ฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีของสารสกัดเอทานอลของข้าวฟ่างไบคัลเลอร์ต่อการสร้างเม็ดสีที่เกิดจาก IBMX ในเซลล์เมลาโนมา B16/F10

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

Hye Ju Han, Seon Kyeong Park, Jin Yong Kang, Jong-Min Kim, Seul Ki Yoo และ Ho Jin Heo

เชิงนามธรรม:เพื่อประเมินความเป็นไปได้ในการเป็นตัวแทนผิวขาวของข้าวฟ่างสองสี(ส. สองสี), ของมันสารต้านอนุมูลอิสระฤทธิ์และฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีต่อ 3-ไอโซบิวทิล-1-เมทิลแซนไทน์ (IBMX)การสร้างเม็ดสีในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16/F10 ถูกตรวจสอบ ผลจากปริมาณฟีนอลิกทั้งหมด (TPC) ระบุว่าสารสกัดเอทานอลร้อยละ 60 ของส. สองสี(ESB) มีปริมาณสูงสุดกว่าสารสกัดเอทานอลอื่นๆสารต้านอนุมูลอิสระกิจกรรมถูกประเมินโดยใช้ 2,2'-azino-bis-(3-เอทิลเบนโซไทอะโซลิน-6-กรดซัลโฟนิก) ไดแอมโมเนียมเกลือ (ABTS)/1,1-ไดฟีนิล-2-พิคริล-ไฮดราซิล (DPPH) กิจกรรมกำจัดอนุมูลอิสระและฤทธิ์ยับยั้งมาลอนไดอัลดีไฮด์ (MDA) ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า ESB มีนัยสำคัญสารต้านอนุมูลอิสระกิจกรรม. ผลการยับยั้งที่ต้านไทโรซิเนสยังถูกประเมินโดยใช้ L-ไทโรซีน (ค่า IC50=89.25 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) และ3,4-ไดไฮดรอกซี-L-ฟีนิลอะลานีน (L-DOPA) เป็นสารตั้งต้น นอกจากนี้ การรักษาด้วย ESB ยังยับยั้งการผลิตเมลานินในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16/F10 ที่เกิดจาก IBMX ได้อย่างมีประสิทธิภาพ เพื่อยืนยันกลไกของฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีของ ESB เราได้ตรวจสอบโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสี ESB ลดลงการสร้างเม็ดสีโดยการลดการแสดงออกของปัจจัยการถอดรหัสที่เกี่ยวข้องกับไมโครพทาลเมีย (MITF), ไทโรซิเนส และโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไทโรซิเนส (TRP)-1 สุดท้าย 9-กรดไฮดรอกซีออคทาเดคาไดอีโนอิก (9-HODE),1,3-O-ไดคาเฟโออิลกลีเซอรอลและทริซินในฐานะสารประกอบหลักของ ESB ถูกวิเคราะห์โดยใช้การแยกโครมาโตกราฟี-ไอออนแบบเคลื่อนที่ด้วยของเหลวสมรรถนะสูงพิเศษ-ควอดรูโพล เวลาของการบิน/การวัดมวลควบคู่ (UPLC-IMS-QTOF/MS2) การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่า ESB อาจมีศักยภาพทางสรีรวิทยาที่จะใช้เป็นวัสดุฟอกสีผิว

คำสำคัญ:ต่อต้าน-การสร้างเม็ดสี; เซลล์มะเร็งผิวหนัง B16/F10; กรดไฮดรอกซีออคทาเดคาดีโนอิก;ข้าวฟ่าง; 3-ไอโซบิวทิล-1-เมทิลแซนทีน

Cistanche ยับยั้งการสร้างเมลานิน.

1. บทนำ

เมลานินถูกสร้างขึ้นด้วยกระบวนการที่เรียกว่าการสร้างเม็ดสีภายในเซลล์เมลาโนโซมของเมลาโนไซต์ และการผลิตและการกระจายของเมลานินเป็นตัวกำหนดผิวหนัง ดวงตา และสีผม นอกจากนี้ เมลานินยังมีบทบาทสำคัญในการปกป้องผิวจากโมเลกุลและสารกระตุ้นต่างๆ เช่น รังสีอัลตราไวโอเลต (UV) ออกซิเจนชนิดปฏิกิริยา (ROS) -melanocyte-stimulatinghormone ( -MSH) และสารช่วยยกไซคลิกอะดีโนซีนโมโนฟอสเฟต (cAMP) รวมทั้งฟอร์สโคลินันด์ ไอบีเอ็มเอ็กซ์ [1] โดยเฉพาะอย่างยิ่ง รังสี UV ทั้งทางตรงและทางอ้อม ทำลายเซลล์ผิวผ่านการสร้าง ROS เช่น อนุมูลไฮดรอกซิล แอนไอออนซูเปอร์ออกไซด์ และไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ [2] ROS ที่สร้างขึ้นทำให้ DNA สายเดี่ยวและสายคู่แตกและโจมตีโมเลกุลโครงสร้างเซลล์ที่สำคัญ เช่น โปรตีนและไขมัน [2] ดังนั้นเมลานินและสารต้านอนุมูลอิสระเอ็นไซม์ เช่น กลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส ซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเตส และคาตาเลสจะรักษาระดับที่คงที่โดยการขจัด ROS ที่สร้างขึ้น อย่างไรก็ตาม การผลิต ROS ที่มากเกินไปอันเป็นผลมาจากปัจจัยต่างๆ กระตุ้นการสร้างเม็ดสีในผิวหนัง และการสะสมของเมลานินที่ผิดปกติจะทำให้เกิดรอยดำในทางลบ ทำให้เกิดจุดด่างอายุหรือตับ รอยด่าง และกระ [3,4] ในปัจจุบัน สารประกอบธรรมชาติ เช่น กรดโคจิก ไฮโดรควิโนน อาร์บูติน และกรดแอสคอร์บิก ซึ่งรู้จักกันในชื่อสารยับยั้งการสังเคราะห์เมลานิน กำลังถูกใช้เป็นสารเติมแต่งสารฟอกสีผิว อย่างไรก็ตาม ส่วนผสมเหล่านี้ไม่เพียงแต่แทรกซึมเข้าสู่ผิวหนังได้ไม่ดี แต่ยังทำให้เกิดความเป็นพิษต่อเซลล์และการอักเสบด้วยการบริหารในระยะยาว [5] ในเรื่องนี้ จำเป็นต้องพัฒนาสารฟอกสีฟันที่ไม่ระคายเคืองและมีประสิทธิภาพในการรักษารอยดำที่ผิวหนังของมนุษย์ ตลอดจนศึกษาวัสดุทรัพยากรธรรมชาติสำหรับสิ่งนี้

เซลล์ผิวหนังของมนุษย์มักสร้างเมลานินเป็นปฏิกิริยาป้องกันแสง การสร้างเม็ดสีเป็นกระบวนการที่ซับซ้อนซึ่งควบคุมผ่านเส้นทางการส่งสัญญาณที่หลากหลาย และสัญญาณทั้งหมดควบคุม MITF ในท้ายที่สุด เนื่องจาก MITF ที่เปิดใช้งานจะส่งเสริมการแสดงออกของยีนไทโรซิเนส (tyrosinase และ TRPs)การสร้างเม็ดสีเริ่มต้นอย่างจริงจัง [6] โดยทั่วไป ขั้นตอนแรกในการสร้างเมลาโนเจเนซิสคือไทโรซิเนสเร่งปฏิกิริยาออกซิเดชันของ L-tyrosine เป็น 34-dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) และต่อมาออกซิไดซ์ L-DOPA เป็น DOPA quinone จากนั้น TRP-2 จะแปลง DOPA chrome เป็น 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA) หรือ 5,6-dihydroxyindole (DHI) ในที่สุด DHICA และ DHI จะถูกออกซิไดซ์โดย TRP-1 ในที่สุดก็นำไปสู่การผลิตเมลานิน [6]

