัญในการทำงานทางชีวเคมีหลายอย่าง ช่วยปกป้องผิวจากการทำลายของรังสีอัลตราไวโอเลต (UV) การกำจัดของ reactive oxygen species (ROS) และปฏิกิริยาทางชีวเคมีอื่นๆ [1–3] การสะสมของเมลานินที่มากเกินไปยังทำให้เกิดรอยดำ ฝ้า จุดด่างดำ ผิวคล้ำ ฯลฯ [4,5]ในโลกตะวันออก ผู้คนให้ความสนใจในประเด็นเรื่องการฟอกสีผิว อุตสาหกรรมเครื่องสำอางมุ่งมั่นที่จะพัฒนาเครื่องสำอางที่ช่วยปรับสีผิวให้ขาวขึ้นเพื่อต่อต้านการสร้างเม็ดสี มีกลไกหลายอย่าง ได้แก่ไทโรซิเนสฤทธิ์ยับยั้ง การกำจัดเมลาโนไซต์ และการแทรกแซงการสังเคราะห์เมลานินเพื่อแสดงฤทธิ์การยับยั้งการสร้างเม็ดสี รีเอเจนต์ที่มีแนวโน้มว่าจะยับยั้งการสร้างเม็ดสีได้รับการตรวจสอบตั้งแต่ช่วงทศวรรษที่ 1940 [2,4,6,7] อย่างไรก็ตาม partการสร้างเม็ดสีสารยับยั้งมีผลข้างเคียงบางอย่าง เช่น ไฮโดรควิโนนอาจทำให้เกิด ochronosis จากภายนอกและภาวะ hypomelanosis ถาวร [5,8] กรดโคจิกที่มากเกินไปอาจส่งผลให้เกิดการแพ้และเนื้องอกต่อมไทรอยด์ [9,10]

เมื่อเร็ว ๆ นี้ นักวิจัยได้ทุ่มเทให้กับการค้นหาสารทำปฏิกิริยาสร้างเม็ดสีที่มีแนวโน้มว่าจะไม่มีผลข้างเคียง/ไม่รุนแรงจากผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติจากพืช [11-13] เป็นธรรมชาติไทโรซิเนสมีรายงานสารยับยั้งจากแหล่งพืช เช่น ฟีนอลธรรมดา กรดฟีนอล สติลบีน ฟลาโวนอยด์ ลิกแนน เทอร์พีนอยด์ คีนอยด์ เป็นต้น [2,14–16] โซลาโน และคณะ ระบุว่าสารประกอบฟีนอลและสารประกอบธรรมชาติอื่นๆ มีศักยภาพในการยับยั้งฟอร์เมลานินสูง เช่น อาร์บูติน (ฟีนอลกลูโคไซด์ที่พบใน Arctostaphylos uva-ursi) สารสกัดจากชาเขียว กรดอัลฟาไฮดรอกซิล (AHA) กรดแอสคอร์บิก และอื่นๆ [5 ].อาร์บูตินใช้กันอย่างแพร่หลายเป็นส่วนประกอบสำคัญของผลิตภัณฑ์ฟอกสีฟันในเชิงพาณิชย์ในตลาด [4,17].Gallocatechin-3-O-gallate (GCG), epigallocatechin-3-O-gallate (EGCG) และ epicatechin {{6 }}O-gallate (ECG) ถูกระบุในชาเขียวสารสกัด; สารประกอบเหล่านี้มีประสิทธิภาพในการยับยั้งไทโรซิเนสที่ดี [17] Arctigenin ซึ่งเป็นลิกแนนที่แยกได้จาก Fructus arcticextract สามารถลดปริมาณเมลานินของตัวอ่อนของ zebrafish (Danio rerio) [18] Lee et al. รายงานว่า ginsenosides จากใบโสม Panax และผลเบอร์รี่ยับยั้งการสร้างเม็ดสีของตัวอ่อนม้าลาย ginsenosides ที่ใช้งานอยู่ ได้แก่ ginsenoside Rh6, vina-ginsenoside R4, vina-ginsenoside R13, ginsenoside Rh23 และ floralginsenoside A [19-21]

