การรักษาชะลอวัยชะลอการแพร่กระจายของซินนิวเคลียสโดยการฟื้นฟูการทำงานของ Lysosomal

การแนะนำ:

การสะสมของมวลรวมโปรตีนเฉพาะเป็นลักษณะของโรคเกี่ยวกับความเสื่อมของระบบประสาท, เช่นโรคอัลไซเมอร์(ค.ศ.),โรคพาร์กินสัน(PD), และเส้นโลหิตตีบด้านข้าง amyotrophic(อ.ส.). โปรตีนที่รวมตัวกันในโรคเหล่านี้ ได้แก่ Ab และ MAPT/ tau ใน AD, SNCA/a-synuclein ใน PD และ TARDBP/TDP-43 ใน ALS การรวมตัวของโปรตีนเป็นผลมาจากความบกพร่องของโปรตีโอสเตซิส ซึ่งได้รับการดูแลโดยการควบคุมที่ประสานกันของการสังเคราะห์ การพับ และการย่อยสลายโปรตีน การกลายพันธุ์ในการสังเคราะห์โปรตีนและกลไกการย่อยสลายทำให้เกิดการเสื่อมของระบบประสาทในแบบจำลองสัตว์และมักเชื่อมโยงกับมนุษย์โรคเกี่ยวกับความเสื่อมของระบบประสาท. โปรตีนรวมตัวเป็นโรคเกี่ยวกับความเสื่อมของระบบประสาทแพร่กระจายไปเรื่อย ๆ จากบริเวณสมองที่ จำกัด ไปสู่พื้นที่ที่ใหญ่ขึ้นตามความก้าวหน้าของโรค ในกรณีของ PD มวลรวม SNCA เริ่มแรกเกิดขึ้นในนิวเคลียสของก้านสมองส่วนล่างและกระเปาะรับกลิ่น และกระจายตามลำดับไปตามทางเดินขึ้นไปยังบริเวณก้านสมองส่วนบนไปยังบริเวณเปลือกนอก การส่งผ่านโปรตีนจากเซลล์สู่เซลล์ได้รับการเสนอแนะว่าเป็นกลไกพื้นฐานสำหรับการแพร่กระจายทางพยาธิสภาพในสมองของผู้ป่วยที่เป็นโรคเกี่ยวกับความเสื่อมของระบบประสาท1-3 รายละเอียดของกลไกการส่งผ่านมวลรวมระหว่างเซลล์ต่อเซลล์ยังคงเข้าใจยาก อย่างไรก็ตาม หลักฐานบ่งชี้ว่าเอกโซไซโทซิสที่ไม่เป็นทางการและเอนโดไซโทซิสที่ตามมาในเซลล์ข้างเคียงประกอบขึ้นเป็นเฟรมหลักของกลไก ภายใต้สมมติฐานที่ว่าการแพร่กระจายโดยรวมนำไปสู่การลุกลามของฟีโนไทป์ของโรค การหยุดชะงักของการส่งผ่านมวลรวมระหว่างเซลล์กำลังเกิดขึ้นเป็นกลยุทธ์ที่มีแนวโน้มในการหยุดการลุกลามของโรค4,5 การส่งผ่านมวลรวมของโปรตีนจากเซลล์สู่เซลล์เป็น2-กระบวนการขั้นตอน: การถ่ายโอนมวลรวมจากเซลล์ผู้บริจาคไปยังเซลล์ผู้รับ และการรวมตัวกันของโปรตีนที่ถ่ายโอนและโปรตีนภายนอก6 ที่นี่ เราพัฒนาแบบจำลอง Caenorhabditis elegans (C. elegans) ที่ใช้การเสริมการเรืองแสงแบบสองโมเลกุล (BiFC)7 เพื่อแสดงการเรืองแสงในกล้ามเนื้อคอหอยและเซลล์ประสาทที่เกี่ยวข้องเฉพาะเมื่อโปรตีน SNCA มีปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์ข้ามเซลล์เท่านั้น เราใช้แบบจำลองสัตว์เหล่านี้ในการตรวจสอบผลกระทบจากความชราเกี่ยวกับการส่งผ่านมวลรวมระหว่างเซลล์และกลไกภายใต้ผลกระทบของริ้วรอย.

คลิกที่นี่เพื่อรู้จัก Cistanche สำหรับโรคเกี่ยวกับระบบประสาท

การสร้างผลลัพธ์และการกำหนดลักษณะของแบบจำลอง C. elegans สำหรับการแพร่เชื้อของ synucleinopathy

เพื่อพัฒนาแบบจำลองสัตว์สำหรับการทดสอบการส่งผ่านโปรตีนจากเซลล์สู่เซลล์อย่างสะดวก เราได้ผลิตสายพันธุ์ดัดแปลงพันธุกรรมของ C. elegans ซึ่งแสดง SNCA ที่หลอมรวมเข้ากับชิ้นส่วน N-terminal หรือ C-terminal ของดาวศุกร์ ซึ่งเป็นโปรตีนเรืองแสงสีเหลืองชนิดหนึ่ง (รูปที่ 1A) ส่วนปลาย N ของดาวศุกร์ (V1) ติดอยู่กับปลาย SNCA N (V1S) และส่วนปลาย C ของดาวศุกร์ (V2) กับปลาย C ของ SNCA (SV2) ในแบบจำลอง C. elegans V1S ถูกแสดงออกในกล้ามเนื้อคอหอยโดยใช้โปรโมเตอร์ myo-2 (Pmyo-2)8 และ SV2 และ DsRed ถูกแสดงออกร่วมกันในเซลล์ประสาทที่เชื่อมต่อกับคอหอยโดยใช้การดีด{{ 16}} โปรโมเตอร์ (Pflflp-21) 9 (รูปที่ 1B) การมีอยู่และการแสดงออกของยีนเหล่านี้ได้รับการตรวจสอบโดยใช้ PCR หนอนเดี่ยวและอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์กับแอนติบอดีต่อต้าน SNCA Ab27410 (รูปที่ S1A ถึง D) ตรวจสอบการแสดงออกของโปรตีนเฉพาะในประเภทเซลล์ที่ต้องการ รูปแบบการแสดงออกของ Pflflp- 21 ได้รับการอธิบายแล้ว9 และเครื่องหมายของเราเองสำหรับกิจกรรมการก่อการ flip-21 (DsRed) ก็แสดงรูปแบบการแสดงออกเดียวกัน ซึ่งรวมถึงการแสดงออกในเซลล์ประสาทสัมผัส ADL, ASE และ ASH เซลล์ประสาทสั่งการ URA, เซลล์ประสาทคอหอย MC, M2 และ M4 และลำไส้ (รูปที่ S1E)

