กิจกรรมต่อต้านออกซิเดชันและต่อต้านวัยของคอลลาเจนไฮโดรไลเสตผลพลอยได้จากสุกรที่ผลิต ตอนที่ 2

โปรดติดต่อoscar.xiao@wecistanche.comสำหรับข้อมูลเพิ่มเติม

2.2. ผลการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชันต่อคุณสมบัติของคอลลาเจนไฮโดรไลเสต

กระบวนการอัลตราฟิลเตรชันอาจเป็นวิธีการที่มีประโยชน์และได้เปรียบทางอุตสาหกรรมสำหรับการผลิตเศษส่วนของเปปไทด์ขนาดเล็กที่มีขนาดโมเลกุลที่ต้องการและมีฤทธิ์ทางชีวภาพสูง ซึ่งขึ้นอยู่กับองค์ประกอบของไฮโดรไลเสตเริ่มต้นและกิจกรรมที่กำลังศึกษา [19] ความสามารถในการละลาย, ปริมาณอะมิโนอิสระ และผลผลิตของ CH หลังจากการทำให้เยือกแข็งถูกแสดงไว้ (ตารางที่ 1) ปริมาณการละลายและปริมาณอะมิโนอิสระของกลุ่มควบคุมคือ 11.95 เปอร์เซ็นต์และ 0.79 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ หลังจากการไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์และอัลตราฟิลเตรชันด้วยการตัดน้ำหนักโมเลกุล 3 kDa ความสามารถในการละลายสูงสุด (21.17 เปอร์เซ็นต์ ) และปริมาณอะมิโนอิสระ (14.17 เปอร์เซ็นต์ ) ถูกสังเกตพบใน CH-Alcalase<3 kda.="" however,=""><3 kda="" was="" the="" lowest="" yield="" (12.42%)observed.="" therefore,="" although="" ultrafiltration="" is="" useful="" in="" separating="" chs="" with="" a="" low="" molecular="" weight="" it="" may="" cause="" a="" reduction="" in="">

น้ำหนักโมเลกุลเฉลี่ยของโปรตีนไฮโดรไลเสตเป็นปัจจัยสำคัญที่กำหนดคุณสมบัติทางชีวภาพ [19] โดยทั่วไป เศษส่วนเฉลี่ยที่มี MW<3 kda="" represents="" a="" collagen="" hydrolysate;="" an="" average="" fraction="" with="" mw="">50 kDa represents gelatin, and an average fraction with MW>300 kDa แทนคอลลาเจน [20,21] การกระจายน้ำหนักโมเลกุลสัมพัทธ์ของกลุ่มควบคุม (ตัวอย่างการปรับสภาพ), CH-Alcalase และ CH-Alcalase<3 kda="" is="" depicted="" in="" figure="" 4.="" the="" molecular="" weight="" distribution="" was="" over="" 20,100="" da="" for="" the="" control,="" which="" did="" not="" include="" the="" collagen="" hydrolysate=""><3 kda).="" this="" could="" not="" be="" numerically="" provided="" in="" this="" study,="" as="" the="" detection="" limit="" of="" the="" index="" detector="" system="" only="" ranged="" from="" 106="" to="" 20,100="" da.="" however,="" ch-alcalase="" showed="" detectable="" values="" in="" a="" higher="" range="" of="" relative="" molecular="" weight="" distribution,="" which="" ranged="" from="" 20,100="" da="" to="" 4270="" da="" (maximum="" peak:12,600="" da).="" in=""><3 kda,="" the="" molecular="" weight="" distribution="" mainly="" showed="" three="" peaks:="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 4270="" da="" (maximum="" peak),="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 424="" da,="" and="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 222="" da="" and="" 102="" da.="" ultrafiltration="" is="" an="" effective="" purification="" method="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight="" peptides="" from="" crude="" hydrolysates.="" results="" indicated="" that="" enzymatic="" hydrolysis="" by="" alcalase="" clearly="" reduced="" the="" high="" mw="" of="" the="" control="" (either="" collagen="" or="" gelatin),="" and="" that="" ultrafiltration="" was="" an="" effective="" purification="" method="" that="" can="" be="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight=""><3 kda)="" from="" crude="" collagen="" hydrolysates.="" reportedly,="" low="" molecular="" weight="" peptides="" (2-20="" amino="" acids)="" are="" more="" biologically="" active="" compared="" to="" their="" parent="" polypeptide/proteins,="" which="" are="" larger="">

กรุณาคลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

แสดงองค์ประกอบของกรดอะมิโนใน CHs (ตารางที่ 2) CHS โดยโปรตีเอสที่แตกต่างกันมีองค์ประกอบของกรดอะมิโนและคุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระที่แตกต่างกัน [23] องค์ประกอบของกรดอะมิโนของคอลลาเจนอุดมไปด้วยไกลซีน (Gly), โพรลีน (Pro) และกรดกลูตามิก (Glu) ปริมาณกรดอะมิโนของ CHs(CH-Alcalase และ CH-Alcalase<3 kda)="" increased="" more="" than="" that="" of="" the="" control,="" following="" enzymatic="" hydrolysis="" with="" or="" without="" ultrafiltration.="" in="" particular,="" the="" content="" of="" gly,="" pro,="" and="" glu="" was="" much="" higher="" in=""><3 kda(gly="" 218="" mg/g,="" pro="" 152="" mg/g,="" and="" glu="" 120="" mg/g)="" than="" ch-alcalase(gly149="" mg/g,="" pro="" 95="" mg/g,="" and="" glu78="" mg/g).="" an="" increase="" in="" the="" content="" of="" these="" amino="" acids="" is="" strongly="" related="" to="" enhanced="" antioxidant="" capabilities="" [16,20].="" gly="" and="" pro="" contain="" hydrophobic="" amino="" acid="" groups,="" and="" glu="" contains="" negatively="" charged="" amino="" acid="" groups.="">cistanche ก้านมีรายงานว่ากรดอะมิโนเหล่านี้ช่วยเพิ่มฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระเนื่องจากความสามารถในการละลายที่เพิ่มขึ้นในไขมันหรือผ่านปฏิกิริยาอนุมูลอิสระ [1,24]

2.3. ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและต่อต้านริ้วรอยของคอลลาเจนไฮโดรไลเสต

การมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของ CHs ถูกวัดโดยใช้ 2,2'-และ-bis-(3-เอทิลเบนโซไทอะโซลีน-6-กรดซัลโฟนิก)(ABTS)การหาปริมาณสารอนุมูลอิสระและการสอบวิเคราะห์กำลังรีดิวซ์ กิจกรรมกำจัดอนุมูลอิสระของ ABTS ของกลุ่มควบคุม (สารแขวนลอยคอลลาเจน), CH-Alcalase และ CH-Alcalase<3 kda="" at="" different="" concentrations="" is="" shown="" (figure="" 5a).abts="" radical="" scavenging="" activity="" of="" peptides="" assay="" is="" important="" to="" exclusively="" measure="" the="" ability="" of="" an="" antioxidant="" peptide="" to="" induce="" a="" hydrogen="" atom="" transfer="" [25].="" abts="" radical-scavenging="" effects="" of="" all="" treatments="" increased="" in="" a="" concentration-dependent="" manner=""><0.05). ch-alcalase="" and=""><3 kda="" showed="" much="" higher="" abts="" radical-scavenging="" activity="" values,="" with="" 41.4%-88.2%="" compared="" to="" the=""><8.5%. both="" ch-alcalase="" and=""><3 kda="" had="" high="" abtsradical-scavenging="" abilities="" of="" ~60%="" when="" concentrations="" were="" greater="" than="" 2.5="" mg/ml.=""><3 kda="" showed="" a="" significantly="" higher="" abts="" radical-scavenging="" activity="" value="" than="" ch-alcalase.="">ซิสแทนเช่ ซัลซ่าสกัดโดยทั่วไป ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของเปปไทด์อาจได้รับอิทธิพลจากลำดับกรดอะมิโนของพวกมัน จำนวนของกรดอะมิโนอิสระที่มีอยู่ ระดับของการไฮโดรไลซิส และน้ำหนักโมเลกุลของเปปไทด์ [26,27] โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ไฮโดรไลเสตที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำมีคุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระที่แข็งแกร่งกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับไฮโดรไลเสตที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูง [2,26]

รูปที่ 5. ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของคอลลาเจนไฮโดรไลเสต (CH) ใน 2,2'-and-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS)radical scavenging(A)และกำลังรีดิวซ์ (B) ตรวจ ข้อมูลที่เขียนด้วยตัวอักษรต่างกัน (ac) แสดงให้เห็นความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติโดยขึ้นอยู่กับการรักษาที่แตกต่างกัน (p<0.05).>ประโยชน์ของ cistanche tubulosa และผลข้างเคียงข้อมูลที่แสดงด้วยตัวอักษรต่างๆ (AD) จะแสดงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติโดยขึ้นอยู่กับความเข้มข้น (p < 0.05)