Elaeocarpus serratus ลินน์ (Tiliaceae) หรือที่เรียกกันทั่วไปว่า Ceylon olive มีการกระจายในแอฟริกา ออสเตรเลีย และเอเชียตะวันออกเฉียงใต้ ของดองที่ทำจากผลไม้ที่กินได้ของมะกอกซีลอนนั้นพบได้ทั่วไปในศรีลังกา [22] นิยมใช้ป้องกันเหาและรังแคในศรีลังกา ฤทธิ์ทางชีวภาพของสารสกัด E. serratus ได้รับการประเมินในการศึกษาที่เกี่ยวข้อง [22,23] สารสกัดจากใบ E.serratus มีฤทธิ์ต้านแบคทีเรียต่อ Plesiomonas, Salmonella typhi และ Proteus spp. ที่ความเข้มข้น 400 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรโดยการสอบวิเคราะห์การแพร่ของรูเพลต [23].E สารสกัดจากใบเซอร์ราตัสมีศักยภาพในการเป็นสารต้านเนื้องอก ยาต้านจุลชีพ และสารกำจัดศัตรูพืชในการทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ของกุ้งน้ำเค็ม (Artemia salina) การทดสอบการตาย theLC50 ของใบไม้สารสกัดเท่ากับ 40 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรเทียบกับกุ้งน้ำเกลือ [23] สารต้านอนุมูลอิสระฟลาโวนอลไกลโคไซด์ รวมทั้ง myricitrin, mearnsetin 3-O- -D-glucopyranoside, mearnsitrin, andtamarixetin 3-O- -L-rhamnopyranoside ถูกแยกและระบุได้จากสารสกัด E. serratusleaf [22].

วัตถุประสงค์ของการศึกษานี้คือเพื่อประเมินผลของใบ E. serratusสารสกัดและเศษส่วนบนสารต้านไทโรซิเนสกิจกรรม (ในหลอดทดลอง) และการสร้างเม็ดสีกิจกรรมการยับยั้ง inzebrafish (ในร่างกาย) การแยกส่วนและเทคนิคการแยกส่วนที่แนะนำโดยการทดสอบทางชีวภาพได้ดำเนินการเพื่อค้นหาสารประกอบที่มีแนวโน้มจะเป็นส่วนผสมในการต้านการเกิดมะเร็ง การพัฒนาส่วนผสมแอนติเมลาโนเจเนซิสที่มีประสิทธิภาพสามารถเพิ่มการใช้ประโยชน์สูงสุดของผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติจากพืชในอุตสาหกรรมยาและเครื่องสำอาง

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. วัสดุพืชและการสกัด

มะกอกซีลอน (Elaeocarpus serratus) อายุประมาณ 50 ปี เก็บใบจากมหาวิทยาลัยแห่งชาติไต้หวัน ไทเป ไต้หวัน เมื่อเดือนกันยายน ใบสด (3.95 กก.) สกัดด้วยเอทานอล 95 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 7 วันที่อุณหภูมิห้อง ตัวกรองสารสกัดถูกทำให้แห้งภายใต้แรงดันที่ลดลงโดยเครื่องระเหยแบบหมุนที่มีอุณหภูมิอ่างที่ 50 ◦C [24] เปลือกของสารสกัดจากใบ (0.32 กก.) เท่ากับ 12.0 เปอร์เซ็นต์ (น้ำหนักแห้ง/น้ำหนักแห้ง)

cistancheสารสกัด

2.2. ฉากกั้นระหว่างของเหลวกับของเหลว

ดิสารสกัดถูกสกัดด้วยตัวทำละลายอินทรีย์อย่างต่อเนื่องในลำดับขั้วที่เพิ่มขึ้นโดยการแบ่งส่วนของของเหลวกับของเหลว [24,25] แยกส่วนของสารสกัดจากใบเป็นเศษส่วนที่ละลายได้เป็นตัน-เฮกเซน (HF, 9.1 เปอร์เซ็นต์ ), ส่วนย่อยที่ละลายได้ของเอทิล อะซิเตต (EF, 11.3 เปอร์เซ็นต์ ), ส่วนที่ละลายได้ของเอ็น-บิวทานอล (BF, 17.3 เปอร์เซ็นต์ ) และเศษส่วนที่ละลายน้ำได้ (WF, 31.{ {13}} เปอร์เซ็นต์ )

