โมเดลดัดแปลงพันธุกรรมเผยให้เห็นบทบาทของ Klotho ในการพัฒนามะเร็งตับอ่อนและปูทางสำหรับการบำบัดด้วย Klotho แบบใหม่

กรุณาคลิกoscar.xiao@wecistanche.comสำหรับข้อมูลเพิ่มเติม

สรุปง่ายๆ:เรามีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาบทบาทของโคลโทโปรตีนต่อต้านวัยและไอโซฟอร์มที่หลั่งออกมาในสหราชอาณาจักรในมะเร็งตับอ่อน แบบจำลองในร่างกาย 3 แบบ ซึ่งรวมถึงแบบจำลองเมาส์ทางพันธุกรรมแบบใหม่และการวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศ ระบุว่า โคลโทเป็นตัวยับยั้งเนื้องอกในมะเร็งท่อน้ำดีในท่อตับอ่อน และเผยให้เห็นรูปแบบเฉพาะของ klotho DNA hypermethylation ในเนื้องอกในตับอ่อน ผลลัพธ์เหล่านี้มีคุณค่าในการพยากรณ์โรคอย่างมีนัยสำคัญ และแนะนำเพิ่มเติมว่าเธออาจทำหน้าที่เป็นตัวแทนในการรักษาโรคมะเร็งท่อน้ำดีในท่อตับอ่อน

กรุณาคลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

บทคัดย่อ: โคลโทเป็นโปรตีนเมมเบรนต่อต้านริ้วรอย ซึ่งสามารถหลั่งออกมาและทำหน้าที่เป็นฮอร์โมนได้ ข้อมูลที่สะสมระบุว่าโคลโทเป็นตัวยับยั้งเนื้องอกในมะเร็งหลายชนิด และกำหนดโดเมนย่อย KL1 เป็นบริเวณที่ออกฤทธิ์ของโปรตีนสำหรับกิจกรรมนี้ เรามีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาบทบาทของโคลโทในการยับยั้งเนื้องอกในมะเร็งท่อน้ำดีตับอ่อน (PDAC) การวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศของชุดข้อมูล Cancer Genome Atlas (TCGA) เผยให้เห็นความสัมพันธ์ระหว่างการรอดชีวิตของผู้ป่วย PDAC ระดับการแสดงออกของ klotho และ DNA methylation และแสดงให้เห็นรูปแบบ hypermethylation เฉพาะของ klotho ในเนื้องอกในตับอ่อน ผลกระทบในร่างกายของ klotho และ KL1 ได้รับการตรวจสอบโดยใช้เมาส์สามรุ่น การใช้แบบจำลองทางพันธุกรรมแบบใหม่ ซึ่งรวมการล้มลงของ klotho ของตับอ่อนกับการกลายพันธุ์ใน Kras การขาด klotho มีส่วนทำให้เกิด PDAC และลดอัตราการรอดชีวิตของหนู ในรูปแบบการปลูกถ่ายวิวิธวิสัย การบริหารอนุภาคไวรัสที่ลอยอยู่บนท้องฟ้า ไอโซฟอร์มโคลโทแบบประกบที่มีโดเมน KL1 ยับยั้งเนื้องอกในตับอ่อนซื้อ cistancheสุดท้าย การรักษาด้วยท้องฟ้าที่ละลายน้ำได้ทำให้การอยู่รอดของ Pdx1-Cre; KrasG12D/ บวก ; หนูเมาส์ Trp53R172H/ บวก (KPC) เป็นที่ทราบกันว่าแบบจำลองเพื่อสรุป PDAC ของมนุษย์ไบโอฟลาโวนอยด์,โดยสรุป การศึกษานี้ให้หลักฐานว่าโคลโธเป็นตัวยับยั้งเนื้องอกใน PDAC นอกจากนี้ ข้อมูลเหล่านี้ยังชี้ให้เห็นว่าระดับของการแสดงออกของโคลโทและเมทิลเลชันของ DNA อาจมีค่าพยากรณ์ในผู้ป่วย PDAC และการบริหาร sKL จากภายนอกนั้นอาจเป็นกลยุทธ์การรักษาแบบใหม่ในการรักษา PDAC

คำสำคัญ:โคลโท; KL1; เอสเคแอล; ตัวยับยั้งเนื้องอก มะเร็งตับอ่อน; PDAC

1. บทนำ

มะเร็งตับอ่อนเป็นหนึ่งในมะเร็งที่ลุกลามมากที่สุด โดยมีอัตราการรอดชีวิต 5-ปีที่ 9 เปอร์เซ็นต์ อุบัติการณ์และการเสียชีวิตเพิ่มขึ้น โดยคาดว่ามีผู้ป่วยรายใหม่ 60,430 รายและผู้เสียชีวิต 48,220 รายในปี 2564 ในสหรัฐอเมริกาประเทศเดียว[1] Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) แสดงถึง 85-90 เปอร์เซ็นต์ของเนื้องอกในตับอ่อนที่เป็นมะเร็งทั้งหมด โมเดลปัจจุบันบ่งชี้การพัฒนาจากเนื้องอกในเยื่อบุผิวในตับอ่อน (PanlN)1-3 ที่ไม่เป็นพิษเป็นภัยไปจนถึงมะเร็งที่แพร่กระจายไปพร้อมกับการกลายพันธุ์ของยีน การกระตุ้น Kras ถือเป็นก้าวแรกสู่ความร้ายกาจ [2] และในแบบจำลองเมาส์ จะนำไปสู่การพัฒนาของ PanIN ภายใน 9 เดือน [3] แม้ว่า PDAC ที่เปิดเผยในหนูเหล่านี้จะหาได้ยาก แต่ในแบบจำลอง KPC ซึ่งรวมการกลายพันธุ์ของ Kras เข้ากับการสูญเสียตัวยับยั้งเนื้องอก p53 [4] PDAC มักจะพัฒนาเมื่ออายุ 3-6 เดือน [5]

Cistanche สามารถต่อต้านริ้วรอย

Klotho (ที่นี่ใช้เป็น klotho) เป็นโปรตีนเมมเบรนชนิดที่ 1 ที่เกี่ยวข้องกับการควบคุมอายุ [6] ในหนู การขาด klotho ทำให้เกิดกลุ่มอาการที่คล้ายกับการแก่เร็วขึ้น ในขณะที่การแสดงออกของ klotho มากเกินไปจะยืดอายุขัย [7,8] บริเวณนอกเซลล์โคลโทประกอบด้วยโดเมนที่คล้ายคลึงกันสองโดเมนคือ KL1 และ KL2 ซึ่งสามารถแยกออกจากเยื่อหุ้มเซลล์และทำหน้าที่เป็นฮอร์โมนหมุนเวียน [9-11] ไอโซฟอร์มของโคลโทที่ต่อแยกส่วนที่สองจะถูกหลั่งออกมา (สหราชอาณาจักร) ท้องฟ้าเหมือนกับ KL1 บวกกับกรดอะมิโนอีก 15 ตัวที่ปลาย C มีการอธิบายกิจกรรมต่างๆ ของ klotho รวมถึงการกระตุ้นการส่งสัญญาณของไฟโบรบลาสต์ (FGF)23 การส่งสัญญาณ [12,13] การควบคุมของสมาชิกช่องไอออนบวกของช่องไอออนบวก (TRPV)5 ของช่องแคลเซียมที่รับชั่วคราว [14,15] และการยับยั้งของ อินซูลินและปัจจัยการเจริญเติบโตคล้ายอินซูลิน (IGF)-1 เส้นทาง [8,16,17]