Cistanche สามารถต่อต้านริ้วรอย

กำลังรีดิวซ์ของตัวควบคุม CH-Alcalase และ CH-Alcalase<3 kda="" are="" shown="" (figure="" 5b).="" the="" reducing="" power="" of="" peptides="" may="" also="" serve="" as="" a="" significant="" indicator="" of="" their="" antioxidant="" potential="" [28,29].="" the="" reducing="" power="" of="" chs="" ranged="" from="" 0.074="" to="" 0.424="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.05). the="" control="" group="" had="" the="" lowest="" reducing="" power,="" which="" did="" not="" change="" significantly="" with="" increasing="" concentrations="" of="" the="" control.="" in="" contrast="" to="" abts="" radical-scavenging="" activity,="" the="" reducing="" power="" of="" ch-alcalase="" was="" higher="" than="" that="" of=""><3 kda.="">สารสกัดจากซิสแทนเช่ทูบูโลซ่าการสังเกตที่คล้ายคลึงกันชี้ให้เห็นว่าคอลลาเจนไฮโดรไลเสตแบบหยาบอาจมีประสิทธิภาพในการลดพลังงานได้ดีกว่าคอลลาเจนเปปไทด์แบบอัลตราฟิลเตรด [30]

การยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนส คอลลาเจนเนส และอีลาสเทสถูกใช้เพื่อตรวจสอบฤทธิ์ในการต่อต้านริ้วรอยในหลอดทดลอง [20] ผลการยับยั้งการทำงานของ tyrosinase, collagenase และ elastase ของ control, CH-Alcalase และ CH-Alcalase<3 kda="" are="" summarized="" (table="" 3).="" tyrosinase,="" collagenase,="" and="" elastase="" inhibitors="" have="" been="" used="" as="" important="" ingredients="" of="" cosmetics="" for="" skin="" whitening,="" anti-aging,="" and="" anti-wrinkling,="" respectively.="" collagenase="" and="" elastase,="" especially,="" are="" known="" to="" be="" major="" enzymes="" responsible="" for="" dehydration="" and="" wrinkle="" formation="" on="" the="" skin="" surface[31].="" the="" results="" indicated="" that="" the="" tyrosinase="" inhibition="" effect="" of="" vitamin="" c(95.50%,1="" mg/ml,="" positive="" control)="" was="" higher="" than="" that="" of="" the="" other="" treatments(table="" 4).="" tyrosinase="" inhibition="" effects="" of="" control,="" ch-alcalase,="" and=""><3 kda="" groups="" were="" 28.21%,="" 15.44%,="" and="" 30.20%,="" respectively.="" thus,="" the="" chs="" did="" not="" show="" a="" better="" skin="" whitening="" effect="" compared="" to="" the="" control.="" collagenase="" inhibition="" by="" the="" control,="" ch-alcalase,="" and=""><3 kda="" groups="" were="" 6.45%,54.37%,="" and="" 61.90%,="" respectively.="" in="" addition,="" ch-alcalase="" and=""><3 kda="" inhibition="" of="" collagenase="" corresponded="" to="" that="" of="" vitamin="" cat="" 1="" mg/ml.="" thus,="" chs="" obtained="" from="" this="" study="" may="" be="" effective="" collagenase="" inhibitors="" that="" may="" possibly="" play="" an="" important="" role="" in="" anti-aging="" activities.="" however,="" all="" collagen="" samples="" did="" not="" display="" elastase="" inhibition="" effects,="" which="" may="" result="" from="" a="" lack="" of="" skin="" elasticity.="" overall,="" vitamin="" c(1="" mg/ml)="" inhibited="" various="" activities="" of="" the="" enzymes="" in="" the="" following="" order:="" tyrosinase(95.50%)="">collagenase(48.09)> elastase(2/.00%o).CH-Alcalase(5 mg/mL)inhibited various activities of the enzymes in the following order: collagenase (54.37%)> tyrosinase (15.44%)>elastase (ไม่มีกิจกรรม) CH-Alcalase<3 kda="" (5="" mg/ml)="" inhibited="" these="" activities="" in="" the="" following="" order:="" collagenase="" (61.90%)="">tyrosinase (30.20%)>elastase (ไม่มีกิจกรรม) แนวโน้มที่คล้ายกันที่รายงานในการศึกษาอื่นระบุว่าคอลลาเจนไฮโดรไลเสตมีศักยภาพที่จะทำหน้าที่เป็นสารต่อต้านริ้วรอยและสารยับยั้งคอลลาเจน [20]

