วัสดุชีวภาพต่อต้านอนุมูลอิสระจากธรรมชาติชนิดใหม่จากใบ Cinnamomum Osmophloeum Kanehira ยับยั้งการสร้างเม็ดสีและป้องกันความเสียหายของ DNA

ติดต่อ: ali.ma@wecistanche.com

Yung-Shu Ho 1, Jane-Yii Wu 1,* และ Chi-Yue Chang 2

เชิงนามธรรม:Cinnamomoum ​​osmophloeum Kanehira (COK) เป็นต้นไม้พื้นเมืองในไต้หวัน องค์ประกอบทางเคมีสารต้านอนุมูลอิสระกิจกรรม เห็ดไทโรซิเนสตรวจสอบการยับยั้ง การสังเคราะห์เมลานินการปราบปราม และการป้องกันความเสียหายของ DNA ของไฮโดรซอลจากใบ COK โดยการกลั่นด้วยไอน้ำ เราทำการทดสอบ 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical scavenging, คีเลตไอออนของโลหะ, พลังงานรีดิวซ์ และการทดสอบความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระเทียบเท่า Trolox (TEAC) และกำหนดความสัมพันธ์ระหว่างปริมาณฟีนอลิกทั้งหมดและกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระ ผลการวิจัยพบว่าคุณสมบัติต้านออกซิเดชันของ COK hydrosol มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับปริมาณฟีนอลของพวกมัน นอกจากนี้ องค์ประกอบหลักของ hydrosol เช่น cinnamaldehyde และ benzaldehyde มีฤทธิ์ต้านไทโรซิเนสที่ขึ้นกับขนาดยาต่อกิจกรรม monophenolase และ diphenolase การวิเคราะห์ GC-MS พบว่าส่วนประกอบที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่สำคัญของ hydrosol คือ trans-cinnamaldehyde (ร้อยละ 87.7) benzaldehyde (7.0 เปอร์เซ็นต์ ) และ cinnamyl acetate (5.3 เปอร์เซ็นต์) นอกจากนี้ เราพบว่าไฮโดรโซลที่มีเบนซาลดีไฮด์มีศักยภาพมากกว่าซินนามัลดีไฮด์บริสุทธิ์ และช่วยเพิ่มไทโรซิเนสฤทธิ์ยับยั้งไฮโดรโซล ในการวิเคราะห์จลนศาสตร์ แผนภาพ Lineweaver–Burk และการจำลองแสดงให้เห็นว่า COK hydrosol เป็นตัวยับยั้งชนิดผสม นอกจากนี้ เราพบว่าปริมาณ COK hydrosol ในปริมาณต่ำมากกด - การสังเคราะห์ฮอร์โมนกระตุ้นเมลาโนไซต์ที่กระตุ้นการสังเคราะห์ของปัจจัยการถอดรหัสที่เกี่ยวข้องกับไมโครพทาลเมีย ส่งผลให้การสังเคราะห์เมลานินในเซลล์ B16-F10melanoma ลดลง ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการผลิตไฮโดรซอลจากใบ COK โดยใช้การกลั่นด้วยไอน้ำอาจให้แหล่งที่ปลอดภัยและมีประสิทธิภาพผิว-ไวท์เทนนิ่งตัวแทนสำหรับการใช้เครื่องสำอางและยาด้วยสารต้านอนุมูลอิสระ, ต่อต้านไทโรซิเนส, ต่อต้านการสร้างเม็ดสี, และกิจกรรมปกป้องดีเอ็นเอ

คำสำคัญ: สารต้านอนุมูลอิสระกิจกรรม; Cinnamomoum ​​osmophloeum; ไฮโดรซอล;ไทโรซิเนสกิจกรรมการยับยั้ง;ไวท์เทนนิ่ง; ผลการป้องกันความเสียหายของดีเอ็นเอ