2.3. โครมาโตกราฟีแบบคอลัมน์และโครมาโตกราฟีแบบชั้นบาง

ส่วนย่อยที่ละลายได้ของเอทิลอะซิเตตที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพถูกแยกส่วนเพิ่มเติมโดยซิลิกาเจลคอลัมน์โครมาโตกราฟี (CC) โครมาโตกราฟีแบบคอลัมน์เปิดถูกดำเนินการโดยการชะแบบเป็นขั้นตอนด้วยอัตราส่วนที่ต่างกันของ n-เฮกเซนและเอทิล อะซีเตต [26] เศษส่วนสิบเก้าส่วน (E1–E19) ได้มาจากโครมาโตกราฟีแบบชั้นบาง (TLC) [27] ผลลัพธ์ของเศษส่วนคือ E1(1.05 เปอร์เซ็นต์ ), E2 (8.21 เปอร์เซ็นต์ ), E3 (1.64 เปอร์เซ็นต์ ), E4 (0.74 เปอร์เซ็นต์ ), E5 (1.52 เปอร์เซ็นต์ ), E6 ({ {59}}.86 เปอร์เซ็นต์ ), E7 (1.51 เปอร์เซ็นต์ ), E8 (9.50 เปอร์เซ็นต์ ),E9 (7.78 เปอร์เซ็นต์ ), E10 (3.97 เปอร์เซ็นต์ ), E11 (2.65 เปอร์เซ็นต์ ), E12 (8.49 เปอร์เซ็นต์ ), E13 (5.58 เปอร์เซ็นต์ ), E14 (4.43 เปอร์เซ็นต์ ), E15 (5.31 เปอร์เซ็นต์ ), E16 (1.14 เปอร์เซ็นต์ ), E17 (1.87 เปอร์เซ็นต์ ), E18 (0.76 เปอร์เซ็นต์ ) และ E19 (2.96 เปอร์เซ็นต์ )

2.4. โครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง

เศษย่อยที่ออกฤทธิ์ของเศษส่วนที่ละลายได้ของเอทิลอะซิเตตถูกวิเคราะห์และแยกโดยโครมาโตกราฟีของเหลวที่มีประสิทธิภาพสูง (HPLC, L-2130, ฮิตาชิ, โตเกียว, ญี่ปุ่น) ที่พอดีกับคอลัมน์ RP-18 ที่เตรียมไว้ล่วงหน้า (Purospher®, STAR RP{{ 3}} หัวปิดปลาย, 250 × 10 มม.,5 µm) เฟสเคลื่อนที่ของเกรเดียนท์ประกอบด้วยน้ำ (A) และอะซีโตไนไทรล์ (B) อัตราการไหลคือ 3 มล./นาที โปรแกรมการชะเกี่ยวข้องกับการไล่ระดับเชิงเส้นจาก 30 ถึง 35 เปอร์เซ็นต์ B ใน A เป็นเวลา 0–15 นาที 35 ถึง 100 เปอร์เซ็นต์ B ใน A 15–25 นาที และตามด้วย 5 นาทีของสมดุลกับ 100 เปอร์เซ็นต์ B ตรวจพบพีคที่ถูกชะออก โดยเครื่องตรวจจับรังสียูวีที่ 254 นาโนเมตร [25,28]

2.5. การระบุสารประกอบที่แยกได้

โครงสร้างของสารประกอบที่แยกได้ถูกกำหนดและแสดงลักษณะเฉพาะโดยการวิเคราะห์สเปกตรัม ซึ่งรวมถึงสเปคโตรสโกปีอัลตราไวโอเลตที่มองเห็นได้ (UV/VIS, V-550, Jasco, โตเกียว, ญี่ปุ่น), ฟูริเยร์ทรานส์ฟอร์มอินฟราเรดสเปกโทรสโกปี (FTIR, FTS{{2} }, Bio-rad, Hercules, CA, USA) และแมสสเปกโทรสโกปี (MS, MAT-958, Finnigan, MA, USA) Nuclear magneticresonance spectroscopy (NMR) รวมถึง 1D (1H-NMR, 500 MHz; 13C-NMR, 125 MHz) และ 2D NMR (HSQC และ HMBC) ถูกบันทึกด้วย Bruker AVIII NMR spectrometer (Bruker Avance, Rheinstetten, Germany) [ 29–32].