3. วัสดุและวิธีการ

3.1. การปรับสภาพผิวสุกร

หนังหมูถูกซื้อจากซัพพลายเออร์ในท้องถิ่น (โซล เกาหลี) และเนื้อเยื่อไขมันและเนื้อเยื่อเกี่ยวพันที่มองเห็นได้ทั้งหมดของผิวหนังสุกรถูกเอาออกโดยใช้ใบมีดโกน หนังสุกรที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ได้มาจากหมูตัวหนึ่งเพื่อลดการเปลี่ยนแปลงทางชีวภาพ ล้างผิวสุกรที่ตัดแต่งแล้วในน้ำที่อุณหภูมิ 90 องศาเป็นเวลา 1 นาทีสี่ครั้งเพื่อขจัดไขมันและสารตกค้าง จากนั้นตัดผิวหนังเป็นชิ้นสี่เหลี่ยมขนาด 1 ซม. และบดในน้ำกลั่นเป็นเวลา 3 นาทีโดยใช้เครื่องปั่นแบบสี่ปีก (CNHR-26, Bosch, Hong Kong, China) ผิวสุกรที่บดแล้วถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันที่ความเร็วสูง (25,000รอบต่อนาที) เป็นเวลา 5 นาทีโดยใช้ Ultra Turrax(T25, IKA Labotechnik, Staufen, Germany) ส่วนผสมหนังสุกรประมาณ 100 กรัม (ปริมาณของแข็งสุดท้าย 50 เปอร์เซ็นต์) ถูกบรรจุในสุญญากาศและแช่แข็งที่ -20 องศา และเก็บไว้เพื่อใช้ภายใน 1 เดือน

3.2. โปรตีเอสและรีเอเจนต์เชิงพาณิชย์

ซื้อ Alcalase, Flavourzyme, Neutrase และ Protamex จาก Novozymes (Bagsvaerd, Denmark) Bromelain และ Papain ถูกซื้อมาจาก Daesong Sangsa (โซล, เกาหลี) ซื้อสารเคมีทั้งหมดสำหรับการทดสอบสารต้านอนุมูลอิสระและต่อต้านริ้วรอยจาก Sigma-Aldrich Chemical Company (St.Louis, MS, USA) รีเอเจนต์และตัวทำละลายอื่นๆ ทั้งหมดที่ใช้ในการศึกษานี้เป็นระดับการวิเคราะห์

3.3. เอนไซม์ไฮโดรไลซิส

การไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์ได้รับการพัฒนาสำหรับเอนไซม์เชิงพาณิชย์เกรดอาหารที่ใช้ (ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ตารางที่ 4) ส่วนผสมของหนังสุกรที่เตรียมไว้ถูกเจือจางด้วยน้ำกลั่นจนเป็นของแข็งสุดท้ายที่ 5 เปอร์เซ็นต์ ความเข้มข้นนี้ถูกเลือกเพื่อให้แน่ใจว่ามีพฤติกรรมการไหลเนื่องจากมีความหนืดต่ำ ส่วนผสมของผิวสุกร 5 เปอร์เซ็นต์เรียกว่าสารแขวนลอยคอลลาเจน (หรือกลุ่มควบคุม) สารแขวนลอยคอลลาเจนถูกไฮโดรไลซ์ในเครื่องปฏิกรณ์โดยใช้เอนไซม์เชิงพาณิชย์เกรดอาหารหกตัวที่เอนไซม์: อัตราส่วนซับสเตรตที่ 1:100 ตัวอย่างส่วนลิควอต (5 มล.)ถูกดึงออกมาที่ 1, 3,6, 12 และ 24 ชั่วโมงของการไฮโดรไลซิสและให้ความร้อนทันทีที่ 100 องศาเป็นเวลา 10 นาทีเพื่อหยุดการทำงานของเอนไซม์ ตามด้วยการทำให้เย็นลงถึง 0 องศาโดยใช้น้ำเย็นจัด ในช่วงเวลาของการสุ่มตัวอย่าง ค่า pH ถูกควบคุมโดยใช้ NaOH 1 โมลาร์ ตามความเหมาะสม หลังจากการระบายความร้อน ตัวอย่างถูกหมุนเหวี่ยงที่ 4000×g เป็นเวลา 15 นาที และส่วนลอยเหนือตะกอน (คอลลาเจน ไฮโดรไลเสต; CH) ถูกรวบรวม CH ถูกทำให้เข้มข้นมากขึ้นโดยอัลตราฟิลเตรชัน โดยใช้ระบบ AmiconStirred Cells (Catalog No. UFSC 20001, EMD Millipore Corporation, Burlington, MA, USA) ด้วยการตัดน้ำหนักโมเลกุล 3 kDa (MWCO) (UltracelMembrane, EMD Millipore Corporation, Burlington, แมสซาชูเซตส์ สหรัฐอเมริกา) ที่ก๊าซไนโตรเจน 60 psi ที่ 20 องศาcistanche tubulosa บทวิจารณ์CH ที่เตรียมไว้ถูกทำให้แห้งเยือกแข็งและเก็บไว้ในภาชนะที่ปิดสนิทที่อุณหภูมิ 20 องศาจนกระทั่งทำการวิเคราะห์

