แบบจำลองหนูเมาส์ Ataxic แบบใหม่ของ Ataxia Telangiectasia ที่เกิดจากการกลายพันธุ์ที่ไร้สาระที่เกี่ยวข้องทางคลินิก (ตอนที่ 2)

หากต้องการเรียนรู้ข้อมูลเพิ่มเติมกรุณาติดต่อdavid.wan@wecistanche.com

3.0 การสนทนา

โดยการเพิ่มความเครียดจากพันธุกรรมโดยการเพิ่ม Hit รองในเส้นทาง DDR เราได้สร้างโมเดลเมาส์ใหม่ที่แสดงอาการ AT ที่ครอบคลุมที่สุดของรุ่นใดๆ จนถึงปัจจุบัน ซึ่งรวมถึงภาวะ ataxia ที่รุนแรงและก้าวหน้าซึ่งเกี่ยวข้องกับการฝ่อของสมองน้อยและการรบกวนของคุณสมบัติของ PN พร้อมด้วยอุบัติการณ์สูงของมะเร็งและข้อบกพร่องในการพัฒนาเซลล์ภูมิคุ้มกัน โรคร่วมเหล่านี้รวมสาเหตุสำคัญสามประการของการตายก่อนวัยอันควรในAT—แต่ละส่วนร่วมถึงประมาณหนึ่งในสามของการเสียชีวิต ในจำนวนนี้ ผลกระทบที่ไร้ความสามารถของ ataxia เป็นสิ่งที่แทรกซึมได้มากที่สุด และผู้ป่วยและผู้ดูแลรายงานว่ามีผลกระทบมากที่สุดต่อคุณภาพชีวิตของพวกเขา ด้วยเหตุผลนี้ การปรากฏตัวของ ataxia และ cerebellar atrophy ในโมเดลเมาส์ใหม่นี้มีความสำคัญอย่างยิ่ง เนื่องจากเป็นครั้งแรกที่มีทรัพยากรที่ไม่เพียงแต่อธิบายกลไกของความผิดปกติของระบบประสาทเท่านั้น แต่ยังจำเป็นอย่างยิ่งในโมเดลในร่างกายเพื่อ การทดสอบที่จำเป็นอย่างยิ่งในการรักษา AT เช่นสารประกอบที่อ่านได้ที่เราอธิบายไว้ที่นี่ เราพบความคล้ายคลึงกันหลายประการระหว่างความก้าวหน้าโดยรวมของ ataxia ใน Atm3535; หนู Aptx และAT ผู้ป่วย. ในทางคลินิก AT การขาดดุลของมอเตอร์สามารถสังเกตได้เมื่ออายุประมาณ 2 ขวบ เมื่อพ่อแม่และแพทย์ตรวจพบความสามารถในการเปลี่ยนจากเด็กวัยหัดเดินไปเป็นประตูที่ประสานกันอย่างราบรื่นและสะท้อนกลับที่ลดลง น่าเสียดายที่ไม่ค่อยมีใครทราบเกี่ยวกับข้อบกพร่องของมอเตอร์ในระยะแรกๆ อันเนื่องมาจากโรค ความชุกต่ำและการขาดการทดสอบวินิจฉัยในระยะเริ่มต้นในปัจจุบัน (Rothblum-Oviatt et al. 2016) ผู้ป่วยมักจะเรียนรู้ที่จะเดินโดยไม่ได้รับความช่วยเหลือและอาการทางระบบประสาทมักจะคงที่ตลอด 4 ถึง 5 ปีแรกของชีวิต (Rothblum-Oviatt et al. 2016) เราพบความก้าวหน้าในช่วงต้นของการขาดดุลของมอเตอร์ใน Atm735 × R3x; หนู Aptx^' ตรวจพบการขาดดุลของมอเตอร์เล็กน้อยในระยะเริ่มต้นที่ P8 (การขาดดุลสะท้อนกลับด้านขวา) ตามด้วยช่วงของความเสถียรสัมพัทธ์ ก่อนเริ่มมีอาการผิดปกติแบบก้าวหน้าและรุนแรงซึ่งพัฒนาขึ้นหลังจาก p210 ซึ่งรวมถึงการเปลี่ยนแปลงในการเดิน การสะท้อนของอาการตกใจ การสั่น และการเคลื่อนไหว กิจกรรม. มีคำถามสำคัญหลายประการที่เกิดขึ้นจากการค้นพบนี้ รวมทั้งว่า ATM และ/หรือ APTX มีบทบาทในการพัฒนาระบบประสาทใน

สมองน้อย การศึกษาในอนาคตที่มุ่งเน้นไปที่ระยะเริ่มต้นของความผิดปกติจะมีความสำคัญอย่างยิ่งในการทำความเข้าใจว่า cerebellum พัฒนาตามปกติก่อนที่จะมีความผิดปกติหรือไม่หรือว่าข้อบกพร่องในการพัฒนาเป็นสาเหตุเริ่มต้นหรือไม่ นอกจากนี้เรายังพบว่า คล้ายกับผู้ป่วย AT ว่าความรุนแรงของ ataxia ที่พัฒนาช้านั้นแปรผัน โดยหนูบางตัวกำลังเดินเตร่อยู่กับประตูหลังที่สูงชันและเงอะงะ (วิดีโอ 3) และตัวอื่นๆ เคลื่อนไหวเกือบทั้งหมดผ่านการบิดของลำตัวด้านหลัง ( รูปที่ 1E และวิดีโอ 4) (Rothblum-Oviatt et al.2016; Levy and Lang 2018; Boder and Sedgwick 1958) โดยรวมแล้วเราพบว่า Atm?35×xR35×; หนูของ Aptx พัฒนาการสูญเสียการประสานงานของมอเตอร์อย่างลึกซึ้งทางสายตาและสามารถวัดได้ คล้ายกับที่พบในผู้ป่วย AT ซึ่งได้รับการช่วยเหลือโดยการแสดงออกของ Atm หรือ Aptx อย่างน้อยหนึ่งชุด การสูญเสียการประสานงานของมอเตอร์ใน AT นั้นเกิดจากความเสื่อมของสมองน้อยเนื่องจากระบบประสาทที่เลือกได้ค่อนข้างทั่วสมองและบทบาทเชิงสาเหตุในรูปแบบต่างๆของ ataxia (Hoche et al.2012) สอดคล้องกับAT ผู้ป่วยการศึกษาเกี่ยวกับระบบประสาท (Wallis et al.2007; Sahama et al.2015; Sahama et al. 2014; Dineen et al. 2020; Tavani et al. 2003; Quarantelli et al.2013) เราพบว่าขนาดของสมองน้อยใน Atm735×R3× ; หนูของ Aptx นั้นปกติในขั้นต้น แต่จะค่อยๆเสื่อมไปพร้อมกับการเปลี่ยนแปลงในการทำงานของระบบประสาท ในขณะที่การสูญเสียเนื้อเยื่อสมองน้อยได้รับการพิจารณาว่าเป็นสาเหตุหลักของการเสียสมดุลในมนุษย์ แต่ก็ไม่ชัดเจนจากข้อมูลทางคลินิกว่าความรุนแรงของการสูญเสียเลือดเป็นตัวทำนายที่ดีของขอบเขตของความเสื่อมของสมองน้อยที่พบหลังการชันสูตรพลิกศพ (Aguilar et al. 1968b: Crawford et al, 2006) : Dineen et al.2020). ในตู้เอทีเอ็ม 35×R35×; หนู Aptx^ เราพบว่ามีการฝ่อที่ชัดเจนซึ่งเกี่ยวข้องกับการทำให้ชั้นของเดนไดรต์ของเซลล์ประสาท Purkinje ผอมบาง ซึ่งเกิดขึ้นก่อนช่วงปลายที่บกพร่องทางพฤติกรรมอย่างรุนแรง การสังเกตทางเนื้อเยื่อวิทยาของเราใน Atm?35xR35×; Aptx'mice แนะนำว่าการเปลี่ยนแปลงในการทำงานของ cerebellar เอง มากกว่าการสูญเสียเซลล์ cerebellar อย่างลึกซึ้ง เพียงพอที่จะทำให้เกิด ataxic phenotype ซึ่งสอดคล้องกับการสังเกตข้อบกพร่องทางพฤติกรรมก่อนที่จะสูญเสีย PN อย่างมีนัยสำคัญใน SCA หลายตัว (Shakkottai et al. 2011: Lorenzetti et al. 2000; Clark et al. 1997; Jayabal et al.2016) เหตุผลที่จำเป็นต้องมีการขาด ATM และ APTX เพื่อสร้าง ataxia ในหนู เมื่อการสูญเสียอย่างใดอย่างหนึ่งเพียงพอที่จะทำให้เกิด ataxia ในมนุษย์ยังไม่ชัดเจน ความเป็นไปได้ประการหนึ่งคือสมองของหนูอาจใช้เส้นทางการชดเชยหรือโปรตีนสำรองได้อย่างยืดหยุ่นมากขึ้น ในขณะที่ตอบสนองต่อรอยโรคของดีเอ็นเอ 10-20k ที่ส่งผลกระทบต่อเซลล์ในแต่ละวัน (Lindahl and Barnes 2000) มีการซ่อมแซมดีเอ็นเอหลายรูปแบบที่อาจตอบสนองความท้าทายนี้ รวมทั้งการซ่อมแซมการตัดตอนฐาน (BER) การซ่อมแซมการตัดตอนนิวคลีโอไทด์ (NER)

คลิกที่นี่เพื่อเรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับ Cistanche