2.6. การทดสอบ Antityrosinase และการศึกษาจลนพลศาสตร์ของเอนไซม์

ในหลอดทดลองสารต้านไทโรซิเนสการทดสอบเป็นการวิเคราะห์ด้วยสเปกโตรโฟโตเมตริกตามวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [33–35] L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine) และ L-tyrosine ถูกใช้เป็นสารตั้งต้น ตามลำดับ ในไมโครเพลท 96-หลุม 40 ไมโครลิตรของสารละลายตัวอย่างและ 70 ไมโครลิตรของบัฟเฟอร์โพแทสเซียม ฟอสเฟต (0.1 โมลาร์, pH 6.8) ถูกผสม ซึ่งตามมาด้วยการเติม 50 ไมโครลิตรของไทโรซิเนสเห็ด 200 หน่วย/มิลลิลิตร ( EC1.14.18.1) หลังฟักที่อุณหภูมิ 25 ◦C เป็นเวลา 10 นาที จากนั้น เราเพิ่ม 40 ไมโครลิตรของซับสเตรต 2.5 มิลลิโมลาร์ (L-ไทโรซีน/L-DOPA) ลงในหลุม และของผสมถูกบ่มเป็นเวลา 10 นาที หลังจากการฟักไข่ การดูดกลืนแสงที่ 475 นาโนเมตรของแต่ละหลุมถูกวัดโดยเครื่องอ่าน ELISA (การทดสอบอิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์) (SPECTROstar Nano, BMG LABTECH, Offenburg, Germany) การควบคุมเชิงบวกคืออาร์บูตินและจำนวนการทำซ้ำคือสาม เปอร์เซ็นต์การยับยั้งของไทโรซิเนสกิจกรรมคำนวณโดยสมการต่อไปนี้: การยับยั้ง ( เปอร์เซ็นต์ )=[(Acontrol–Acontrol's blank)–(Asample–Asample's blank)/(Acontrol–Acontrol's blank)] × 100 จากนั้น ความเข้มข้นการยับยั้งสูงสุดครึ่งหนึ่ง ( IC50) ของชิ้นงานทดสอบคำนวณจากกราฟการตอบสนองความเข้มข้น

การศึกษาจลนศาสตร์ของเอนไซม์วิเคราะห์โดยพล็อตซึ่งกันและกันของ Lineweaver–Burk ของอัตราการเกิดปฏิกิริยาและความเข้มข้นของสารตั้งต้นเพื่อประเมินผลของตัวอย่างต่อสัมพรรคภาพของซับสเตรตและเอนไซม์ ความเข้มข้นของไทโรซิเนสถูกคงไว้ที่ 200 หน่วย/มล. ในขณะที่ความเข้มข้นของซับสเตรต (L-ไทโรซีน/L-DOPA) แปรผันที่ 0.5, 0.75,1.0 , 1.25 และ 1.5 มิลลิโมลาร์ ปฏิกิริยาคล้ายกับการสอบวิเคราะห์แอนติไทโรซิเนสตามที่บรรยายไว้ข้างต้น 40 ไมโครลิตรของสารละลายตัวอย่างและ 70 ไมโครลิตรของบัฟเฟอร์โพแทสเซียม ฟอสเฟต (0.1 โมลาร์, pH 6.8) ถูกผสม ซึ่งตามมาด้วยการเติมไทโรซิเนส 200 หน่วย/มิลลิลิตร 50 ไมโครลิตร หลังจากการฟักไข่ที่25 ◦ C เป็นเวลา 10 นาที จากนั้น เราเติมสารตั้งต้น 40 ไมโครลิตรลงในหลุมและผสมให้ละเอียด และการวัดทางจลนศาสตร์ของสารละลายถูกวัดทันทีเป็นระยะเวลา 3 นาทีตามความยาวคลื่นที่ตรวจพบ (475 นาโนเมตร) ทั้งพารามิเตอร์จลนศาสตร์ ค่าคงที่ไมเคิลลิส–เมนเทน (Km) และความเร็วสูงสุด (Vmax) คำนวณจากสมการเชิงเส้นของ Lineweaver–Burk [36–38]