Klotho แสดงออกอย่างเด่นชัดในไตและสมอง แต่ยังอยู่ในเนื้อเยื่อต่างๆ รวมทั้งตับอ่อนต่อมไร้ท่อและต่อมไร้ท่อ [7,17-20] ยังไม่ได้กำหนดกิจกรรมทางสรีรวิทยาในตับอ่อน อย่างไรก็ตาม มีหลักฐานว่าเกี่ยวข้องกับการควบคุมภาวะธำรงดุลของกลูโคส Klotho กระตุ้นการผลิตและการหลั่งอินซูลิน ในหลอดทดลอง และในร่างกาย ลดความไวของอินซูลินในหนูทดลอง และหมดไปในผู้ป่วยเบาหวานชนิดที่ 2 เกาะตับอ่อน (T2DM) [8,19-22] Klotho เป็นตัวยับยั้งเนื้องอกที่มีศักยภาพในมะเร็งหลายชนิด รวมถึงมะเร็งในทางเดินอาหาร [16,17,23-30] เซลล์มะเร็งจะถูกยับยั้งโดย epigenetically และทั้ง klotho และ Karl ช่วยลดการเติบโตของเซลล์มะเร็ง ในหลอดทดลอง และในร่างกาย [16,17,23,25,26,28,31-33] ในมะเร็งตับอ่อน การปรับลดของโคลโธมีความสัมพันธ์กับการอยู่รอดของผู้ป่วย ในหลอดทดลอง โคลโทลดการเจริญเติบโตของเซลล์มะเร็งตับอ่อนและยับยั้งวิถี IGF-I และ bFGF[17,34]

ในการศึกษานี้ เรามุ่งเป้าที่จะถอดรหัสบทบาทของโคลโธในฐานะตัวยับยั้งเนื้องอกใน PDAC โดยใช้แบบจำลองในร่างกายสามแบบ ด้วยการใช้แบบจำลองทางพันธุกรรมแบบใหม่ เราแสดงให้เห็นว่าการล้มลงของตับอ่อน klotho มีส่วนทำให้เกิดการพัฒนา PDAC และลดอัตราการรอดชีวิตของหนูกลายพันธุ์ Kras ในรูปแบบที่สอง เราแสดงให้เห็นว่าการบริหารอนุภาคไวรัสที่มี sKL ยับยั้งเนื้องอกตับอ่อนในรูปแบบการปลูกถ่ายวิวิธพันธุ์ สุดท้าย การรักษาด้วย recombinant sky ที่ละลายน้ำได้ช่วยยืดอายุการรอดชีวิตของหนู KPC ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นถึงบทบาทของโคโตะในฐานะผู้เล่นที่สำคัญในการพัฒนา PDAC และแนะนำ klotho เป็นกลยุทธ์ในการรักษาผู้ป่วย PDAC

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. การวิเคราะห์ TCGA โดยใช้ UCSC Xena Browser

การแสดงออกของยีน RNAseg (IlluminaHiSeq) และชุดข้อมูล DNA methylation (Methylation450k) สำหรับ The Cancer Genome Atlas (TCGA) Pancreatic Cancer (PAAD) cohort ได้รับการศึกษาโดยใช้ University of California Santa Cruz (UCSC)Xena Browser (http://xena.ucscedu/, เข้าถึงเมื่อ 19 กรกฎาคม 2020)[35].cistanchการใช้เบราว์เซอร์ Xena วิเคราะห์การรอดชีวิตโดยรวมและช่วงเวลาที่ไม่มีความก้าวหน้าของผู้ป่วยมะเร็งตับอ่อนตามการแสดงออกของ klotho หรือการทำ DNA methylation ของ KLOTHO และสร้างแผนภาพ Kaplan-Meier ข้อมูลที่ซ้ำกันถูกลบออกโดยการกรองเฉพาะเนื้องอกปฐมภูมิเท่านั้น ข้อมูลการแสดงออกของยีนที่ให้ไว้ใน log2(x บวก 1) หน่วย ถูกแบ่งออกเป็นสองกลุ่มตามค่ามัธยฐาน ข้อมูล DNA methylation ถูกแบ่งออกเป็นสองกลุ่มตามควอไทล์ล่างและบน

สำหรับการทำเมทิลเลชัน DNA ของ KLOTHO ที่จำเพาะต่อตำแหน่งนั้น ตัวอย่างที่มีการแสดงออกของโคลโทในระดับต่ำหรือสูง ตามที่กำหนดโดยควอไทล์ที่ต่ำกว่าหรือบนตามลำดับ ถูกวิเคราะห์เพิ่มเติม ค่า 36 สำหรับแต่ละไซต์เมทิเลชั่นถูกคำนวณ และสหสัมพันธ์กับการแสดงออกของโคลโทในตัวอย่างที่สอดคล้องกันถูกตรวจสอบผ่านสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ของเพียร์สัน (r)

2.2. เคมีภัณฑ์ แอนติบอดี และโครงสร้าง

สารเคมีที่ใช้ในการศึกษานี้รวมถึงโคลโทแวเรียนต์รอยต่อของมนุษย์ที่ละลายได้ ซึ่งประกอบด้วยกรดอะมิโน34-549(โดเมนสกี; เลขทะเบียน BAA24941.1) ที่มี15-ลำดับเฉพาะของกรดอะมิโนที่ปลาย C({ {6}}; PeproTech Inc, ร็อคกี้ ฮิลล์, นิวเจอร์ซีย์, สหรัฐอเมริกา); กลูโคส (Floris, Misgav, Israel), อินซูลินของมนุษย์ (Actrapid; Novo Nordisk A/S, Bagværd, Den-mark) และ luciferin (122799; PerkinElmer, Waltham, MA, USA)

แอนติบอดีที่ใช้ในการศึกษานี้รวมถึงกลุ่มควบคุมไอโซไทป์ IgG2a ของหนูแรท (02-9688; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) และสารต้าน- -แอคติน (A5441; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) . แอนติบอดีต่อต้านโคลโทที่ต่อต้านโดเมน KL1 (KM2076) เป็นของขวัญจาก Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. โตเกียว ประเทศญี่ปุ่น