รวมถึงการต่อปลายที่คล้ายคลึงกันและไม่คล้ายคลึงกัน (HEJ และ NHEJตามลำดับ) ทั้งหมดที่เกี่ยวข้องกับ ATM และ APTX (Chou et al.2015; Caglayan et al.2017; Wakasugi et al. 2014; Tumbale et al. 2018; Chatterjee and Walker 2017) หรืออาจเป็น กรณีที่ความบกพร่องใน ATM หรือ APTX เพียงอย่างเดียวไม่ส่งผลกระทบต่อสุขภาพของเซลล์อย่างเพียงพอในช่วงอายุขัยที่ค่อนข้างสั้นของเมาส์ ดังนั้นการกำจัดโปรตีนทั้งสองจึงจำเป็นเพื่อให้เกิดการสะสมของความเสียหายของ DNA ที่เพียงพอในช่วงเวลาดังกล่าว ความเป็นไปได้นี้แข็งแกร่งขึ้นจากข้อเท็จจริงที่ว่า ATM และ APTX มีคุณสมบัติทางชีวเคมีที่แตกต่างกันและบทบาทหน้าที่ในการตอบสนองต่อความเสียหายของ DNA ดังนั้น ความบกพร่องทั้งสองอย่างจึงถูกคาดการณ์ว่าจะทำให้เกิดผลกระทบในวงกว้างต่อความเสถียรของจีโนม (เช่น ความเครียดจากพันธุกรรมที่เพิ่มขึ้น) การค้นพบของเราว่าโปรตีนในวิถีทางเสถียรของจีโนมสองตัวนั้นจำเป็นต่อการกระตุ้นความบกพร่องทางระบบประสาทในหนู แสดงให้เห็นอย่างชัดเจนว่ามันคือการสูญเสีย Oriole ของ ATM ในการซ่อมแซม DNA มากกว่าที่จะเป็นหน้าที่ที่อาจเกิดขึ้นในการส่งสัญญาณความเครียดออกซิเดชัน ไมโทฟาจี หรือการทำงานของไมโทคอนเดรียที่ทำให้เกิดความบกพร่องในสมองน้อย ( ไชโลห์ 2020). อย่างไรก็ตาม ทางเลือกอื่นไม่สามารถตัดออกได้อย่างสมบูรณ์ เนื่องจาก APTX เช่น ATM ได้รับการสังเกตภายในไมโตคอนเดรียของเซลล์สมอง ซึ่งเชื่อกันว่าสนับสนุนการประมวลผลของ DNA ของไมโตคอนเดรีย (Meagher and Lightowlers 2014; Sykora et al. 2011) เมาส์รุ่นใหม่นี้เป็นเครื่องมือใหม่ในการสำรวจความเป็นไปได้เหล่านี้ และกำหนดกลไกด้วยกลไกว่าการสูญเสีย ATM และ APTX ทำให้เกิดความผิดปกติของสมองน้อยในท้ายที่สุดได้อย่างไร การรบกวนทางชีวฟิสิกส์ที่สังเกตพบใน PNs ที่บันทึกจาก AtmR35XR35X; หนู Aptx นั้นพบได้ใน ataxia หลายรุ่นเช่นเดียวกัน ซึ่งรวมถึงการเปลี่ยนแปลงที่เราสังเกตเห็นในความต้านทานอินพุต PN ความจุเมมเบรน และเกณฑ์และความกว้างของ AP ซึ่งได้รับการอธิบายไว้ในโมเดลเมาส์ของ SCA เช่น 1, 3 และ 7 (Stoyas et al.2020; Shakkottai et al.2011; Dell 'Orco et al.2015). ยิ่งกว่านั้น การลดความถี่ในการยิงที่อาจเกิดขึ้นของ PN แบบก้าวหน้าที่เรารายงานมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับการพัฒนาของ ataxia ใน AtrnR35XR35X; Aptx'mice มีรายงานในโมเดลเมาส์แบบ ataxic จำนวนมาก รวมถึง SCA 1, 2, 3,5, 6 และ 13 รวมถึงรูปแบบตอนบางส่วน (ดูรีวิว (Cook, Fields และ Watt 2021)) เนื่องจากความเหลื่อมล้ำกันอย่างมีนัยสำคัญในการรบกวนของ PN ที่สังเกตได้จากความผิดปกติต่างๆ ที่เกิดจากความบกพร่องของเซลล์อย่างชัดเจน การคืนค่าความถี่การยิง PN AP จึงถือเป็นวิธีการรักษาแบบกว้างๆ อย่างไรก็ตาม ยังไม่ชัดเจนว่าการยิง PN ที่ลดลงเป็นปัจจัยเชิงสาเหตุของการเสียสมดุลหรือไม่ นอกจากนี้ หลักฐานจากการทดลองชี้ให้เห็นว่าการเปลี่ยนแปลงในกิจกรรมของ PN อาจเป็นการตอบสนองโดยทั่วไปในการรักษาสภาวะสมดุลระหว่างการด้อยค่าทางสรีรวิทยาของ PN ที่เกี่ยวข้องกับโรค (Dell'Orco et al.2015) ดังนั้น จำเป็นต้องใช้ความพยายามอย่างต่อเนื่องในทุกความผิดปกติของสมองน้อยในการเชื่อมโยงการหยุดชะงักของยีน โมเลกุล และเซลล์ที่เกิดจากโรคกับการเปลี่ยนแปลงเฉพาะในการส่งสัญญาณของระบบประสาทในสมองน้อยซึ่งท้ายที่สุดแล้วจะทำให้เกิดความผิดปกติ ความสำคัญที่มีนัยสำคัญในความพยายามนี้จะกำหนดว่าความบกพร่องของสมองน้อยที่ก่อให้เกิดโรคโดยปกติหรือแตกต่างกันทำให้เกิด ataxia ผ่านการสูญเสียการทำงานของสมองน้อย (เช่น การสูญเสียสัญญาณการประสานงานระหว่างการเคลื่อนไหว) หรือจากผลเชิงลบที่โดดเด่น (เช่น การทำลายระบบประสาทส่วนปลายน้ำ) วงจรที่มีรูปแบบเอาท์พุตของระบบประสาทผิดปกติ) ในท้ายที่สุด ในขณะที่กลยุทธ์การรักษาทั่วไปเพื่อจัดการกับความผิดปกติของสมองน้อยจะส่งผลกระทบมากที่สุด วิธีการโดยตรงที่กล่าวถึงสาเหตุทางพันธุกรรมและระดับโมเลกุลที่ชัดเจนของความผิดปกติของเซลล์ในท้ายที่สุดอาจจำเป็นต่อการพัฒนาการรักษาที่มีประสิทธิภาพ การเชื่อมโยงทางกลไกระหว่างความบกพร่องในดีเอ็นเอ โปรตีนที่มีความคงตัวเช่น ATM และ APTX และความผิดปกติของ PN นั้นยังห่างไกลจากความชัดเจน ผลลัพธ์ของเราแนะนำว่าผลกระทบของการสูญเสีย ATM และ APTX ต่อ PNs นั้นเกิดขึ้นจริง เนื่องจากเราไม่พบการเปลี่ยนแปลงในคุณสมบัติ presynaptic ของเซลล์แกรนูลหรือหลักฐานของการสูญเสียเซลล์ (ไม่มีการเปลี่ยนแปลงในความหนาของ GCL) ยิ่งกว่านั้น ในขณะที่เราสังเกตเห็นความแตกต่างในการปั้นระยะสั้นของอินพุตมะกอกที่ด้อยกว่าใน PNs และ wildtype ที่ขาด ATM และ APTX ผลลัพธ์เหล่านี้น่าจะชี้ไปที่การหยุดชะงักในสภาวะสมดุลของ Ca2* ที่อาจเกิดขึ้นจากการลด Inositol 1,4,5- การแสดงออกของตัวรับไตรฟอสเฟต 1 (ltpr1) คล้ายกับที่สังเกตได้ในแบบจำลองเมาส์ SCA 1,2 และ 3 เช่นเดียวกับหนูที่ขาด ATM (Kim et al.2020; Chen et al.2008; Demirci et al.2009; Shakkottai et al.2011). แม้ว่าสิ่งนี้จะเป็นหนทางที่มีแนวโน้มสำหรับการตรวจสอบและการเปรียบเทียบในอนาคต แต่ก็ยังไม่ชัดเจน แม้แต่สำหรับ SCA ไม่ว่าการเปลี่ยนแปลงในสภาวะสมดุลของ Ca²* จะเป็นปัจจัยเชิงสาเหตุหรือเพียงแค่อาการอื่น หรือแม้แต่การตอบสนองเพื่อชดเชยสำหรับ PNs ที่เป็นโรคหรือถูกรบกวน (Dell 'Orco et al.2015). ในระบบภูมิคุ้มกัน ATM มีส่วนเกี่ยวข้องในการซ่อมแซม DNA ที่แตกสลายซึ่งเกิดขึ้นตามธรรมชาติในระหว่างการจัดเรียงยีนใหม่ของยีนรับแอนติเจนในสารตั้งต้นของ B และ T-cell ซึ่งเป็นปรากฏการณ์ที่สำคัญสำหรับความหลากหลายของตัวรับแอนติเจน (LG และ TCR) ของเซลล์เหล่านี้ พบว่าทีเซลล์สัดส่วนในเลือดลดลงอย่างมีนัยสำคัญซึ่งสอดคล้องกับการศึกษาก่อนหน้าในมนุษย์และหนูที่น่าพิศวง AT (Schubert, Reichenbach และ Zielen 2002; Hathcock et al.2013; Chao, Yang และ Xu 2000; Barlow et al.1996) การลดลงของ T-cells ในบริเวณรอบนอกนี้น่าจะสัมพันธ์กับความบกพร่องในภูมิคุ้มกันทั้งในระดับเซลล์และทางร่างกาย ที่สำคัญ เราพบว่าการแสดงออกของยีน ATM สำเนาหนึ่งสำเนานั้นเพียงพอที่จะฟื้นฟู CD4 บวกกับการขาดดุลในเลือด ซึ่งบ่งชี้ว่าการรักษาที่สามารถฟื้นฟูการแสดงออกของ ATM บางส่วนจะมีประสิทธิภาพในการรักษา แม้ว่าเราจะยังไม่ได้ประเมินการพัฒนา B-cell ในบทความนี้ แต่ก็มีแนวโน้มว่าข้อสรุปที่คล้ายคลึงกันจะนำไปใช้กับกระบวนการนั้นเนื่องจากความคล้ายคลึงกันทางกลไก (Marshall et al. 2018) ตามที่คาดไว้ การลดลงของ T-cells ในเลือดส่วนปลายมีความสัมพันธ์กับการพัฒนาของ thymocyte ที่บกพร่อง ในต่อมไทมัส เราพบข้อบกพร่องหลักสองประการ ประการแรกเกิดจากความบกพร่องของ APTX เป็นหลัก โดยแสดงเป็นข้อบกพร่องในการเปลี่ยนผ่าน DN3 เป็น DN4 ที่สอดคล้องกับการจัดเรียงตำแหน่ง TCR ใหม่ในช่วงต้น ข้อบกพร่องอื่น ๆ ซึ่งส่วนใหญ่เกิดจากการขาด ATM มีความสัมพันธ์กับความก้าวหน้าที่ลดลงของ CD4*CD8 ที่เป็นบวกสองเท่ากับเซลล์ที่มีบวกเดี่ยว ซึ่งส่วนใหญ่เป็น CD4' thymocytes ในขณะที่การค้นพบ APTX นั้นน่าประหลาดใจ เนื่องจากความบกพร่อง (AOA 1) ไม่เกี่ยวข้องกับการขาดภูมิคุ้มกัน APTX เป็นที่ทราบกันว่ามีปฏิสัมพันธ์กับโปรตีนการจัดเรียงยีน TCR รวมถึง XRCC4 (Clements et al. 2004) การศึกษาในอนาคตที่มุ่งกำหนดบทบาทของ APTX ในกลไกการต่อปลายระหว่างการจัดเรียงยีน TCR ใหม่จะเป็น

