การเตรียมอัลบูมินในซีรั่มมนุษย์ S-sulfhydrated นวนิยายยับยั้งการสังเคราะห์เมลานิน
Jan 30, 2022
ติดต่อ:jaslyn.ji@wecistanche.com
มายูมิ อิเคดะa,1, ยู อิชิมะa,⁎,1, เรียว คิโนชิตะb, วิคเตอร์ TG Chuangc, นานามิ ทาซากะa, นานา มัตสึโอะa, ฮิโรชิ วาตานาเบะb, ทาโร่ ชิมิสึa, ทัตสึฮิโระ อิชิดะa, มาซากิ โอตากิริd, โทรุ มารุยามะb,⁎
บทคัดย่อ
ผลิตภัณฑ์ของการฉายรังสีอัลตราไวโอเลต (UV) เช่น รีแอคทีฟออกซิเจนสปีชีส์ (ROS) และไนตริกออกไซด์ (NO) กระตุ้นการสังเคราะห์เมลานิน สายพันธุ์กำมะถันปฏิกิริยา (RSS) แสดงให้เห็นว่ามี ROS ที่แข็งแกร่งและไม่มีผลในการขับ อย่างไรก็ตาม ความไม่เสถียรและการคงอยู่ของ RSS ต่ำนั้นจำกัดการใช้สารยับยั้งการสังเคราะห์เมลานิน ไทออลอิสระที่ Cys34 ในซีรัมอัลบูมินของมนุษย์ (HSA) มีความเสถียรสูง มีการกักเก็บยาวนาน และมีปฏิกิริยาต่อ RSS สูง เรารายงานในที่นี้เกี่ยวกับการพัฒนาระบบการจัดส่ง RSS ที่ใช้ HSA อนุพันธ์ซัลเฟนซัลเฟอร์ที่ปล่อยออกมาจากโซเดียมพอลิซัลไฟด์ (Na2Sn) ทำปฏิกิริยาได้ง่ายกับ HSA การสอบวิเคราะห์สำหรับการประมาณการการกำจัดซัลไฟด์จากพอลิซัลไฟด์แสดงให้เห็นว่าเกือบทั้งหมดของกำมะถันที่ปล่อยออกมาจาก Na2Sn ที่จับกับ HSA พบว่า HSA ที่ได้รับการบำบัดด้วย Na2Sn สามารถกำจัด ROS และ NO ที่เกิดจากสารเคมีได้อย่างมีประสิทธิภาพ นอกจากนี้ยังพบว่า HSA ที่ได้รับการรักษาด้วย Na2Sn ยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16 และการยับยั้งนี้ไม่ขึ้นกับจำนวนของอะตอมของกำมะถันที่เพิ่มเข้ามา ในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16 HSA ที่ได้รับการรักษาด้วย Na2Sn ยังยับยั้งระดับ ROS และ NO ที่เกิดจากรังสียูวี ในที่สุด HSA ที่บำบัดด้วย Na2Sn ยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินจาก L-DOPA และไทโรซิเนสจากเห็ด และยับยั้งขอบเขตการรวมตัวของเม็ดสีเมลานิน ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า HSA ที่ได้รับการรักษาด้วย Na2Sn ยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนสสำหรับการสังเคราะห์เมลานินผ่านสองวิถีทาง โดยการยับยั้งการส่งสัญญาณ ROS โดยตรงและโดยการกำจัด NO การค้นพบนี้บ่งชี้ว่า HSA ที่ได้รับการรักษาด้วย Na2Sn มีศักยภาพที่จะเป็นตัวเลือกที่น่าสนใจและมีประสิทธิภาพสำหรับใช้เป็นสารฟอกสีผิว
Cistanche เป็นสารฟอกสีผิว
1. บทนำ
การฉายรังสีอัลตราไวโอเลต (UV) ทำให้เกิดปฏิกิริยาออกซิเจน (ROS) ที่ทำให้เซลล์ตายในที่สุด [1] เพื่อปกป้องผิวจากอันตรายจากรังสียูวี เมลานินซึ่งเป็นเม็ดสีสีเข้มถูกผลิตโดยเมลาโนไซต์ [2] แม้ว่าเมลานินมีความสำคัญต่อสุขภาพผิว แต่ก็มีความต้องการในการเตรียมการขจัดเมลานิน เกลื้อน (melasma) เป็นภาวะที่ผิวหนังพัฒนาบริเวณที่เปลี่ยนสีซึ่งเกิดจากการผลิตเมลานินมากเกินไป และบางครั้งถือได้ว่าเป็นอุปมาของการแก่ชรา นอกจากนี้ สารยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินยังเป็นเครื่องสำอางยอดนิยมสำหรับปรับผิวให้กระจ่างใส โดยเฉพาะในประเทศแถบเอเชีย [3]
ไทโรซิเนสกระตุ้นการผลิตเมลานินจากไทโรซีนผ่าน DOPA และโดปาควิโนนในเมลาโนไซต์ [4] กิจกรรมถูกควบคุมโดยปัจจัยต่างๆ เช่น ERK1/2 และการส่งสัญญาณ Akt [5] ROS เช่น
ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่ผลิตโดยฉายรังสี UV กระตุ้นไทโรซิเนสและส่งเสริมการสังเคราะห์เมลานินในเมลาโนไซต์ [2] UV ยังทำให้เกิดการผลิตไนตริกออกไซด์ (NO) และกระตุ้นการทำงานของไทโรซิเนสผ่าน cGMP [6] ซึ่งเป็นสารตัวที่สองของ NO