2.7. การประเมินฤทธิ์ต้านการเกิดมะเร็งในปลาม้าลาย

ปลาซีบราฟิช (Danio rerio) ของสายพันธุ์ AB ชนิดป่าได้รับการบำรุงรักษาในสภาพแวดล้อมทางน้ำที่มีสุขภาพดีที่ 26–30 ◦C โดยมีวัฏจักรมืดและแสง 14:10 ชั่วโมง หลังจาก 9 ชั่วโมงหลังการปฏิสนธิ (hpf) ตัวอ่อนจะถูกวางลงในจานหลุม 24-หลุม (3 ตัวต่อหลุม) บำบัดด้วยความเข้มข้นสุดท้ายของตัวอย่างที่ละลายใน DMSO 1 เปอร์เซ็นต์ และฟักที่อุณหภูมิ 28 ◦C เป็นเวลา 48 ชั่วโมง (at57 แรงม้า). ภาพดิจิทัลของตัวอ่อน zebrafish ที่มีชีวิตถูกถ่ายผ่าน stereomicroscope (Olympus SZ61, Tokyo, Japan) ด้วยกำลังขยายทั้งหมด 40 เท่า; จากนั้นจึงวิเคราะห์เนื้อหาเมลานินของตัวอ่อน zebrafish ด้วยซอฟต์แวร์ ImageJ การควบคุมเชิงบวกคืออาร์บูติน(ส่วนผสมที่ทำให้ผิวขาวในเชิงพาณิชย์) และ 1-ฟีนิล-2-ไธโอยูเรีย (PTU, สารยับยั้งการสังเคราะห์เมลานิน) จำนวนการจำลองแบบหก [21,39,40]

2.8. การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลที่ได้จากการศึกษาวิเคราะห์โดย Statistical Analysis System (SAS) v 9.2(Cary, NC, USA) กับการทดสอบของ Scheffe ซึ่งเป็นวิธีเปรียบเทียบแบบ post hoc Multiple ช่วงความเชื่อมั่นกำหนดไว้ที่ 95 เปอร์เซ็นต์

dr vita OPC ในผิวขาวใส

3. ผลลัพธ์และการอภิปราย

3.1. ฤทธิ์ต้านไทโรซิเนสของสารสกัดใบ E. serratus และเศษส่วน

แผนผังของการสกัด การแยก การระบุสารต้านไทโรซิเนสกิจกรรมและการเกิด antimelanogenesisผลของ E. serratus leafสารสกัดแสดงไว้ในรูปที่ 1 สารสกัดใบถูกแยกส่วนเพิ่มเติมเป็นเศษส่วนที่ละลายได้ของ n-เฮกเซน (HF), เศษส่วนที่ละลายได้ของเอทิล อะซิเตต (EF), ส่วนที่ละลายได้ของเอ็น-บิวทานอล (BF) และส่วนที่ละลายน้ำได้ (WF) โดยของเหลว - การแบ่งของเหลว

ไทโรซิเนสที่ผลิตโดยเซลล์เมลาโนไซต์มีบทบาทสำคัญในการกระตุ้นการสังเคราะห์เมลานินที่ซับซ้อน การสำรวจของไทโรซิเนสสารยับยั้งเป็นหนึ่งในวิธีที่โดดเด่นในการชะลอการสร้างเม็ดสี[2,5,41]. ฤทธิ์ยับยั้งไทโรซิเนสของใบสารสกัดและเศษส่วนสี่ส่วนแสดงไว้ในรูปที่ 2 เมื่อใช้ L-tyrosine เป็นสารตั้งต้น เฉพาะส่วนที่ละลายได้ของเอทิลอะซิเตตเท่านั้นที่มีผลการยับยั้งต่อไทโรซิเนสที่ความเข้มข้น 400 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร สารสกัดจากใบ ส่วนที่ละลายได้ของเอทิลอะซิเตท และส่วนที่ละลายได้ของเอ็น-บิวทานอล มีฤทธิ์ต้านไทโรซิเนสเมื่อเปลี่ยน L-DOPA เป็นสารตั้งต้น ในบรรดาสารสกัดจากใบและเศษส่วนสี่ส่วน ส่วนที่ละลายน้ำได้ของเอทิลอะซิเตตได้แสดงให้เห็นดีที่สุดสารต้านไทโรซิเนสกิจกรรมที่มีค่า IC50 เท่ากับ 279.38 และ 166.95 ug/mL เมื่อใช้ L-tyrosine และ L-DOPA เป็นสารตั้งต้น ตามลำดับ (ตารางที่ 1)