สำคัญ และความเป็นไปได้ที่กลไกการสิ้นสุดทางเลือกอื่น เช่น การใช้ไมโครโฮโมโลจี ทำให้เกิดการขาดภูมิคุ้มกันในกรณีที่ไม่มีมันจำเป็นต้องมีการตรวจสอบเพิ่มเติม (Bogue et al. 1997) ความอยู่รอดของ Atm?35×/R35×; Aptx'mice นั้นยาวกว่าเมาส์ AT รุ่นก่อนมาก ในการเปรียบเทียบครั้งแรกที่เกาะโมเดลเมาส์ที่รายงานโดย Barlow et al มักจะเสียชีวิตจากไธโมมาภายใน 2-4 เดือนหลังคลอด (Barlow et al. 1996) ความอยู่รอดของมะเร็งที่ลดลงในเรื่องนี้และโมเดลเมาส์ AT ที่น่าพิศวงอื่น ๆ อีกมากมายมีแนวโน้มว่าจะเป็นกรรมพันธุ์ เนื่องจากความเครียดเบื้องหลังที่เก็บการกลายพันธุ์ได้แสดงให้เห็นว่ามีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อความชุกของมะเร็งและความอยู่รอดด้วย A/J และ C57BL/6

ภูมิหลังที่มีความอยู่รอดเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเหนือสายพันธุ์ BALBC และ 129S (Genik et al. 2014) ความจริงที่ว่าหนูที่ขาด ATM ของเราถูกสร้างขึ้นบนพื้นหลัง C57BL/6 น่าจะเป็นที่รองรับ ที่หนู Aptx*t ไม่พัฒนา ataxia มันเป็นช่วงอายุขัยที่ค่อนข้างยาว ระบุว่า Atm35xR35×; ไม่น่าเป็นไปได้ที่การตายของหนู AT KO ก่อนกำหนดจะป้องกันการสังเกตฟีโนไทป์ที่ไม่เป็นพิษซึ่งจะเกิดขึ้นในหนูเหล่านี้ อย่างไรก็ตาม ไม่ทราบว่าพื้นหลังของ C57BL/6 มีความยืดหยุ่นต่อการพัฒนาภาวะ ataxia หรือไม่ เช่นเดียวกับมะเร็ง การกำหนดปัจจัยทางพันธุกรรมหรืออีพีเจเนติกส์ที่มีอิทธิพลต่อความรุนแรงของโรคอาจเป็นช่องทางสำหรับการพัฒนาการรักษาในอนาคต เนื่องจากลักษณะทั่วไปของโลกของการกลายพันธุ์เป็นโมฆะของ ATM และ APTX ในแบบจำลองเมาส์ของเรา เราไม่สามารถแยกแยะได้ว่าข้อบกพร่องพิเศษของสมองน้อยอาจส่งผลต่อฟีโนไทป์ที่รุนแรงได้เช่นกัน และด้วยเหตุนี้การตรวจสอบในอนาคตนอกซีรีเบลลัมในสมองส่วนหน้า ก้านสมอง และไขสันหลัง และแม้กระทั่งกล้ามเนื้อจะต้องดำเนินการ ภายในสมองน้อย ขณะที่เราพบความแตกต่างทางกายวิภาคบางประการในคุณสมบัติการยิง PN ภายในบริเวณต่างๆ ของสมองน้อย เราไม่พบความแตกต่างในระดับภูมิภาคในความกว้าง ML หรือความหนาแน่นของ PN อย่างไรก็ตาม มีความท้าทายในการใช้กายวิภาคในระดับภูมิภาคเป็นปัจจัยในการจัดกลุ่มในสมองน้อย เนื่องจากรอยพับทางกายภาพของเนื้อเยื่อไม่จำเป็นต้องสัมพันธ์กับขอบเขตของขอบเขตการทำงาน การแสดงออกของโมเลกุล หรือคุณสมบัติทางสรีรวิทยาที่ได้อธิบายไว้ (Apps and Hawkes 2009 ; Tsutsumi et al.2015; Gao, van Beugen และ De Zeeuw 2012; Zhou et al.2014) การทดลองที่มุ่งเน้นไปที่การตรวจสอบขอบเขตของความบกพร่องของสมองน้อยภายในโดเมนเหล่านี้จะมีความสำคัญในการศึกษาในอนาคต และเมื่อเปรียบเทียบกับรายงานเล็กๆ น้อยๆ เกี่ยวกับความแตกต่างทางกายวิภาคในผู้ป่วย AT (Verhagen et al.2012; De Leon, Grover และ Huff 1976; Amromin, Boder, และ Teplitz 1979; Monaco et al. 1988; Terplan and Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare and Lopez 1967; Aguilar et al. 1968a; Paula-Barbosa et al. 1983) ในขณะที่เราตรวจพบสองขั้นตอนที่อาจเกิดขึ้นในการเกิด ataxia ใน Atm735wR35x; หนู Aptx ซึ่งเป็นระยะหลังของภาวะ ataxia รุนแรงพัฒนาในวัยผู้ใหญ่ในหนู เมื่อเทียบกับการเริ่มมีอาการในวัยเด็กในมนุษย์ ซึ่งอาจจำกัดการใช้ในการศึกษาพัฒนาการทางระบบประสาทบางอย่าง นอกจากนี้ การตีความการทดลองในอนาคตจะต้องพิจารณาปัจจัยอย่างรอบคอบในความจริงที่ว่า โมเดลใหม่นี้แสดงการกลายพันธุ์ที่เป็นโมฆะในยีนความเสถียรของจีโนมสองยีนในเวลาเดียวกัน ซึ่งเป็นสถานการณ์ที่ไม่พบในผู้ป่วยที่เป็นมนุษย์ด้วย AT หรือ AOA1 ในที่สุด การระบุตำแหน่ง เมื่อใด และอย่างไรที่การขาด ATM ทำให้เกิดพยาธิสภาพของสมองน้อยและ ataxia เป็นสิ่งที่ท้าทาย เนื่องจากหนูที่ขาด ATM ก่อนหน้านี้มักไม่มีคุณลักษณะเฉพาะที่จำเป็นในการเชื่อมโยงความบกพร่องของเซลล์และโมเลกุลกับฟีโนไทป์ของ ataxic มีการกำหนดช่องทางการสอบสวนที่มีแนวโน้มว่าจะเป็นไปได้หลายทาง รวมทั้งแนวทางที่มุ่งไปที่ระดับเซลล์ประสาท โดยที่ ATM มีส่วนเกี่ยวข้องในการส่งสัญญาณความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน (Chen et al.2003) และฟังก์ชัน synaptic (Li et al.2009; Vail et al.2016) เช่น เช่นเดียวกับฟังก์ชัน glial ซึ่งหลักฐานล่าสุดชี้ให้เห็นว่าพยาธิสภาพของ glial อาจเป็นปัจจัยสำคัญในพยาธิวิทยาของสมองน้อย (Kaminsky et al. 2016; Campbell et al.2016; Petersen, Rimkus และ Wassarman 2012; Weyemi et al.2015) โมเดลสัตว์ใหม่นี้เป็นเครื่องมือใหม่ในการทดสอบสมมติฐานทางกลไกเกี่ยวกับความบกพร่องของ ATM ที่ทำให้เกิดพยาธิสภาพของสมองน้อยและ ataxia นอกจากนี้ โมเดลนี้อาจทำหน้าที่เป็นเครื่องมือที่สำคัญที่สุดในการทดสอบพรีคลินิกสำหรับการทดสอบตัวเลือกการรักษาที่เสนอไว้ก่อนหน้านี้ (Browne et al.2004; Chen et al.2003) และสารประกอบ SMRT ของเราเอง (Du et al. 2013) ข้อจำกัดที่รุนแรงของการไม่มีแบบจำลองพรีคลินิกที่เหมาะสมสำหรับการทดสอบการรักษา โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับความผิดปกติที่หายาก เช่น AT และ AOA1 ไม่สามารถพูดเกินจริงได้