คลิกเพื่อCistancheต้นกำเนิดและผลิตภัณฑ์เพื่อผิวขาวใส

1. บทนำ

ความผิดปกติของผิวหนังของมนุษย์ เช่น เลนติโก จุดด่างอายุ ฝ้า และเมลาโนมาร้าย เชื่อมโยงกับการสร้างและการสะสมของเมลานิน [1] การยับยั้ง tyrosinases และ melanogenesiscan ช่วยบรรเทาอาการผิดปกติทางผิวหนังและกลุ่มอาการรอยดำ นอกจากนี้ ตลาดทั่วโลกสำหรับสารฟอกสีผิวและผลิตภัณฑ์เครื่องสำอางได้ขยายตัวขึ้นเมื่อเร็วๆ นี้ เนื่องจากสีผิวที่อ่อนกว่าเป็นที่ต้องการของคนผิวคล้ำหลายคน [2] จึงมีประสิทธิภาพและปลอดภัยไทโรซิเนสและสารยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินถือว่ามีความสำคัญต่อการป้องกันโรคผิวคล้ำและปัญหาสุขภาพอื่นๆ ที่เกี่ยวข้องกับเมลานิน [3,4] นอกจากนี้ สารพิษต่อสิ่งแวดล้อมยังทำให้เกิดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันต่างๆ ต่อมนุษย์ และสามารถผลิตไนโตรเจนชนิดปฏิกิริยาหรือชนิดออกซิเจนปฏิกิริยา (ROS) ได้ [5] อนุมูลอิสระที่มากเกินไปและ ROS เกี่ยวข้องกับเส้นทางส่งสัญญาณการอักเสบ ซึ่งในที่สุดจะนำไปสู่ความเสียหายของเซลล์ การแก่ชรา ความผิดปกติของระบบประสาท โรคเบาหวาน หลอดเลือด การอักเสบ โรคหัวใจและหลอดเลือด มะเร็ง และการสร้างเม็ดสี [6,7] งานวิจัยหลายชิ้นแนะนำว่าสารต้านอนุมูลอิสระสามารถยับยั้งความเสียหายจากแรงดันออกซิเดชันโดยทำหน้าที่เป็นตัวกำจัดอนุมูลอิสระหรือ ROSscavengers [7,8] นอกจากนี้ สารยับยั้งการสร้าง ROS และ ROS scavengers อาจลดการผลิตเม็ดสีเมลานิน [9] โดยเฉพาะไทโรซิเนสเป็นเอ็นไซม์สำคัญที่กระตุ้นสเต็ปจำกัดอัตราในสองขั้นตอนแรกระหว่างกระบวนการสังเคราะห์เมลานิน [10] และการปรับลดไทโรซิเนสเป็นเป้าหมายสำคัญในการป้องกันการเจ็บป่วยของผิวหนังและการผลิตผิว-ไวท์เทนนิ่งสาร [11] ดังนั้น การพัฒนาสารต้านอนุมูลอิสระตามธรรมชาติที่ยับยั้งไทโรซิเนสอย่างมีประสิทธิภาพสำหรับการป้องกันหรือการรักษารอยดำที่ไม่พึงประสงค์ของผิวหนังและการป้องกันความเสียหายของดีเอ็นเอจึงเป็นสิ่งจำเป็น

Cinnamomum osmophloeum Kanehira (COK) เป็นอบเชยพันธุ์พื้นเมืองของไต้หวันที่มีการใช้เป็นยาสมุนไพรจีนหลายชนิด สารประกอบเชิงรุกของน้ำมันหอมระเหย COK แสดงศักยภาพที่ดีเยี่ยมในการต้านเชื้อแบคทีเรียทางเภสัชวิทยา [12] แม้ว่าการศึกษาก่อนหน้านี้เกี่ยวกับสารสกัดแอลกอฮอล์ของใบ COK แสดงให้เห็นถึงฤทธิ์ต้านไทโรซิเนส แต่การศึกษาเกือบทั้งหมดเหล่านี้มุ่งเน้นไปที่สารสกัดจากเอธานอลหรือน้ำมันหอมระเหยจาก COK นอกจากนี้ ยังไม่มีรายงานการศึกษาเชิงปริมาณและเป็นระบบสารต้านอนุมูลอิสระคุณสมบัติ,ไทโรซิเนสฤทธิ์ยับยั้งและยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินด้วยสารสกัดจากน้ำ (hydrosol) ของใบ COK ดังนั้น การศึกษานี้จึงได้ดำเนินการเพื่อตรวจสอบผลของ COK hydrosol ต่อความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและการสร้างเม็ดสีในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16F10 และป้องกันความเสียหายของดีเอ็นเอ การศึกษานี้เป็นรายงานรายละเอียดฉบับแรกเกี่ยวกับองค์ประกอบทางเคมีและสารต้านอนุมูลอิสระ,การยับยั้งไทโรซิเนส, การยับยั้งการสร้างเม็ดสี และ DNA ทำลายกิจกรรมการป้องกันของไฮโดรโซลจากใบ COK