ตารางที่ 1. ค่า IC50 ของเศษส่วนที่ใช้งานกับไทโรซิเนสของเห็ด

เศษส่วนที่ละลายได้ของเอทิลอะซิเตตอยู่ภายใต้การแยกส่วนด้วยการวิเคราะห์ทางชีวภาพโดยใช้เทคนิคโครมาโตกราฟีแบบคอลัมน์เตรียมการและโครมาโตกราฟีแบบบาง และได้เศษส่วนย่อยสิบเก้าส่วน (E1–E19) ในบรรดาเศษย่อยเหล่านี้ เศษย่อยของ E7–E10 แสดงผลการยับยั้งไทโรซิเนสที่สูงขึ้นในการสอบวิเคราะห์สารตั้งต้นทั้งสอง (L-tyrosine และ L-DOPA) ค่าความเข้มข้นการยับยั้งสูงสุดครึ่งหนึ่ง (IC50) ของเศษส่วนที่ใช้งานเทียบกับไทโรซิเนสแสดงไว้ในตารางที่ 1 ค่า IC50 ของเศษส่วนย่อย E7–E10 ทั้งหมดต่ำกว่า 200 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร เศษส่วน E7 และ E9 ยังแสดงประสิทธิภาพที่ดีขึ้นเมื่อเทียบกับอาร์บูตินซึ่งเป็นส่วนผสมไวท์เทนนิ่งในเชิงพาณิชย์

3.2. การแยกและการระบุสารประกอบจากเศษย่อยที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพ

สารประกอบสามชนิด (ES1–3) ถูกแยกออกจากเศษย่อยที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพ (E7–E10) โดยโครมาโตกราฟีของเหลวที่มีประสิทธิภาพสูง กรดแกลลิก (ES1): ผงสีขาว; mp 257 องศา ; UV (MeOH) λmax (log ε) 215.5 (3.94), 268.0 (3.46) นาโนเมตร; IR (KBr) νสูงสุด 3495, 3416, 3285, 1647, 1542 และ 1220 cm-1; EI-MS m/z 171 [M plus H] plus สอดคล้องกับสูตรโมเลกุล C7H6O5 Myricetin (ES2): เข็มสีเหลือง; mp 358 องศา ; UV (MeOH) λmax (log ε) 252.5 (4.43) และ 374.0 (4.50) นาโนเมตร; IR (KBr) νสูงสุด 3421, 1663, 1596, 1520, 1229, 1202 และ 1171 cm-1; EI-MS m/z 319.36 [M plus H] plus สูตรโมเลกุล C15H10O8 Mearnsetin (4′-O-methyl myricetin, ES3): ผงสีเหลือง; mp 184 องศา ; UV (MeOH) λmax (log ε) 259.5 (4.21) และ 364.5 (4.26) nm; IR (KBr) νสูงสุด 3409, 2960, 2927, 2853, 1661, 1599, 1507, 1208 และ 1163 cm-1; EI-MS m/z 333.0 [M บวก H] บวก สูตรโมเลกุล C16H12O8 ข้อมูล NMR ของสารประกอบเหล่านี้สรุปไว้ในตารางที่ 2 โครงสร้างทางเคมีของสารประกอบที่ระบุแสดงไว้ในรูปที่ 3

ตารางที่ 2. ข้อมูล 1H, 13C และ HMBC NMR ของสารประกอบ

ในบรรดาสารประกอบเหล่านี้ กรดแกลลิกเป็นกรดฟีนอลิก myricetin และ mearnsetin เป็นของฟลาโวนอยด์ เนื้อหาของสารประกอบแต่ละชนิดในเศษส่วนที่ละลายได้ของเอทิลอะซิเตตและเศษส่วนย่อย E7–E10 ถูกระบุไว้ในตารางที่ 3 เศษส่วน E7 นั้นอุดมไปด้วยมีร์นเซติน (433.38 มก./กรัม); เศษส่วนหลัก E8 มีกรดแกลลิก (417.64 มก./กรัม) องค์ประกอบหลักของเศษส่วน E9 และ E10 คือไมริซิติน (406.41 และ 336.41 มก./กรัม ตามลำดับ) เนื้อหาของสารประกอบสามชนิดในส่วนที่ละลายได้ของเอทิลอะซิเตตเท่ากับ 59.72 มก./กรัม (กรดแกลลิก), 45.21 มก./กรัม (ไมริซิติน) และ 22.66 มก./กรัม (มีร์นเซติน)

3.3. ฤทธิ์ต้านไทโรซิเนสและการศึกษาจลนพลศาสตร์ของเอนไซม์ของสารประกอบที่แยกได้

แอนติไทโรซิเนสกิจกรรมของสารประกอบเหล่านี้จากเศษย่อยแบบแอคทีฟถูกแสดงไว้ในตารางที่ 4 เมื่อใช้ L-tyrosine เป็นสารตั้งต้น ลำดับของฤทธิ์ต้านไทโรซิเนสของสารประกอบที่ตรวจสอบคือ mearnsetin > myricetin > gallic acid > arbutin; เมียร์นเซทินมีผลการยับยั้งที่ดีที่สุดด้วยค่า IC50 ที่ 56.57 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (0.17 มิลลิโมลาร์) พบผลลัพธ์ที่คล้ายกันใน L-DOPA ที่ใช้เป็นสารตั้งต้น ประสิทธิภาพของไฟโตเคมิคอลสามชนิดดีกว่าของอาร์บูติน.