4.0 วัสดุและวิธีการ

4.1 คำชี้แจงจริยธรรม

การศึกษานี้ดำเนินการอย่างเคร่งครัดตามคำแนะนำในแนวทางการดูแลและการใช้สัตว์ทดลองของสถาบันสุขภาพแห่งชาติ สัตว์ทั้งหมดได้รับการจัดการตามโปรโตคอล Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ที่ได้รับอนุมัติที่สถาบัน Lundquist (31374-03,31773-02) และ UCLA(ARC-2007-082, ARC{{3} }) โปรโตคอลนี้ได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมการทดลองกับสัตว์ของสถาบัน Lundquist (หมายเลขประกัน: D16-00213) พยายามทุกวิถีทางเพื่อลดความเจ็บปวดและความทุกข์ทรมานโดยให้การสนับสนุนเมื่อจำเป็นและเลือกจุดสิ้นสุดทางจริยธรรม

4.2หนู

All mice were group-housed and kept under a 12-h day/night cycle with food and water available ad libitum. Animals were housed within the general mouse house population, and not in specialized pathogen-free rooms. Older animals were made available wetted food or food gel packs on the ground of the cages as ataxia developed. Atm35 and Atm935×mice were created and provided by Dr. Hicks and colleagues at the University of Manitoba. These mice were created to contain the c.103C>การกลายพันธุ์ T พบในประชากรจำนวนมากของแอฟริกาเหนือที่ผู้ป่วย using recombineering Gateway technology and site-directed mutagenesis. A C>T mutation at this position in the mouse Atm gene creates a TAG G stop codon. The same mutation in the human ATM gene produces a TGA G stop codon. In consideration of the use of these models for therapeutic interventions, we chose to create a mouse model for each of the two PTC codons(Fig.1A). A modified Gateway R3-R4-destination vector was used to pull out the desired region of the mouse Atm gene from a Bacterial Artificial Chromosome (BAC) and subsequently mutated to create either a TAG G stop codon at codon 35(M00001, position 103(C>T))or a TGA G stop codon (M00002, position 103 (CAG>TGA) จำลอง AT PTC ของมนุษย์) จากนั้นอัลลีลของจีโนมถูกโคลนให้เป็นเวอร์ชันดัดแปลงของเวกเตอร์การกำหนดเป้าหมายของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม NorCOMM โดยใช้ 3-way Gateway Reaction (Bradley et al. 2012) เวคเตอร์การกำหนดเป้าหมายที่เป็นผลลัพธ์ถูกอิเล็กโตรโพเรเตอร์เข้าไปในเซลล์ C2 ES (C57BI/6N, ได้มาจากห้องปฏิบัติการ A. Nagy, โตรอนโต, แคนาดา) และโคลนที่กำหนดเป้าหมายได้สำเร็จถูกระบุโดยการคัดเลือกด้วย G418 (Gertsenstein et al.2010) การรวมตลับเทปการกำหนดเป้าหมายที่กลายพันธุ์เข้ากับโลคัสของยีน Atm ได้รับการยืนยันโดย Southern blot และโดยการหาลำดับของผลิตภัณฑ์ PCR เพื่อยืนยันการมีอยู่ของการกลายพันธุ์ PTC ของ Atm การกำหนดเป้าหมายที่ปราศจากข้อผิดพลาดในตำแหน่งที่ตั้งของ Atm และส่วนประกอบการทำงานที่ปราศจากข้อผิดพลาดของ

เวกเตอร์ (ไม่แสดงข้อมูล) มีการใช้สำเนาพันธุ์ ES เชิงบวกสำหรับการฉีดบลาสโตซิสต์เพื่อให้ได้สายแปลงพันธุ์ อัลลีลดัดแปรพันธุกรรมมีโปรโมเตอร์เดลตาTK1-นีโอ cassette in the intron upstream of the region containing the mutated exon. This floxed cassette was subsequently excised by crossing with a Cre driver mouse(B6.C-Tg(CMV-are)1Cgn/J) to generate Atm3x+ and AtmM1(103CTMFcc, respectively) mouse lines Atm35×+ (MGI nomenclature: AtmTM1(103CAG>TGA)MFGCc;(รูปที่ 1A) การทำจีโนไทป์ของ Atm สองบรรทัดได้ดำเนินการโดยใช้ไพรเมอร์ต่อไปนี้ที่ Tm 62 องศาดีกรี : Atm gene forward (F) ไพรเมอร์:5'-CCTTTGAGGCATAAGTTGCAACTTG-3'; และ Atm gene reverse(R)primer: 5'-GTACAGTGTATCAGGTTAGGCATGC-3' สร้างผลิตภัณฑ์อัลลีลแบบ wild-type 151bp หรือผลิตภัณฑ์อัลลีลเป้าหมาย 241bp (รูปที่ 1A, 1B)Atmn35~ และ Atm035×v คือ ผสมกลับด้วยหนูเมาส์ C57Bl/6J เป็นเวลา 9 รุ่น (99.2 เปอร์เซ็นต์คือไอโซเจนิก) ก่อนการเก็บรักษาด้วยการแช่เยือกแข็งและการให้กำเนิดซ้ำในภายหลังโดยใช้มารดาที่ตั้งครรภ์แทน C57BI/6J Atm735× และ Atm?35xand Atm 35×/Q35× เป็นพ่อพันธุ์แม่พันธุ์ที่ได้รับจากพี่น้อง F1 Atm35 และ Atm835X บวกกับหนู AtmR35×k35×: พบว่าทั้งคู่มีความอุดมสมบูรณ์ หนู Aptx knockout (Aptx) ถูกสร้างขึ้นและมอบให้กับ Dr. Mathews ในฐานะเอ็มบริโอจาก Dr. McKinnon (Ahel et al.2006) และต่อมาได้กำเนิดใหม่ผ่านทางมารดาตัวแทน C57Bl/6J หนูของ Aptx อยู่บนพื้นหลังแบบผสม C57Bl/6 และ 129 ตู้เอทีเอ็ม 35k35; หนู Aptx ของ wildtype, heterozygous และ homozygous ที่หลากหลายถูกสร้างขึ้นจาก Atm35X; พ่อพันธุ์แม่พันธุ์ Aptxt ถูกสร้างขึ้นโดยการข้าม Atm?35×R35 และ Aptx^ หนู กลุ่มหนึ่งของกลุ่มกลายพันธุ์คู่และหนูควบคุมที่สอดคล้องกันถูกใช้ในการศึกษาพฤติกรรมตามยาวสำหรับการวิเคราะห์การเดินและการทดสอบ SHERPA (รูปที่ 2,3) กลุ่มเพิ่มเติมหลายกลุ่มของหนูเมาส์กลายพันธุ์คู่และหนูควบคุมที่เข้าคู่กันอายุถูกใช้สำหรับการทดลองอิเล็กโตรกายภาพวิทยา ภูมิคุ้มกันวิทยา และขั้วแนวตั้ง (รูปที่ 4, 7) การทดลองการแสดงออกทางภูมิคุ้มกันและโปรตีนได้ดำเนินการโดยใช้หนูที่ผสมพันธุ์จากหนูทดลอง AtmR35× และ Atm35×ดั้งเดิม (รูปที่ 5, 6 และ 8) การทำจีโนไทป์ถูกดำเนินการจากตัวอย่างเนื้อเยื่อหูของหนูเมาส์ P8-11 วิธีการ PCR แบบเรียลไทม์ที่ดำเนินการโดย Transnetyx Inc. ถูกใช้เพื่อกำหนดจีโนไทป์ของสัตว์แต่ละตัว สัตว์ถูกทำให้สามารถระบุตัวตนได้ด้วยการสักที่นิ้วเท้าในเวลาเดียวกับการตรวจชิ้นเนื้อหู ไพรเมอร์เฉพาะสำหรับ Atm35× และ Atm35× ถูกหาปริมาณและใช้เพื่อระบุหนูประเภท wild, heterozygous และ homozygous (รายการด้านบน) ไพรเมอร์ Aptx'and Aptx*" ถูกใช้เพื่อประเมินจีโนไทป์ของพวกมัน

4.3 สุขภาพสัตว์

ชั่งน้ำหนักสัตว์ด้วยเครื่องชั่งดิจิตอลที่ P8, 45, 120,210,400 การเสียชีวิตของสัตว์ถูกบันทึกเป็นวันที่พบศพ หรือวันที่การุณยฆาตเมื่อสัตว์มาถึงจุดสิ้นสุดที่มีมนุษยธรรม (สัตว์ไม่สามารถปรับตัวให้เข้ากับตัวเองได้ภายในช่วงทศวรรษที่ 60 ขนปูขึ้นอย่างเห็นได้ชัดบ่งชี้ว่าขาดการดูแลตนเองหรือความลำบากใจมากเกินไปตามที่สัตวแพทย์ระบุไว้ พนักงาน). ซากสัตว์ถูกแช่แข็งทันทีเมื่อเสียชีวิต และมีการชันสูตรพลิกศพเป็นชุดๆ สาเหตุการตายที่เป็นไปได้ถูกกำหนดอย่างสุดความสามารถโดยร่วมมือกับเจ้าหน้าที่สัตวแพทย์ (Dr. Catalina Guerra) โดยการตรวจอวัยวะภายในด้วยสายตา หนูบางตัวถูกกินเนื้อหรือถูกกำจัดโดยไม่ได้ตั้งใจโดยเจ้าหน้าที่ของ vivarium และ