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. สารเคมีและแอนติบอดี

เห็ดไทโรซิเนส, บิวทิเลตไฮดรอกซีโทลูอีน (BHT), -โทโคฟีรอล, 6-ไฮดรอกซี-2,5,7,8-เตตระเมทิลโครแมน-2-กรดคาร์บอกซิลิก (โทรลอกซ์), กรดไตรคลอโรอะซิติก (TCA), แกลลิก กรด, โพแทสเซียมเฟอริไซยาไนด์, เฟอริกคลอไรด์, เฟอร์รัสคลอไรด์, เฟอร์โรซีน, 1,1-ไดฟีนิล-2-พิคริลไฮดราซิล (DPPH),2,20-อะซิโน-บิส-3-เอทิลเบนไทอะโซลีน{{14} } กรดซัลโฟนิก (ABTS), รีเอเจนต์ Folin–Ciocalteu, L-tyrosine และ L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) ได้จาก Merck Co. (Darmstadt, Germany) สารเคมีทั้งหมด และตัวทำละลายที่ใช้ในการศึกษาเป็นเกรดวิเคราะห์หรือโครมาโตกราฟีของเหลวที่มีประสิทธิภาพสูง แอนติบอดีที่ต่อต้าน microphthalmia-associated transcription factor (MITF) และ -actin ได้มาจาก Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) และ Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA) ตามลำดับ

2.2. การเตรียมไฮโดรโซล: การสกัดจากใบ COK โดยใช้การกลั่นด้วยไอน้ำ

ใบไม้จากต้น COK อายุ 13-ปีในไต้หวัน (No.186, Yongping Road, Zhongliao Township,Nantou County, Taiwan) ถูกทำให้แห้งด้วยอากาศ ใช้เครื่องบดสแตนเลส จากนั้นบดใบให้เป็นผงละเอียด (น้อยกว่า 10 เมช) และเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้อง ถัดไป สกัดผงใบ COK แห้ง 3.5 กก. โดยใช้การกลั่นด้วยไอน้ำเป็นเวลา 4 ชั่วโมง กระบวนการนี้ซ้ำแล้วซ้ำอีกสี่ครั้ง โดยใช้สุญญากาศ สารสกัดถูกกรอง จากนั้น ใช้เครื่องระเหยแบบหมุน ได้สารสกัดแห้ง (รูปที่ 1) ในที่สุดสารสกัดก็ระเหยจนได้น้ำหนักสุดท้าย

2.3. การวิเคราะห์แก๊สโครมาโตกราฟี/แมสสเปกโตรเมทรี (GC/MS) ของไฮโดรโซล

เครื่องมือ Thermo-GC/MS ที่มี THERMO WaxMS cross-linked 5 เปอร์เซ็นต์ phenyl- 95 เปอร์เซ็นต์ methylpolysiloxane capillary column (60 ม. × 0.25 mm id, ความหนาของฟิล์ม {{1 0}}.25 µm) ถูกใช้ด้วยฮีเลียมในฐานะก๊าซพาหะที่อัตราการไหลคงที่ 1.0 มล./นาที คอลัมน์ถูกคงไว้ที่ 200 ◦C เป็นเวลา 5 นาทีหลังการฉีด และจากนั้นถูกให้ความร้อนที่ 5 ◦C/นาที ถึง 260 ◦C น้ำมันหอมระเหยบริสุทธิ์ (1.0 มล.) ถูกฉีดด้วยอัตราส่วนการแยกเป็น 1:100 อุณหภูมิของหัวฉีด สายส่ง และแหล่งกำเนิดไอออนคือ 250 ◦C,250 ◦C และ 200 ◦C ตามลำดับ การตรวจจับ MS ดำเนินการในโหมดกระทบอิเล็กตรอนที่พลังงาน 70 eVionisation และกระแสไอออไนเซชัน 60 µA; เครื่องมือนี้ทำงานในโหมดการได้มาซึ่งการสแกนแบบเต็มในช่วง 50–350 amu สารประกอบถูกระบุโดยการเปรียบเทียบเวลาการกักเก็บและดัชนีของพีคโครมาโตกราฟีกับของมาตรฐานอ้างอิงที่แท้จริง ฉีดภายใต้สภาวะเดียวกัน รูปแบบการกระจายตัวของ MS ถูกเปรียบเทียบกับของสารประกอบบริสุทธิ์ และฐานข้อมูลแมสสเปกตรัมถูกค้นหาโดยใช้ฐานข้อมูล MSspectral ของสถาบันมาตรฐานและเทคโนโลยีแห่งชาติ (NIST) [13]