3.4. การหาค่า pH การนำโปรตีนกลับมาใช้ใหม่ ปริมาณอะมิโนที่ปราศจากการละลาย และผลผลิต ค่า pH ของตัวอย่าง (กลุ่มควบคุมและ CH) ถูกกำหนดโดยใช้เครื่องวัดค่า pH (รุ่น S220, Mettler Toledo GmbH, Columbus, OH, USA) การกู้คืนโปรตีนหรือความสามารถในการละลายถูกกำหนดโดยการประมาณปริมาณโปรตีนโดยใช้การทดสอบโปรตีนกรด bicinchoninic (BCA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต (Sigma-Aldrich, St. Louis, MS, USA) โดยมี albumin ในซีรัมเป็นมาตรฐาน ปริมาณอะมิโนอิสระถูกกำหนดหาโดยการวิเคราะห์กรดทริไนโตรเบนซีนซัลโฟนิก (TNBSA) 2,4,6- ตามคำแนะนำของผู้ผลิต (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) โดยใช้ L-leucine เป็นมาตรฐาน วัดทั้งน้ำหนักเปียกและแห้งเพื่อคำนวณพื้นที่การผลิต

3.5. การกระจายน้ำหนักโมเลกุล

3.5.1.โซเดียม โดเดซิล ซัลเฟต-โพลีอะคริลาไมด์ เจล อิเล็กโทรโฟรีซิส (SDS-PAGE)

รูปแบบ SDS-PAGE ของตัวอย่าง (กลุ่มควบคุมและ CH) ถูกวัดตามวิธีการที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ [10] ตัวอย่างถูกเจือจางด้วยยูเรีย 8 โมลาร์ (ความเข้มข้นของโปรตีนสุดท้าย,4 มก./มล.) แต่ละตัวอย่างถูกผสมกับบัฟเฟอร์ตัวอย่าง KTG 020 หนึ่งส่วน (10 เปอร์เซ็นต์ของกลีเซอรอล, 2 เปอร์เซ็นต์ของ SDS, 0.003 เปอร์เซ็นต์ของโบรโมฟีนอลบลู, 5 เปอร์เซ็นต์ของ -mercaptoethanol และ 63 mM Tris-HCl, pH6.8) จาก KOMA Biotech Inc ., （โซล, เกาหลี）, และต้ม 2 นาที. ส่วนผสมตัวอย่าง (20 ไมโครลิตร) ถูกบรรจุลงในเจลอะคริลาไมด์ EzWayTM PAG 6 เปอร์เซ็นต์ (KOMA Biotech Inc. กรุงโซล ประเทศเกาหลี) หลังจากอิเล็กโตรโฟรีซิส เจลได้รับการแก้ไข ย้อมสี และขจัดคราบ น้ำหนักโมเลกุลถูกกำหนดหาโดยใช้มาตรฐานน้ำหนักโมเลกุลช่วงกว้างระหว่าง 10 ถึง 210 kDa

3.5.2. โครมาโตกราฟีการซึมผ่านของเจล (GPC)