ตัวยับยั้งเอนไซม์ที่แท้จริงประกอบด้วยโหมดการยับยั้งสี่รูปแบบ ได้แก่ แบบแข่งขัน ไม่มีการแข่งขัน ประเภทผสม (ทั้งแบบแข่งขันและไม่แข่งขัน) และแบบไม่แข่งขัน [12] ค่าคงที่ทางจลนศาสตร์ Km และ Vmax ถูกกำหนดโดยอัตราเริ่มต้นของเอนไซม์ที่สารตั้งต้นที่แตกต่างกัน ความเข้มข้นในพล็อต Lineweaver–Burk; ตัดกันที่แกน y เท่ากับ 1/Vmax และตัดที่แกน x คือ -1/Km ในจลนพลศาสตร์ของเอนไซม์ ศึกษาสารประกอบเทอร์พีนอยด์จากน้ำมันหอมระเหยเปลือกส้มต้านไทโรซิเนส, citralacted เป็นตัวยับยั้งที่ไม่สามารถแข่งขันได้ และ myrcene เป็นตัวยับยั้งการแข่งขัน [36] กลไกการยับยั้งของ 37-dioleylquercetin ต่อไทโรซิเนสของเห็ดได้ผ่านรูปแบบการยับยั้งการแข่งขันเพื่อยับยั้งการผลิตเมลานิน [42]

ตารางที่ 4. ค่า IC50 ของสารต้านไทโรซิเนสของเห็ด

ชนิดการยับยั้งบนไทโรซิเนสของไฟโตเคมิคัลสามชนิดถูกอธิบายโดยการศึกษาจลนศาสตร์ในหลอดทดลอง รูปที่ 4 แสดงพล็อต Lineweaver–Burk (พล็อตส่วนกลับสองครั้ง) ของเมียร์นเซติน ในการวิเคราะห์สารตั้งต้นทั้งสอง L-tyrosine และ L-Dopa เส้นการถดถอยเชิงเส้นของความเข้มข้นต่างกันของ mearnsetin มีการสกัดกั้นเดียวกันบนแกน y และความชันที่เพิ่มขึ้น พารามิเตอร์จลนพลศาสตร์ของกรดแกลลิก ไมริซิติน และเมียร์นเซตินถูกสรุปไว้ในตารางที่ 5 เมื่อมีกรดแกลลิกหรือเมียร์นเซติน จะสังเกตพบการเพิ่มขึ้นของ Km และค่าคงที่ใน Vmax ซึ่งบ่งชี้ว่าทั้งกรดแกลลิกและเมียร์นเซตินเป็นตัวยับยั้งการแข่งขันของไทโรซิเนส มันบ่งชี้ว่ากรดแกลลิกและเมียร์นเซตินสามารถจับอิสระได้ไทโรซิเนสมีความสัมพันธ์กันสูงและป้องกันสารตั้งต้น (L-tyrosine หรือ L-DOPA) ผูกมัดกับไซต์ที่ใช้งานของไทโรซิเนส พบว่า Myricetin เป็นสารยับยั้งแบบผสมซึ่งมีการยับยั้งแบบแข่งขันและไม่มีการแข่งขันเนื่องจาก Km เพิ่มขึ้นและ Vmax ลดลง การยับยั้งที่ไม่มีการแข่งขันแสดงให้เห็นว่าสารประกอบจับกับ tyrosinase–substratecomplex แต่ไม่ใช่กับ tyrosinase อิสระ

3.4. ฤทธิ์ต้านการเกิดกระบวนการสร้างเม็ดสีของสารสกัด เศษส่วน และไฟโตเคมิคอลที่แยกออกมา