การแสดงออกของ V1S หรือ SV2 เพียงอย่างเดียวไม่ก่อให้เกิดการเรืองแสง BiFC อย่างไรก็ตาม การผสมกันของโครงสร้างทั้งสองทำให้เกิดการเรืองแสง BiFC ที่แข็งแกร่งทั้งในกล้ามเนื้อคอหอยและเซลล์ประสาทที่อยู่ติดกัน และส่วนหลังถูกระบุด้วย DsRed (รูปที่ 1C และ D; รูปที่ S1E และ G) ข้อมูลระบุว่าการส่งผ่านโปรตีนเกิดขึ้นทั้งสองทิศทาง การแสดงออกร่วมกันของ Pflflp-21::SV2-DsRed และ Pmyo-2::V1 (ไม่มียีน SNCA) ไม่ได้สร้างสัญญาณ BiFC (รูปที่ 1C และ D; รูปที่ S1E) ซึ่งบ่งชี้ว่าสัญญาณไม่ได้เกิดจากการโต้ตอบที่ไม่เฉพาะเจาะจงระหว่างชิ้นส่วนของดาวศุกร์ เพื่อทดสอบความจำเพาะของระบบ BiFC เราสร้าง Pmyo-2::V1Q25 C Pflflp-21::SV2-DsRed line ซึ่งเป็นหนอนดัดแปลงพันธุกรรมที่แสดง Huntingtin exon 1 ด้วยกลูตามีน 25 ภายใต้การควบคุมของ Pmyo-2 และ SV2 ในเซลล์ประสาท เวิร์มเหล่านี้ไม่แสดงสัญญาณ BiFC ในกล้ามเนื้อคอหอยหรือเซลล์ประสาท (รูปที่ 1D; รูปที่ S1E) ผลลัพธ์นี้ตรวจสอบความจำเพาะของหนอนดัดแปลงพันธุกรรม BiFC สำหรับการส่งผ่าน SNCA นอกจากนี้ เรายังสร้างสายพันธุกรรมแบบบูรณาการที่แสดง V1S และ SV2-DsRed ตามลำดับ และผสมข้ามสายพันธุ์เพื่อสร้างสายพันธุกรรมคู่แบบผสมผสาน ตามที่คาดไว้ ทั้งสาย V1S และ SV{26}}DsRed ไม่มีการเรืองแสง BiFC FL ในขณะที่สายพันธุกรรมคู่แบบบูรณาการแสดงการเรืองแสง BiFC ที่แข็งแกร่งทั้งในกล้ามเนื้อคอหอยและเซลล์ประสาทที่อยู่ติดกัน (รูปที่ S1F และ H) ดังนั้น ระบบ C. elegans BiFC นี้สามารถใช้เป็นแบบจำลองในร่างกาย ซึ่งทั้งการถ่ายโอนโปรตีนและการรวมตัวกันระหว่างโปรตีน SNCA ที่ได้มาจากเซลล์ที่อยู่ติดกันสามารถวิเคราะห์ได้อย่างแม่นยำและเชิงปริมาณในแบบเรียลไทม์

การเรืองแสง BiFC FL เพิ่มขึ้นเมื่อหนอนมีอายุมากขึ้น (รูปที่ 1E และ F) และสัตว์ที่มีอายุมากกว่าแสดงสัญญาณ BiFC เป็นกลุ่มก้อนในขณะที่สัตว์ที่อายุน้อยกว่าแสดงรูปแบบการแพร่กระจายเป็นส่วนใหญ่ (รูปที่ 1E) ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าการส่งผ่าน SNCA เป็นกระบวนการที่ต่อเนื่อง และมวลรวมที่สะสมทำให้เกิดการรวมกันจำนวนมากในภายหลัง

จากนั้นเราตรวจสอบความเสื่อมของกระบวนการแอกซอนจากเซลล์ประสาทสั่งการของ URA 9 เส้นประสาทเหล่านี้ไม่เสียหายใน N2 ชนิดไวด์ที่ d 8 การแสดงออกของ SV2 ในเซลล์ประสาททำให้เกิดการก่อตัวของ neuritic bleb และการแตกกระจายของเส้นประสาทในเวิร์มจำนวนเล็กน้อย (รูปที่ 1G ถึง K) ซึ่งบ่งชี้ความเป็นพิษต่อเซลล์ในตัวเองของ SNCA ในเซลล์ประสาท ฟีโนไทป์ของความเสื่อมเหล่านี้รุนแรงขึ้นอีกเมื่อ V1S ถูกแสดงออกในกล้ามเนื้อคอหอย ในกรณีหลังนี้ เส้นประสาทประมาณ 15 เปอร์เซ็นต์สูญเสียไปโดยสิ้นเชิง (รูปที่ 1K) ในการตรวจสอบการแตกตัวของเส้นประสาท เราได้ทำ 3-D ขึ้นใหม่จากภาพซ้อนของกระบวนการของเส้นประสาท การทดลองนี้แสดงการแตกกระจายของเส้นประสาทและการเกิดเกล็ดเลือดอย่างชัดเจน (รูปที่ 1H) ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นอย่างชัดเจนถึงผลกระทบของเซลล์ที่ไม่เป็นอิสระต่อความมีชีวิตของเซลล์ประสาท ความเสื่อมของเส้นประสาทแย่ลงเมื่อเวิร์มดัดแปรพันธุกรรมมีอายุมากขึ้น (รูปที่ 1J)