2.3.AAV การผลิตเวกเตอร์และการทำให้บริสุทธิ์

เวกเตอร์ AAV9, เวกเตอร์ว่างที่เป็นค่าว่าง และท้องฟ้า (ซึ่งมีไอโซฟอร์มของตัวแปรการประกบโคลโทที่คัดหลั่งแล้ว หมายเลขภาคยานุวัติ BAA24941.1) ถูกผลิตและทำให้บริสุทธิ์ในโรงงานความปลอดภัยทางชีวภาพระดับ 2 ของ United Mixta UAB-VHIR และหน่วยการผลิตเวกเตอร์ (VPU) อย่างย่อ , เวกเตอร์ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ระบบการถ่ายแบบสามชั้นในเซลล์ HEK293 หลังจากผ่านไป 48 ชั่วโมง เวกเตอร์ AAV ถูกเก็บเกี่ยว บำบัดด้วยเบนโซเนส ทำให้บริสุทธิ์ด้วยการไล่ระดับไอโอดีซานอล และไทเทรตโดยใช้ PicoGreen [37] การแสดงออกของยีนถูกขับเคลื่อนโดยโปรโมเตอร์ CMV ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [37]

2.4. การดูแลสัตว์

การบำรุงรักษาและการทดลองของเมาส์ได้ดำเนินการในศูนย์การแพทย์ Sourasky (เทลอาวีฟ ประเทศอิสราเอล) และเป็นไปตามข้อบังคับและมาตรฐานของคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ของศูนย์การแพทย์ Sourasky

สายพันธุ์ของหนูเมาส์ที่ใช้สำหรับแบบจำลองดัดแปรพันธุกรรมทั้งหมดอยู่บนพื้นหลัง C57BL/6 และ JVB/NJ แบบผสม Pdx1-Cre, LSL-KrasG12D/ plus และ LSL-Trp53R172H/ plus t หนูเป็นของขวัญจาก Dr. Ziv Gil (สถาบันเทคโนโลยี Technion-Israel ที่ Rambam, Haifa, Israel)

2.5. KLOTHO Knockdowm Mouse รุ่นเฉพาะสำหรับตับอ่อน

เพื่อที่จะกำหนดเป้าหมายการทำให้ล้มลงของ KLOTHO ไปที่ตับอ่อนของหนู หนูที่มีอัลลีล KLOTHO ที่เป็นฟล็อกซ์ (KLlox) ได้ถูกสร้างขึ้นตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [38]cistanche ออสเตรเลียหนูเมาส์ Keflex/ฟล็อกซ์ถูกผสมข้ามพันธุ์กับหนูเมาส์ Pdx1-Cre ซึ่งแสดงออก Cre recombinase ที่ควบคุมโดยโปรโมเตอร์ของ Pdxl ด้วยเหตุนี้จึงได้ Pdx1-Cre; KL-/-หนู. การล้มลงของตับอ่อน KLOTHO ได้รับการยืนยันด้วยระดับอิมมูโนฮิสโตเคมีและ mRNA ตามที่อธิบายไว้ต่อไปนี้

เพื่อสร้างหนูที่มีการควบคุม KLOTHO ที่ควบคุมโปรโมเตอร์ Pdxl และการแสดงออกของ Kras ที่กลายพันธุ์ LSL-KrasG12D/ plus หนู [3] ซึ่งมีลำดับ Lox-Stop-Lox ตามด้วยอัลลีล Kras กลายพันธุ์ถูกผสมข้ามพันธุ์กับหนู KLflox/flox หนูเหล่านี้ถูกผสมข้ามพันธุ์เพิ่มเติมด้วย Pdx1-หนู Cre ที่ให้ผล Pdx1-Cre; กัวลาลัมเปอร์-/-; KrasG12D/บวกหนู. LSL-KrasG12D/ plus ยังถูกผสมข้ามพันธุ์ด้วย Pdx1-Cre หนูแยกจากกัน และ Pdx1-Cre นี้; KrasG12D/ plus หนูเมาส์ถูกใช้เป็นตัวควบคุม หนูได้รับการตรวจสอบทุกวันเพื่อหาสัญญาณของความทุกข์ รวมถึงการหายใจลำบาก น้ำหนักเปลี่ยนแปลง และเนื้องอกขนาดใหญ่ (มากกว่า 1 ซม.) และหนูที่ตรงตามเกณฑ์ที่กำหนดโดยคณะกรรมการจริยธรรมก็เสียสละ หนูได้รับการตรวจสอบเพื่อความอยู่รอด โดยกำหนดความตายโดยธรรมชาติหรือโดยสัญญาณที่จำเป็นต้องเสียสละ เนื่องจากการย่อยอย่างรวดเร็วของเนื้อเยื่อตับอ่อนโดยของเหลวในตับอ่อน เราจึงสามารถตรวจสอบตับอ่อนของหนูที่ได้รับการสังเวยเท่านั้น เนื้อเยื่อถูกเก็บเกี่ยวและเก็บไว้ในฟอร์มาลดีไฮด์เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นจึงแทนที่ด้วยเอทานอล 70 เปอร์เซ็นต์

2.6. หนูศึกษา Xenograft เนื้องอก

หนูเปลือยเปล่าเพศเมีย (พื้นหลัง BALB/c) อายุ {0}} สัปดาห์ ถูกซื้อจาก Envigo RMS (เยรูซาเล็ม ประเทศอิสราเอล) หนูถูกจัดวางและบำรุงรักษาในตู้ไหลแบบลามิเนตภายใต้สภาวะที่ปราศจากเชื้อโรคโดยเฉพาะ ในวันแรกของการทดลอง MIA PaCa-2 เซลล์ที่แสดงออก m-Cherry/luciferase อย่างคงตัวถูกฉีดเข้าใต้ผิวหนัง(sc) ไปในสีข้าง (n=21, 1 ×10 องศา เซลล์ใน 100 ไมโครลิตรจาก 5 เปอร์เซ็นต์สื่อ FCS DMEM) สิบวันหลังจากการฉีดวัคซีนเนื้องอก ปริมาณสูง (5× 1011 GC/mL, n=7) หรือขนาดต่ำ (5× 1010GC/mL,n=6) ของมนุษย์ AAV-เธอถูกฉีดเข้ากล้าม (im).AAV-null ทำหน้าที่เป็นตัวควบคุม (5×1010 GC/mL, n=8) เนื้องอกถูกวัดด้วยคาลิปเปอร์ดิจิตอลสามครั้งต่อสัปดาห์ และปริมาตรคำนวณโดยสูตรการคำนวณปริมาตรทรงรี (0.5×ยาว × กว้าง2) ในวันที่ 20 ของการทดลอง เนื้องอกถูกประเมินผล ภายในร่างกาย โดยการเฝ้าติดตามการทำงานของลูซิเฟอเรสของเซลล์ MIA PaCa-2 โดยการฉีดลูซิเฟอรินในช่องท้อง 150 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร และความเข้มข้นของลูซิเฟอเรสถูกวัดโดยไบโอสเปส