การกระจายน้ำหนักโมเลกุลของตัวอย่างถูกกำหนดตามวิธีการที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ [3] โครมาโตกราฟีการซึมผ่านของเจล (GPC) ถูกดำเนินการโดยใช้ระบบโครมาโตกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง (HPLC) YL9100 (YL9100, Youngling Instrument Co., Ltd, Gyeonggi-do, เกาหลี) ที่ติดตั้ง Ultrahydrogel TM 120 สามคอลัมน์ ( 7.8×3000 มม.) จาก Waters (Milford, MA, USA) เฟสเคลื่อนที่คือน้ำกลั่น/ปราศจากไอออนที่อัตราการไหล 1.0 มล./นาที และการกระจายน้ำหนักโมเลกุลของคอลลาเจนเปปไทด์ถูกเฝ้าติดตามโดยใช้เครื่องตรวจจับดัชนีการหักเหของแสง YL 9100 ที่ 40 องศา ชุดมาตรฐานน้ำหนักโมเลกุล (106-67,500 Da, Polymer Standards Service, Mainz, Germany) ทำหน้าที่เป็นมาตรฐาน

3.6.อะมิน0 องค์ประกอบของกรด

องค์ประกอบกรดอะมิโนของตัวอย่างถูกวิเคราะห์ผ่านการทำให้เกิดอนุพันธ์ด้วย {{0}}fluorenyl ethoxy carbonyl (FMOC)-chloride และ o-phthalic dialdehyde (OPA) บนระบบ Ultimate 3000 HPLC ( Dionex, Idstein, Germany)ติดตั้งอุปกรณ์ตรวจจับสองตัว (ตัวตรวจจับเรืองแสงและตัวตรวจจับ UV) และ VDSpher 100 C18-E (4.6 มม. ×150 มม., ขนาดอนุภาค 3.5 ไมครอน, VDS Optilab, เบอร์ลิน, เยอรมนี) ปริมาตรการฉีดคือ 1.0 ลิตร และเฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยสารชะสองตัว: 40 มิลลิโมลาร์ โซเดียม ฟอสเฟต ไดบาซิก (pH 7) และสารละลายเมทานอล 45 เปอร์เซ็นต์ (o/v)อะซีโตไนไตรล์/45 เปอร์เซ็นต์ (ปริมาตร/ปริมาตร) โดยการเชื่อมต่อเครื่องตรวจจับรังสียูวีและเครื่องตรวจจับเรืองแสง รังสีอัลตราไวโอเลตตรวจพบที่ 338 นาโนเมตร อนุพันธ์ของ OPA ตรวจพบที่ 450 นาโนเมตรของความยาวคลื่นการปล่อยและ 340 นาโนเมตรของความยาวคลื่นกระตุ้น อนุพันธ์ FMOC ตรวจพบที่ 305 นาโนเมตรของความยาวคลื่นการปล่อยและ 266 nm ของความยาวคลื่นกระตุ้น ส่วนผสมของกรดอะมิโน (1.0 nmol mL-I สำหรับกรดอะมิโนแต่ละตัว) ถูกใช้สำหรับการสอบเทียบ

โดยที่กรด Atotalamino เป็นเนื้อหาหลังจากการไฮโดรไลซิสโดยใช้ 6 M HCl (ที่ 130 องศาเป็นเวลา 24 ชั่วโมง) และกรดอะมิโน Afree เป็นเนื้อหาหลังจากการละลายในน้ำกลั่น

3.7. การประเมินฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ

3.7.1.2,2'-Azino-bis-(3-เอทิลเบนโซไทอะโซลีน-6-กรดซัลโฟนิก) (ABTS)กิจกรรมการกำจัดสารที่รุนแรง

กิจกรรมการกำจัดอนุมูล ABTS ของ CH ถูกวัดตามวิธีการที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ [20] ไอออนบวกของ ABTSradical ถูกสร้างขึ้นโดยการผสมสารละลายสต็อค ABTS (7.{7}} มิลลิโมลาร์) กับโพแทสเซียม เพอร์ซัลเฟต (2.45 มิลลิโมลาร์) และบ่มของผสมที่เป็นผลลัพธ์ในที่มืดที่อุณหภูมิห้องข้ามคืน สารละลายเรดิคัล ABTS ถูกเจือจางใน5.0 มิลลิโมลาร์ น้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (pH7.4) ถึงระดับการดูดกลืนแสงที่ 0.70±0.02 ที่ 734 นาโนเมตร สารละลายเรดิคัล ABTS ที่เจือจางหนึ่งมิลลิลิตรถูกผสมกับตัวอย่างแต่ละตัวอย่าง 1 มิลลิลิตร สิบนาทีต่อมา การดูดกลืนของตัวอย่าง (ตัวอย่างที่มีตัวอย่าง) และกลุ่มควบคุม (กลุ่มควบคุมที่ไม่มีตัวอย่าง) ถูกวัดที่ 734 นาโนเมตร กิจกรรมการกำจัดอนุมูลอิสระของ ABTS ( เปอร์เซ็นต์ ) ถูกคำนวณดังนี้:

3.7.2.ลดกำลังไฟฟ้า

กำลังรีดิวซ์ของ CH ถูกวัดตามวิธีการที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ [20] หนึ่งมิลลิลิตรของตัวอย่างแต่ละตัวอย่างถูกผสมกับ1 มิลลิลิตรของ 0.2 โมลาร์ฟอสเฟตบัฟเฟอร์(pH6.6) และ 1 มิลลิลิตรของโพแทสเซียมเฟอริไซยาไนด์ 1 เปอร์เซ็นต์ ของผสมถูกบ่มที่ 50 องศาเป็นเวลา 20 นาที และจากนั้น 1 มล. ของกรดไตรคลอโรอะซิติก 10 เปอร์เซ็นต์ ถูกเติม สารละลายจำนวน 2 มล. จากของผสมการฟักไข่นี้ผสมกับน้ำกลั่น 2 มล. และเฟอริก คลอไรด์ 0.1 เปอร์เซ็นต์ 0.4 มล. หลังจาก 10 นาที การดูดกลืนแสงของสารละลายที่เป็นผลลัพธ์ถูกวัดที่ 700 นาโนเมตรบนสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ (OPTIZEN, Mecasys Co., Daejeon, Korea)การดูดกลืนแสงที่เพิ่มขึ้น (ที่ 700 นาโนเมตร) ของของผสมปฏิกิริยาได้รับการพิจารณาเพื่อบ่งชี้ถึงกำลังรีดิวซ์ที่เพิ่มขึ้น

3.8. การประเมินผลการต่อต้านวัย

3.8.1. การยับยั้งกิจกรรมไทโรซิเนส

การยับยั้งไทโรซิเนสถูกกำหนดโดยวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [20] สารละลายพรีมิกซ์ที่มี 70 ไมโครลิตรของบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 0.1 โมลาร์ (pH6.8), ไทโรซิเนสเห็ด 30uLof (167U/mL; Sigma-Aldrich, USA) และตัวอย่าง 20 ลิตรถูกบ่มเป็นเวลา 5 นาทีที่ 30 องศา จากนั้นเติมประมาณ 100μL ของ 3,4-dihydroxy phenyl-L-alanine (L-DOPA) เพื่อเริ่มปฏิกิริยาของเอนไซม์ การดูดกลืนที่ 492 นาโนเมตรถูกวัดเป็นเวลา 20 นาทีเพื่อตรวจสอบการก่อรูปของ L-DOPA กรดแอสคอร์บิก (1 มก./มล.)ทำหน้าที่เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก ซึ่งใช้สำหรับการเปรียบเทียบ อัตราส่วนการยับยั้งคำนวณดังนี้:

โดยที่ A คือส่วนผสมที่มีไทโรซิเนสโดยไม่มีตัวอย่าง B คือของผสมที่ไม่มีตัวอย่างและไทโรซิเนส C คือของผสมที่มีตัวอย่างและไทโรซิเนส และ D คือของผสมที่มีตัวอย่างแต่ไม่มีไทโรซิเนส

3.8.2.การยับยั้งการทำงานของคอลลาเจนเนส

การยับยั้งคอลลาเจนเนสถูกกำหนดหาโดยวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [20] โดยสรุป บัฟเฟอร์ทริซีน 50 มิลลิโมลาร์ (pH7.5)ที่มีแคลเซียม คลอไรด์ 10 มิลลิโมลาร์และโซเดียม คลอไรด์ 400 มิลลิโมลาร์ถูกเตรียม จากนั้น 50mLof 1.0mM N-[3-(2-furyl) acrloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala solution และ 0.2 mg/ml collagenase (จาก Clostridium histolyticum, Type IA, 0.{ {19}} FALGPA U/mg solid; Sigma-Aldrich, USA) ถูกเติมเข้าไปในการมีอยู่และไม่มีตัวอย่าง ปฏิกิริยาหยุดโดยเติมกรดซิตริก (6 เปอร์เซ็นต์ ) ของผสมของปฏิกิริยาถูกแยกออกโดยเติมเอทิล อะซีเตต การดูดกลืนแสงของส่วนลอยถูกวัดที่ 345 นาโนเมตร กรดแอสคอร์บิก (1 มก./มล.) ทำหน้าที่เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวกและถูกใช้สำหรับการเปรียบเทียบ เปอร์เซ็นต์ของการยับยั้งคำนวณดังนี้:

โดยที่ A เป็นส่วนผสมของคอลลาเจนเนสโดยไม่มีตัวอย่าง B เป็นส่วนผสมที่ไม่มีตัวอย่างและคอลลาเจนเนส C คือของผสมที่มีตัวอย่างและคอลลาเจนเนส และ D คือของผสมที่มีตัวอย่างแต่ไม่มีคอลลาเจนเนส

3.8.3.การยับยั้งกิจกรรมอีลาสเทส

การยับยั้งอีลาสเทสถูกกำหนดโดยวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [20] N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (Suc-Ala-Ala-Ala-pNA) ทำหน้าที่เป็นสารตั้งต้น และการปล่อย p-nitroaniline ถูกเฝ้าติดตามเป็นเวลา 2{{20}} นาทีที่ 25 องศา ส่วน (1 ไมโครกรัม) ของอีลาสเทสตับอ่อนของสุกรชนิด IV (PPE) ถูกละลายใน 1 มล. ของ 0.2 โมลาร์บัฟเฟอร์ Tris-HCl (pH 8.0) ของผสมของปฏิกิริยาประกอบด้วยบัฟเฟอร์ Tris-HCl 0.2 โมลาร์ (pH8.0), 1 ppm PPE, 0.8 mM Suc-Ala-Ala-Ala-pNA, ตัวอย่างและซับสเตรตดังกล่าว วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 214 นาโนเมตร กรดแอสคอร์บิก(1 มก./มล.)ทำหน้าที่เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวกที่ใช้สำหรับการเปรียบเทียบ อัตราส่วนการยับยั้งคำนวณดังนี้:

โดยที่ A เป็นส่วนผสมที่มีอีลาสเทสและไม่มีตัวอย่าง B คือของผสมที่ไม่มีตัวอย่างและอีลาสเทส C คือของผสมที่มีตัวอย่างและอีลาสเทส และ D คือของผสมที่มีตัวอย่างแต่ไม่มีอีลาสเทส

3.9.การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) ความสำคัญของความแตกต่างระหว่างกลุ่มได้รับการประเมินโดยใช้การเปรียบเทียบหลายรายการและการวิเคราะห์ความแปรปรวน (ANOVA) ตามด้วยการทดสอบความแตกต่างที่มีนัยสำคัญอย่างซื่อสัตย์สุจริต (HSD) ความแตกต่างที่มีค่า p น้อยกว่า 0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ

4. บทสรุป

ในการศึกษานี้ คอลลาเจนไฮโดรไลเสต ซึ่งเป็นส่วนผสมในอาหารเชิงหน้าที่ ผลิตได้สำเร็จผ่านการไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์ ตามด้วยอัลตราฟิลเตรชันและการทำให้บริสุทธิ์ โปรตีเอสทางการค้าหลายชนิดได้รับการทดสอบว่ามีประโยชน์ที่เป็นไปได้ในการผลิตคอลลาเจนไฮโดรไลเสตที่เหมาะสม CHS ที่ไฮโดรไลซ์โดย Alcalase เป็น CHS ที่ถูกไฮโดรไลซ์อย่างมีประสิทธิภาพมากที่สุด และอัลตราฟิลเตรชันที่ตามด้วยการทำให้บริสุทธิ์มีประสิทธิผลในการสร้างเปปไทด์ที่ออกฤทธิ์ที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำ ผลการศึกษาพบว่า CHs แสดงฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและการยับยั้งคอลลาเจนได้ดีเยี่ยม ดังนั้น CHs ที่ได้จากการศึกษานี้อาจใช้ในอุตสาหกรรมอาหาร เครื่องสำอาง หรือยาเป็นสารเติมแต่งตามธรรมชาติ ซึ่งมีคุณสมบัติต่อต้านอนุมูลอิสระและต่อต้านริ้วรอย การศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับการประเมินกิจกรรมการแก่ก่อนวัยของเปปไทด์ที่ใช้งานอยู่ในผิวหนังมนุษย์อาจพิสูจน์ได้ว่ามีประโยชน์

บทความนี้คัดลอกมาจาก Molecules 2019, 24, 1104; ดอย:10.3390/molecules24061104 www.mdpi.com/journal/molecules