IBMX และเมทิลแซนทีนอื่น ๆ กระตุ้นการสร้างเมลาโนเจเนซิสโดยการยับยั้ง phosphodiesterase และเพิ่มระดับของแคมป์ [7] แคมป์ที่ถูกกระตุ้นโดย IBMX phosphorylates extracellular signal-driven kinase (ERK) และ phosphoinositide 3-kinases/protein kinase B (PI3K/Akt) signalingpathways และท้ายที่สุดจะนำไปสู่การกระตุ้น MITF ในกระบวนการสร้างเม็ดสี [7] ดังนั้นการลดระดับโปรตีนเหล่านี้จึงถือได้ว่าเป็นปัจจัยสำคัญในการต่อต้านการฟอกสีฟัน

ข้าวฟ่างสองสี(S. bicolor) ซึ่งอยู่ในวงศ์ Poaceae ถือเป็นพืชผลในเขตเขตร้อนที่สำคัญ ได้แก่ แอฟริกา อเมริกากลาง และพื้นที่แห้งแล้ง และเป็นพืชธัญพืชที่สำคัญอันดับสี่ของโลก รองจากข้าวสาลี ข้าว และข้าวโพดเลี้ยงสัตว์ [8 ]. การศึกษาล่าสุดแสดงให้เห็นว่า S. bicoloris มีประโยชน์ต่อมนุษย์เพราะมีสารพฤกษเคมี เช่น สารประกอบฟีนอลิก แทนนินและแอนโธไซยานิน [9] ไฟโตเคมิคอลเหล่านี้ได้รับความสนใจเพิ่มขึ้นเนื่องจากสารต้านอนุมูลอิสระ,ต้านโรคอ้วน ต้านเบาหวาน และฤทธิ์ต้านการอักเสบ [10] แม้ว่าจะมีผลการวิจัยมากมาย แต่ยังไม่มีการศึกษาผลการฟอกสีผิวของ S. bicolor ดังนั้น การศึกษานี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีของส. สองสีและเพื่อตรวจสอบผลกระทบต่อ IBMX ที่เหนี่ยวนำให้เกิดการสร้างเม็ดสีในเซลล์เมลาโนมา B16/F10

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. เคมีภัณฑ์

รีเอเจนต์ของ Folin–Ciocalteu, L-DOPA, L-tyrosine, L-ascorbic acid, arbutin, acarbose, dimethylsulfoxide (DMSO), bovine serum albumin, -glucosidase, Mushroom tyrosinase, bovine serum albumin,3-(4,{ {6}}dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) และ IBMX ซื้อมาจาก Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) MITF (bsm-51339M) และ tyrosinase (bs-0819R) ถูกซื้อจาก Bioss (ปักกิ่ง ประเทศจีน) TRP-1 (sc-166857) และ -actin (sc-69879) ถูกซื้อจากเทคโนโลยีชีวภาพซานตาครูซ (ดัลลัส รัฐเท็กซัส สหรัฐอเมริกา) แอนติบอดีทุติยภูมิ (ต้านกระต่ายและต้านเมาส์) ได้มาจาก Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)

2.2. การเตรียมตัวอย่าง

ส. สองสี(20 ก.) ถูกสกัดด้วยความเข้มข้นของเอทานอลต่างๆ (0, 20, 40, 60, 80 และ 95 เปอร์เซ็นต์ ; 1 ลิตร) ที่ 40 องศา เป็นเวลา 2 ชั่วโมงโดยใช้เครื่องควบแน่นแบบรีฟลักซ์ สารสกัดถูกกรองโดยใช้กระดาษกรอง (WhatmanInternational Limited, Kent, UK) และทำให้เข้มข้นโดยใช้เครื่องระเหยแบบสุญญากาศ (N-1000; EYELA Co.,Tokyo, Japan) หลังจากที่สารสกัดถูกแช่เยือกแข็งโดยใช้เครื่องทำแห้งแบบสุญญากาศ (Il Shin Lab Co., Ltd., Yangju, Korea) สารสกัดแห้งจะถูกเก็บไว้ที่ -20 องศาจนกว่าจะใช้

2.3. กิจกรรมต้านอนุมูลอิสระในหลอดทดลอง

2.3.1. ปริมาณฟีนอลิกทั้งหมด (TPC)

ปริมาณฟีนอลทั้งหมดได้รับการตรวจสอบโดยอาศัยหลักการที่ว่ารีเอเจนติสของ Folin–Ciocalteu ลดลงเป็นผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาสีน้ำเงินภายใต้สภาวะที่เป็นด่าง ตัวอย่าง (1 มล.) ผสมกับน้ำยาของ Folin–Ciocalteu และโซเดียม คาร์บอเนต 7 เปอร์เซ็นต์ ของผสมถูกกระตุ้นเป็นเวลา 2 ชั่วโมง จากนั้นวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 760 นาโนเมตรโดยใช้สเปกโตรโฟโตมิเตอร์ (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japan) TPC คำนวณจากเส้นโค้งมาตรฐานของกรดแกลลิก และผลลัพธ์ถูกแสดงเป็นมิลลิกรัม GAE g-1

2.3.2. กิจกรรมการกวาดล้างที่รุนแรง

สารละลายแคตไอออนของ ABTS ถูกผลิตขึ้นโดยผสมโพแทสเซียมเปอร์ซัลเฟต 2.45 mM และ 7 mMABTS กับ 10{{10}} mM โพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7.4) ที่มี 150 mM และปล่อยให้ พวกเขาทำปฏิกิริยาเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง จากนั้น สารละลาย ABTS ถูกเจือจางด้วยน้ำกลั่นเพื่อให้ได้ค่าการดูดกลืนแสงที่ 0.700 ± 0.020 ที่ 734 นาโนเมตร ตัวอย่างได้รับอนุญาตให้ทำปฏิกิริยากับสารละลาย ABTS 980 µL เป็นเวลา 10 นาทีที่ 37 องศา จากนั้นวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 734 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japan) สารละลายอนุมูล DPPH ถูกเตรียมโดย ละลาย 0.1 mM DPPH ในเมทานอล 80 เปอร์เซ็นต์ สารละลาย DPPH ถูกเจือจางจนถึงการดูดกลืนแสงที่ 1.000 ± 0.020 ที่ 517 นาโนเมตร 50 ไมโครลิตรของตัวอย่างถูกผสมกับสารละลาย DPPH 1.45 มล. และทำปฏิกิริยาเป็นเวลา 30 นาทีในความมืด หลังจากทำปฏิกิริยา ของผสมคือกำหนดที่ 517 นาโนเมตร