ในวันเดียวกันนั้น การทดลองสิ้นสุดลงและหนูถูกทำการุณยฆาต เนื้องอกจะถูกลบออก ชั่งน้ำหนัก และวัดด้วยคาลิปเปอร์ดิจิตอล เก็บเลือดก่อนการุณยฆาต และวัดระดับโคลโทของมนุษย์ในซีรัมโดยใช้ ELISA (IBL, Minneapolis, MN, USA) เซรั่ม 50 ไมโครลิตรต่อตัวอย่าง (ซ้ำกัน) ถูกใช้สำหรับ ELISA และการทดสอบได้ดำเนินการตามคำแนะนำของผู้ผลิต ความสัมพันธ์ระหว่างน้ำหนักของเนื้องอกและระดับโคลโทในเลือดของมนุษย์ได้รับการตรวจสอบโดยใช้ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ของเพียร์สัน

2.7. รุ่นเมาส์ KPC

การสร้างหนูเมาส์ KPC ทำได้โดยการผสมข้ามพันธุ์ LSL-Trp53R172H/ บวกหนู [5] ที่มีลำดับ Lox-Stop-Lox ตามด้วยอัลลีล p53 ที่กลายพันธุ์แบบจุดซึ่งทำหน้าที่เป็นการกลายพันธุ์แบบ null โดยมีหนูเมาส์ LSL-KrasG12D/ plus t สิ่งเหล่านี้ถูกผสมข้ามพันธุ์เพิ่มเติมกับ Pdx1-หนู Cre ทำให้เกิด Pdx1-Cre; KrasG12D/ บวก ; Trp53R172H/ บวกกับเมาส์ หนูถูกจับคู่ตามเพศ อายุ และน้ำหนัก และได้รับการสุ่มให้รับการรักษาด้วยการฉีดเข้าช่องท้อง (ip) ของผิวหนังมนุษย์ที่ละลายได้ (15 มก./กก. สัปดาห์ละสองครั้ง)หรือกลุ่มควบคุมด้วยกระสายยา (n =6 สำหรับ กลุ่มท้องฟ้าบำบัด n =7 สำหรับกลุ่มควบคุม) การรักษาต่อเนื่องนานถึง 30 สัปดาห์ หนูได้รับการตรวจสอบทุกวันเพื่อหาสัญญาณของความทุกข์ รวมถึงการหายใจลำบาก น้ำหนักเปลี่ยนแปลง และเนื้องอกขนาดใหญ่ (มากกว่า 1 ซม.) และหนูที่ตรงตามเกณฑ์ที่กำหนดโดยคณะกรรมการจริยธรรมก็เสียสละ หนูได้รับการตรวจสอบเพื่อความอยู่รอด โดยกำหนดความตายโดยธรรมชาติหรือโดยสัญญาณที่จำเป็นต้องเสียสละ

2.8. จีโนไทป์

หางหนูถูกถ่ายเมื่ออายุ 3 สัปดาห์สำหรับการสร้างยีน DNA ถูกสกัดโดยการฟักตัวของหางในสารละลายอัลคาไลน์ lysis ซึ่งประกอบด้วย 250 μM NaOH และ 2 μM disodium EDTA (pH 120) เป็นเวลา 30-60 นาที ที่ 95 องศา ตามด้วยการทำให้เป็นกลางด้วย 0.4 mM Tris HCL(pH 5.0) ต่อมา DNA ได้รับการขยาย PCR สำหรับจีโนไทป์ต่างๆ โดยใช้ REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix(Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel) ไพรเมอร์อยู่ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 1,000 นาโนโมลาร์ วัฏจักร PCR และไพรเมอร์มีรายละเอียดอยู่ในตาราง S1 ผลิตภัณฑ์ถูกอิเล็กโตรโฟรีสบนเจลอากาโรส 1.5 เปอร์เซ็นต์ และย้อมด้วยเอทิเดียมโบรไมด์

2.9. การวิเคราะห์อิมมูโนฮิสโตเคมี (IHC)

เนื้อเยื่อได้รับการแก้ไขในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์และเนื้อเยื่อที่ฝังตัวถูกแบ่งส่วนตามลำดับ ส่วนต่างๆ ถูกย้อมด้วย hematoxylin และ eosin (H&E) และตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์โดยนักพยาธิวิทยาที่มีประสบการณ์ หรือย้อมโดย IHC ตามที่อธิบายไว้ สำหรับโคลโท IHC ส่วนที่ตรึงฟอร์มาลินและฝังพาราฟินหนา 4 ไมโครเมตร ถูกกำจัดออกในไซลีนและนำความชื้นกลับมาใช้ใหม่ การดึงแอนติเจนถูกดำเนินการโดยใช้อ่างน้ำร้อน (95 องศา ) เป็นเวลา 20 นาทีในบัฟเฟอร์ซิเตรต pH6.0 หลังจากการทำให้เย็นลงเป็นเวลา 30 นาที สไลด์ถูกล้างในบัฟเฟอร์ TBS-triton (TBS-T)ประโยชน์ของซิสแทนเช่ต่อมา และดำเนินการบล็อกเปอร์ออกซิเดสภายในร่างกายเป็นเวลา 10 นาทีใน 3 เปอร์เซ็นต์ H, O/เมทานอล หลังจากการชะล้างใน TBS-T ส่วนต่างๆ ถูกปิดกั้นเป็นเวลา 30 นาทีโดยใช้ BSA 5 เปอร์เซ็นต์ใน TBS-T และต่อมาถูกบ่มในชั่วข้ามคืนด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิของโคลโทที่ 4 องศา ตรวจจับด้วย ZytoChem Plus(HRP)One-Step Polymer anti-Mouse/Rabbit/Rat (ZUC053; Zytomed Systems, Berlin, Germany) หนู IgG2a ทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมไอโซไทป์

2.10.ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส Transcription ย้อนกลับ (RT-PCR)

ตับอ่อนจาก Pdxl-Cre ที่เสียสละ; หนูควบคุม KL-/- และ KLflox/flox ถูกตัดออก แช่แข็งในไนโตรเจนเหลว และเก็บไว้ที่-80 องศา หลังจากการทำให้ตับอ่อนเป็นเนื้อเดียวกันแล้ว RNA ทั้งหมดถูกเตรียมโดยใช้ชุดแยก RNA (Sigma) และคัดลอกย้อนกลับโดยใช้ JScript cDNA SuperMix (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD, USA) cDNA ถูกขยายสำหรับ klotho และ -actin (เป็นตัวควบคุมการโหลด) โดยใช้ REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix(Sigma) PCR ได้รับการปรับให้เหมาะสมที่ 94 องศาเป็นเวลา 5 นาที ตามด้วยรอบ 30 วินาทีที่ 94 องศา , 90 วินาทีที่ 52.5 องศา และ 20 วินาทีที่ 72 องศา (45 รอบสำหรับโคลโท 25 รอบสำหรับ -แอคติน) และ 10 นาทีที่ 72 องศาสำหรับการขยาย โดยใช้ไพรเมอร์ 12.5 pmol โคลโท (F,5-ACGTTCAAGTGGACACTACTCT-3'and R,5'-TTCTTIGGCTACACCCCCGTC-3') และไพรเมอร์ 5 pmol -actin (F,5' -TGTTACCAACTGGGACGACA-3'และ R,5'-GGGGTGTTGA AGGTCTCAAA-3) ผลิตภัณฑ์ถูกอิเล็กโตรโฟรีสบนเจลอากาโรส 1.5% ที่ย้อมด้วยเอธิเดียมโบรไมด์ การหาปริมาณทำได้โดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA

2.11.การวิเคราะห์ทางสถิติ

ผลลัพธ์จะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SD หรือ SEM ตามที่กล่าวไว้ เปรียบเทียบตัวแปรต่อเนื่องโดยใช้การทดสอบ t เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น การทดสอบนัยสำคัญทั้งหมดเป็นแบบสองด้าน และค่า p ที่น้อยกว่าหรือเท่ากับ 0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ ประเมินความสัมพันธ์โดยใช้สัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ของเพียร์สัน (r) การวิเคราะห์การรอดชีวิตทำได้โดยใช้การทดสอบระดับบันทึก

3. ผลลัพธ์

3.1.ระดับของการแสดงออกของโคลโทและเมทิลเลชันของดีเอ็นเอในเนื้องอกในตับอ่อนมีความสัมพันธ์กับการรอดชีวิตของผู้ป่วยมะเร็ง

กลุ่ม Cancer Genome Browser (TCGA) Pancreatic Cancer (PAAD) ได้รับการตรวจสอบโดยใช้เบราว์เซอร์ Xena Browser ของมหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนียซานตาครูซ (UCSC) [35] การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนเผยให้เห็นการรอดชีวิตโดยรวมที่ลดลง (OS) และช่วงที่ปราศจากการลุกลาม (PFI) สำหรับผู้ป่วยมะเร็งตับอ่อนที่มีเนื้องอกที่แสดงออกของ klotho ต่ำ เมื่อเปรียบเทียบกับค่าสูง (n=89 สำหรับแต่ละกลุ่ม; รูปที่ 1A, B) การตรวจสอบข้อมูลเมทิลเลชันแสดงให้เห็นแนวโน้มที่เข้ากันได้ของ OS และ PFI ที่ถูกขัดขวางในผู้ป่วยที่มีเนื้องอกที่มีระดับเมทิลเลชัน DNA ของ KLOTHO สูง เมื่อเทียบกับระดับต่ำ (n=45 และ n=46 ตามลำดับ รูปที่ 2A, B) .

Further analyses of gene expression and methylation data (Table S2) revealed three specific sites, evaluated by probes cg23282559, cg02441765, and cg25650964, which were hypermethylated(IDelta βI>0.15)and negatively correlated to klotho expression(Irl>0.3)ในมะเร็งตับอ่อนของมนุษย์ (รูปที่ 2C-E)

3.2. การสร้างหนูล้มลง KLOTHO ตับอ่อน

หนูที่น่าพิศวงที่ไม่มีเงื่อนไขของ KLOTHO ตายเมื่ออายุประมาณ 8-9 สัปดาห์ [7] ดังนั้นจึงไม่สามารถใช้เป็นแบบอย่างสำหรับการพัฒนามะเร็งได้ ดังนั้นเราจึงมุ่งเป้าไปที่การล้มลงของ KLOTHO ไปที่ตับอ่อนของหนู เพื่อจุดประสงค์นี้ Pdx1-หนู Cre ถูกผสมข้ามพันธุ์กับหนูที่มีอัลลีล KLOTHO ที่เป็นฟล็อกซ์, KLlox/lox [38] ดังนั้นจึงได้รับ Pdx1-Cre; หนูเมาส์ KL-/- (รูปที่ 3A, B).RNA และระดับโปรตีนตรวจสอบการล้มลงของ klotho ของตับอ่อน (รูปที่ 3C-E) Pdx1-เคร; KL-77หนูมีน้ำหนักเพิ่มขึ้นเล็กน้อยเมื่อเวลาผ่านไป เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 3F) แต่ไม่มีความแตกต่างในซีรัมกลูโคสหรืออินซูลินและความทนทานต่อกลูโคส (รูปที่ S1)

รูปที่ 3 การสร้างหนูล้มลง KLOTHO ตับอ่อน (A)แผนผังไดอะแกรมของอัลลีล KLflox: ไซต์ LoxP ขนาบข้าง exon 2 ของ KLOTHO ซึ่งนำไปสู่การล้มลงเป้าหมายในตับอ่อนของ Pdx1-Cre; KL-/-หนู. แผงด้านบนแสดงอัลลีลแบบฟล็อกซ์ แผงด้านล่างแสดงผลลัพธ์ที่คาดหวังของการรวม Cre (B) เจลตัวแทนที่แสดงผลิตภัณฑ์ PCR ของการสร้างยีน KLOTHO ของเมาส์: KL plus / plus (WT;370 bp), KLl/ plus (470 และ 370 bp) และ KLflox/flox (470 bp) (C,D) RNA ของตับอ่อนถูกสกัดจาก Pdx1-Cre; KL-/-(n=7) และหนูควบคุม (n=4) ระดับ Klotho mRNA ถูกกำหนดหาโดย RT-PCR กึ่งเชิงปริมาณและหาปริมาณ แสดงเจลที่เป็นตัวแทน (จุดที่ไม่ผ่านการตัดแต่งดั้งเดิมมีอยู่ในรูปที่ S2) (E) การย้อมสีโคลโทอิมมูโนฮิสโตเคมีที่เป็นตัวแทนของตับอ่อนที่ตัดออกจาก Pdx1-Cre; KL-/- และหนูควบคุม กำลังขยาย: X20 W/O, ไม่มี (F)น้ำหนักของหนูในทั้งสองกลุ่ม (n=5ต่อกลุ่ม) วิเคราะห์โดยใช้การวัดซ้ำ ANOVA.p=0.01 ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SEM การควบคุม, หนู KLflox/flox หนูที่อยู่ในตับอ่อน KLOTHO ล้มลงและการแสดงออกของ Kras กลายพันธุ์ถูกสร้างขึ้นโดยการผสมข้ามพันธุ์ Pdx1-Cre ที่มี LSL-KrasG12D/ บวก [3] หนู (Pdx1-Cre; KrasG12D/ บวกกับหนู) และผสมข้ามพันธุ์พวกมันด้วย หนูเมาส์ KLflox/lox (Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ บวกเมาส์) การวิเคราะห์ดำเนินการโดยใช้หนูตัวผู้ ไม่รวมหนูเพศเมีย เนื่องจากอัตราที่สูงของรอยโรคทางทวารหนักใน Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus และ Pdx1-Cre; กัวลาลัมเปอร์-/-; KrasG12D/ plus mice ซึ่งสอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้ของ mucocutaneous papillomas ในหนูดังกล่าว [3]