ดังนั้นจึงระบุว่า "หายไป" หนูที่ไม่มีสาเหตุการตายที่มองเห็นได้ชัดเจนจึงถูกระบุว่า "ไม่สามารถระบุได้" หนูที่ถูกพบว่ามีมวลทรวงอกใกล้กับบริเวณที่ต่อมไทมัสปกติจะอยู่ในหนูอายุน้อยถูกระบุว่ามี "มะเร็งต่อมไทมัส" ทั้งหมดที่ระบุ สาเหตุที่เป็นไปได้ของการเสียชีวิต (เช่น ตับโต การอุดตันของทางเดินปัสสาวะ) ถูกระบุว่าเป็น "อื่นๆ"

4.4 พฤติกรรม

ก่อนทำการทดสอบพฤติกรรมใดๆ หนูทดลองถูกปรับให้เข้ากับชุดพฤติกรรมเป็นเวลาประมาณ 20 นาที หนูได้รับการทดสอบในช่วงเวลาต่างๆ ของวัน โดยสอดคล้องกับวัฏจักรประจำวันของหนู แบตเตอรีของการทดสอบพฤติกรรมได้ดำเนินการกับหนูเมาส์กลายพันธุ์คู่ไร้เดียงสาของจีโนไทป์ที่ระบุ ณ จุดเวลาต่างๆ ขึ้นอยู่กับพฤติกรรม แต่ในกลุ่มเดียวกันของหนู การทดสอบแบตเตอรี่ประกอบด้วยการประเมิน Catwalk Gait (P45, 120,210, 400) และชุดย่อยของ SmithKline-Beecham Harwell Imperial-College และ Royal-London-Hospital Phenotype Assessment (SHERPA) (P30 และ 400) การทดสอบเหล่านี้ดำเนินการโดย UCLA Behavioral Core หนูทดลองคู่และหนูควบคุมได้รับการตรวจสอบเพิ่มเติมในการทดสอบเสาแนวตั้ง เครื่องมือวัดพฤติกรรมทั้งหมดถูกเช็ดออกด้วยเอทานอล (ร้อยละ 70 ) ระหว่างแต่ละหัวข้อที่ทำการทดสอบ

การวิเคราะห์การเดิน

เราใช้ระบบวิเคราะห์ Noldus Catwalk Gait ที่ออกแบบมาเพื่อวัดและวิเคราะห์การเดินของหนูกึ่งอัตโนมัติในระหว่างการเดินปกติ โดยสังเขป การเคลื่อนไหวของหนูข้ามทางเดินก้นแก้วเป็นวิดีโอที่บันทึกจากตำแหน่งตรงกลาง ภาพพิมพ์อุ้งเท้าถูกเน้นในวิดีโอเนื่องจากมีแสงส่องสว่างทั่วแท่นเดินกระจก แต่ละขั้นตอนของเมาส์ในวิดีโอจะถูกตรวจพบในภายหลังโดยใช้ Catwalk XT (Noldus) ในแบบกึ่งอัตโนมัติ การวิ่งสำหรับเมาส์แต่ละตัวประกอบด้วยการทดลอง 3 ครั้งของ ambulation ที่สอดคล้องกันทั่วทั้งแพลตฟอร์มที่ได้รับการตรวจสอบ ยอมรับเฉพาะการทดลองที่สม่ำเสมอเท่านั้น และหนูอาจใช้ความพยายามสูงสุด 10 ครั้งเพื่อดำเนินการทดลองที่สอดคล้อง 3 แบบให้เสร็จสิ้นในทิศทางใดทิศทางหนึ่งทั่วทั้งทางเดิน การทดลองที่เป็นไปตามข้อกำหนดถูกกำหนดให้เป็นแบบที่มีการเคลื่อนไหวข้ามแพลตฟอร์มที่มีความยาวไม่เกิน 5 วินาทีและมีการเปลี่ยนแปลงความเร็วไม่เกิน 60 เปอร์เซ็นต์ เมื่อวางลงบนแพลตฟอร์มแล้ว หนูมักจะวิ่งไปมาโดยไม่จำเป็นต้องให้ผู้ทดลองแจ้ง

เสาแนวตั้ง

หนูถูกวางไว้ที่ด้านบนสุดของสลักเกลียวสูง 80 ซม. โดยให้จมูกของพวกมันคว่ำลงและอุ้งเท้าหลังใกล้กับด้านบนมากที่สุด หนูจะถูกปล่อยทันที และเวลาเริ่มต้นทันทีเมื่อวาง

เวลาจะหยุดเมื่ออุ้งเท้าแรกสัมผัสพื้นผิวใต้เสา ความชอบโดยธรรมชาติของหนูคือต้องปีนลงจากเสาทันที และให้เวลา 60 วินาทีในการสำรวจขั้วโลก มิฉะนั้น พวกมันจะได้รับความช่วยเหลือจากเสา การทดลองที่ยังไม่เสร็จสิ้นจะได้รับเวลา 30 วินาทีโดยอัตโนมัติ เนื่องจาก 95 เปอร์เซ็นต์ของหนูที่ไม่ได้ลงมาภายใน 30 วินาทียังคงอยู่บนเสาที่เครื่องหมาย 60s SHIRPA การทดสอบพฤติกรรมดำเนินการโดย University of California, Los Angeles Behavioral Core ที่ P30

และ P400 พารามิเตอร์ทั้งหมดจะถูกให้คะแนนเพื่อให้การประเมินเชิงปริมาณ ซึ่งช่วยให้สามารถเปรียบเทียบผลลัพธ์ทั้งในช่วงเวลาหนึ่งและระหว่างห้องปฏิบัติการต่างๆ เมาส์แต่ละตัวได้รับการทดสอบตามลำดับพฤติกรรมทั้งหมดภายใน ~20-ช่วงเวลานาทีก่อนที่จะย้ายไปยังเมาส์ตัวถัดไป ผู้ทดลองตาบอดต่อยีนของสัตว์ หน้าจอดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Rogers et al. 1997)

การสังเกตพฤติกรรม

หน้าจอหลักแสดงโปรไฟล์การสังเกตพฤติกรรม และการประเมินสัตว์แต่ละตัวเริ่มต้นด้วยการสังเกตพฤติกรรมที่ไม่ถูกรบกวนในโถสำหรับดู (เส้นผ่านศูนย์กลาง 10 ซม.) เป็นเวลา 5 นาที นอกเหนือจากพฤติกรรมคะแนนของตำแหน่งของร่างกาย กิจกรรมที่เกิดขึ้นเอง อัตราการหายใจ และการสั่นสะเทือน ผู้สังเกตจะบันทึกกรณีของพฤติกรรมที่แปลกประหลาดหรือเป็นแบบแผนและการชัก การเลียโดยบังคับ การกัดแบบทำลายตัวเอง และการย้อนกลับ (เดินถอยหลัง) และข้อบ่งชี้ของเชิงพื้นที่ งุนงง

พฤติกรรมอารีน่า

หลังจากนั้น เมาส์จะถูกส่งไปยังสนามประลอง (30 ซม. x 50 ซม.) เพื่อทดสอบความตื่นตัวของการถ่ายโอนและการสังเกตพฤติกรรมปกติ สนามกีฬาถูกทำเครื่องหมายเป็นตารางขนาด 10 x 10 ซม² สี่เหลี่ยมเพื่อวัดกิจกรรมของหัวรถจักรภายในระยะเวลา 30 วินาที ขณะที่เมาส์ทำงานอยู่ในที่เกิดเหตุ จะมีการบันทึกการวัดการตอบสนองที่ทำให้ตกใจ การเดิน ระดับความสูงของอุ้งเชิงกราน และระดับความสูงของหาง

ท่านอนหงาย

สัตว์ถูกขังอยู่ในท่าหงายเพื่อบันทึกพฤติกรรมอัตโนมัติ ในระหว่างการประเมินนี้ ได้มีการประเมินความแข็งแรงของการยึดเกาะ, โทนสีร่างกาย, พินนารีเฟล็กซ์, การสะท้อนของกระจกตา, การหนีบนิ้วเท้า, การเคลื่อนตัวของลวด และอัตราการเต้นของหัวใจ

ความสมดุลและการวางแนว

ในที่สุด ได้ทำการวัดการทำงานของระบบขนถ่ายหลายแบบ ได้ดำเนินการทดสอบการสะท้อนกลับ การสะท้อนการสัมผัส และการทดสอบการแทกซิสเชิงลบ ตลอดขั้นตอนนี้ มีการบันทึกการเปล่งเสียง การถ่ายปัสสาวะ และความกลัวทั่วไป ความหงุดหงิด หรือความก้าวร้าว