ในทางกลับกัน สารประกอบไทออลที่มีฤทธิ์ต่อต้านอนุมูลอิสระได้ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในฐานะอาหารเสริม สารป้องกันรังสี และสารดัดผม [7] สารประกอบที่ประกอบด้วยไทออลจะเกิดปฏิกิริยาออกซิเดชันในตัวเองเพื่อสร้างกรดซัลโฟนิก กรดซัลฟีนิกและกรดซัลโฟนิก [8] Thiol ยังขับ NO ผ่าน S-nitrosation [8] เนื่องจากผลกระทบเหล่านี้ สารประกอบที่ประกอบด้วยไทออลจึงมักใช้ในการรักษาเกลื้อน [7,9] อย่างไรก็ตาม ผลการฟอกสีผิวของ thiols นั้นอ่อนแอมาก ความต้องการ ROS ที่มีประสิทธิภาพมากขึ้นและไม่มีสารกำจัดศัตรูพืชมีอยู่
เมื่อเร็ว ๆ นี้ได้มีการรายงานว่าสปีชีส์กำมะถันที่เกิดปฏิกิริยา (RSS) รวมทั้งซิสเทอีนเพอร์ซัลไฟด์มีฤทธิ์ในการต่อต้านอนุมูลอิสระที่แรงกว่าไทออล RSS มีหมู่ปฏิกิริยา thiol [10] และ pKa ของ RSS ส่วนใหญ่นั้นต่ำกว่าสำหรับ thiols [11] มาก ดังนั้น RSS จึงสามารถตอบสนองต่อทั้ง ROS และ NO ได้อย่างมีประสิทธิภาพ และคาดว่าจะลดขอบเขตของการผลิตเมลานิน โซเดียมโพลีซัลไฟด์ (Na2Sn), diallyltrisulfide (DATS) และ dimethyltrisulfides (DMTS) มักถูกใช้เป็นผู้ให้ RSS [12] อย่างไรก็ตาม Na2Sn มีการกักเก็บต่ำที่ pH เป็นกลางและมีกลิ่นฉุน นอกจากนี้ DATS และ DMTS ซึ่งผลิตโดยกระเทียมและหัวหอมก็มีกลิ่นเช่นกัน และศักยภาพในการรักษาดังกล่าวมีจำกัด [13] นอกจากนี้ ค่าครึ่งชีวิตของ Na2Sn ยังสั้นมากในซีรัม และจากแบบจำลองในร่างกาย จำเป็นต้องฉีดหลายครั้งเพื่อให้มีประสิทธิภาพ ดังนั้นการพัฒนา RSS- ระบบการจัดส่งแบบใหม่จึงเป็นที่ต้องการอย่างมาก
อัลบูมินในซีรัมของมนุษย์ (HSA) เป็นโปรตีนที่มีมากที่สุดในซีรัมและมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในฐานะพาหะของยา เนื่องจากมีความเข้ากันได้ทางชีวภาพและคุณสมบัติในการกักเก็บพลาสมาไว้ได้ยาวนาน [14,15] HSA มีสารตกค้างทั้งหมด 35 Cys และหนึ่งในนั้นคือ Cys34 อยู่ในรูปแบบของกลุ่มไทออลอิสระ [16] Cys34 บางครั้งเป็นเป้าหมายสำหรับไซต์ที่มีผลผูกพันยาเนื่องจากกลุ่ม thiol ที่มีปฏิกิริยา [17,18] ตัวอย่างเช่น เมื่อมีไนตริกออกไซด์ (NO) กลุ่ม Cys34 thiol จะถูก S-nitrosated ก่อนหน้านี้เราได้แสดงให้เห็นว่า S-nitrosated HSA (SNO-HSA) ช่วยให้ NO ถูกกักไว้เป็นเวลานานในซีรัม [19] SNO-HSA มีหน้าที่ทางชีวภาพที่หลากหลาย รวมถึงผลในการป้องกันตับต่อภาวะขาดเลือดขาดเลือด/การกลับเป็นซ้ำ [20] และผลในการยับยั้งเนื้องอก [21]
ด้วยเหตุนี้ เราจึงตั้งสมมติฐานว่า HSA สามารถใช้เป็นพาหะ RSS (เช่น SNO-HSA) ผ่านทาง S-sulfhydration of Cys34-SH ในฐานะที่เป็นแหล่งของโพลิซัลเฟอร์ DATS และ DMTS ถูกจำกัดเนื่องจากความชอบและความผันผวน ดังนั้น จึงใช้ Na2Sn (Na2S, Na2S2, Na2S3 และ Na2S4) ที่มีจำหน่ายในท้องตลาดในการศึกษานี้ โอกาซาวาระและคณะ อัลบูมินในซีรัมที่จับกำมะถันที่เตรียมไว้ก่อนหน้านี้ทำปฏิกิริยากับโซเดียมซัลไฟด์ (NaHS) โดยการผสมรีเอเจนต์อย่างง่าย [22] กำมะถันจาก NaHS ถูกเติมลงใน Cys34 และการเตรียมที่เป็นผลลัพธ์ป้องกันความเสียหายของตับที่เกิดจากลิปิดเปอร์ออกไซด์ เรานำวิธีการนี้มาใช้ในการเตรียม RSS-added-HSA โดยใช้ Na2Sn สำหรับการส่ง RSS