3.3.การสูญเสีย Klotho ของตับอ่อนมีส่วนทำให้การอยู่รอดในหนูลดลง

ไม่มีความแตกต่างในการอยู่รอดของ Pdx1-Cre; KL-/- หนูเมาส์ เปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม) เราดำเนินการศึกษาผลของการล้มลงของ KLOTHO แบบรวมของตับอ่อนและการกลายพันธุ์ของ Kras ต่อการอยู่รอดโดยการติดตามหนูเป็นเวลา 65 สัปดาห์ ความตายเกิดขึ้นเองตามธรรมชาติหรือโดยนาเซียเซียเมื่อสัญญาณของความทุกข์ทรมานอย่างรุนแรงหรือภาระเนื้องอกที่จำเป็นต้องเสียสละเริ่มต้นขึ้น การอยู่รอดของ Pdx1-Cre; KL-/-;KrasG12D/ บวกหนูเมาส์ (n =21) ​​ลดลง เมื่อเปรียบเทียบกับ Pdx กลุ่มควบคุม1-Cre; KrasG12D/ บวกหนูเมาส์ (n=18;p= 0.02; รูปที่ 4A) ดังนั้น เมื่ออายุ 22 สัปดาห์ 100 เปอร์เซ็นต์ (18/18)ของ Pdx1-Cre; KrasGi2D/ plus หนูยังมีชีวิตอยู่ เทียบกับ 71 เปอร์เซ็นต์ (15/21) ของ Pdx1-Cre; กัวลาลัมเปอร์-/-; KrasG12D/ บวกกับหนูเมาส์ ไม่มีการสังเกตการเปลี่ยนแปลงของน้ำหนักที่มีนัยสำคัญระหว่างกลุ่ม (รูปที่ 4B)

รูปที่ 4 การล้มลงของตับอ่อน KLOTHO มีส่วนทำให้การอยู่รอดลดลงและกระตุ้น PDAC ในร่างกาย (A) เส้นโค้ง Kaplan-Meier ของ Pdx1-Cre; KL-/-;KrasGi2D/ plus (n=21) เปรียบเทียบกับ control Pdx1-Cre;KrasGi2D/ plus (n=18)mice.p=0.02.( B) น้ำหนักของหนูในทั้งสองกลุ่ม (n=19 ต่อกลุ่ม) (CE) ตับอ่อนถูกตัดออกจาก Pdx1-Cre; กัวลาลัมเปอร์-/-; KrasG12D/ plus (n=7 อายุเฉลี่ย 36 สัปดาห์)และการควบคุม Pdx1-Cre; KrasGi2D/ plus (n=8 อายุเฉลี่ย 49 สัปดาห์)หนูเมื่อเสียสละ (C) การเปรียบเทียบระหว่างการประเมินทางพยาธิวิทยาของตับอ่อนที่ย้อมด้วย H&E ของทั้งสองกลุ่ม (D) การย้อมสีแทน H&E ของตับอ่อนที่เก็บเกี่ยวจากหนูเมาส์อายุหนึ่งสัปดาห์ 24-สัปดาห์.Pdx1-Cre; กัวลาลัมเปอร์-/-; KrasG12D/ plus (ขวา): การสูญเสียขั้วของเซลลูลาร์โดยสิ้นเชิง, ความผิดปกติของนิวเคลียร์อย่างมีนัยสำคัญ, และการรวมกลุ่มของเซลล์ในรูเมนของท่อนำไข่, ร่วมกับการเกิดพังผืดและเคราตินจำนวนมาก ควบคุม Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus (ซ้าย): ไม่มีบาดแผล กำลังขยาย: ×10.(E) รอยโรค PanIN ตัวแทนของทั้งสองกลุ่ม กำลังขยาย: ×10

3.4. Klotho ให้ความร่วมมือในการพัฒนา PDAC ใน Vioo

จากการศึกษาก่อนหน้านี้ที่แสดงการพัฒนา PDAC ในหนูที่มีทั้งการกลายพันธุ์ Kras และการสูญเสียกิจกรรมการยับยั้งเนื้องอก [4] เราตรวจสอบ Pdx1-Cre; กัวลาลัมเปอร์-/-; KrasG12D/ plus mouse pancreata สำหรับแผล เนื่องจากการย่อยอย่างรวดเร็วของเนื้อเยื่อตับอ่อนด้วยของเหลวในตับอ่อน เราจึงสามารถใช้ตับอ่อนของหนูที่ได้รับการสังเวยเท่านั้น ตัวอย่างของ Pdx1-Cre; กัวลาลัมเปอร์-7-; KrasGi2D/ plus (n =7) ​​และควบคุม Pdx1-Cre; KrasGi2D/ plus (n =8) หนูได้รับการประเมินทางพยาธิวิทยา (อายุเฉลี่ยของการเสียชีวิต:36 และ 49 สัปดาห์ตามลำดับ) PDAC ถูกระบุในสอง Pdx1-Cre; กัวลาลัมเปอร์-/-; KrasG12D/ บวกหนู แต่ไม่มี Pdx1-Cre; KrasG12D/ บวกหนู ในขณะที่ PanN2 ถูกบันทึกใน Pdx1-Cre สองตัว; กัวลาลัมเปอร์-/-; KrasG12D/ บวกหนูและในสี่ของ Pdx1-Cre; KrasG12D/ บวกเมาส์ (รูปที่ 4C) แสดงภาพตัวแทน (ภาพที่ 4D-E)

3.5. การรักษาด้วย sKL ยับยั้งเนื้องอกในตับอ่อนและยืดอายุการรอดชีวิตใน Vivo

The potential of SQL treatment as a therapeutic strategy for PDAC was studied using two mouse models, a xenograft model treated with a viral skin vector, and the transgenic KPCmodel treated with soluble, recombinant sKL. For the xenograft model, m-Cherry/luciferase-labeled MIA PaCa-2 cells were s.c.inoculated into nude mice. Ten days later, mice were injected with adeno-associated viruses(AAV)encoding sKL(AAV-L) at two doses. Tumor load in mice inoculated with AAV skin was significantly lower compared to the control, reflected by smaller size, weight, and luciferase signals (Figure 5A-E). Importantly, tumor weights negatively correlated with human klotho blood levels in mice (Ir| >0.729; รูปที่ 5F-G)

โมเดลที่สองที่ใช้สำหรับเป้าหมายนี้คือโมเดล KPC หนูถูกจับคู่ตามเพศ อายุ และน้ำหนัก และได้รับการบำบัดด้วยการฉีด sKL ของมนุษย์ที่ละลายได้หรือการควบคุมด้วยกระสายยาเป็นเวลาสูงสุด 30 สัปดาห์ ความตายเกิดขึ้นเองตามธรรมชาติหรือโดยนาเซียเซียเมื่อสัญญาณของความทุกข์ทรมานอย่างรุนแรงหรือภาระเนื้องอกที่จำเป็นต้องเสียสละเริ่มต้นขึ้น การรอดชีวิตของหนูเมาส์ที่บำบัดด้วย sKL เพิ่มขึ้น เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม (p=0.005; รูปที่ 5H)