2.3.3. ผลการยับยั้งต่อไขมันเปอร์ออกซิเดชัน

ในการวัดผลการยับยั้งต่อลิพิดเปอร์ออกซิเดชันในเนื้อเยื่อสมอง ใช้วิธีสารปฏิกิริยาของกรดไธโอบาร์บิทูริก (TBA) เนื้อเยื่อสมองถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในบัฟเฟอร์ Tris-HCl 20 มิลลิโมลาร์ (pH7.4) และหมุนเหวี่ยงที่ 6000× g เป็นเวลา 20 นาที ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกเติมลงในกรดแอล-แอสคอร์บิก 0.1 มิลลิโมลาร์ และเฟอร์รัส ซัลเฟต 37 องศา 10 ไมโครโมลาร์ สำหรับการบ่ม 1 ชั่วโมง ต่อมา กรดไตรคลอโรอะซิติก 30 เปอร์เซ็นต์ และ TBA 1 เปอร์เซ็นต์ ถูกเติมลงในของผสม ซึ่งจากนั้นถูกบ่มในอ่างน้ำที่ 80 องศา เป็นเวลา 20 นาที จากนั้น วัด TBA-MDAcomplex โดยใช้สเปกโตรโฟโตมิเตอร์ (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japan) ที่ 532 นาโนเมตร

2.4. ผลการยับยั้งไทโรซิเนส

ผลการยับยั้งไทโรซิเนสถูกกำหนดโดยใช้แอล-ไทโรซีนเป็นสารตั้งต้น ตัวอย่างถูกเติมลงในจานหลุม 96-หลุม และผสมกับบัฟเฟอร์โซเดียม ฟอสเฟต 1 โมลาร์, ไทโรซิเนส และ 0.1 มิลลิโมล-ไทโรซีน ซับสเตรตเพื่อทำปฏิกิริยาที่ 37 องศา หลังจากการฟักไข่ กิจกรรมของเอนไซม์ถูกวัดโดยใช้ไมโครเพลทรีดเดอร์ (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, USA) ที่ 490 นาโนเมตร นอกจากนี้ L-DOPA ยังถูกใช้เป็นสารตั้งต้นเพื่อวัดฤทธิ์การยับยั้งไทโรซิเนส 67 มิลลิโมลาร์โซเดียม ฟอสเฟตบัฟเฟอร์, ไทโรซิเนสและซับสเตรต 10 มิลลิโมลาร์-DOPA ถูกเติมไปยังตัวอย่างเพื่อทำปฏิกิริยาที่ 37 องศาเป็นเวลา 10 นาที กิจกรรมของไทโรซิเนสคือวัดที่ 415 นาโนเมตร

Cistanche ยับยั้งการสร้างเมลานิน

2.5. -Glucosidase ยับยั้งผล

ผลการยับยั้ง -glucosidase ถูกวัดโดยการผสม 0.1 M โซเดียม ฟอสเฟตบัฟเฟอร์และ -กลูโคซิเดส ที่ 37 องศา เป็นเวลา 10 นาที หลังการกระตุ้น ของผสมถูกเติมไปยัง 5 มิลลิโมลาร์4-ไนโตรฟีนิล- -D-กลูโคพาราโนไซด์ในบัฟเฟอร์ที่ 37 องศา เป็นเวลา 5 นาที และจากนั้นวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 405 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, สหรัฐอเมริกา)

2.6. การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์

ความเป็นพิษต่อเซลล์ของตัวอย่างถูกประเมินโดยใช้การสอบวิเคราะห์ MTT เซลล์เมลาโนมา B16/F10 ถูกเพาะเลี้ยงที่ 1×104 เซลล์/หลุมในจาน 96-หลุมเป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากนั้น ตัวอย่างถูกบำบัดที่ความเข้มข้น 1, 2, 5 และ 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ตัวอย่างถูกบำบัดเป็นเวลา 48 ชั่วโมง หลังจากนั้นเซลล์ถูกบำบัดด้วย 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรของสารละลายสต็อก MTT เป็นเวลา 3 ชั่วโมง ในที่สุด สื่อถูกลบออก และเพิ่ม DMSO เพื่อละลายฟอร์มาซาน ปริมาณฟอร์มาซานถูกหาปริมาณโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, USA) ที่ 570 นาโนเมตร (ความยาวคลื่นที่กระตุ้น) และ 655 นาโนเมตร (ความยาวคลื่นที่ปล่อยออกมา)

2.7. การวัดปริมาณเมลานินของเซลล์

ในการวัดปริมาณของเมลานิน เซลล์เมลาโนมา B16/F10 ถูกเพาะเลี้ยงในจาน 24-หลุมที่ความหนาแน่น 4×104 เซลล์/หลุมที่สูงกว่าเป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้น เซลล์ถูกบำบัดด้วยสารกลุ่มควบคุมหรืออาร์บูติน 100 มิลลิโมลาร์ IBMX และ ESB (อาร์บูติน) 100 มิลลิโมลาร์ เป็นเวลาเพิ่มเติม 48 ชั่วโมง หลังการบำบัด เซลล์ถูกล้างและเก็บเกี่ยวโดยใช้น้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) จากนั้นเซลล์ที่เก็บเกี่ยวถูกหมุนเหวี่ยงที่ 16,000× ก. เป็นเวลา 10 นาที และเม็ดที่ได้รับถูกละลายด้วยโซเดียมไฮดรอกไซด์ 1 นิวตันที่มี DMSO 10 เปอร์เซ็นต์ที่ 90 องศาเป็นเวลา 20 นาที ปริมาณเมลานินถูกวัดที่ 490 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท (EPOCH2; BioTek,Winooski, VT, USA)

2.8. การวิเคราะห์ Western Blot

เซลล์มะเร็งผิวหนัง B16/F10 ที่บำบัดแล้วถูกล้างด้วย PBS และสลายโดยใช้บัฟเฟอร์ RIPA ที่มีสารยับยั้งโปรตีเอส 1 เปอร์เซ็นต์บนน้ำแข็ง ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดโดยการทดสอบโปรตีนของ Bradford และโปรตีนที่เท่ากันถูกทำให้เสียสภาพด้วยบัฟเฟอร์ Laemmli เป็นเวลา 10 นาทีที่ 95 องศา โปรตีนที่แปลงสภาพถูกแยกออกจากกันโดยโซเดียม โดเดซิล ซัลเฟต-โพลีอะคริลาไมด์ เจล อิเล็กโทรโฟรีซิส (SDS-PAGE) 10 เปอร์เซ็นต์ จากนั้นจึงถ่ายโอนไปยังเมมเบรนโพลีไวนิลลิดีน ไดฟลูออไรด์ (PVDF) (Millipore, Billerica,MA, USA) ถัดไป เมมเบรนถูกบล็อกด้วยนมพร่องมันเนย 5 เปอร์เซ็นต์ในน้ำเกลือ Tris-buffered ด้วย Tween20 (TBST) 0.1 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 1 ชั่วโมง และจากนั้นทำปฏิกิริยากับแอนติบอดีปฐมภูมิในชั่วข้ามคืนที่ 4 องศา เยื่อหุ้มเซลล์ทำปฏิกิริยากับแอนติบอดีทุติยภูมิเป็นเวลา 1 ชั่วโมง และมองเห็นสารเชิงซ้อนของภูมิคุ้มกันโดยใช้รีเอเจนต์เคมีลูมิเนสเซนส์ที่ปรับปรุงสภาพ (Bionote, Hwaseong, Korea) ภาพวงดนตรีถูกตรวจพบและวิเคราะห์โดย Chemi-doc (iBright Imager, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)