ในงานนี้ เรารายงานการจัดเตรียม HSA ที่บำบัดด้วย Na2Sn และการใช้งานเป็นระบบการนำส่ง RSS แบบใหม่ วิเคราะห์กำมะถันที่เติมโดยใช้โพรบซัลเฟนซัลเฟอร์ [23] และการกำจัดซัลไฟด์ออกจากพอลิซัลไฟด์ [24] เพื่อประเมินผลของ HSA ที่ได้รับการรักษาด้วย Na2Sn ต่อการฟอกสีผิว ผลของ HSA ที่บำบัดด้วย Na2Sn ต่อการสังเคราะห์เมลานินได้รับการศึกษาโดยใช้สายเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16
2. วัสดุและวิธีการ
2.1. วัสดุ
ซื้อเซรั่มอัลบูมินของมนุษย์ (HSA) จาก KAKETSUKEN (คุมาโมโตะ ประเทศญี่ปุ่น) และตัวอย่าง HSA ทั้งหมดถูกกำจัดไขมันด้วยการบำบัดด้วยถ่าน ซื้อโซเดียมซัลไฟด์และโซเดียมเตตระซัลไฟด์จากห้องปฏิบัติการ DOJINDO (คุมาโมโตะ ประเทศญี่ปุ่น) โพรบซัลเฟน 4 (SSP4) ถูกเตรียมตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [23] L-DOPA, กลูตาไธโอน, (DTNB), กรดแอสคอร์บิกและโซเดียม ซาติริก รีเอเจนต์ Griess (ซัลฟานิลาไมด์, แนพธิลเอทิลีนไดเอมีน-HCl) ถูกซื้อมาจาก Nakarai Chemicals (เกียวโต ประเทศญี่ปุ่น) Sephadex G-25 เสาแยกเกลือ (φ 1.6 × 2.5 ซม.) ซื้อมาจาก GE Healthcare (เกียวโต ประเทศญี่ปุ่น) สื่อ Eagle ดัดแปลง (DMEM) ของ Dulbecco และ 2,2-diphenyl-1-pi-crylhydrazyl (DPPH) ได้มาจาก Wako Pure Chemical (โอซาก้า ประเทศญี่ปุ่น) ซื้อไทโรซิเนสเห็ดจาก Sigma-Aldrich สารเคมีอื่นๆ ทั้งหมดเป็นเกรดที่ดีที่สุดที่มีจำหน่ายทั่วไป และสารละลายทั้งหมดถูกเตรียมในน้ำปราศจากไอออนและน้ำกลั่น
สารสกัดจากซิสแทนเช่
2.2. การทดสอบโปรตีน BCA
วัดความเข้มข้นของโปรตีนโดยใช้การสอบวิเคราะห์โปรตีน BCA 10 ไมโครลิตรของตัวอย่างและมาตรฐานโบวีนในเลือดอัลบูมิน (BSA) ถูกบ่มใน 100 ไมโครลิตรของบัฟเฟอร์ปฏิกิริยาที่ 25 องศา เป็นเวลา 30 นาที หลังจากทำปฏิกิริยาแล้ว เครื่องอ่านไมโครเพลทถูกใช้เพื่อวัดค่าการดูดกลืนแสง 540 นาโนเมตร BSA ถูกใช้เพื่อสร้างเส้นโค้งมาตรฐาน
2.3. การสังเคราะห์ของ Na2Sn ที่บำบัด -HSA
HSA (300 ไมโครโมลาร์) ถูกบ่มด้วยโซเดียมพอลิซัลไฟด์ (Na2Sn) 1 มิลลิโมลาร์ใน PBS (pH 7.4) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37 องศา หลังจากเกิดปฏิกิริยา โซเดียมพอลิซัลไฟด์ส่วนเกินจะถูกลบออกโดยการกรองแบบเจลด้วยคอลัมน์ Sephadex G-25
2.4. การหาอัตราการจับกำมะถันโดยวิธีกำจัดซัลไฟด์จากพอลิซัลไฟด์ (EMSP)
EMSP ถูกเตรียมตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (3×EMSP โดยการเติมกรดแอล-แอสคอร์บิก 792 มก. เป็น 5 มล. ของ 3 นิวตันของ NaOH) [24] ตัวอย่าง (7.5 ไมโครโมลาร์, 133 ไมโครลิตร) ถูกบ่มด้วย 66.7 ไมโครลิตรของ 3×EMSP เป็นเวลา 3 ชั่วโมงที่ 37 องศา จากนั้นเติมสารละลายซิงค์ อะซิเตต 1 เปอร์เซ็นต์ (600 ไมโครลิตร) ลงในสารละลายปฏิกิริยา ตามด้วยการหมุนวนทันที ตัวอย่างถูกหมุนเหวี่ยงที่ 8,{18}}×g เป็นเวลา 5 นาทีและล้างด้วยน้ำเกลือที่บัฟเฟอร์ด้วยฟอสเฟต (PBS) สองครั้ง หลังจากขจัดสิ่งเหนือตะกอนออกแล้ว น้ำที่ปราศจากไอออนและน้ำกลั่น (200 ไมโครลิตร) ถูกเติมลงในตะกอน หลังจากเติมซิงค์ อะซิเตท 1 เปอร์เซ็นต์ (300 ไมโครลิตร), 50 ไมโครลิตรของ 20 มิลลิโมลาร์ N, N-ไดเมทิล-พี-ฟีนิลีนไดไมน์ และ 20 มิลลิโมลาร์ FeCl3 ใน 7.2 N HCl สารละลายถูกบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่ 25 องศา ตัวอย่างถูกหมุนเหวี่ยงที่ 8000×g เป็นเวลา 1 นาที และถ่ายโอนไปยังเพลต 96-หลุมและ OD ที่ 665 นาโนเมตรที่วัดได้ Na2S ถูกใช้เพื่อสร้างเส้นโค้งมาตรฐาน
2.5. การตรวจหาซัลเฟนซัลเฟอร์ด้วย SSP4