รูปที่ 5 การบำบัดด้วย sKL ลดการเจริญของเนื้องอกเฉพาะที่และยืดอายุการรอดชีวิต ในร่างกาย (AG)หนูเมาส์ BALB/c เปลือย Athymic ถูกฉีดวัคซีนด้วยเซลล์ MIA PaCa-2 ที่แสดงออก m-Cherry/luciferase อย่างคงตัว (1× 10 องศาเซลล์ต่อ หนูเมาส์) สิบวันต่อมา หนูถูกฉีดด้วยขนาดยาสูง AAV-sKL(5×1011 GC/mL,n=7), ขนาดยาต่ำ AAV-sKL (5×1010 GC/mL, n{{13} }) หรือกลุ่มควบคุม AAV-null(5×1010 GC/mL,n= 8).(A) ปริมาตรของเนื้องอกถูกวัดในร่างกายด้วยคาลิปเปอร์แบบดิจิตอล (B) รูปภาพตัวแทนของการสร้างภาพทางชีวภาพของกิจกรรม luciferase ของเนื้องอกในท้องถิ่น (C) กิจกรรมของเนื้องอกลูซิเฟอเรสถูกวัดโดยการนับต่อนาที (D) ภาพตัวแทนของเนื้องอกที่เก็บเกี่ยวในวันบูชายัญ (E) น้ำหนักของเนื้องอกที่เก็บเกี่ยว (F) ระดับเลือดของมนุษย์ klotho *พี<0.05, was="" calculated="" using="" the="" kruskal-wallis="" test.="" (g)="" correlation="" between="" tumor="" weights="" and="" human="" klotho="" blood=""><0.05.r, pearson's="" correlation="" coefficient.="" (h)kpc="" mice="" were="" matched="" according="" to="" sex,="" age,="" and="" weight,="" and="" randomly="" assigned="" to="" receive="" treatment="" with="" i.p.injections="" of="" soluble="" human="" skin="" (15="" mg/kg,="" twice="" weekly)or="" vehicle="" control(n="6" for="" the="" sky-treated="" group;n="7" for="" the="" control="" group)for="" up="" to="" 30="" weeks.="" kaplan-meier="" curves="" of="" skin-treated="" and="" control="" mice="" are="" presented.p=""><0.05;*><0.005;*** p=""><0.0005 compared="" to="" control.="" error="" bars,="" mean="" ±="">

4. การอภิปราย

การศึกษานี้กำหนดบทบาทของโคลโธเป็นตัวยับยั้งเนื้องอกใน PDAC การวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศเผยให้เห็นความสัมพันธ์ระหว่างการรอดชีวิตของผู้ป่วย PDAC กับระดับของการแสดงออกของโคลโทและ DNA methylation และแสดงให้เห็นรูปแบบไฮเปอร์เมทิลเลชันเฉพาะของ KLOTHO ในเนื้องอกในตับอ่อน ด้วยการใช้เมาส์รูปแบบใหม่ เราแสดงให้เห็นว่าการล้มลงของตับอ่อน klotho ร่วมมือกับการกลายพันธุ์ของ Kras เพื่อลดอัตราการรอดชีวิตและสร้าง PDACin Vivo นอกจากนี้ L ยังยับยั้งการเติบโตของเนื้องอกที่เกิดจากเซลล์ตับอ่อนในแบบจำลองการปลูกถ่ายวิวิธกรรมและยืดอายุการอยู่รอดของหนู KPC

Klotho ถูกยับยั้งโดย epigenetically ผ่านโปรโมเตอร์ hypermethylation ในมะเร็งที่หลากหลาย [16,23,25,26,28-31,33,39,40] สิ่งนี้ยังได้รับการรายงานในกลุ่มประชากรกลุ่มเล็กๆ ใน PDAC เช่นเดียวกับความสัมพันธ์ระหว่างการอยู่รอดของผู้ป่วย PDAC กับระดับการแสดงออกของโคลโทและ DNA methylation [17,34] ตามการประเมิน OS ของเรา เช่นเดียวกับ PFI โดยใช้ข้อมูลที่ประกอบด้วยตัวอย่าง PDAC 178 ตัวอย่าง แสดงให้เห็นความสัมพันธ์เชิงบวกกับการแสดงออกของ klotho และความสัมพันธ์เชิงลบที่สอดคล้องกับ KLOTHO DNA methylation ข้อมูลเหล่านี้ระบุเพิ่มเติมว่าการแสดงออกของโคลโทอาจถูกควบคุมโดย DNA methylation และตอกย้ำแนวคิดที่ว่าพารามิเตอร์เหล่านี้สามารถใช้ในการประเมินการพยากรณ์โรคของผู้ป่วย PDAC

การศึกษาก่อนหน้านี้เกี่ยวกับ KLOTHO DNA methylation ใน PDAC [17,34] ขึ้นอยู่กับกลุ่มย่อยที่จำกัดของผู้ป่วยและการทดลองในหลอดทดลอง และไม่ได้วิเคราะห์รูปแบบ methylation ของไซต์เฉพาะภายในยีน KLOTHO ทั้งหมด การวิเคราะห์ในปัจจุบันซึ่งอิงจากชุดข้อมูลที่กว้างขวางดังกล่าว เปิดเผยว่าไซต์เฉพาะสามแห่ง ซึ่งสองแห่งตั้งอยู่ภายใน CpGisland ใน exon สุดท้ายของ KLOTHO ทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมเชิงลบของการแสดงออกของ klotho โดย hypermethylation ก่อนหน้านี้เราพบว่าหนึ่งในไซต์เหล่านี้ cg23282559 เป็น hypermethylated ในมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก [25] ยังไม่เป็นที่แน่ชัดว่าไซต์เหล่านี้มีบทบาทในการควบคุม klotho ในมะเร็งชนิดอื่นด้วยหรือไม่

Klotho เป็นที่รู้กันว่าแสดงออกในตับอ่อน อย่างไรก็ตาม บทบาทในการพัฒนาและการทำงานของตับอ่อนปกติยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด ในขณะที่หนูที่ขาด klotho แสดงการผลิตอินซูลินที่ลดลงพร้อมกับความไวของอินซูลินที่เพิ่มขึ้นอย่างมาก [22] การแสดงออกของ klotho ในหนูที่มากเกินไปส่งผลให้อินซูลินในเลือดอดอาหารเพิ่มขึ้นพร้อมกับการดื้อต่ออินซูลิน [8] น่าแปลกที่รูปแบบเมาส์ที่นำเสนอในการศึกษานี้ซึ่งมีการล้มลงของ klotho ของตับอ่อนไม่ได้แสดงฟีโนไทป์ที่เปิดเผยของโรคเบาหวานหรือความไวต่ออินซูลินที่เปลี่ยนแปลงไป นอกจากนี้ยังไม่มีผลต่อรูปร่างของตับอ่อน การสร้างเนื้องอก หรือการรอดชีวิต ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการสูญเสียโคลโทตับอ่อนอาจได้รับการชดเชยโดยผลกระทบรอบข้างของโคลโทที่เป็นระบบหรือโดยกลไกอื่นๆ นอกจากนี้ การพัฒนาของโรคเบาหวานยังเป็นกระบวนการที่ซับซ้อน ซึ่งไม่เพียงแต่ขึ้นอยู่กับตับอ่อนเท่านั้น แต่ยังขึ้นกับตับ กล้ามเนื้อ และเนื้อเยื่อไขมันด้วย ในแบบจำลองของเรา โคลโทถูกทำให้ล้มลงส่วนใหญ่ในตับอ่อน ซึ่งอาจอธิบายการขาดโรคเบาหวานในหนูรุ่นนี้