2.4.เนื้อหาฟีนอลิกทั้งหมด

ปริมาณฟีนอลิกทั้งหมด (TPC) ของสารสกัดถูกกำหนดโดยใช้ Folin–Ciocalteu assayas ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [14] โดยสังเขป ตัวอย่างไฮโดรซอล (100 ไมโครลิตร) ถูกผสมด้วย 100 ไมโครลิตรของอะลิควอตของสารทำปฏิกิริยา Folin–Ciocalteu (10-การเจือจางเท่า) และส่วนลิคอต 10 ไมโครลิตรของโซเดียม คาร์บอเนต (10 เปอร์เซ็นต์ , น้ำหนัก/ปริมาตร) หลังจากการจัดเก็บเป็นเวลา 30 นาที วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 735 นาโนเมตร TPCs แสดงเป็นกรดแกลลิกเทียบเท่า (GAE) ในหน่วยมิลลิกรัมต่อวัสดุสด 100 กรัม

2.5. DPPH Free Radical Scavenging Assays

ตามที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ โดยใช้การสอบวิเคราะห์ DPPH กิจกรรมการกำจัดอนุมูลอิสระของไฮโดรซอลถูกกำหนดไว้ [15] โดยมีการดัดแปลง โดยย่อ การเจือจางที่แปรผันของตัวอย่างไฮโดรซอล (75 ไมโครลิตรในสามเท่า) ถูกเติมไปยังส่วนลิคอต 150 ไมโครลิตรของ DPPH (0.02 ก./100 มล.) และการดูดกลืนแสงถูกวัดที่ 517 นาโนเมตร หลังจาก 30 นาที BHT ถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก (0.5 มก./มล. เอทานอล) กิจกรรมการกำจัดสารที่รุนแรงถูกแสดงเป็นอัตราส่วนการยับยั้ง ( เปอร์เซ็นต์ ) โดยใช้สมการต่อไปนี้:

อัตราส่วนการยับยั้ง ( เปอร์เซ็นต์ )=[1 − (A/B)] × 100 เปอร์เซ็นต์

โดยที่ A คือค่าการดูดกลืนแสงของตัวอย่างไฮโดรโซล และ B คือการดูดกลืนแสงของสารเปล่า

2.6. ความเข้มข้นของการยับยั้งเศษส่วน

การสอบวิเคราะห์ความเข้มข้นของตัวยับยั้งแบบเศษส่วน (FIC) ถูกดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [16] ด้วยการดัดแปลง โดยย่อ, FeSO4 (20 ไมโครลิตร; 2 มิลลิโมลาร์) ถูกผสมกับการเจือจางที่แตกต่างกันของตัวอย่างไฮโดรซอล (200 ไมโครลิตร) หลังจากการเติมเฟอร์โรซีน (40 ไมโครลิตร; 5 มิลลิโมลาร์), ปฏิกิริยาถูกปล่อยให้ดำเนินไปเป็นเวลา 10 นาทีจากนั้นจึงวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 562 นาโนเมตร นอกจากนี้ 0.5 มก./มล. เอทิลีน ไดเอมีน เตตระอะซิติก แอซิด (EDTA) ยังถูกใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก เปอร์เซ็นต์การยับยั้งของเฟอร์โรซีน-Fe2 บวกกับรูปแบบเชิงซ้อนถูกคำนวณโดยใช้สูตรต่อไปนี้:

เอฟเฟกต์คีเลตโลหะ ( เปอร์เซ็นต์ )=[1 − (A/B)] × 100 เปอร์เซ็นต์

โดยที่ A คือค่าการดูดกลืนแสงของตัวอย่างไฮโดรโซล และ B คือการดูดกลืนแสงของสารเปล่า