อุปกรณ์ที่ใช้

1.สนามลูกแก้วใส (ขนาดภายในโดยประมาณ 55x33 x18 ซม.) บนพื้นของเวทีมีแผ่นเพล็กซิกลาสที่มีเครื่องหมาย 15 สี่เหลี่ยม(11 ซม.) ลวดแนวนอนแบบแข็ง (เส้นผ่านศูนย์กลาง 3 มม.) ถูกยึดไว้ที่มุมขวาด้านหลัง เพื่อให้สัตว์ไม่สามารถสัมผัสด้านข้างได้ในระหว่างการเคลื่อนลวด ตะแกรง (40x 20 ซม.) ที่มีตาข่าย 12 มม. (โดยประมาณ) ถูกยึดไว้ตลอดความกว้างของกล่องเพื่อวัดระบบกันสะเทือนส่วนท้ายและลักษณะความแข็งแรงของด้ามจับ 2. กระบอกลูกแก้วใส(15 x ll cm) ใช้เป็นโถสำหรับดู 3. ชั้นกริดหนึ่งชั้น (40x 20 ซม.) พร้อมตาข่าย 12 มม. ที่วางโถสำหรับดู4. โครงรองรับสเตนเลสสตีลสี่ทรงกระบอก (ยาว 3 ซม. x เส้นผ่านศูนย์กลาง 2.5 ซม.) เพื่อยกตะแกรงออกจากม้านั่ง 5. แผ่นสแตนเลส 1 เหลี่ยม (13 ซม.) สำหรับขนย้ายสัตว์สู่สนาม 6. ตัดความยาว 3/0 Mersilk ไว้ในคีมสำหรับการทดสอบการสะท้อนของกระจกตาและพินนา 7. แท่งเดือยพลาสติกถูกลับให้แหลมที่จุดดินสอเพื่อทดสอบน้ำลายไหลและการกัด คีมอุปกรณ์ผ่า โค้งมีจุดละเอียด (คีม 125 มม. Philip Harris Scientific Cat. No. D46-174) สำหรับการหนีบนิ้วเท้า 9.นาฬิกาจับเวลา.10. กล่อง IHR Click ใช้สำหรับทดสอบการตอบสนองที่น่าตกใจ Click Box จะสร้างโทนเสียง 20 kHz สั้นๆ ที่ 90dB SPL เมื่อถือเมาส์ไว้เหนือเมาส์ 30 ซม. ติดต่อ Prof. KP Steel, MRC Institute of Hearing Research, University Park, Nottingham NG7 2RD 11.ไม้บรรทัด 12.หลอดลูกแก้วใส 30 ซม. ที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 2.5 ซม. สำหรับรีเฟลกซ์สัมผัสขวา 4.5 สรีรวิทยาไฟฟ้า การเตรียมสมองน้อยซีรีเบลล่าเฉียบพลันชิ้นปารากจิตต์น่ารักที่มีความหนา 300 ไมโครเมตร ได้เตรียมจากซีรีเบลลัมของหนูทดลองและควบคุมหนูทดลอง โดยทำตามวิธีการเผยแพร่ (Hansen et al., 2013) โดยสังเขป สมองน้อยถูกกำจัดออกอย่างรวดเร็วและแช่ในสารละลายนอกเซลล์ที่เย็นจัดด้วยองค์ประกอบ (mM): 119 NaCl, 26 NaHCOg, 11 กลูโคส, 2.5 KCl, 2.5 CaCla, 1.3 MgCla และ 1 NaHzPOa, pH7.4 เมื่อ ก๊าซที่มีคาร์บอนไดออกไซด์ร้อยละ 5 / ร้อยละ 95 O2 เซเรเบลลาถูกแบ่งแยกแบบพาราไซทอลโดยใช้ไวบราโทม (Leica VT-100, Leica Biosystems, Nussloch, Germany) และเริ่มต้นฟักที่ 35 องศาเป็นเวลา-30 นาที จากนั้นจึงปรับสมดุลและเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องจนกว่าจะใช้งาน การบันทึกภายนอกเซลล์และภายในเซลล์ได้มาจากเซลล์ประสาท Purkinje (PNs) ในชิ้นที่ผสมอย่างต่อเนื่องด้วยสารละลายภายนอกเซลล์ที่มีฟองเป็นฟองคาร์โบเจนและคงไว้ที่ 37 องศาเซลเซียส (นอกเซลล์) หรือ 32 องศา (ภายในเซลล์) ± 1 องศา (ดูด้านบน) เซลล์ถูกมองเห็นด้วยเลนส์ DIC และวัตถุประสงค์ 40× ในการแช่น้ำ (NA 0.75) โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Zeiss Examiner ปิเปตแก้วที่มีความต้านทาน ~3 MQ (รุ่น P-1000, Sutter Instruments, Novato, CA) ถูกเติมด้วยสารละลายนอกเซลล์และวางตำแหน่งใกล้กับ PN axon hillock เพื่อวัดค่าทรานซิชันของกระแส capacitive ที่เกี่ยวข้องกับศักย์ไฟฟ้าในโหมดแคลมป์แรงดัน ด้วยศักย์ไฟฟ้าของปิเปตที่ 0 mV สำหรับการบันทึกแบบแพตช์แคลมป์ทั้งเซลล์ ปิเปตถูกเติมด้วยสารละลายภายในเซลล์ (mM): 140 เดือน (CH3KO3S), 10 NaCl, 2 MgCl2,0.2 CaClz,10 HEPES,14 ฟอสโฟครีเอทีน (เกลือทริส), 1 EGTA,4 Mg -ATP,0.4 Na-GTP.100 ไมโครโมลาร์ พิโครทอกซิน (ซิกมา) ถูกเติมเพื่อสกัดกั้นอินพุตซินแนปติก GABAegeric ที่ยับยั้ง ข้อมูลได้มาโดยใช้

แอมพลิฟายเออร์ MultiClamp 700B ที่ 20 หรือ 100 kHz ในโหมดแรงดันไฟหรือกระแสแคลมป์ Digidata 1440 พร้อม pClamp10 (อุปกรณ์ระดับโมเลกุล Sunnyvale, CA) และกรองที่ 2 ถึง 4 kHz ความต้านทานอนุกรมมักจะอยู่ระหว่าง 10 ถึง 15 MQ ความต้านทานของซีรีส์ได้รับการชดเชยที่ 80 เปอร์เซ็นต์สำหรับการทดลองปั้นในระยะสั้นเท่านั้น สำหรับการบันทึกนอกเซลล์ มีการบันทึก PNs ทั้งหมด 20 ถึง 45 รายการสำหรับสัตว์แต่ละตัวในทุกจีโนไทป์ เพศ และกลุ่มอายุ การบันทึกถูกแจกจ่ายไปทั่วแกนกลาง-ด้านข้างและแกนรอสโทรคอดัลของซีรีเบลลัม ตรวจสอบเฉพาะเซลล์ที่มีลักษณะ "แข็งแรง" (ความคมชัดต่ำของเส้นขอบเซลล์) และอัตราการยิงที่สม่ำเสมอและสม่ำเสมอ ในระหว่างการวิเคราะห์ พบว่าเซลล์สองสามเซลล์มีช่องว่างในการยิงนานกว่า 2 วินาที และเซลล์เหล่านี้ถูกกำจัดออกจากการวิเคราะห์ เนื่องจากการยิงประเภทนี้เกี่ยวข้องกับการ "ไม่แข็งแรง" เนื้อเยื่อที่กลายพันธุ์คู่ไม่ได้แตกต่างกันในเชิงคุณภาพใน การปรากฏภายใต้กล้องจุลทรรศน์ DIC ก่อนการบันทึก และจำนวนเซลล์ที่ "ไม่แข็งแรง" ก็ไม่มีมากกว่าจีโนไทป์อื่นๆ (7 เปอร์เซ็นต์ เทียบกับ 4 ถึง 11 เปอร์เซ็นต์ ของเซลล์ทั้งหมดทั่วกลุ่มควบคุมที่ P400) การเปรียบเทียบเชิงพื้นที่ของกิจกรรมประสาทได้มาจากการบันทึกจากส่วนอนุกรมใน flocculus, ด้านข้าง (2"d หรือ 3'), กลาง (6" หรือ 7th) และอยู่ตรงกลาง (11" หรือ 12t) ชิ้น ใช้ชิ้นตัวเลขที่ต่ำกว่าใน กลุ่มอายุที่น้อยกว่า (P45 และ 110) เพื่อให้ตรงกับตำแหน่งสัมพัทธ์ของการบันทึกตามกลุ่มอายุ การบันทึก 0-3 รายการสร้างขึ้นจากแต่ละ lobule ภายในแต่ละส่วนขึ้นอยู่กับคุณภาพของเนื้อเยื่อและสุขภาพ การบันทึกแต่ละครั้งใช้เวลา {{29} }นาที. ใช้หนู 3 ถึง 5 ตัวสำหรับแต่ละกลุ่มอายุ และผู้ทดลองมองไม่เห็นจีโนไทป์ อายุ และเพศ

การบันทึกภายในเซลล์ได้มาจาก PNs ใน lobule IIl หรือ VIl ของ medial cerebellum (เช่น vermis); ไม่พบความแตกต่างทางสถิติในคุณสมบัติระหว่าง lobules