สอดคล้องกับผลลัพธ์ทางคลินิกที่นำเสนอ Pdx1-Cre; กัวลาลัมเปอร์-/-; KrasG12D/ plus หนูเมาส์มีช่วงชีวิตสั้นลงเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม Pdx1-Cre; KrasGi2D/ บวกกับหนู (48 vs.60 สัปดาห์ ตามลำดับ) แม้ว่าเราไม่สามารถตรวจสอบพยาธิสภาพของตับอ่อนของหนูได้ทั้งหมด แต่พบอัตราที่สูงกว่าของ PDAC ที่เปิดเผยใน Pdx1-Cre; กัวลาลัมเปอร์-7-; KrasG12D/ plus หนูเมาส์ เปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม Pdx1-Cre; KrasG2D / บวกเมาส์ ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นถึงความสำคัญของ klotho ในการพัฒนามะเร็งตับอ่อนและการอยู่รอดในร่างกาย ฟีโนไทป์ของ Pdx1-Cre; KL-/-:หนู KrasGl2D/ plus นั้นเด่นชัดน้อยกว่า เมื่อเทียบกับแบบจำลองที่รวมการสูญเสียตัวยับยั้งเนื้องอกอื่นๆ ที่มีการกลายพันธุ์ของ Kras ตัวอย่างเช่น หนู KPC มีอัตราการรอดชีวิตเฉลี่ยเพียง 5 เดือน[5] เป็นไปได้ว่านี่เป็นเพราะการชดเชยการสูญเสีย klotho ในท้องถิ่นบางส่วนโดยการหมุนเวียน klotho อีกทางหนึ่ง การแสดงออกที่ตกค้างของ klotho ในตับอ่อนอาจส่งผลต่อฟีโนไทป์ การบรรลุการปิดเสียงเป้าหมายที่สมบูรณ์ของ klotho ในการศึกษาในอนาคตจะช่วยให้เข้าใจบทบาทของมันในเนื้อเยื่อต่างๆ ได้ดีขึ้น รวมถึงการถ่วงดุลระหว่างผลกระทบในท้องถิ่นและในระบบของ klotho

เรานำเสนอสองแบบจำลองที่แสดงให้เห็นถึงศักยภาพในการรักษาของโคลโธ ในแบบจำลองหนูเมาส์ที่ปลูกถ่ายวิวิธพันธุ์ การฉีดมะเร็งตับอ่อนของเวกเตอร์ผิวหนังจากไวรัสนั้นมีประสิทธิภาพสูง ไม่เพียงแต่ในการยับยั้งการเติบโตของเนื้องอกเท่านั้น แต่ยังช่วยลดขนาดของเนื้องอกด้วย การรักษาเริ่มขึ้นเมื่อมองเห็นเนื้องอกได้และก่อตัวขึ้นแล้ว ซึ่งคล้ายกับเวลาที่เริ่มการรักษาในผู้ป่วยส่วนใหญ่ ผลการวิจัยชี้ให้เห็นว่าเธออาจถูกนำมาใช้ในการบำบัดด้วยยีน ดังนั้นจึงข้ามอุปสรรคสำคัญต่อความเสถียรและการส่งมอบโปรตีนและยาที่ใช้เปปไทด์อย่างมีประสิทธิผล นอกจากนี้ยังพบความสัมพันธ์เชิงลบระหว่างน้ำหนักเนื้องอกและระดับเลือดของมนุษย์ การวิจัยเพิ่มเติมเกี่ยวกับระดับของโคลโทในเลือดที่เกี่ยวกับผลกระทบของมันอาจช่วยในการทำนายว่าใครจะได้ประโยชน์จากการรักษาด้วยโคลโทหรือ SQL เช่นเดียวกับการรักษาระดับภายในหน้าต่างการรักษา

การพัฒนาวิธีการรักษาโดยใช้โคลโทเป็นเป้าหมายของกลุ่มวิจัยหลายกลุ่ม รวมถึงบริษัทเภสัชกรรม ในการรักษาโรคมะเร็ง มีหลายช่องทางที่มีการสำรวจ หนึ่งสามารถเพิ่มระดับของ klotho ภายนอกได้โดยการใช้ประโยชน์จากกลไก epigenetic ที่มีผลต่อการแสดงออกของ klotho มีรายงานว่าโปรโมเตอร์โคลโทมีเมทิลเลตอย่างหนักในมะเร็งหลายชนิด และยังเป็นหน้าที่ของอายุอีกด้วย ดังนั้น สารประกอบที่ยับยั้ง DNA methyl transferases อาจกลายเป็นเป้าหมายในการรักษาเพื่อเพิ่มการแสดงออกของโคลโท ในทางกลับกัน เราสามารถเพิ่มระดับได้โดยการเพิ่มโคลโทจากภายนอก ตัวอย่างเช่น โดยการใช้ยีนบำบัดหรือการนำส่งโปรตีนโคลโทลูกผสม ในที่นี้ เรารายงานการแนะนำบริเวณแอคทีฟของ klotho (L) โดยใช้ระบบ AAVexpression ซึ่งส่งผลให้มีผลการรักษาในรูปแบบของมะเร็งตับอ่อน

ต่อไป เราแสดงให้เห็นว่าการรักษาด้วยท้องฟ้าที่ละลายน้ำได้ช่วยยืดอายุการอยู่รอดของหนู KPC ซึ่งเป็นแบบจำลองที่ทราบกันว่าสรุป PDAC ของมนุษย์ สิ่งนี้แสดงให้เห็นถึงผลกระทบของท้องฟ้าในสภาพแวดล้อมที่มีภูมิคุ้มกันและเนื้องอกตามธรรมชาติ ซึ่งสนับสนุนการใช้ SSL ที่เป็นไปได้ในการตั้งค่าทางคลินิก

5. สรุปผลการวิจัย

โดยสรุป การศึกษานี้ระบุว่าโคลโทเป็นตัวยับยั้งเนื้องอกที่มีศักยภาพใน PDAC สูตรการรักษาปัจจุบันสำหรับ PDAC ไม่เพียงพอ และการบริหาร sKL จากภายนอกอาจเป็นกลยุทธ์ใหม่สำหรับการรักษา PDAC

บทความนี้คัดมาจาก Cancers 2021, 13, 6297 https://doi.org/10.3390/cancers13246297 https://www.mdpi.com/journal/cancers