เพื่อประเมินการเปลี่ยนแปลงพฤติกรรมเนื่องจากการส่งผ่านมวลรวม SNCA เราได้ทำการวิเคราะห์การปั๊มคอหอย อัตราการสูบฉีดของ N2 ชนิดธรรมชาติไม่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อมีอายุมากขึ้นจนกระทั่งอายุ 16 ปี การแสดงออกเพียงครั้งเดียวของ V1S หรือ SV2-DsRed ในกล้ามเนื้อคอหอยและเซลล์ประสาทที่อยู่ติดกันตามลำดับ ส่งผลให้อัตราการสูบฉีดลดลงเล็กน้อย ในวัยชรา (รูปที่ 1L และตาราง S1) การลดอัตราการปั๊มของ Expressers เดี่ยวทั้งหมดมีนัยสำคัญในวันที่ 13 (รูปที่ 1L และตาราง S1) การอัดฉีดแบบผสมและเส้นคู่แสดงฟีโนไทป์ที่รุนแรงมากขึ้นสำหรับอัตราการสูบน้ำ โดยความลดลงเริ่มชัดเจนตั้งแต่ช่วงวันที่ 2 และทวีความรุนแรงขึ้นเรื่อย ๆ เมื่อเวิร์มมีอายุมากขึ้น (รูปที่ 1L และตารางที่ S1) ในการทดสอบอายุยืน สัตว์ที่มีการดัดแปลงพันธุกรรมเดี่ยวมีช่วงชีวิตที่ลดลงเล็กน้อยเมื่อเทียบกับเวิร์ม N2 ในขณะที่อายุขัยของสัตว์ที่มีการดัดแปลงพันธุกรรมสองครั้งนั้นสั้นกว่าสายพันธุ์ที่มีการดัดแปลงพันธุกรรมเดี่ยว (รูปที่ 1M และตารางที่ S2) ดังนั้น การส่งผ่านโดยรวมและการรวมตัวกันของร่างกาย รวมทั้งฟีโนไทป์ที่เกี่ยวข้องกับความเสื่อม ความคืบหน้าตามอายุ การเปรียบเทียบเส้นเวลาบ่งชี้ว่าการตายของสิ่งมีชีวิตเกิดขึ้นก่อนการสะสมของสัญญาณ BiFC การเสื่อมของเส้นประสาท และพฤติกรรมการสูบฉีดที่ลดลง ผลลัพธ์เหล่านี้ถูกจำลองแบบด้วยเวิร์มที่แสดง SNCA ที่ไม่ติดแท็กในเซลล์ประเภทเดียวกับแบบจำลอง BiFC (รูปที่ S1I ถึง L) ซึ่งบ่งชี้ว่าฟีโนไทป์ที่สังเกตได้ในแบบจำลอง BiFC นั้นมีสาเหตุมาจาก SNCA

ผลของปัจจัยทางพันธุกรรมที่เกี่ยวข้องกับอายุต่อการส่งผ่าน SNCA จากเซลล์สู่เซลล์

ต่อไป เราตรวจสอบผลกระทบของการแปรผันทางพันธุกรรมที่เกี่ยวข้องกับอายุต่อการถ่ายทอดโดยรวมและฟีโนไทป์ที่เสื่อมลง โครงสร้าง BiFC SNCA ถูกฉีดเข้าไปใน daf-2(e1370) และ daf-16(mu86) กลายพันธุ์ (รูปที่ S2A และ B) ซึ่งจำลองเอฟเฟกต์การแก่ชรา ด้วย daf{{6 }} (e1370) มิวแทนต์แสดงอัตราการแก่ที่ช้าลงและอายุขัยที่ยาวขึ้น ในขณะที่ daf-16(mu86) มิวแทนต์จะแก่เร็วกว่าประเภท wild และมีอายุขัยสั้นลง11 daf{{11 }}(e1370); สัตว์ V1SCSV2 แสดงสัญญาณ BiFC ที่ลดลง (รูปที่ 2A และ B; รูปที่ S2D), จำนวนรวมที่น้อยกว่า (รูปที่ 2C และ D; รูปที่ S2E), การเสื่อมของเส้นประสาทน้อยลง (รูปที่ 2E และ F; รูปที่ S2F และ G) ปรับปรุงพฤติกรรมการปั๊ม (รูปที่ 2G; รูปที่ S2H) และยืดอายุการใช้งานมากกว่าสาย V1SCSV2 (รูปที่ 2H; รูปที่ S2I) ในทางกลับกัน ใน daf-16(mu86); สัตว์ V1SCSV2, ร่างกายที่รวมเป็นบวกของ BiFC ปรากฏเร็วกว่าในสัตว์ V1SCSV2 มาก; ทันทีที่ 2-d โพสต์สเตจ L4- (รูปที่ 2C และ D; รูป S2E) สัญญาณ BiFC นั้นต่ำกว่าใน daf-16(mu86); V1SCSV2 มากกว่าใน V1SCSV2 (รูปที่ 2B; รูปที่ S2D) อาจเนื่องมาจากการก่อตัวของเนื้อความรวมที่เร็วและแข็งแกร่ง ดาฟ-16(มิว86); สัตว์ V1SCSV2 แสดงการเสื่อมของเส้นประสาทที่รุนแรงมากขึ้น (รูปที่ 2E และ F; รูปที่ S2F และ G) พฤติกรรมการปั๊มที่ลดลงมากขึ้น (รูปที่ 2G; รูปที่ S2H) และอายุขัยที่สั้นกว่าสัตว์ V1SCSV2 (รูปที่ 2H; รูปที่ เอสทูไอ). ได้รับผลลัพธ์ที่คล้ายกันใน 3 บรรทัดอิสระสำหรับแต่ละจีโนไทป์ ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าปัจจัยทางพันธุกรรมที่ส่งผลต่อกระบวนการชราภาพอาจเปลี่ยนอัตราการส่งผ่านระหว่างเซลล์ต่อเซลล์ของมวลรวม SNCA และฟีโนไทป์ความเสื่อมในร่างกายที่เกี่ยวข้อง