Zebrafish (Danio rerio) เป็นสิ่งมีชีวิตรูปแบบใหม่และถูกต้องสำหรับการวิจัยการสร้างเม็ดสีในการศึกษาล่าสุด [18–21,40] ดิการเกิด antimelanogenesisผลของสารสกัดจากใบและเศษส่วนสี่ส่วนในการทดสอบ zebrafish ในร่างกาย แสดงไว้ในรูปที่ 5 ใบไม้สารสกัดและเศษส่วนเอทิลอะซิเตทที่ละลายน้ำได้แสดงประสิทธิภาพที่ดีในการยับยั้งการสร้างเมลานินตัวอ่อน inzebrafish ที่ความเข้มข้น 200 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร สารสกัดจากใบและเศษส่วนที่ละลายได้ของเอทิล อะซิเตทสามารถยับยั้งการผลิตเมลานินของตัวอ่อนม้าลายได้ร้อยละ 27.72 และร้อยละ 35.60 ตามลำดับ การรักษาทั้งหมดไม่ได้ส่งผลต่อการเจริญเติบโตของตัวอ่อนม้าลายที่มีอัตราการรอดตาย 100 เปอร์เซ็นต์

รูปที่ 6 นำเสนอผลของสารประกอบและกลุ่มควบคุมเชิงบวก PTU และอาร์บูตินต่อการสร้างเม็ดสีของปลาม้าลายที่ความเข้มข้น 50 µM PTU แข็งแกร่งไทโรซิเนสยับยั้งการผลิตเมลานินในขณะที่อาร์บูตินเป็นสารฟอกสีผิวในเชิงพาณิชย์ การควบคุมเชิงบวกทั้งสองอย่างสามารถลดการสร้างเมลานินในปลาม้าลายได้ ในบรรดาสารพฤกษเคมีสามชนิด myricetin แสดงผลการยับยั้งเมลานินเล็กน้อย ในขณะที่ mearnsetin มีกิจกรรมการยับยั้งการสร้างเม็ดสีที่ดีขึ้นในปลาม้าลาย

ความเข้มข้นที่มีประสิทธิภาพของการสร้างเม็ดสี inhibition activity in zebrafish of compounds are listed in Table 6. IC50 values of PTU and arbutin were 26.29 µM and 323.69 µM, respectively. The order of antimelanogenesis activity of examined compounds was PTU >เมิร์นเซติน >อาร์บูตินและไมริซิติน > กรดแกลลิก เมียร์นเซตินแสดงประสิทธิภาพที่ดีที่สุดด้วยค่า IC50 ที่ 121.01 ไมโครโมลาร์ ในบรรดาไฟโตเคมิคอลที่ตรวจสอบ

นี่คือผลิตภัณฑ์ของเรา

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมกรุณาคลิกที่ภาพ

4. บทสรุป

ดิการสร้างเม็ดสีผลการยับยั้งและสารต้านไทโรซิเนสการศึกษานี้ประเมินฤทธิ์ของสารสกัดจากใบมะกอกซีลอน (E. serratus) ท่ามกลางใบไม้สารสกัดและเศษส่วนสี่ส่วน ส่วนที่ละลายน้ำได้ของเอทิลอะซิเตตดีที่สุดสารต้านไทโรซิเนสกิจกรรม. ไฟโตเคมิคอลซึ่งรวมถึงกรดแกลลิก ไมริซิติน และเมียร์นเซติน ถูกแยกและระบุจากเศษย่อยเชิงปฏิกิริยาโดยโครมาโตกราฟีที่นำทางด้วยไบโอแอสเซย์และการวิเคราะห์ด้วยสเปกตรัม ลำดับของฤทธิ์ต้านไทโรซิเนสของสารประกอบเหล่านี้คือ mearnsetin > myricetin > gallic acid การศึกษาจลนศาสตร์ของเอนไซม์ Thein vitro พบว่ากรดแกลลิกและเมียร์นเซตินเป็นตัวยับยั้งการแข่งขันของไทโรซิเนส และไมริซิตินเป็นสารยับยั้งชนิดผสม ผลจากการทดสอบปลาม้าลายในกายพบว่าเศษส่วนที่ละลายน้ำได้ของเอทิลอะซิเตตและไฟโตเคมิคอลสามชนิดมีส่วนสำคัญการสร้างเม็ดสีผลการยับยั้ง ผลแอนติเมลาโนเจเนซิสของเมียร์นเซตินดีกว่ากลุ่มควบคุมเชิงบวกอาร์บูตินในปลาม้าลาย