2.9. การวิเคราะห์ UPLC-IMS-QTOF/MS2

สารประกอบหลักในสารสกัดเอธานอล 60 เปอร์เซ็นต์ของส. สองสีวิเคราะห์โดย UPLC-IMS QTOF/MS2(Vion, Waters Corp., Milford, MA, USA) การแยกโครมาโตกราฟีดำเนินการโดยใช้คอลัมน์ Acquity UPLC BEH C18 (2.1 × 10{{10}} มม., ขนาดอนุภาค 1.7 µm; Waters Corp.) ที่อัตราการไหล 0.35 มล./นาที เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยตัวทำละลาย A (กรดฟอร์มิก 0.1 เปอร์เซ็นต์ในน้ำกลั่น) และB (อะซิโตไนไตรล์) และเงื่อนไขการวิเคราะห์รวมถึงการไล่ระดับเวลาต่อไปนี้: 1 เปอร์เซ็นต์ B ที่ 0-1 นาที, 1–100 เปอร์เซ็นต์ B ที่ 1-7 นาที 100 เปอร์เซ็นต์ B ที่ 7-8 นาที 100-1 เปอร์เซ็นต์ B ที่ 8–8.2 นาที 1 เปอร์เซ็นต์ B ที่ 8.2–10 นาที แมสสเปกโตรเมทรีถูกดำเนินการในโหมดลบด้วยอิเล็กโตรสเปรย์ไอออนไนซ์ (ESI) ภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้: อุณหภูมิแหล่งที่มา 100 ◦C; อุณหภูมิเส้นรกร้าง 400 ◦C; พลังงานการชนทางลาด 10–30 V; แรงดันไฟฝอย 2.5 kV ตรวจพบสารประกอบฟีนอลิกโดยการสแกนแบบเต็มซึ่งมีช่วงตั้งแต่ m/z 50 ถึง 1500

2.10. การวิเคราะห์ทางสถิติ

ผลลัพธ์ทั้งหมดถูกนำเสนอเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) ความแตกต่างทางสถิติระหว่างกลุ่มถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA) โดยใช้การทดสอบหลายช่วงของ Duncan (p < 0.05)="" ด้วยซอฟต์แวร์="" sas="" เวอร์ชัน="" 9.4="" (sas="" institute,="" cary,="" nc,="" usa)="">สารต้านอนุมูลอิสระผลกระทบ (กิจกรรมกำจัดอนุมูลอิสระ ABTS/DPPH และฤทธิ์ยับยั้ง MDA) และผลการยับยั้งของการสร้างเม็ดสีเอนไซม์ที่อาศัยสื่อกลาง (ไทโรซิเนสและ -กลูโคซิเดส) ได้รับการประเมินการวิเคราะห์สหสัมพันธ์ของเพียร์สัน

3. ผลลัพธ์

3.1. เนื้อหาฟีนอลิกทั้งหมด

เพื่อเปรียบเทียบสารต้านอนุมูลอิสระฤทธิ์ของสารสกัดเอธานอลแต่ละชนิดจากส. สองสี, ได้ทำการตรวจสอบ TPC ดังแสดงในรูปที่ 1 TPC มีความแตกต่างกันในสารสกัดเอทานอล สารสกัดเอธานอล 60 เปอร์เซ็นต์ (150.08 ± 1.13 มก. GAE/g) สูงกว่าสารสกัดอื่นๆ อย่างมีนัยสำคัญ (0 เปอร์เซ็นต์ ; 70.83 ± 1.18, 20 เปอร์เซ็นต์ ; 100.42 ± 0.72, 40 เปอร์เซ็นต์ ; 114.67 ± 1.46, 80 เปอร์เซ็นต์ ; 118.33 ± 3.17 และ 95 เปอร์เซ็นต์ ; 73.67 ± 1.46 มก. GAE/g) ดังนั้นสารสกัดเอธานอล 60 เปอร์เซ็นต์จึงถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์เชิงทดลองต่อไป

3.2. กิจกรรมการกวาดล้างที่รุนแรง

ดิสารต้านอนุมูลอิสระฤทธิ์ของสารสกัดเอทานอลร้อยละ 60 จากส. สองสี(ESB) ถูกวัดโดยใช้ ABTS/DPPH assay และ MDA assay และผลลัพธ์ถูกแสดงไว้ในรูปที่ 2 กิจกรรมการกำจัดอนุมูลอิสระของ ABTS ของ ESB แสดงที่ 97.98 เปอร์เซ็นต์ที่ความเข้มข้น 1000 ug/mL และวิตามินซี (99.82 เปอร์เซ็นต์) ซึ่งถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวกและยังมีฤทธิ์ในการไล่ระดับที่เหมือนกันที่ความเข้มข้นเดียวกัน (รูปที่ 2A) และ ESB แสดงผลการยับยั้ง 50 เปอร์เซ็นต์ (ค่า IC50) ของอนุมูล ABTS ที่ความเข้มข้น 409.71 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 2B การมีฤทธิ์ในการขับอนุมูล DPPH ของ ESB แสดงที่ 79.44 เปอร์เซ็นต์ที่ความเข้มข้น 1000 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร และค่า IC50 ถูกบ่งชี้ที่ 612.53 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ผลการยับยั้งการผลิต MDA ของ ESB แสดงผลการยับยั้งที่ 89.54 เปอร์เซ็นต์ที่ความเข้มข้น 50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร และแสดงผลการยับยั้งที่สูงกว่าคาเทชิน (71.03 เปอร์เซ็นต์) ซึ่งเป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวกที่ความเข้มข้นเท่ากัน (รูปที่ 2C) นอกจากนี้ ค่า IC50 ของ MDA ถูกสังเกตพบที่ความเข้มข้น 16.56 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรของ ESB

3.3. ผลการยับยั้งของเอนไซม์ที่สร้างเมลาโนเจเนซิสเป็นสื่อกลาง

ผลการยับยั้งของการสร้างเม็ดสีเอนไซม์ที่อาศัยสื่อกลางถูกประเมินโดยใช้ไทโรซิเนสและ -กลูโคซิเดส (รูปที่ 3) ในการวัดฤทธิ์การยับยั้งของไทโรซิเนสต่อการสังเคราะห์เมลานิน การทดลองได้ดำเนินการโดยใช้ L-tyrosine และ L-DOPA เป็นสารตั้งต้นภายใต้สภาวะที่ปราศจากเซลล์ ด้วยเหตุนี้ ค่า IC50 จึงเป็น 89.25 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรเมื่อ L -ไทโรซีนถูกใช้เป็นสารตั้งต้น (รูปที่ 3A) แต่ L-DOPA ไม่สามารถสังเกตพบผลการยับยั้งได้มากกว่า 50 เปอร์เซ็นต์ (รูปที่ 3B) ณ เวลานี้ ค่า IC50 ของกลุ่มควบคุมเชิงบวก (อาร์บูติน) สำหรับ L-ไทโรซีนคือ 74.35 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ซึ่งสูงกว่า ESB พบว่า ESB มีผลยับยั้งไทโรซิเนสโดยใช้ L-tyrosine ได้ดีกว่าการใช้ L-DOPA เป็นสารตั้งต้น ดังนั้น จากผลการทดสอบโดยใช้สารตั้งต้นสองชนิด ผลการยับยั้ง tyrosinase ของ ESB จึงถือว่าเกี่ยวข้องกับการออกซิเดชันของ L-tyrosine กับ L-DOPA มากกว่าการเกิดออกซิเดชันของ L-DOPA กับ DOPA quinone ในเมลาโนเจเนซิส ผลการยับยั้งไทโรซิเนสโดยใช้L-DOPA เป็นสารตั้งต้นและกิจกรรมการขับออกอย่างรุนแรง (ABTS; 0.943, p < 0.05,="" dpph;="" 0.952,="" p="">< 0.05)="" ระบุความสัมพันธ์ที่แข็งแกร่งในเชิงบวกในตารางที่="">