รูปที่ 1 การสร้างและลักษณะของแบบจำลอง C. elegans สำหรับการแพร่เชื้อของ synucleinopathy (A) เหตุการณ์ที่ถูกตั้งสมมติฐานซึ่งนำไปสู่การสร้างสารเรืองแสง BiFC ผ่านการส่งผ่านระหว่างเซลล์กับเซลล์ของ SNCA (B) ยีนที่ใช้ใน C. elegans DsRed แสดงเป็นหน่วยการแปลอิสระ ซึ่งใช้ในการติดป้ายกำกับเซลล์ประสาท (C) การเรืองแสง BiFC ในกล้ามเนื้อคอหอยและเซลล์ประสาท รูปภาพทั้งหมดประกอบด้วย DIC และรูปภาพเรืองแสง ลูกศรบ่งชี้สัญญาณ BiFC จากเซลล์ประสาท (ดูรูปที่ S1E ถึง H) สเกลบาร์: 20{{20}} มม. (D) การหาปริมาณของการเรืองแสง BiFC ใน (C) และสายรวม V1S C SV2 แบบรวมสองพันธุ์ ใช้เวิร์มยี่สิบห้าตัวจากแต่ละบรรทัด (E) การเรืองแสง BiFC เพิ่มขึ้นตามอายุ ลูกศรสีขาวระบุสัญญาณ BiFC ในเซลล์ประสาท และหัวลูกศรสีแดงระบุถึงสิ่งที่รวมอยู่ในคอหอย สเกลบาร์: 200 มม. (F) การหาปริมาณของการเรืองแสง BiFC ใน (E) และ V1SCSV2 สองเท่าของสายอินทิเกรตทรานส์เจนิก ใช้เวิร์มยี่สิบห้าตัวจากแต่ละบรรทัด , P < 0.001. (G) กระบวนการของเส้นประสาทที่แสดง DsRed ถูกวิเคราะห์สำหรับการเสื่อมสภาพของระบบประสาท แท่งสเกล : 200 มม. (H) 3-การสร้างมิติใหม่ของกระบวนการแอกซอนจากเซลล์ประสาทสั่งการ URA ที่มีสารเรืองแสง DsRed N กระบวนการแอกซอนปกติ F กระบวนการแอกซอนที่แยกส่วน "Fragmented" หมายถึงความเสื่อมของเส้นประสาททั้งหมด สเกลบาร์ : 40mm. (I และ J) ฟีโนไทป์ของ Blebbing เปอร์เซ็นต์ของเวิร์มที่มีเลือดออกที่ d 8 (I) และฟีโนไทป์ที่มีเลือดออกตามอายุ (J) ใช้เวิร์มสามสิบตัวจากแต่ละบรรทัด n D 3; , หน้า < 0.05; , พี < 0.01. (K) การแยกส่วนของกระบวนการแอกซอนที่ d 8. ใช้เวิร์มสามสิบตัวจากแต่ละบรรทัด, n D 3; , พี < 0.05. (L) อัตราการสูบฉีดของคอหอยตามอายุ; ใช้เวิร์มยี่สิบห้าตัวจากแต่ละบรรทัด ค่า P แสดงอยู่ในตาราง S1 (M) การวิเคราะห์ช่วงชีวิต มีการใช้เวิร์มหนึ่งร้อยห้าสิบตัวสำหรับแต่ละบรรทัด ค่า P แสดงอยู่ในตาราง S2

รูปที่ 2 ผลกระทบของการกลายพันธุ์ของ daf-2, daf-16 ต่อการส่งผ่าน SNCA แบบเซลล์ต่อเซลล์ (A และ B) การเรืองแสง BiFC ในการกลายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องกับอายุ daf-2(e1370) และ daf-16(mu86) (ดูรูปที่ S2D ด้วย) . สเกลบาร์: 200 มม. (A) ใช้เวิร์มยี่สิบตัวสำหรับแต่ละบรรทัด n D 3; , P < 0.05; , P < 0.01; , P < 0.001. (C และ D) เปอร์เซ็นต์ของเวิร์มที่มีการรวม BiFC-positive เมื่ออายุมากขึ้น (ดูรูปที่ S2E ด้วย) ใช้เวิร์มยี่สิบตัวสำหรับแต่ละบรรทัด n D 3; , หน้า < 0.05; , พี < 0.01. (E และ F) การหาปริมาณของ axonal bleb number (E) และการกระจายตัวของเส้นประสาท (F) ที่ d 8 (ดูรูปที่ S2F และ G) ใช้เวิร์มยี่สิบตัวสำหรับแต่ละบรรทัด n D 3; , หน้า < 0.05; , พี < 0.01. (G) อัตราการปั๊มคอหอยที่ d 13 (ดูรูปที่ S2H) ใช้เวิร์มยี่สิบตัวสำหรับแต่ละบรรทัด n D 3; , พี < 0.01. (H) การวิเคราะห์อายุขัย (ดูรูปที่ S2I) ใช้เวิร์มสามร้อยตัวสำหรับแต่ละบรรทัด ค่า P แสดงอยู่ในตาราง S2