แต่ละตัวอย่าง (20 ไมโครโมลาร์) ถูกบ่มด้วย SSP4 5 ไมโครโมลาร์ใน 1 มิลลิโมลาร์ Cetyltrimethylammonium Bromide / PBS (pH 7.4) เป็นเวลา 10 นาทีที่ 25 องศา หลังจากการฟักตัว การเรืองแสงที่วัดโดยสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ (JASCO Corporation) ด้วยการกระตุ้นที่ 457 นาโนเมตร การแผ่รังสีที่ 490–535 นาโนเมตร
2.6. การทดสอบอนุมูล DPPH
DPPH (250 ไมโครโมลาร์) ในเอทานอลถูกผสมกับบัฟเฟอร์ MES ปริมาณเท่ากัน (50 มิลลิโมลาร์, pH 7.4) HSA ที่บำบัดด้วย Na2Sn (40 ไมโครโมลาร์) ถูกเติมลงในสารละลาย DPPH นี้ ซึ่งจากนั้นจึงบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่ 25 องศา และการดูดกลืนแสงของอนุมูล DPPH ถูกวัดที่ 540 นาโนเมตร อัตราหัวรุนแรงที่ถูกกำจัดถูกแปลงโดยใช้สูตรต่อไปนี้
รากถอนโคน ( เปอร์เซ็นต์ )=(Abssample-Abspbs)/ Abspbs × 100
2.7. การวิเคราะห์ NO และ SNO
HSA ที่บำบัดด้วย Na2Sn (50 ไมโครโมลาร์) ถูกบ่มด้วยผู้ให้ NO, NOC7 (200 ไมโครโมลาร์) เป็นเวลา 30 นาทีที่ 25 องศา หลังจากปฏิกิริยา ความเข้มข้นของ NO และ SNO ถูกวัดโดยการทดสอบ Griess ด้วยการดัดแปลงเล็กน้อย [25] สารละลายรีเอเจนต์ Griess ถูกเตรียมโดยการผสม 0.1 เปอร์เซ็นต์ N-1- Naphtylethylene-diamide dihydrochloride และ 1 เปอร์เซ็นต์ sulfanilamide ในกรดฟอสฟอริก 2 เปอร์เซ็นต์ บัฟเฟอร์ของปฏิกิริยาประกอบด้วย 0.1 โมลาร์ NaCl, 0.5 มิลลิโมลาร์ DTPA และ 10 มิลลิโมลาร์ AcONa・AcOH (pH 5.5) ตัวอย่าง (20 ไมโครโมลาร์) ถูกทำปฏิกิริยากับสารละลายรีเอเจนต์ Griess (60 ไมโครลิตร) ในบัฟเฟอร์ปฏิกิริยา (110 ไมโครลิตร) ที่มี 3 มิลลิโมลาร์ HgCl2 ใน 10 มิลลิโมลาร์ Na Acetate (pH 5.5) หลังจากการฟักตัว 15 นาที การดูดกลืนแสง 540 nm ถูกวัดโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท อัตราส่วน NO/SNO ที่เหลือ ( เปอร์เซ็นต์ ) ถูกคำนวณและเปรียบเทียบกับค่า PBS สำหรับตัวอย่าง
2.8. การเพาะเลี้ยงเซลล์
เซลล์มะเร็งผิวหนังชนิด B16 จัดทำโดยธนาคารทรัพยากรการวิจัยโรคมะเร็งแห่งประเทศญี่ปุ่น (JCRB, โตเกียว, ญี่ปุ่น) และเพาะเลี้ยงใน DMEM ที่มีซีรั่มวัวในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์และสารละลายยาปฏิชีวนะ เซลล์ถูกเลี้ยงโดยคงสภาพไว้ที่ 37 องศาในอากาศที่มีความชื้นซึ่งมี CO2 5 เปอร์เซ็นต์ในตู้ฟัก (หมายเลข 10–20)
2.9. การผลิตเมลานิน
เซลล์มะเร็งผิวหนัง B16 ถูกเพาะในจาน 24 หลุมที่ความเข้มข้น 2.5×104 เซลล์/หลุม และเพาะเลี้ยงภายใต้ 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 ที่ 37 องศาเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ตัวอย่างถูกบำบัดด้วยไทโรซีน 0.4 มิลลิโมลาร์และ 10 มิลลิโมลาร์ NH4Cl ใน DMEM ที่มี FBS 10 เปอร์เซ็นต์และจากนั้นบ่มภายใต้คาร์บอนไดออกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์ที่ 37 องศาเป็นเวลา 72 ชั่วโมง หลังจากการฟักไข่ เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS และละลายใน 1 N NaOH (200 ไมโครลิตร) หลังจากการบ่ม 2 ชั่วโมงที่ 60 องศา การดูดกลืน (405 นาโนเมตร) จะถูกวัดโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท
Cistanche ยับยั้งการผลิตเมลานิน
2.10. รังสียูวี
ใช้หลอด UV แบบมือถือเพื่อฉายรังสีตัวอย่างที่ระยะห่าง 5 ซม. จากเพลตหลุม หลอด UV นี้ให้ความเข้ม UV ที่ 614 หรือ 743 μW/cm2 ตามลำดับ โดยมีการแผ่รังสี 254 nm หรือ 365 nm จากระยะห่าง 5 ซม.