วิเคราะห์

ตรวจพบและวิเคราะห์ช่วงเวลาระหว่างสิ่งกระตุ้นที่อาจเกิดขึ้นได้เองตามธรรมชาติโดยใช้รูทีนมาตรฐานและแบบกำหนดเองใน ClampFit (Molecular Device), GoPro (Wavemetrics) และ Excel (Microsoft) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ศักยภาพในการดำเนินการถูกตรวจพบขีดจำกัด และสถิติที่เพิ่มขึ้น (เช่น ความถี่และความยาวช่วง) ถูกกำหนดโดยใช้adaptedlgorProroutines(TaroTools;https://sites.google.com/site/tarotoolsregister/) ค่าสัมประสิทธิ์การแปรผันของช่วงระหว่างสไปค์เฉลี่ย (CV) และช่วงกลางระหว่างสไปค์ (CV2=2 ISIn บวก 1-ISInl/(ISIn บวก 1 บวก ISIn)) คำนวณใน Excel โดยใช้ มาโครที่กำหนดเอง วิเคราะห์คุณสมบัติของเมมเบรนมาตรฐานโดยใช้ lgorPro RM ถูกกำหนดโดยการหาค่าเฉลี่ย 3 การตอบสนองการติดตามของแรงดันไฟฟ้ากับพัลส์แบบสเต็ป -5 mV จากศักย์คงตัวของ -80 mV และการวัดผลการโก่งตัวของกระแสที่เกิดขึ้นระหว่าง 900 ถึง 1,000 มิลลิวินาทีหลังจากการโจมตี ค่าคงที่เวลาของเมมเบรนถูกวัดโดยการใส่เลขชี้กำลังเดี่ยวเข้ากับเฟสการสลายตัวเริ่มต้นตั้งแต่ 90 เปอร์เซ็นต์ ถึง 10 เปอร์เซ็นต์ของพีค CM คำนวณโดยการหารค่าคงที่เวลาของเมมเบรนโดยเหตุการณ์ RM.sEPSC ถูกบันทึกในช่วงเวลา 1-นาที และตรวจพบและวัดโดยใช้ Neuroexpress (v21.1.13) แอกซอนไฟเบอร์แบบขนานและแบบปีนถูกกระตุ้นโดยใช้อิเล็กโทรด theta-glass (WPI) และตัวแยกตัวกระตุ้นที่ควบคุมด้วย TTL (ISO-Flex, AMPI) แอมพลิจูด EPSC ที่ปรากฏขึ้นและค่าคงที่ของเวลาที่สลาย (1 exp สำหรับ Parallel และ 2 exp. สำหรับการปีนเส้นใย) ถูกวิเคราะห์โดยใช้รูทีนแบบกำหนดเองใน lgorPro ศักยภาพในการดำเนินการได้รับการตรวจสอบโดยเป็นส่วนหนึ่งของชุดการฉีดกระแสไฟ 1 วินาทีระหว่าง -500 ถึง 2250 pA (ขั้นตอน 250 pA) โดยปรับกระแสกักเก็บเพื่อรักษาศักย์ไฟฟ้า ~70 mV วัดรูปคลื่นที่อาจเกิดขึ้นจากการดำเนินการโดยใช้กำหนดเอง

กิจวัตรใน lgorPro ขีด จำกัด ศักยภาพในการดำเนินการถูกกำหนดให้เป็นแรงดันเมมเบรนแรกซึ่งอนุพันธ์แรกเกิน 30 mV/ms (Zhu et al.2006)

4.6 การตรวจสมองเสื่อม

ขนาดของสมองน้อย ทันทีหลังจากเอาสมองออกจากกะโหลกศีรษะ ได้ภาพหลังทั้งภูเขา รูปภาพได้รับการประมวลผลโดยใช้ฟิจิ (NIH) ขนาดของสมองน้อยและสมองน้อยได้รับการประเมินโดยสรุปพื้นที่มิติของ 2- แล้วคำนวณพื้นที่ เราทำให้เป็นมาตรฐานสำหรับความแตกต่างที่เป็นไปได้ในขนาดสมองโดยรวมโดยหารผลลัพธ์ของซีรีเบลลัมด้วยขนาด forebrain เพื่อสร้างอัตราส่วนระหว่างสมองน้อยกับสมองส่วนหน้า ผู้ทดลองมองไม่เห็นจีโนไทป์ของสัตว์ อิมมูโนฮิสโตเคมี ณ จุดยุติการศึกษาตามลำดับ (P45, 120,210,4{{7{{104}}}}0) หนูเมาส์ตัวผู้และตัวเมียของยีนทั้งหมด ในการศึกษานี้ได้รับการดมยาสลบด้วย isoflurane และได้รับการ perfusion transcardial กับ phosphate-buffered saline ตามด้วย 4 เปอร์เซ็นต์ (w / v) buffered paraformaldehyde (PFA) จากนั้นจึงผ่าเพื่อแยกสมอง รูปภาพของสมองทั้งหมดถูกถ่ายทันทีหลังจากถอดสมองออกจากกะโหลกศีรษะ จากนั้นสมองก็จุ่มลงใน PFA 4% เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นจึงแช่เยือกแข็งในน้ำเกลือ Tris-buffered (TBS) ด้วยเอไซด์ 0.05 เปอร์เซ็นต์ และน้ำตาลซูโครส 30 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 72 ปี ชั่วโมงและเก็บไว้ที่ 4 องศาจนกว่าจะใช้งานต่อไป ซีรีเบลลัมถูกแยกออกจากสมองส่วนหน้าและส่วนพาราแซกทัลโดยใช้ไมโครโทมแบบเลื่อน (Microm HM 430, Thermo Scientific) ที่ความหนา 40 ไมโครเมตร ส่วนของสมองน้อยถูกรวบรวมในชุดของหกและเก็บไว้ใน TBS-AF (TBS ที่มีซูโครส 30 เปอร์เซ็นต์, โซเดียมเอไซด์ 0.05 เปอร์เซ็นต์ และเอทิลีนไกลคอล 30 เปอร์เซ็นต์) ที่ 4 องศาหรือ -20 องศาจนกว่าจะใช้ต่อไป สำหรับการสร้างภาพอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ของเซลล์ประสาท Purkinje ส่วนซีรีเบลลัมของ Atm ทั้งสอง*; Aptx*t และ Atm?35×R35×; Aptx^(n=5 ต่อจีโนไทป์) ถูกล้างเป็นเวลา 5 นาทีใน TBS สามครั้ง และจากนั้นถูกบล็อกในซีรั่มแพะปกติ 15 เปอร์เซ็นต์ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที ตามด้วยการฟักตัวแบบลอยอิสระในยาต้านแคลบินดิน D ของกระต่ายหรือเมาส์ -28k (1:1000) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องบนเครื่องปั่นแบบโคจร จากนั้นล้างส่วนต่างๆ เป็นเวลา 5 นาทีด้วย TBS สามครั้ง ตามด้วยการฟักตัวแบบลอยอิสระในสารต่อต้านกระต่ายหรือหนูเมาส์ Alexa Fluor 488 (1:1000) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงในความมืดที่อุณหภูมิห้องบนเครื่องปั่นแบบโคจร หลังจากการฟักตัวของแอนติบอดีทุติยภูมิ ส่วนต่างๆ ถูกล้างเป็นเวลา 5 นาทีใน TBS สามครั้ง จากนั้นติดตั้งและปิดฝาด้วย Fluoromount-G ด้วย DAPI สำหรับบางส่วน แอนติบอดี Caspase-3 (1:200) และ anti-CD68 (1:400) ที่ต้านการตัดแยกถูกตรวจสอบเพิ่มเติมควบคู่ไปกับ Calbindin โดยใช้แอนติบอดีทุติยภูมิของ Alexa Fluor 647 (1:500) สไลด์ถูกสแกนโดยใช้ Stereo Investigator (MBF Bioscience, ver.2020) บนกล้องจุลทรรศน์ Zeiss ที่ติดตั้ง ApoTome 2 (Carl Zeiss Microscopy, Axio Imager.M2) โดยใช้วัตถุประสงค์ 2.5, 10,20,40 หรือ 63x และรูปภาพ ถ่ายด้วยกล้อง Hamamatsu CMOS (Hamamatsu Photonics, ORCA Flash 4.0 LT plus ) ในการหาจำนวนเซลล์ปฏิกิริยา calbindin ในแต่ละ lobule ในภาพผลลัพธ์ เราใช้ Stereo Investigator เพื่อสุ่มวาดเส้น 2 เส้นที่มีความยาวระหว่าง 300 ถึง 500 μm แต่ละก้อนและนับจำนวน PNs ทั้งหมดด้วยตนเองตามความยาวภายในความหนา 40 um ของชิ้นเนื้อเยื่อภายใต้กำลังขยาย 40x ความหนาแน่น 2D (# ของ PNs/(ความยาวเชิงเส้น*ความหนา 40 um)) ของสองตัวอย่างต่อ lobule เฉลี่ยสำหรับการเปรียบเทียบเพิ่มเติมระหว่าง lobules และสัตว์ วัดความกว้างของ PN เดนไดรต์ที่เป็นบวกของ Calbindin ที่ตำแหน่งที่กำหนดไว้ล่วงหน้าใน lobule VI จากสัตว์แต่ละตัวในส่วนเนื้อเยื่อหนา 25 หรือ 40 ไมโครเมตรภายใต้กำลังขยาย 20 เท่า วัดความกว้างของเดนไดรต์ของกิ่งหลักและกิ่งรองที่เส้นกึ่งกลางระหว่างตัวเซลล์ PN กับขอบของชั้นโมเลกุล วัดเดนไดรต์ระหว่าง 7 ถึง 13 ชิ้นต่อหนึ่งส่วน หนึ่งส่วนต่อสัตว์ สำหรับการวัดโซมาติก PN Stereo Investigator ถูกใช้เพื่อสุ่มเลือก PN ที่กระจายทั่วทั้งส่วนตรงกลางทั้งหมดภายใต้กำลังขยาย 20x ความกว้าง PN เฉลี่ยต่อสัตว์หนึ่งตัวถูกกำหนดโดยผลลัพธ์โดยเฉลี่ยใน 3 ส่วนต่อเนื่อง (16 ถึง 37 PNs ต่อส่วน) ความกว้างของ PN ถูกวัดในแนวตั้งฉากกับชั้น PN หรือกับเดนไดรต์ที่ทางออกหากเอียงมากกว่าสองสามองศา ชั้นโมเลกุลและชั้นเซลล์แบบเม็ด (มองเห็นได้ด้วยคราบ Calbindin และ DAPI ตามลำดับ) ประเมินความกว้างใน Stereo Investigator โดยการวัดความกว้างสองครั้งที่ตำแหน่งที่กำหนดไว้ล่วงหน้าสำหรับแต่ละ lobule ประมาณครึ่งทางพร้อมกับขอบเขตยาวของแต่ละ lobule ภายใต้กำลังขยาย 2.5xCD68 ค่าบวกในส่วนของสมองน้อยถูกหาปริมาณโดยการวัดพื้นที่เปอร์เซ็นต์ทั้งหมดของ CD68 บวกกับการย้อมสีที่เป็นบวกทั่วทั้งส่วนของสมองน้อยที่อยู่ตรงกลางทั้งหมด ภาพที่เย็บ 10x ถูกกำหนดเกณฑ์ไปยังกลุ่มควบคุมเชิงลบและวัดปริมาณโดยใช้ ImageJ หนึ่งส่วนต่อสัตว์หนึ่งตัว ในการหาจำนวนเปอร์เซ็นต์ของ PN ที่เป็นบวกของ Calbindin ที่เป็นค่าบวกสำหรับ Caspase ที่แยกออกมา-3 เรานับ PNs ทั่วทั้งสมองน้อยโดยใช้ Stereo Investigator ตรวจสอบภาพที่เย็บด้วยกำลังขยาย 20 เท่า จำนวน 3 ภาพต่อสัตว์หนึ่งตัว และนำมาเฉลี่ยผลลัพธ์ ขีด จำกัด สำหรับความเป็นบวกของแคสเปส-3 ถูกสร้างขึ้นจากส่วนควบคุมที่ย้อมด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิเท่านั้น สำหรับการวิเคราะห์เนื้อเยื่อที่ไม่เรืองแสง 25-ส่วนเนื้อเยื่อที่ลอยได้อิสระหนา {{98} ม. บนสไลด์ที่มีประจุบวกและตากให้แห้งในชั่วข้ามคืน ล้างเนื้อเยื่อในน้ำเกลือที่บัฟเฟอร์ด้วยฟอสเฟต (PBS) สองครั้งเป็นเวลา 5 นาที จากนั้นย้อมตามลำดับด้วยฮีมาทอกซิลิน 0.1 เปอร์เซ็นต์ในเอทานอล 95 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา ~ 25 วินาที และอีโอซิน 0.5 เปอร์เซ็นต์ในเอทานอล 95 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา ~ 3 วินาที และล้างในน้ำกลั่นสองครั้งหลังจากนั้น แต่ละคราบ เนื้อเยื่อถูกทำให้แห้งเป็นเวลา 1 นาทีในเอทานอล 95 เปอร์เซ็นต์ เอทานอล 100 เปอร์เซ็นต์ และล้างด้วยไซลีน 100 เปอร์เซ็นต์ จากนั้นปิดฝาด้วย Permount สไลด์ถูกถ่ายภาพโดยใช้กล้องสี (Q Imaging, MBF Biosciences) ในกล้องจุลทรรศน์ Zeiss เดียวกันและซอฟต์แวร์การจัดหา MBF ผู้ทดลองมองไม่เห็นจีโนไทป์ของหนูที่ส่วนต่างๆ ถูกตรวจสอบ และลำดับของการตรวจสอบถูกสอดแทรกสำหรับการวัดทางเนื้อเยื่อวิทยาทั้งหมด