เพื่อวัดผลการยับยั้งของการสร้างเม็ดสีเอนไซม์ที่อาศัยสื่อกลาง การมีฤทธิ์ในการยับยั้งต่อ -กลูโคซิเดสของ ESB ถูกวัด ตามที่แสดงไว้ในรูปที่ 3C, ESB ยับยั้ง -กลูโคซิเดสได้ 33.72 เปอร์เซ็นต์ที่ความเข้มข้น 200 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร และ IC50 ของ ESB คือ 46.29 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ซึ่งสูงกว่าทานาคาร์โบสประมาณห้าเท่า (216.05 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า ESB มีฤทธิ์ยับยั้ง -glucosidase ได้ดีกว่าอะคาโบสในฐานะกลุ่มควบคุมเชิงบวก และผลการยับยั้ง -glucosidase พบความสัมพันธ์เชิงบวกที่แข็งแกร่งกับผลการยับยั้ง MDA (0.966, p < 0.05)="" ในตารางที่="">

3.4. ความมีชีวิตของเซลล์และการสังเคราะห์เมลานินของเซลล์

เพื่อยืนยันความเป็นพิษต่อเซลล์ของ ESB เซลล์เมลาโนมา B16/F10 ถูกบำบัดด้วย ESB เป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ความเข้มข้น 1, 2, 5, 10 และ 20 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่า ESB ไม่ส่งผลต่อความมีชีวิตของเซลล์ที่ความเข้มข้นที่ระบุเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 4A) ดังนั้น การทดลองจึงดำเนินการโดยการเลือกความเข้มข้น 2, 5 และ 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ต่อจากนั้น เซลล์มะเร็งผิวหนัง B16/F10 ได้รับการรักษาด้วย IBMX เพื่อวิเคราะห์ผลของ ESB ต่อการผลิตเมลานิน ดังแสดงในรูปที่ 4B ระดับของเนื้อหาเมลานินเพิ่มขึ้นเป็น 316.85 เปอร์เซ็นต์ เมื่อรับการรักษาด้วย IBMX ในทางกลับกัน กลุ่มที่ได้รับ ESB (108.60 เปอร์เซ็นต์) ที่ความเข้มข้น 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรพบว่ามีปริมาณเมลานินลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย IBMX และมีปริมาณเมลานินที่คล้ายคลึงกันเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มอาร์บูติน (101.79 เปอร์เซ็นต์) เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก

3.5. เส้นทางการสร้างเมลาโนเจเนซิสในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16/F10

การสร้างเมลาโนเจเนซิสเป็นกระบวนการที่จำเป็นในการปกป้องผิวหนังของมนุษย์จากสิ่งเร้าภายนอก และกระบวนการนี้ถูกควบคุมโดยกลไกต่างๆ ในการศึกษานี้ เราวัดระดับการแสดงออกของโมเลกุลที่ควบคุมการสร้างเม็ดสีเพื่อยืนยันกลไกการยับยั้งศักยภาพของ ESB บนการผลิตเมลานินที่เหนี่ยวนำโดย IBMX ในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16/F10 (รูปที่ 5) ผลการศึกษาพบว่า ESB ลดการแสดงออก MITF ที่เกิดจาก IBMX อย่างมีประสิทธิภาพ (รูปที่ 5A, B) ดังนั้น การแสดงออกของไทโรซิเนส(รูปที่ 5A, C) และ TRP-1 (รูปที่ 5A, D) ถูกปรับลดโดย MITF ที่ลดลงด้วยการบำบัดด้วย ESB ตามผลลัพธ์ การรักษาด้วย ESB ปรับลดการแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16/F10 ที่สร้างเมลาโนเจเนซิซินที่เกิดจาก IBMX

3.6. การวิเคราะห์ UPLC-IMS-QTOF/MS2

โปรไฟล์ของสารประกอบหลักของ ESB ถูกสแกนโดย LC/MS ในช่วง m/z 50–1500 และโครมาโตแกรมของพีคพีคฐานแสดงไว้ในรูปที่ 6 การจำแนกและการแสดงคุณลักษณะเพิ่มเติมของสารประกอบถูกดำเนินการในการเปรียบเทียบกับข้อมูลวรรณกรรมโดยใช้ ข้อมูลการกระจายตัวของ MS2 (ตารางที่ 2) ตามชิ้นส่วนในวรรณกรรมก่อนหน้า พีค 2 คือ 1-O-caffeoylglycerol(m/z 253.07, 179.03, 161.02 และ 135.04) [15]; พีค 3, ไดคาเฟออยล์กลีเซอไรด์ (m/z 415.10, 253.07, 179.03 และ 135.04) [16]; พีค 4, 1,3-O-dicaffeoylglycerol (m/z 415.10, 253.07, 179.03, 161.02 และ 135.04) [16];พีค 5, p-coumaroyl-caffeoylglycerol (m/z 399.10, 253.07, 179.03, 161.02 และ 135.04) [17]; พีค 6,feruloyl-caffeoylglycerol (m/z 429.12, 253.07, 193.05, 161.02 และ 134.03) [18]; ยอด 7, ทริซิน (m/z 329.23,314.04, 299.01 และ 271.02) [19]; และพีค 9 9-กรดไฮดรอกซีออคทาเดคาไดอีโนอิก (9-HODE) (m/z 295.22, 277.21 และ 171.10) [20] ตามลำดับ ในหมู่พวกมัน 1,3-O-dicaffeoylglycerol (รูปที่ 6B), tricin (รูปที่ 6C) และ9-HODE (รูปที่ 6D) ถูกระบุว่าเป็นสารประกอบหลัก

ผลกระทบของ cistanche:ต่อต้านอนุมูลอิสระ

4. การอภิปราย

การสร้างเมลาโนเจเนซิสมีรายงานว่าเกิดจากความเครียดออกซิเดชันที่เพิ่มขึ้นจากสิ่งเร้าภายนอก ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันทำให้เกิดออกซิเดชันของดีเอ็นเอและโปรตีน ลิพิดเปอร์ออกซิเดชัน และกรดไขมันไม่อิ่มตัวที่เพิ่มขึ้น ความเครียดนี้ยังนำไปสู่การเพิ่มการสังเคราะห์เมลานินในเมลาโนไซต์บนผิวหนังโดยไม่จำเป็น ดังนั้นการสร้างเมลานินที่มากเกินไปอาจทำให้เกิดการสร้างเม็ดสี และอาจนำไปสู่มะเร็งผิวหนังได้ IBMXstimulates melanogenesis โดยการยับยั้ง phosphodiesterase และเพิ่มระดับของ cAMP [7] เมื่อระดับของ cAMP ในเซลล์เพิ่มขึ้น จะทำให้เกิดการกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณ ERK และ PI3K/Akt ที่ส่งเสริมการสร้างโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสี ดังนั้นเราจึงตรวจสอบผลการฟอกสีฟันของ ESB ต่อการสร้างเมลาโนเจเนซิสที่เกิดจาก IBMX ในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16/F10