ผลของการรักษาด้วยการชะลอวัยทางเภสัชวิทยาต่อการส่งผ่าน SNCA ข้ามเซลล์

จากนั้นเราพยายามที่จะหาผลกระทบของสารต่อต้านความชรา N-acetylglucosamine (GlcNAc)12 ต่อการส่งผ่านโดยรวม เมื่อ GlcNAc ถูกบริหารให้กับ V1SCSV2 และ daf-16 (mu86); สัตว์ V1SCSV2 สัตว์ทั้งสองแสดงการก่อตัวของ BiFC-positive inclusion bodies ที่ลดลง (รูปที่ 3A และ B) และฟีโนไทป์ที่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญสำหรับการเสื่อมของเส้นประสาท (รูปที่ 3C ถึง F) พฤติกรรมการปั๊ม (รูปที่ 3G) และอายุขัย (รูปที่ 3H). ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการรักษาด้วยยาชะลอวัยสามารถชะลอการดำเนินของโรคซินนิวเคลียสได้

การเปลี่ยนแปลงในระดับคงตัวของโปรตีนโพลียูบิควิติเนตโดยการรักษาต่อต้านริ้วรอย

เพื่อยืนยันข้อมูลทางจุลทรรศน์สำหรับการเปลี่ยนแปลงในระดับมวลรวม เราได้ทำการวิเคราะห์แบบดอทบล็อตด้วยแอนติบอดีที่จำเพาะต่อมัลติเมอร์ SNCA ที่มี b-sheet-rich (Syn-O2)13 สอดคล้องกับการวิเคราะห์การรวม BiFC การวิเคราะห์ดอทบล็อตแสดงให้เห็น การรวม SNCA ที่มี b-sheet จำนวนมากนั้นลดลงโดยการกลายพันธุ์ของ daf-2 และโดย GlcNAc ในขณะที่การกลายพันธุ์ของ daf-16 เพิ่มการรวม (รูปที่ 4A และ B) อายุที่เพิ่มขึ้นทำให้สภาวะสมดุลของโปรตีนลดลงอย่างต่อเนื่อง 12,14,15 สิ่งนี้ทำให้เราตรวจสอบระดับคงที่ของโปรตีน polyubiquitinated ซึ่งเป็นตัวแทนของกิจกรรมของระบบการย่อยสลายโปรตีนที่สำคัญ เช่น ระบบ ubiquitin-proteasome และ autophagy ระดับของโปรตีนโพลียูบิควิติเนตเพิ่มขึ้นในสัตว์ดัดแปรพันธุกรรม daf{15}} ในขณะที่พวกมันลดลงในสัตว์ดัดแปรพันธุกรรม daf-2 (รูปที่ 4C ถึง F) ในทำนองเดียวกัน การบำบัดสัตว์ด้วย GlcNAc ลดระดับของโปรตีนโพลียูบิควิติเนต (รูปที่ 4G ถึง J) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าผลของการรักษาความชราและการชะลอวัยต่อการแพร่กระจายของ synucleinopathy นั้นอาศัยการเปลี่ยนแปลงในความสามารถของระบบการย่อยสลายโปรตีน

รูปที่ 3 ผลกระทบของ GlcNAc ในการส่งผ่าน SNCA ข้ามเซลล์ (A) การเปลี่ยนแปลงในการเรืองแสง BiFC ด้วยการรักษา GlcNAc ที่ d 13 ลูกศรสีขาวระบุสัญญาณ BiFC จากเซลล์ประสาท และหัวลูกศรสีแดงบ่งชี้การรวมในคอหอย สเกลบาร์: 200 มม. (B) เวิร์มที่มีการรวม BiFC-positive ถูกวัดปริมาณ ใช้เวิร์มสามสิบตัวสำหรับแต่ละบรรทัด (C และ D) หมายเลข Axonal bleb ใน V1SCSV2 (C) และ daf-16(mu86); สัตว์ V1SCSV2 (D) ที่มีการรักษา GlcNAc ที่ d 8 ใช้เวิร์มยี่สิบตัวสำหรับแต่ละบรรทัด n D 5; , P < 0.05. (E และ F) การกระจายตัวของเส้นประสาทใน V1SCSV2 (E) และ daf-16(mu86); V1SCSV2 (F) สายพันธุ์ดัดแปรพันธุกรรมที่ d 8 ใช้หนอนยี่สิบตัวสำหรับแต่ละบรรทัด n D 5; , พี < 0.05. (G) อัตราการสูบฉีดคอหอยที่ d 11 ใช้เวิร์มสี่สิบตัวสำหรับแต่ละบรรทัด , หน้า < 0.05; , พี < 0.01. (H) การวิเคราะห์อายุขัยด้วยการรักษา GlcNAc มีการใช้เวิร์มห้าร้อยตัวสำหรับแต่ละบรรทัด ค่า P แสดงอยู่ในตาราง S2