2.11. กิจกรรมการกำจัดของ Na2S4-ที่บำบัด HSA กับ ROS ภายในเซลล์, NO, RSS
ROS และ NO ในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16 ถูกวัดโดยโพรบเรืองแสงแต่ละตัว CM-H2DCF-DA และ DAF-FM-DA ตามลำดับ เซลล์มะเร็งผิวหนัง B16 ถูกเพาะในจาน 96- หลุมที่ความเข้มข้น 1 × 104 เซลล์/หลุม และเพาะเลี้ยงใน 37 องศา , CO2 5 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากการเพาะเลี้ยง สื่อถูกดึงออกและแทนที่ด้วย CM-H2DCF-DA (5 ไมโครโมลาร์) หรือ DAF-FM-DA (10 ไมโครโมลาร์) ใน PBS เซลล์นำโพรบขึ้นมาโดยการฟักที่อุณหภูมิ 37 องศาเป็นเวลา 30 นาที หลังจากทำปฏิกิริยาแล้ว นำ supernatants ออก ตัวอย่างที่เจือจางใน PBS และวัดค่าการเรืองแสงทันที เซลล์ถูกฉายรังสีโดยหลอด UV เป็นเวลา 15 นาที หลังจากการฉายรังสี ความเข้มของการเรืองแสง (เช่น 485 nm, Em. 535 nm) ถูกวัดโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลทเรืองแสง
2.12. กิจกรรมไทโรซิเนสของเห็ดและการรวมตัวของเมลานิน
สารละลายไทโรซิเนสและ L-DOPA ถูกเตรียมใน PBS (pH 7.4) ทันทีก่อนการทดสอบ ไทโรซิเนสที่แยกได้จากเห็ดถูกใช้เพื่อตรวจสอบฤทธิ์การยับยั้งของ HSA ที่บำบัดด้วย Na2Sn ส่วน 20 ไมโครลิตรของไทโรซิเนสเห็ด (537 U/mL) และ 100 ไมโครลิตรของ HSA ที่บำบัดด้วย Na2Sn (40 ไมโครโมลาร์) ถูกผสมอย่างดีกับ PBS (60 ไมโครลิตร) ในเพลต 96 หลุม และ 20 ไมโครลิตรของ L-DOPA (5 มิลลิโมลาร์) คือ แล้วเพิ่ม หลังจากการฟักตัว 30 นาที ระดับของเมลานินสังเคราะห์ถูกวิเคราะห์โดยการวัดค่า OD 490 นาโนเมตร สำหรับการสอบวิเคราะห์การรวมกลุ่มของเมลานิน ของผสมถูกหมุนเหวี่ยงที่ 20,000 กรัม, 15 นาที เป็นเวลา 3 ชั่วโมง ลูกศรสีขาวแสดงวัสดุรวม เมลานินที่ไม่จับกลุ่มกันในส่วนลอยเหนือตะกอนถูกวัดที่ OD ที่ 490 นาโนเมตร
2.13. การทดสอบความปลอดภัย
ครีมเฉพาะที่ใช้ในการศึกษานี้จัดทำขึ้นโดยผสมน้ำ (30 มล.) น้ำมันโจโจ้บา (15 มล.) และแว็กซ์อิมัลชัน 5 กรัมที่ 60 องศา หลังจากการทำให้เย็นลง Na2S4-บำบัด HSA (20 ไมโครโมลาร์) และสารแขวนลอยที่เป็นผลลัพธ์ถูกผสมอย่างดี การทดสอบการระคายเคืองของผิวหนังดำเนินการตามแนวทางการทดสอบ OECD 439 โดยใช้ LabCyte Epi-Model (แบบจำลองผิวหนังมนุษย์ที่เพาะเลี้ยง 3 มิติ)
2.14. การวิเคราะห์ทางสถิติ
นัยสำคัญทางสถิติของข้อมูลที่รวบรวมได้รับการประเมินโดยการวิเคราะห์ ANOVA ตามด้วยวิธี Newman-Keuls มากกว่า 2 วิธี ความแตกต่างระหว่างกลุ่มได้รับการประเมินโดยการทดสอบของนักเรียน P < 0.05="">
มะเดื่อ 1.โพลีซัลเฟอร์จับกับ HSA โดยการบ่มด้วยโซเดียมโพลีซัลfiเดอ.