สารประกอบฟีนอลในฐานะเมแทบอไลต์ทุติยภูมิของพืชมีคุณสมบัติในการคงตัวด้วยโครงสร้างเรโซแนนซ์เมื่อพวกมันทำปฏิกิริยากับอนุมูล [21] นอกจากนี้ สารประกอบฟีนอลยังทำหน้าที่เป็นปัจจัยสำคัญสำหรับการทำงานของสารต้านอนุมูลอิสระ เช่น ฤทธิ์กำจัดอนุมูลอิสระ ABTS/DPPH และสารยับยั้งการสร้างเม็ดสีเนื่องจากมีโครงสร้างทางเคมีเช่นเดียวกับแอล-ไทโรซีน [22,23] การทดสอบ ABTS/DPPH คือ วิธีทั่วไปและง่ายที่สุดสำหรับการประมาณค่าในหลอดทดลองสารต้านอนุมูลอิสระกิจกรรม. ในการศึกษานี้ ESB ได้แสดงให้เห็น TPC สูง (รูปที่ 1) และกิจกรรมการขจัดอนุมูลอิสระ ABTS/DPPH (รูปที่ 2A, B) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ESB นั้นสูงกว่าในกิจกรรมการกำจัดอนุมูลอิสระของ ABTS มากกว่ากิจกรรมการไล่ตาม DPPHradical การทดสอบ DPPH ใช้เพื่อวัดกิจกรรมการขับสารอนุมูลอิสระของสารประกอบที่ไม่ชอบน้ำ ในขณะที่การทดสอบ ABTS ทำให้สามารถวัดการออกฤทธิ์ที่รุนแรงต่อสารประกอบที่ไม่ชอบน้ำและชอบน้ำ [24] ดังนั้นจึงได้รับการยืนยันว่ากิจกรรมการขจัดอนุมูลอิสระของ ESB ได้รับผลกระทบจากสารประกอบที่ชอบน้ำมากกว่า

การได้รับรังสี UV ทำให้เกิดการผลิต ROS และมีผลโดยตรงและโดยอ้อมต่อผิวหนัง โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ROS ทำให้เกิด lipid peroxidation โดยโจมตีกรดไขมันไม่อิ่มตัวซึ่งเป็นส่วนประกอบของเยื่อหุ้มเซลล์ [2] การสะสมของลิพิดเปอร์ออกไซด์ทำให้เกิดการทำลายระบบต้านอนุมูลอิสระของผิวหนัง ทำให้เกิดผิวคล้ำ อักเสบ และแก่ก่อนวัย [25] ในการศึกษานี้ ESB แสดงการยับยั้งลิพิดเปอร์ออกซิเดชันที่ยอดเยี่ยม (รูปที่ 2C) สารประกอบฟีนอลที่มีอยู่ในพืชธรรมชาติมีรายงานว่าเกี่ยวข้องกับกิจกรรมการขจัดอนุมูล [26] นอกจากนี้ Maresca และคณะ [27] รายงานว่าการกำจัด ROS ด้วยสารต้านอนุมูลอิสระมีประสิทธิภาพในการยับยั้งการสังเคราะห์เมลานิน ผลการศึกษาล่าสุดรายงานว่าเอทิลอะซิเตทและเศษส่วน aglycone ของใบ Dendropanax morbifera สามารถทำหน้าที่เป็นสารปกป้องเซลล์ผิวและสารต้านอนุมูลอิสระตามธรรมชาติโดยการปกป้องเซลล์ HaCaT จากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน [28] นอกจากนี้ การบำบัดด้วยเศษส่วนเดียวกันยังแสดงฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีได้ดีกว่าอาร์บูติน ซึ่งใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวก ต่อต้านการสร้างเมลานินที่มากเกินไปที่เกิดจาก -MSH ในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16/F10 [28]

กลไกหลายอย่างเกี่ยวข้องกับการสร้างเม็ดสีและเป้าหมายร่วมกันของสารฟอกสีผิวคือการควบคุมไทโรซิเนส ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่สำคัญในการสร้างเมลาโนเจเนซิส ไทโรซิเนส เอนไซม์ที่ประกอบด้วยทองแดง เร่งปฏิกิริยาสองปฏิกิริยาในวิถีทางนี้: การไฮดรอกซิเลชันของ L-tyrosine toL-DOPA และการเกิดออกซิเดชันของ L-DOPA กับ DOPA quinone [6] เมื่อสัมผัสกับรังสียูวีหรือ ROS จำนวนมาก กิจกรรมของไทโรซิเนสจะเพิ่มขึ้นและการสังเคราะห์เมลานินก็เพิ่มขึ้นเช่นกัน ดังนั้น ผลของการวัดผลการยับยั้งของไทโรซิเนสที่สัมพันธ์กับการสังเคราะห์เมลานิน พบว่า ESB มีผลในการยับยั้งไทโรซิเนสโดยใช้ L-tyrosine ได้ดีกว่าการใช้ L-DOPA เป็นสารตั้งต้น (รูปที่ 3A,B) การศึกษาเมื่อเร็ว ๆ นี้รายงานความสัมพันธ์ระหว่างการยับยั้ง TPC และการยับยั้ง tyrosinase เนื่องจากสารประกอบฟีนอลมีโครงสร้างทางเคมีคล้ายกับ L-tyrosine ซึ่งเป็นสารตั้งต้นของ tyrosinase ตาม Choi et al. (29) พบว่าประสิทธิภาพของกิจกรรมกำจัดอนุมูลอิสระและฤทธิ์ยับยั้งไทโรซิเนสเพิ่มขึ้นตามสัดส่วนของเวลาการหมักของชองกุกจัง ซึ่งเกิดจากปริมาณ TPC ที่เพิ่มขึ้นตามเวลาในการหมัก Im & Lee [30] สังเกตว่าเศษส่วนของเอทิลอะซิเตตของสารสกัดเอธานอล 75 เปอร์เซ็นต์จาก Taraxacum core num มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ TPC และสารต้านอนุมูลอิสระมากมาย และผลการยับยั้งไทโรซิเนสนั้นเหนือกว่าเศษส่วนอื่นๆ (เฮกเซน คลอโรฟอร์ม บิวทานอล และในน้ำ)