เส้นทาง endolysosomal ในการส่งผ่าน SNCA

การศึกษาก่อนหน้านี้ในแบบจำลองเซลล์แสดงให้เห็นว่าการส่งผ่าน SNCA ระหว่างเซลล์อาศัยสื่อกลางโดยเอนโดไซโทซิส และโปรตีนที่ถ่ายโอนจะถูกส่งไปยังไลโซโซมเพื่อการย่อยสลาย16-19 เมื่อนำ V1SCSV2 เข้าสู่ไดนามินกลายพันธุ์ dyn-1 (ky51) 20 การเรืองแสง BiFC ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับชนิดไวด์ (รูปที่ 5A และ B) การลดลงของสัญญาณ BiFC ในสัตว์ดัดแปรพันธุกรรม dyn-1(ky51) มีค่ามากกว่าที่ d 5 ที่ d 2 ซึ่งบ่งชี้ว่าผลกระทบเป็นแบบสะสม การศึกษาก่อนหน้าของเราแสดงให้เห็นว่าการทำงานของไลโซโซมมีความสำคัญต่อการล้าง "เมล็ด" ในกระบวนการส่งผ่าน SNCA ระหว่างเซลล์ และความผิดปกติของไลโซโซมส่งผลให้เกิดการเพิ่มประสิทธิภาพของการส่งผ่านรวม 17,19,21 สอดคล้องกับการศึกษาเหล่านี้ เมื่อมีการนำ V1SCSV2 เข้าสู่ การกลายพันธุ์ของ asp-4 (ok2693) และ asp-1(tm666) ซึ่งมีการกลายพันธุ์ในยีน cathepsin,22 การเรืองแสง BiFC เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในการกลายพันธุ์ทั้งสอง ซึ่งมักจะอยู่ในรูปแบบของการรวมร่าง (รูปที่ 5C ถึง E; มะเดื่อ S3D และ E) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการตอบสนองของไลโซโซมมีความสำคัญต่อการปกป้องสัตว์จากการขยายพันธุ์โดยรวมตามอายุ สอดคล้องกับการตีความนี้ การรักษาด้วย GlcNAc เพิ่มการแสดงออกของยีน lysosomal เช่น lamp-1/LAMP1, sul-3/ARSB และ asp-1/ CTSD (รูปที่ 4K และ L) สิ่งนี้ได้รับการตรวจสอบเพิ่มเติมโดยการวิเคราะห์ epistasis โดยที่ asp-4(ok2693); V1SCSV2 และ asp-1(tm666); เวิร์ม V1SCSV2 ได้รับการรักษาด้วย GlcNAc ตรงกันข้ามกับเวิร์ม V1SCSV2 ฟีโนไทป์ที่เกี่ยวข้องกับอายุไม่ได้รับการช่วยเหลือโดยการรักษา GlcNAc ในสัตว์ดัดแปรพันธุกรรม asp-1 และ asp-4 (รูปที่ 5F ถึง J) นอกจากนี้ เรายังวิเคราะห์การแสดงออกของ sqst- 1/p62 ซึ่งเป็นองค์ประกอบหลักของกระบวนการ autophagic และดูเหมือนว่าการแสดงออกของมันจะถูกควบคุม แม้ว่าการเปลี่ยนแปลงจะล้มเหลวในการแสดงนัยสำคัญทางสถิติ (รูปที่ 4K และ L)

ผลของการรักษาด้วยการต่อต้านวัยต่อการแพร่เชื้อโดยรวมนั้นสัมพันธ์กับการทำงานของไลโซโซมที่เพิ่มขึ้น

ในการตรวจสอบบทบาทของไลโซโซมในการป้องกันการแพร่กระจายแบบรวม เราสร้างสายพันธุกรรมสูง-30 ที่แสดงเวกเตอร์ hlh-30p::hlh-30 สูงเกินไป, 14 ออร์โธโลจีของ TFEB ซึ่งเป็นต้นแบบ ควบคุมปัจจัยการถอดความสำหรับการกำเนิดทางชีวภาพของไลโซโซม23 เข้าไปใน daf-16(mu86); V1SCSV2 สัตว์แปลงพันธุ์ (รูปที่ S4A) นอกจากยีน lysosomal และ autophagic แล้ว ยีนเป้าหมายปลายน้ำสำหรับ HLH-30/TFEB ยังรวมถึงยีนที่เกี่ยวข้องกับเมแทบอลิซึม การตายของเซลล์ และการส่งสัญญาณ24 การแสดงออกของ hlh-30p::hlh-30 ใน คนบ้า-16(มิว86); สัตว์ V1SCSV2 เพิ่มการแสดงออกของยีน lysosomal, asp-1 รวมถึงยีนที่เกี่ยวข้องกับ autophagy, sqft-1 (รูปที่ 6A) และลดระดับของโปรตีน polyubiquitinated (รูปที่ . 6B ถึง E) ซึ่งบ่งชี้การฟื้นฟูการย่อยสลายโปรตีน และการก่อตัวของมวลรวม SNCA (รูปที่ 6F) สายพันธุ์ดัดแปลงพันธุกรรมสูง-30p::hlh- 30แสดงสัญญาณ BiFC ที่ลดลง (ด้วยเหตุนี้ การขยายพันธุ์แบบรวมที่ลดลง) การเสื่อมของเส้นประสาทลดลง อัตราการสูบฉีดเพิ่มขึ้น และอายุขัยที่เพิ่มขึ้น (รูปที่ 7A ถึง H; รูปที่ . S4B ถึง D).