3. ผลลัพธ์
3.1. การเตรียม S-sulfydrated HSA
HSA ที่บำบัดด้วย Na2Sn ถูกเตรียมจาก HSA ที่ถูกบ่มด้วย Na2Sn และถูกกรองด้วยเจลหลังจากปฏิกิริยา ในการประเมินปริมาณซัลเฟนซัลเฟอร์ในตัวอย่าง เราใช้ EMSP ซึ่งเป็นวิธีการเชิงปริมาณแบบใหม่ที่เราพัฒนาขึ้นก่อนหน้านี้ [24] ดังนั้น Na2S4- ที่บำบัดด้วย HSA จึงถูกเตรียมจาก HSA และ Na2Sn โดยปล่อยให้สารทำปฏิกิริยาทำปฏิกิริยาเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37 องศา โซเดียมพอลิซัลไฟด์ในปริมาณที่แตกต่างกันได้รับอนุญาตให้ทำปฏิกิริยากับ HSA จากนั้น ตัวอย่าง HSA ถูกบ่มด้วยสารละลาย EMSP ซึ่งถูกเตรียมในขณะที่ใช้งานเป็นเวลา 3 ชั่วโมง ที่ 37 องศา ตามการวิเคราะห์ของ EMSP ระดับของ S-sulfydration เพิ่มขึ้นโดยไม่ขึ้นกับปริมาณของกำมะถัน (รูปที่ 1A) ในทางกลับกัน ดังที่แสดงในรูปที่ 1B การบำบัดด้วย Na2S3- หรือ Na2S4-เพิ่มความเข้มข้นของแสงเรืองแสง SSP4 (โพรบเรืองแสงสำหรับซัลเฟนซัลเฟอร์) เมื่อเทียบกับ Na2S- หรือ Na2S{{24 }}การบำบัด โดยบอกว่า SSP4 อาจทำปฏิกิริยากับพอลิซัลไฟด์ของโปรตีนในลักษณะที่ไม่เป็นเชิงเส้น (รูปที่ 1B)
3.2. สารต้านอนุมูลอิสระและไม่มีผลยับยั้งของ HSA . ที่บำบัดด้วย Na2S
เราตั้งสมมติฐานว่า HSA ที่ได้รับการรักษาด้วย Na2Sn จะยับยั้งการผลิตเมลานินเนื่องจากมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ ดังนั้นจึงทำการทดสอบอนุมูล DPPH [26,27] เพื่อวิเคราะห์ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระในหลอดทดลอง เป็นผลให้ HSA ที่บำบัดด้วย Na2Sn มีความเข้มข้นของกำมะถันที่เพิ่มสูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 2A) เพื่อชี้แจงผลของ NO, NOC7 (ผู้ให้ NO) ถูกบ่มร่วมกับ Na2S4-ที่ถูกบำบัด HSA ที่ 25 องศา หลังจากระยะฟักตัว 30 นาที ความเข้มข้นของ NO ที่เหลือจะถูกหาปริมาณโดยการสอบวิเคราะห์ Griess ตามที่เห็นในแท่งปิดของรูปที่ 2B, Na2S4-ที่ถูกบำบัด HSA กำจัด NO มากกว่าอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมและ HSA (รูปที่ 2B) ธาตุปรอท (Hg) เป็นที่รู้จักกันในการลด SNO และปล่อย NO2- เมื่อ Hg ถูกเติมลงในสารละลายของ Na2S4- HSA ที่บำบัดแล้ว NO2- จะถูกปลดปล่อยออกมา ซึ่งบ่งชี้ว่า HSA ที่บำบัดด้วย Na2S4- ถูกกำจัดโดยทาง S-nitrosation
มะเดื่อ 2.คุณสมบัติต่อต้านอนุมูลอิสระของ Na2Sn- ได้รับการรักษาด้วย HSA
3.3. ผลการยับยั้งเมลานินของ HSA . ที่บำบัดด้วย Na2Sn
เซลล์มะเร็งผิวหนังของหนู B16 ได้รับการเพาะเลี้ยงและการสังเคราะห์เมลานินได้รับการส่งเสริมโดยการเพิ่มไทโรซีนลงในสื่อ ดังแสดงในรูปที่ 3 HSA ที่บำบัดด้วย Na2Sn ยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินและการยับยั้งขึ้นอยู่กับปริมาณกำมะถัน ภาพเซลล์ของเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16 หลังการใช้ HSA ที่ได้รับการรักษาด้วย Na2Sn ยังแสดงให้เห็นว่า HSA ที่ได้รับการรักษาด้วย Na2Sn ลดอัตราส่วนการผลิตเมลานินเซลล์บวก (รูปที่ 3)
3.4. ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของ Na2S4-ที่บำบัด HSA ด้วยการฉายรังสี UV