ไทโรซิเนส ซึ่งเป็นหนึ่งในไกลโคโปรตีน ถูกไกลโคซิเลตเมื่อสายโซ่โพลีเปปไทด์เคลื่อนตัวไปเป็นเส้นเอ็นโดพลาสมิกเรติคูลัม กระบวนการนี้มีส่วนเกี่ยวข้องกับเอนไซม์หลายชนิด และในหมู่พวกเขา การยับยั้ง -glucosidase สามารถยับยั้งการพับของ tyrosinase เพื่อสร้างโครงสร้างที่ไม่ใช้งานโดยไม่มีทองแดง ส่งผลให้ tyrosinase ไม่สามารถขนส่งไปยัง melanosome และยับยั้งการผลิตเมลานินได้ โพลีฟีนอลมีอยู่ ในพืชไม่เพียงแต่สามารถช่วยลดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันเท่านั้น แต่ยังช่วยยับยั้งเอนไซม์ไฮโดรไลซ์คาร์โบไฮเดรต เช่น -กลูโคซิเดสโดยการจับกับโปรตีน [31] การศึกษาก่อนหน้านี้ระบุว่าเซลล์เมลาโนมา B16/F10 ต่อหน้าสารยับยั้งไกลโคซิเลชั่นส่งผลให้เกิดการสร้างเมลาโนเจเนซิสโดยการลดปริมาณไทโรซิเนสทั้งหมด [32] และชอยและคณะ [33]รายงานว่าดีออกซีโนจิริมัยซิน ซึ่งเป็นหนึ่งในสารยับยั้ง -กลูโคซิเดส บล็อกไกลโคซิเลชันของไทโรซิเนสและยับยั้งการย้ายถิ่นของไทโรซิเนสไปยังเมลาโนโซม อันโด และคณะ [34] ได้แสดงให้เห็นว่าเป็นไปได้ที่จะยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินในเซลล์เมลาโนมาโดยการควบคุมไกลโคซิเลชันของไทโรซิเนสด้วยสารยับยั้ง -กลูโคซิเดส เช่น กลูตาไธโอน เฟอร์ริติน และเจลดานามัยซิน คิมและคณะ [35] รายงานความสัมพันธ์ที่ดีของเกสรผึ้งว่าเป็นธรรมชาติสารต้านอนุมูลอิสระระหว่างผลการยับยั้ง TPC และไทโรซิเนส ({{0}}.973,p < 0.05)="" และ="" tpc="" ยังให้ความสัมพันธ์เชิงบวกกับกิจกรรมการกำจัดอนุมูล="" dpph="" (0.897,="" พี="">< 0.05)="" และผลการวิจัยชี้ให้เห็นว่าโพลีฟีนอลเป็นสารต้านอนุมูลอิสระตามธรรมชาติอาจมีประสิทธิภาพในการทำให้ผิวขาวขึ้นโดยพิจารณาจากฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่ดีเยี่ยม="" ในการศึกษาของเรา="" ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของ="" esb="" ในกระบวนการยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนสมีความสัมพันธ์สูงผ่านการยับยั้งการเกิดออกซิเดชันของ="" l-dopa="" กับ="" dopa="" quinone="" และไกลโคซิเลชันของไทโรซิเนส="" (ตารางที่="" 1)="" ด้วยเหตุนี้="" สารต้านอนุมูลอิสระ="" ผลของ="" esb="">การสร้างเม็ดสี- เอนไซม์ที่เป็นกลาง

สารต้านอนุมูลอิสระตามธรรมชาติ: cistanche tubulosa

เส้นทางการส่งสัญญาณ PKA เป็นกระบวนการหลักที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเมลาโนเจเนซิส และสิ่งนี้ถูกกระตุ้นโดย IBMX ซึ่งเป็นตัวแทนยกระดับแคมป์ เส้นทางการส่งสัญญาณ PKA สามารถควบคุมปัจจัยการถอดรหัส เช่น MITF และโปรตีนจับองค์ประกอบที่ตอบสนองต่อแคมป์ ซึ่งเกี่ยวข้องกับการแสดงออกของการสร้างเม็ดสีสารควบคุม เช่น tyrosinase, TRP-1 และ TRP-2 ดังนั้น การรักษาของ IBMX จะเพิ่มการแสดงออกของ MITF และยีนตระกูลไทโรซิเนส (ไทโรซิเนสและ TRP-1) ผ่านการเปิดใช้งานแคมป์ [7] ปาร์คและคณะ [36] แสดงให้เห็นว่าปริมาณของการสังเคราะห์เมลานินจากสารสกัด PapenfusiellaCuomo ethanolic (65.17 ± 13.40 เปอร์เซ็นต์ ) ที่ความเข้มข้น 40 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรมีความคล้ายคลึงกับกรดโคจิก (72.30 ± 3.92 เปอร์เซ็นต์ ) เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก และรายงานว่ามีศักยภาพ เป็นวัสดุไวท์เทนนิ่งธรรมชาติ ในการศึกษานี้ ESB แสดงผลการยับยั้งที่มีประสิทธิผลต่อการสังเคราะห์เมลานินที่คล้ายคลึงกับการควบคุมเชิงบวกที่ความเข้มข้นต่ำ (รูปที่ 4) หลังจากนั้น เพื่อประเมินผลการต่อต้านการสร้างเม็ดสีโดยละเอียดของ ESB ได้ทำการวิเคราะห์ western blot กับโปรตีนที่สร้างเมลาโนเจเนซิสโดยใช้เซลล์มะเร็งผิวหนัง B16/F10

Akt ซึ่งเกี่ยวข้องกับกลไกต่างๆ มีบทบาทสำคัญในกระบวนการของเซลล์หลายอย่าง เช่น การตายของเซลล์ กลูโคส และการเผาผลาญของผิวหนัง โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การเพิ่มขึ้นของ cAMP โดยการรักษา IBMX ลด Akt phosphorylation และการเปิดใช้งาน นอกจากนี้ Akt ที่ปิดใช้งานจะกระตุ้นการเปิดใช้งาน GSK-3 ซึ่งหมายความว่าไม่บรรลุฟอสโฟรีเลชั่น นั่นคือระดับของ p-GSK-3 ลดลง [7] ตามวรรณกรรมก่อนหน้านี้ ส่วนทางอากาศของ Pueraria thunbergia ปรับลดรุ่น MITF โดยเปิดใช้งานเส้นทางการส่งสัญญาณ Akt/GSK-3 ในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16/F10 [37] นอกจากนี้ Huang etal [38] แสดงให้เห็นว่า [6] - โรงเรียนส่งเสริมการแสดงออก p-Akt และยับยั้งการส่งสัญญาณเมลาโนเจเนซิสในเซลล์เมลาโนมา B16/F10 GSK ที่เปิดใช้งานแล้ว-3 ควบคุมตระกูลยีนไทโรซิเนสโดย phosphorylatingSer289 ของ MITF ส่งผลให้มีการสร้างเมลาโนเจเนซิส MITF เป็นปัจจัยการถอดรหัสที่สำคัญซึ่งผูกมัดกับโปรโมเตอร์ของยีนไทโรซิเนส และต่อมาจะเพิ่มการแสดงออกของเอ็นไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการเพิ่มจำนวนเมลาโนไซต์และการสร้างเม็ดสี[7]. เมื่อ MITF ส่งเสริมการแสดงออกของไทโรซิเนส ส่งผลให้ระดับ TRP-1 และ TRP-2 เพิ่มขึ้น และด้วยเหตุนี้ เอนไซม์สร้างเม็ดสีจึงผลิตเมลานิน [6] ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันที่เกิดจากแสงยูวีช่วยกระตุ้นการสร้างเม็ดสีเมลานินในผิวหนัง ดังนั้นกิจกรรมการขับของอนุมูลอิสระหรือ ROS จึงมีประสิทธิภาพในการยับยั้งการผลิตเมลานิน และโพลีฟีนอลที่มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระอาจมีผลการฟอกสีฟันที่ดีเยี่ยม [38] ชอย และคณะ [39] แสดงให้เห็นว่าก้านไผ่ของเกาหลี (Phyllostachys nigra variety henosis) ปรับลด MITF ที่อาศัย PKA/CREB ผ่านการกำจัดอนุมูล ABTS/DPPH และสารสกัดเอธานอล 70% ของ Nelumbo nucifera G. Leaf ยับยั้งการแสดงออกของ MITF, tyrosinase และ TRPs ด้วยฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ เช่น ความสามารถในการบริจาคอิเล็กตรอนและการยับยั้ง xanthine oxidase [40] ในการทดลองนี้ แสดงให้เห็นว่าการบำบัดด้วย ESB ลดการแสดงออกของยีน MITF และไทโรซิเนส (ไทโรซิเนสและ TRP-1) ซึ่งส่งเสริมการเกิดออกซิเดชันของ DHICA ไปยัง DHI ในวิถีการสร้างเม็ดสี (รูปที่ 5) จากผลลัพธ์เหล่านี้ ESB แสดงให้เห็นว่ามีการปรับลดการสร้างเมลาโนเจเนซิสที่เป็นสื่อกลางของ IBMX โดยอิงจากความเหนือกว่าสารต้านอนุมูลอิสระผลกระทบ

ตามวรรณกรรมก่อนหน้านี้ สารประกอบฟีนอลิกหลักใน ESB ถูกระบุว่า1,3-O-di-caffeoyl glycerol (รูปที่ 6B), tricin (รูปที่ 6C) และ 9-HODE (รูปที่ 6D) [16 ,19,20]. ในหมู่พวกเขา 9-HODE ซึ่งเป็นสารประกอบที่มีมากที่สุดใน ESB เป็นหนึ่งในสารเมแทบอไลต์ของ linoleicacid และแสดงผลไวท์เทนนิ่งบนผิวที่ระคายเคืองโดยการยับยั้งไทโรซิเนส [41] นอกจากนี้ ไม่เหมือนกับสารประกอบอะลิฟาติกอื่นๆ 9-HODE มีรายงานว่ามีเสถียรภาพในการทดลองออกซิเดชันทั้งหมด และมีผลทำให้ไวท์เทนนิ่งต่อความเสียหายของ ROS [41] ในขณะเดียวกัน ทริซิน (5,7-ไดไฮดรอกซี- 2-(4-ไฮดรอกซี-3,5-ได-เมทอกซีฟีนิล)-4H-โครมีน{{24 }}หนึ่ง) ได้รับการยอมรับมานานแล้วว่ามีผลดีต่อสุขภาพ เช่น ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ ต้านไวรัส และต้านเนื้องอก/ต้านมะเร็ง [42–44] หมู่ et al. [45] รายงานว่าทริซินมีผลยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนสได้ดีกว่าเมื่อเทียบกับอาร์บูตินในกลุ่มควบคุมเชิงบวก นอกจากนี้ Meng และคณะ [46] รายงานว่า tricin ที่แยกได้จากสารสกัดเมทานอลของข้าวบาร์เลย์อ่อน (Hordeum vulgare L.) ยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินและการทำงานของไทโรซิเนสในเซลล์ B16/F10melanoma ผ่านกลุ่มไฮดรอกซิลที่ตำแหน่ง C-4' และกลุ่มเมทอกซีที่ตำแหน่ง C-3',5'ตำแหน่งของโครงกระดูกไตรซิน Phenylpropanoids เช่น 1-O-caffeoylglycerol, dicaffeoylglycerides และ 1,3-O-dicaffeoylglycerol เป็นสารประกอบอินทรีย์ที่สังเคราะห์โดยพืชจาก phenylalanine และ tyrosine ฟีนิลโพรพานอยด์และรูปแบบไกลโคซิเลตของพวกมันได้รับรายงานว่าเป็นสารต้านอนุมูลอิสระที่มีศักยภาพโดยการกำจัด ROS โดยตรงหรือโดยทำหน้าที่เป็นตัวกำจัดอนุมูลเพอร์ออกซิลที่ทำลายลูกโซ่ [47]

กรด p-Coumaric ซึ่งมีโครงสร้างทางเคมีคล้ายกับ L-tyrosine สามารถแข่งขันกับ L-tyrosine สำหรับไซต์ที่ใช้งานบน tyrosinase [48] เป็นที่ทราบกันดีว่าเป็นสารยับยั้งไทโรซิเนสที่แรง และมีรายงานว่าฤทธิ์ต้านการสร้างเมลาโนเจเนซิสนั้นแข็งแกร่งกว่าสารประกอบที่มีโครงสร้างคล้ายคลึงกัน เช่น ซินนามิคาซิด [48] นอกจากนี้ An et al. [48] ​​รายงานว่ากรด p-coumaric ซึ่งเป็นส่วนประกอบของ Sasa quelpaertensisNakai ยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนสโดยใช้ L-DOPA เป็นสารตั้งต้น และลดการผลิตเมลานินในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16/F10 ดังนั้น ESB อาจได้รับการพิจารณาว่ามีผลการฟอกสีฟันที่ดีเยี่ยมผ่านกรด p-coumaric นอกจากนี้ สเปกตรัม MS ของ 1-O-caffeoylglycerol และ 1-3-O-dicaffeoylglycerol แสดงรูปแบบการกระจายตัวที่คล้ายกันที่ m/z 179, 161 และ 135 และชิ้นส่วนเหล่านี้ถูกรายงานว่าเป็นเรซิดิวของกรดคาเฟอีน พวกมันมีสเปกตรัม UV ที่คล้ายกับอนุพันธ์ของกรดคาเฟอีนที่มี λmax ที่ประมาณ 326 นาโนเมตร และถือว่าเป็นอนุพันธ์ของกรดคาเฟอีน [48] มีรายงานว่ากรดคาเฟอีนซึ่งเป็นอนุพันธ์ของสารประกอบต่างๆ เป็นสารต้านอนุมูลอิสระที่มีศักยภาพ ในหลอดทดลอง/ในร่างกาย และลดกิจกรรมของไทโรซิเนสและการสร้างเม็ดสีในเซลล์เมลาโนมา B16/F10 ดังนั้น ฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีของ ESB อาจถือได้ว่าเกิดจากสารต้านอนุมูลอิสระและสารฟอกสีผิว เช่น สารประกอบอะซาลิฟาติกและฟีนอลิก

ผลกระทบของ cistanche: ต่อต้านอนุมูลอิสระ

5. สรุปผลการวิจัย

เพื่อประเมินความเป็นไปได้ในการเป็นสารฟอกสีผิวของข้าวฟ่างสองสีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ และฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีของ ESB ต่อการสร้างเม็ดสีที่เกิดจาก IBMX ได้รับการประเมินในเซลล์เมลาโนมาเซลล์ B16/F10 ESB มีนัยสำคัญสารต้านอนุมูลอิสระกิจกรรมในกิจกรรมกำจัดอนุมูลอิสระ ABTS/DPPH และฤทธิ์ยับยั้ง MDA ESB ป้องกันขั้นตอนแรกของการสร้างเม็ดสีโดยการยับยั้ง -glucosidase และ tyrosinase โดยใช้ L-tyrosine และ L-DOPA เป็นสารตั้งต้น ฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีของ ESB ต่อ IBMX ที่เหนี่ยวนำให้เกิดการสร้างเม็ดสีได้รับการประเมินในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16/F10 และผลการศึกษาพบว่า ESB ยับยั้งการสร้างเม็ดสีที่เกิดจาก IBMX ในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16/F10 การสะสมของเมลานินถูกยับยั้งโดยการปรับลดการแสดงออกของ MITF และตระกูลยีนไทโรซิเนส (ไทโรซิเนสและ TRP-1) ในการสร้างเมลาโนเจเนซิสที่เกิดจาก IBMX สารประกอบหลักของ ESB ถูกวิเคราะห์เป็น 1,3-O-di-caffeoyl glycerol, tricin และ 9-HODE ดังนั้น ESB แสดงให้เห็นในหลอดทดลองสารต้านอนุมูลอิสระกิจกรรมและฤทธิ์ต้านการสร้างเม็ดสีในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16/F10 จึงสามารถใช้เป็นสารฟอกสีผิวในตลาดเครื่องสำอางได้

ต่อต้านอนุมูลอิสระเม็ด cistanche