รูปที่ 4 การเปลี่ยนแปลงในระดับคงตัวของโปรตีนโพลียูบิควิติเนตโดยการรักษาต่อต้านริ้วรอย. (A และ B) ระดับของมวลรวม SNCA (Syn-O2) ในสายที่เกี่ยวข้องกับอายุและการรักษาด้วย GlcNAc ข้อมูลได้รับการทำให้เป็นมาตรฐานเป็นนิพจน์ SNCA ทั้งหมด (274) Agg, SNCA รวม; รวม, นิพจน์ SNCA ทั้งหมด, n D 3 (A), n D 5 (B); , P < 0.{{20}}5. (C และ D) ระดับของโปรตีนโพลียูบิควิติเนตในแบบจำลองที่เกี่ยวข้องกับอายุ (E และ F) การหาปริมาณของระดับในเศษส่วน Tx-sol (E) และ Tx-insole (F) ระดับสูงสุดใน daf-16(mu86); V1SCSV2 เส้น Tx-sol, Triton ที่ละลายน้ำได้; Tx-insole, Triton-ไม่ละลายน้ำ, n D 3; , P < 0.05. (G และ H) ระดับของโปรตีนโพลียูบิควิติเนตด้วยการรักษา GlcNAc ในแบบจำลองที่เกี่ยวข้องกับอายุ (I และ J) การหาปริมาณของระดับในเศษส่วน Tx-sol (I) และ Tx-insole (J) n D 5; , พี < 0.05. เส้นทั้งหมดทางด้านขวาของภาพตะวันตกระบุช่วงขนาดเชิงปริมาณในรอยเปื้อน ข้อมูลทั้งหมดถูกทำให้เป็นมาตรฐานในการแสดงออกของ ACTB (K และ L) ระดับการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการดูดเลือดอัตโนมัติและยีน lysosomal ใน V1SCSV2 (K) และ daf-16(mu86); สัตว์ V1SCSV2 (L) ที่มีการบำบัดด้วย GlcNAc ที่วัดโดย qPCR n D 5; , หน้า < 0.05; , พี < 0.01.

รูปที่ 5 การมีส่วนร่วมของ endolysosomal pathways ในการส่งผ่าน SNCA (A และ B) การเรืองแสง BiFC ในสายพันธุกรรมพันธุ์ป่าและสายพันธ์ุ-1(ky51) สเกลบาร์: 200 มม. (A) ใช้เวิร์มยี่สิบสี่ตัวสำหรับแต่ละบรรทัด , P < 0.01; , P < 0.001. (C ถึง E) การเรืองแสง BiFC และการก่อตัวของร่างกายรวมใน wild-type, asp-4(ok2693) และ asp-1(tm666) เวิร์มกลายพันธุ์ (ดูรูปที่ S3D และ E) สเกลบาร์: 200 มม. (C) ใช้เวิร์มยี่สิบตัวสำหรับแต่ละบรรทัด n D 3; , หน้า < 0.05; , พี < 0.01. (F ถึง J) การวิเคราะห์ Epistasis ของเวิร์มดัดแปรพันธุกรรม asp-4 และ asp-1 ด้วยการรักษา GlcNAc (F และ G) ระดับของโปรตีนโพลียูบิควิติเนตด้วยการบำบัดด้วย GlcNAc (H และ I) การหาปริมาณของระดับในเศษส่วน Tx-sol (H) และ Tx-insole (I) (J) ระดับของ SNCA รวมกับการรักษา GlcNAc ข้อมูลถูกทำให้เป็นมาตรฐานเป็น ACTB (F และ G) และนิพจน์ SNCA ทั้งหมด (J), n D 3, ns: ไม่สำคัญ

การรวมเซลล์แบบอิสระกับการส่งผ่านระหว่างเซลล์ ผลลัพธ์ที่นำเสนอข้างต้นไม่ได้แยกความแตกต่างระหว่างการส่งผ่านแบบรวมระหว่างเซลล์และการรวมแบบอัตโนมัติของเซลล์ เพื่อแก้ไขปัญหานี้ เราได้สร้างสายพันธุ์ดัดแปรพันธุกรรม 4 สายพันธุ์ที่แสดง V1S หรือ SV2 เพียงลำพังในเวิร์มกลายพันธุ์ N2 และ daf-16(mu86) นอกจากนี้ มีการสร้างเวิร์มดัดแปลงพันธุกรรม 2 ตัวที่แสดงยีน hlh-30p:: huh-30 ด้วย V1S หรือ SV2 มากเกินไป ระดับการแสดงออกถูกทำให้เป็นมาตรฐานด้วย single-worm PCR และการวิเคราะห์แบบตะวันตก (ในกรณีของเส้น V1S) หรือการเรืองแสง DsRed (ในกรณีของเส้น SV2) ความเสื่อมของเส้นประสาท พฤติกรรมการสูบฉีด และอายุขัยของเวิร์มดัดแปรพันธุกรรมในภูมิหลังที่กลายพันธุ์เมื่อเปรียบเทียบกับตัวที่มีภูมิหลังทางพันธุกรรมปกติ เราไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในฟีโนไทป์ (รูปที่ S5C ถึง G) ซึ่งบ่งชี้ว่าการดัดแปลงทางพันธุกรรมที่เราตรวจสอบนั้นไม่มีผลกระทบอย่างมากต่อการรวมตัวของ SNCA ในเนื้อเยื่อที่เกี่ยวข้อง (รูปที่ S5H)