4.7 การวัดการไหลของไซโตเมทรี

การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีของเลือดและเซลล์ไทมัสถูกดำเนินการโดยการย้อมสีด้วยแอนติบอดีต้านหนูที่จำเพาะ∶CD4, CD8, CD3, CD44 และ CD25 โดยสังเขป ตัวอย่างเลือดครบส่วน (50 ไมโครเมตร) ถูกย้อมโดยใช้แอนติบอดีที่ติดฉลากเรืองแสง จากนั้นเซลล์เม็ดเลือดแดงจะถูกสลายโดยใช้สารละลาย BD lysing ในขณะที่เซลล์เม็ดเลือดขาวที่มีชีวิตถูกย้อมโดยใช้สีย้อมที่มีชีวิตได้ โหระพาถูกแยกออกจากกันทางกลไก เซลล์ไทมัส 1 ถึง 2 ล้านเซลล์ถูกย้อมในทำนองเดียวกันโดยใช้แอนติบอดีจำเพาะสำหรับ CD4, CD8, CD44 และ CD25 การวิเคราะห์เซลล์เม็ดเลือดขาวหรือตัวอย่างต่อมไทมัสที่ย้อมด้วยภูมิคุ้มกันได้ดำเนินการโดยใช้ FACS ARIA l และวิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ซอฟต์แวร์ FlowJo ตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ (Sanghez et al. 2017)

4.8 ไบโอตตะวันตก

สารสกัดจากโปรตีน (เซลล์/เนื้อเยื่อ) ถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในการทดสอบด้วย radioimmunoprecipitation assay (RIPA) ไลซิสบัฟเฟอร์ (150 mM NaCl,1 เปอร์เซ็นต์ Nonidet P-40 [NP-40],0 .5 เปอร์เซ็นต์ deoxycholate,0.1 เปอร์เซ็นต์ SDS,50 mM Tris, pH 8.0) ที่มีสารยับยั้งโปรตีเอส (10 ug/ml AEBSF, 10 ug/ml leupeptin, 5 ug/ml pepstatin, 5 ug/ml chymotrypsin, อะโปรตินิน 10 ก./มล.) สารสกัดโปรตีนถูกโซนิเคตแล้วอัดเป็นเม็ดโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 13,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 15 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส การทดสอบโปรตีน BCA ถูกใช้เพื่อหาปริมาณความเข้มข้นของโปรตีน ตัวอย่างที่มีปริมาณโปรตีนเท่ากัน 50 ถึง 100 ไมโครกรัมต่อเลนถูกแยกออกโดยใช้เจลพรีคาสต์ TGX แบบไล่ระดับ 4 ถึง 12 เปอร์เซ็นต์ BioRad จากนั้นถ่ายโอนโดยระบบ TransBlot Semi-Dry BioRad โดยใช้ชุดถ่ายโอนไนโตรเซลลูโลส จุดที่ถูกถ่ายโอนถูกย้อมด้วยสีย้อม Ponceau S เพื่อให้บรรจุโปรตีนเท่ากัน จากนั้นล้างและปิดกั้นด้วยนมแห้งที่ไม่มีน้ำมัน 5 เปอร์เซ็นต์ใน TBST เป็นเวลา 60 นาทีที่อุณหภูมิห้อง แอนติบอดีปฐมภูมิถูกบ่มด้วยการเขย่าข้ามคืนที่ 4 องศา บล็อตถูกโพรบสำหรับแอนติบอดีต่อไปนี้: ATM (D2E2)Rabbit mAb Cell Signaling, ที่ 1:1000 การเจือจาง, -Actin (D6A8)Rabbit mAb Cell Signaling, GAPDH (D16H11)Rabbit mAb Cell Signaling ตามด้วยฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดสที่เหมาะสม ( HRP) แอนตี้กระต่ายรอง แอนตี้เมาส์ เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หลังจากล้างด้วย TBST หลายครั้ง การแสดงออกของโปรตีนถูกตรวจพบโดยซับสเตรตเคมีลูมิเนสเซนซ์ Radiance Plus โดยใช้ Azure c400 และระบบภาพ BioRad ChemiDoc การวิเคราะห์เดนซิโตเมตริกของ ATM ดำเนินการโดยใช้ ImageJ ทำการทดลองด้วยการจำลองแบบทางเทคนิค 2 ครั้งและ 2-3 ครั้งตามที่ระบุไว้

4.9 การประเมินทางสถิติ

จำนวนสัตว์ที่เลือกสำหรับแต่ละกลุ่มขึ้นอยู่กับการวิเคราะห์กำลังก่อนโดยใช้ GPower v3.1 ตามขนาด 0.5 กำลัง 0.8 และขนาดผลกระทบที่ประเมินจากข้อมูลเบื้องต้น หรือการศึกษาก่อน เราใช้ทั้งวิธีพาราเมตริก (1-และ 2-way ANOVA) สำหรับวิธีทางสถิติแบบกระจายปกติและไม่อิงพารามิเตอร์ (Kruskal Wallace) สำหรับข้อมูลช่วงเวลาเพื่อทดสอบความแตกต่างระหว่างกลุ่ม ตามด้วยการทดสอบการเปรียบเทียบพหุคูณแบบคู่ตามที่ระบุไว้ใน ข้อความ. ค่าผิดปกติสำหรับข้อมูลภูมิคุ้มกันในรูปที่ 6 และ 7 ถูกแยกออกจากวิธี ROUT (Q=2 เปอร์เซ็นต์ ) การวิเคราะห์เฉพาะที่ใช้สำหรับชุดข้อมูลแต่ละชุดจะระบุไว้ในคำอธิบายภาพแต่ละภาพ สำหรับตัวเลขทั้งหมด: ns ไม่มีนัยสำคัญ,*p น้อยกว่าหรือเท่ากับ 0.05,** p<0.01,***><0.001,****><0.0001. data="" are="" reported="" as="" mean="" ±="" sem="" and="" box="" and="" whisker="" plots="" indicate="" the="" minimum,="" first="" quartile,="" median,="" third="" quartile,="" and="" maximum="" data="" values.="" all="" figures="" and="" statistical="" analyses="" were="" completed="" using="" excel="" (microsoft="" 360)="" or="" prism="" v8="" and="" 9="">