เพื่อตรวจสอบว่า HSA ที่บำบัดด้วย Na2Sn ยับยั้งการก่อตัวของ ROS หรือ NO ที่เกิดจากรังสียูวีหรือไม่ การทดสอบความเครียดออกซิเดชันได้ดำเนินการโดยใช้เซลล์มะเร็งผิวหนัง B16 เป็นแบบจำลอง การผลิต ROS โดย Na2S4-ที่บำบัด HSA ในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16 โดยการฉายรังสีด้วยอุปกรณ์ UV ที่แตกต่างกัน 2 เครื่องเป็นเวลา 15 นาทีถูกวัดโดย CMH2-DCF-DA ผลการวิจัยระบุว่า Na2S4- HSA ที่บำบัดแล้วทำให้การเรืองแสงของ CMH2-DCF-DA เป็น PBS และ HSA ลดลงอย่างมีนัยสำคัญโดยการฉายรังสีที่ 254 nm และ 365 nm (รูปที่ 4AB) ในทางกลับกัน HSA ที่บำบัดด้วย Na2S4-ยังยับยั้งการผลิต NO ในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16 โดยการฉายรังสีด้วย UV 254 นาโนเมตร (รูปที่ 4CD) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า HSA ที่ได้รับการรักษาด้วย Na2Sn ยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินโดยการยับยั้ง ROS และ NO ที่เกิดจากการฉายรังสี UV
3.5. การปราบปรามโดยตรงของการรวมตัวของไทโรซิเนสและเมลานินโดย HSA . ที่บำบัดด้วย Na2Sn
สารต่อต้านเมลานินทางการค้าบางชนิดสามารถยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนสได้โดยตรง ดังนั้นเราจึงทดสอบว่า HSA ที่ได้รับการรักษาด้วย Na2Sn เปลี่ยนแปลงการทำงานของไทโรซิเนสหรือไม่ ผลการวิจัยระบุว่า HSA ที่ได้รับการรักษาด้วย Na2Sn สามารถยับยั้งไทโรซิเนสของเห็ดได้ในระดับที่มากกว่า HSA ที่ไม่ผ่านการบำบัด (รูปที่ 5A) หลังจากที่ถูกสร้างขึ้นแล้ว เมลานินจะเข้าสู่การรวมตัวและทำให้เกิดการสร้างเมดัลลาได้อย่างง่ายดาย [28] ดังนั้นเราจึงพูดถึงประเด็นต่อไปว่า HSA ที่ได้รับการรักษาด้วย Na2Sn ยับยั้งการรวมตัวของเมลานินหรือไม่ ดังนั้น เมื่อไทโรซิเนสและ L-DOPA ถูกบ่มด้วยกันเป็นเวลา 3 ชั่วโมง เม็ดสีเมลานินก็กลายเป็นการรวมตัว แต่ HSA ที่บำบัดด้วย Na2Sn ป้องกันการรวมกลุ่ม (รูปที่ 5B) ในอีกด้านหนึ่ง HSA ยังพบว่ายับยั้งการรวมตัว ซึ่งบ่งชี้ว่า HSA เองสามารถป้องกันการจับของ L-DOPA กับไทโรซิเนสได้
มะเดื่อ 3.Effอื่นๆ ของ Na2Sn- รักษา HSA ในการสังเคราะห์เมลานินในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16
3.6. การทดสอบความปลอดภัยของ HSA ที่บำบัดด้วย Na2Sn โดยใช้ผิวหนังมนุษย์ที่เพาะเลี้ยง 3 มิติ
การทดสอบการระคายเคืองผิวหนังสำหรับ Na2S4- HSA ที่บำบัดได้ดำเนินการโดยใช้เซลล์ผิวหนังของมนุษย์ที่เพาะเลี้ยง 3 มิติตามแนวทางของ OECD ด้วยเหตุนี้ จำนวนเซลล์ที่รอดชีวิตจึงไม่ลดลงโดย Na2S4-ที่บำบัดด้วย HSA โดยมี/ไม่ใช้ครีมทาเฉพาะที่ (รูปที่ 6A) การใช้ชุดตรวจหาความเป็นพิษต่อเซลล์ของ LDH ยังเผยให้เห็นว่าเซลล์ผิวหนังไม่ได้รับความเสียหายจาก HSA ที่บำบัดด้วย Na2S4- (รูปที่ 6B) ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่า HSA ที่ได้รับการรักษาด้วย Na2Sn มีความปลอดภัยสูงสำหรับใช้กับผิวหนังมนุษย์ภายใต้ความเข้มข้นที่ตรวจสอบในการศึกษานี้
มะเดื่อ 4.ROS และ NO scavenging effect ของNa2S4- บำบัดด้วย HSA ภายใต้การฉายรังสี UV
4. การอภิปราย
เมลานินถูกสังเคราะห์โดยปฏิกิริยาออกซิเดชันของไทโรซีน ไทโรซีนถูกออกซิไดซ์เป็น L-DOPA และโดปาควิโนนโดยการกระทำของไทโรซิเนส โดปาควิโนนถูกออกซิไดซ์ตามธรรมชาติไปเป็นเมลานิน เมลานินกระตุ้นการสร้างเม็ดสีดำและกระ แต่ยังมีบทบาทในการปกป้องผิวจากการถูกทำลายจากรังสียูวี ในผิวหนังของมนุษย์ เมลาโนไซต์จะผลิต ROS และ NO เมื่อถูกกระตุ้นโดยรังสียูวี [2,29,30] ROS ส่งเสริมการสังเคราะห์เมลานินโดยกระตุ้น tyr-osinase ผ่านการกระทำของ ATP synthase, phenylalanine hydroxylase และ phosphorylation ของ MAPKs [31,32] NO เปิดใช้งานไทโรซิเนสโดยการเพิ่มระดับเซลล์ของ cGMP [6] ดังนั้น ROS และ NO scavengers จึงถือเป็นสารต่อต้านการสร้างเม็ดสี ในที่นี้ เราได้ตรวจสอบผลการสังเคราะห์สารต้านเมลานินของ HSA ที่บำบัดด้วย Na2Sn HSA ที่บำบัดด้วย Na2Sn ยับยั้งระดับเซลล์ของ ROS และ NO ที่เกิดจากรังสี UV อย่างรุนแรง (รูปที่ 4) นอกจากนี้ HSA ที่บำบัดด้วย Na2Sn มีผลโดยตรงต่อการยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนส (รูปที่ 5A) และการรวมตัวของเมลานิน (รูปที่ 5B) เราไม่สามารถชี้แจงกลไกสำหรับการถ่ายโอนซัลเฟนซัลเฟอร์จาก HSA ที่บำบัดด้วย Na2Sn ไปยังเซลล์ได้อย่างไร ดังนั้น ธรรมชาติของผลกระทบโดยตรงของฟังก์ชัน HSA ที่บำบัดด้วย Na2Sn ยังคงไม่ชัดเจน ยามาชิตะและคณะ แสดงให้เห็นว่าโดปาควิโนนจับกับโปรตีนไทออลผ่านซิสเทอีนตกค้าง [33] เมื่อนำมารวมกัน การยับยั้งการรวมตัวของเมลานินโดย HSA ที่บำบัดด้วย HSA และ Na2Sn อาจเกี่ยวข้องกับการก่อรูปพันธะไดซัลไฟด์ด้วยโดปาควิโนนหรือเมลานิน ในทางกลับกัน การยับยั้งไทโรซิเนสขึ้นอยู่กับเนื้อหาของกำมะถันที่เติม (รูปที่ 5A) เป็นที่ทราบกันดีว่า GSH จับไทโรซิเนสและลดการทำงานของมัน [34] เนื่องจากซิสเทอีน S-sulfhydrated มีปฏิกิริยาที่แรงกว่าซิสเทอีนปกติ [11] กลูตาไธโอนเพอร์ซัลไฟด์ (GSSH) อาจยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนสมากกว่า GSH จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับประเด็นที่ว่า HSA ที่ได้รับการรักษาด้วย Na2Sn จะเพิ่ม GSSH ภายในเซลล์หรือไม่ในอนาคต
ROS เกิดจากการฉายรังสี UV หรือความเครียดจากภายนอกทำให้เกิดสัญญาณของริ้วรอย ไม่เพียงแต่ในรูปแบบของการสังเคราะห์เมลานิน แต่ยังเกิดจากการปรากฏของริ้วรอยและผิวหย่อนคล้อยที่เกิดจากความเสียหายของ DNA และการก่อตัวของคอลลาเจนที่เชื่อมโยงกัน เป็นที่ทราบกันดีว่า ROS เป็นปัจจัยที่ทำให้เกิดการอักเสบหลายประเภท เช่น สิวและโรคสะเก็ดเงิน สารฟอกสีผิวต่างๆ เช่น tranexamic acid [35] และ arbutin [36] ได้รับการออกแบบมาเพื่อแก้ไขปัญหาเหล่านี้ อย่างไรก็ตาม สารประกอบเหล่านี้ยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินเท่านั้น และไม่มีผลต่อความเครียดออกซิเดชัน ดังนั้น ความเสี่ยงของความเป็นพิษที่เกิดจาก ROS ยังคงอยู่ ข้อดีของการใช้ HSA ที่บำบัดด้วย Na2Sn คือสามารถกำจัด ROS ได้อย่างมีประสิทธิภาพ (รูปที่ 2 และ 4)
ไฮโดรเจนซัลไฟด์ได้รับการศึกษาว่าเป็นโมเลกุลจำเป็นลำดับที่สามรองจากไนตริกออกไซด์และคาร์บอนมอนอกไซด์ ผลการรักษาของไฮโดรเจนซัลไฟด์ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าใช้ได้กับการรักษาภาวะขาดเลือดขาดเลือด/ การกลับเป็นซ้ำ [37], หลอดเลือด [38], ภาวะติดเชื้อ [39] และความเป็นพิษที่เกิดจากอาหารที่มีไขมันสูง [40] นอกจากนี้ ไฮโดรเพอร์ซัลไฟด์ยังมีกิจกรรมที่สูงกว่าไฮโดรเจนซัลไฟด์ ตัวอย่างเช่น Na2S4 ล้างพิษเมทิลเมอร์คิวรีอย่างมีประสิทธิภาพและยับยั้งการสร้างความแตกต่างของเซลล์นิวโรบลาสโตมา ในขณะที่ Na2S ไม่ [12,41] ดังนั้น ไม่เพียงแต่จะมีผลทำให้ผิวขาวขึ้นเท่านั้น แต่ยังมีผลในเชิงบวกอื่นๆ ของ HSA ที่ได้รับการรักษาด้วย Na2Sn ด้วย
โดยสรุป เรารายงานเกี่ยวกับการพัฒนาระบบกำจัด RSS แบบใหม่โดยใช้เซรั่มอัลบูมินเป็นตัวพาที่เสถียร กำมะถันปฏิกิริยาเมื่อรวมกับ HSA มีฤทธิ์ต่อต้านอนุมูลอิสระที่แรงกว่า HSA และยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินในเซลล์มะเร็งผิวหนัง กลไกการต่อต้านการสร้างเมลาโนเจเนซิสไม่เพียงเกี่ยวข้องกับ ROS และ NO scavenging แต่ยังรวมถึงการปราบปรามกิจกรรมของไทโรซิเนสและการรวมตัวของเมลานิน ดังนั้น HSA ที่ได้รับการรักษาด้วย Na2Sn มีศักยภาพมากในการใช้เป็นสารฟอกสีผิวที่ปลอดภัย
นี่คือผลิตภัณฑ์ของเรา
สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมกรุณาคลิกที่ภาพ