รูปที่ 6 การฟื้นฟูฟังก์ชันการย่อยสลายของ lysosomal โดยการแสดงออกของยีนของ hlh-30phlh-30 ( A ) ระดับการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับ autophagy และ lysosomal ที่วัดโดย qPCR n D 3; , P < 0.05. (B และ C) ระดับของโปรตีนโพลียูบิควิติเนตใน daf-16(mu86); V1SCSV2 ในการมีอยู่หรือไม่มีทรานส์ยีน-30phlh- 30 สูง (D และ E) การหาปริมาณของระดับในเศษส่วนไตรตันที่ละลายน้ำได้ (D) และไตรตันที่ไม่ละลายน้ำ (E) ช่วงขนาดที่วัดได้จะระบุโดยเส้นทางด้านขวาในจุด ข้อมูลทั้งหมดถูกทำให้เป็นมาตรฐานด้วย ACTB, n D 3; , หน้า < 0.05. (F) ระดับของการรวมตัวของ SNCA ในสายพันธุกรรมสูง-30p::hlh-30 ข้อมูลถูกทำให้เป็นมาตรฐานเป็นนิพจน์ SNCA ทั้งหมด, n D 3; , พี < 0.05.

นอกจากนี้ เรายังปฏิบัติต่อเส้นการแสดงออกของเนื้อเยื่อเดี่ยวที่มี V1S หรือ SV2 เพียงอย่างเดียวในเวิร์มกลายพันธุ์ N2 และ daf-16(mu86) ด้วย GlcNAc และเปรียบเทียบการทดสอบฟีโนไทป์ชุดเดียวกันกับสัตว์ที่ไม่ได้รับการรักษา ซึ่งแตกต่างจากแบบจำลองการส่งผ่าน เส้นการแสดงออกของเนื้อเยื่อเดี่ยวไม่ได้แสดงการเปลี่ยนแปลงที่มีนัยสำคัญในฟีโนไทป์ที่ทำให้เกิดโรคเมื่อทำการรักษาด้วย GlcNAc (รูปที่ S6D ถึง M) ในการตรวจสอบผลกระทบของ GlcNAc ต่อระดับการแสดงออกของ SNCA เราวัดระดับของ SNCA ด้วย dot blot (รูปที่ S6N และ O) ข้อมูลแสดงให้เห็นว่าระดับการแสดงออกไม่ได้เปลี่ยนแปลงโดยการรักษา GlcNAc นอกจากนี้ เรายังตรวจสอบการแสดงออกของเซลล์ประสาทของแมลงวัน-21 โปรโมเตอร์จากการรักษาด้วย GlcNAc โดยการตรวจสอบ DsRed การแสดงออกของ DsRed ถูก จำกัด อย่างเคร่งครัดในเซลล์ประสาทที่มีหรือไม่มีการรักษา GlcNAc (รูปที่ S6P) ซึ่งบ่งชี้ว่าการรักษาไม่ได้เปลี่ยนความจำเพาะประเภทเซลล์ของโปรโมเตอร์ สุดท้าย เราตรวจสอบความสามารถในการละลายของผงซักฟอกของ SNCA ในเวิร์มดัดแปรพันธุกรรมเดี่ยว (V1S หรือ SV2) และสองเท่า (V1SCSV2) ที่มีหรือไม่มีการบำบัดด้วย GlcNAc Triton X-100-อัตราส่วนที่ไม่ละลายน้ำต่อ -ละลายน้ำได้เพิ่มขึ้นอย่างมากในการดัดแปรพันธุกรรมสองเท่าเมื่อเทียบกับการดัดแปรพันธุกรรมเดี่ยว แม้ว่าระดับการแสดงออกของโปรตีนแต่ละชนิดจะเท่ากัน (รูปที่ 8A ถึง E; รูปที่ S8) ผลลัพธ์นี้เกี่ยวข้องกับการขยายมวลรวมระหว่างเซลล์กล้ามเนื้อคอหอยและเซลล์ประสาทที่เกี่ยวข้อง Dot blot ที่มีแอนติบอดี Syn-O2 ที่จำเพาะต่อการรวมแสดงผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกัน โดยยืนยันว่าการดัดแปรพันธุกรรมสองเท่าสร้างมวลรวมมากกว่าผลรวมของการดัดแปรพันธุกรรมทุกตัว (รูปที่ 8F) ประเด็นสำคัญอีกประการหนึ่งในที่นี้ก็คือการดัดแปลงพันธุกรรมเดี่ยวนั้นสร้างมวลรวม SNCA อย่างแท้จริง นี่เป็นการยืนยันว่าการรวมตัวแบบอิสระของเซลล์เกิดขึ้น ดังนั้นจึงสามารถเริ่มต้นการส่งการรวมได้ ในการทดลองความสามารถในการละลายของผงซักฟอก อัตราส่วนไตรตันที่ไม่ละลายน้ำต่อ - ที่ละลายน้ำไม่ได้เปลี่ยนแปลงเมื่อบำบัดด้วย GlcNAc ในการดัดแปลงพันธุกรรมเดี่ยว ในขณะที่การบำบัดแบบเดียวกันลดอัตราส่วนลงอย่างมาก (รูปที่ 8C ถึง E; รูปที่ S8) ซึ่งบ่งชี้ว่าการต่อต้านริ้วรอย การรักษาส่งผลกระทบต่อกระบวนการส่งผ่านเป็นหลัก มากกว่าการรวมตัวกันของโปรตีนแต่ละชนิด การวิเคราะห์ดอทบล็อตด้วยแอนติบอดี Syn-O2 แสดงผลลัพธ์ที่เหมือนกันเป็นส่วนใหญ่ (รูปที่ 4B; รูปที่ S6N) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการรักษาต่อต้านความชราและโปรไลโซโซมที่ใช้ในการศึกษาปัจจุบันมีผลกระทบต่อการส่งผ่านมวลรวมระหว่างเซลล์

สอบถามเพิ่มเติม:

อีเมล:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950