2.7. การทดสอบการลดกำลังไฟฟ้า

กำลังรีดิวซ์ของ COK hydrosol ถูกกำหนดโดยการติดตามการลดลงของ Fe3 บวก toFe2 plus ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [17] โดยมีการปรับเปลี่ยน โดยสังเขป ถึง 50 ไมโครลิตร การเจือจางของไฮโดรโซล 50-ไมโครลาลิคอตของบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (pH 6.6, 200 มิลลิโมลาร์) และ 50-μL ลิควอตของโพแทสเซียมเฟอริไซยาไนด์ (1 เปอร์เซ็นต์ , น้ำหนัก/ปริมาตร) เพิ่ม หลังจากการบ่มที่ 50 ◦C เป็นเวลา 20 นาที, 50 µL ของ TCA (10 เปอร์เซ็นต์ , w/v) ถูกเติม; และปั่นส่วนผสมด้วยการหมุนเหวี่ยงที่ 9,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 3 นาที สุดท้าย สารลอยลอยเหนือตะกอน 50 ไมโครลิตรถูกผสมกับน้ำกลั่น 50 ไมโครลิตรและเฟอริก คลอไรด์ 50 ไมโครลิตรในน้ำ (0.1 เปอร์เซ็นต์, น้ำหนัก/ปริมาตร) และค่าการดูดกลืนแสงถูกวัดที่ 700 นาโนเมตรเทียบกับสิ่งว่างเปล่าหลังจากเวลาทำปฏิกิริยา 10 นาที กลุ่มควบคุมเชิงบวกที่ใช้คือบิวทิเลตไฮดรอกซีโทลูอีน (BHT) และ -โทโคฟีรอล

2.8. การทดสอบความจุสารต้านอนุมูลอิสระเทียบเท่า Trolox (TEAC)

สารต้านอนุมูลอิสระกิจกรรมของ COK hydrosol ได้รับการประเมินตามวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [15,18] โดยมีการดัดแปลง โดยสรุป สารละลายไอออนเรดิคัลไอออนของ ABTS เข้มข้น (ABTS• บวก ) ถูกเจือจางในน้ำเกลือที่บัฟเฟอร์ด้วยฟอสเฟต (pH 7.4) จนถึงค่าดูดกลืนแสงสุดท้ายที่ 0.80 ± 0.05 ที่ 734 นาโนเมตร หลังจากผสมตัวอย่าง (0.02 มล.) กับ ABTS บวก 1 มล. บวกสารละลาย มีการลดลงในการดูดกลืนแสงที่ 734 นาโนเมตรหลังจาก 5 นาที Trolox ถูกใช้เป็นมาตรฐาน และกิจกรรมของไฮโดรโซลแสดงเป็น TEAC โดยการวาดกราฟเส้นกราฟของการปรับเทียบ Trolox ค่า TEAC ที่เทียบเท่าโมลของตัวอย่างไฮโดรซอลถูกคำนวณตามค่าการดูดกลืนแสงของสารละลาย Trolox ที่ลดลง ใช้ BHT และ -tocopherol เป็นกลุ่มควบคุมเชิงบวก

2.9. ผลของ Hydrosol ต่อการยับยั้ง Tyrosinase เห็ด

เห็ดไทโรซิเนสกิจกรรมถูกวัดโดยใช้การวิเคราะห์สเปกโตรโฟโตเมตริกตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยมีการปรับเปลี่ยน [19] โดยย่อ, 20 ไมโครลิตร L-ไทโรซีนหรือ 20 ไมโครลิตร L-DOPA ใน PBS (pH 6.8; 80 ไมโครลิตร) และ80 ไมโครลิตร PBS ที่มีหรือไม่มีไฮโดรซอลทดสอบถูกเติมเข้าไปในไมโครเพลท 96-หลุม, และจากนั้นเห็ดไทโรซิเนส 20 ไมโครลิตร (100 U/ มล.) ถูกเติมเข้าไป หลังจากผสมและบ่มที่ 37 ◦C เป็นเวลา 20 นาที การผลิตโดปาโครม (หรือการบริโภค) ในของผสมปฏิกิริยาถูกกำหนดหาที่การดูดกลืนแสง 475 นาโนเมตร กรดโคจิกซึ่งยับยั้งไทโรซิเนสถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวก เปอร์เซ็นต์การยับยั้งไทโรซิเนสคำนวณได้ดังนี้:

การยับยั้ง ( เปอร์เซ็นต์ ) ≡ {[(A - B) − (C - D)]/(A - B)} × 100 เปอร์เซ็นต์

โดยที่ A ระบุการดูดกลืนด้วยเอนไซม์ในกรณีที่ไม่มีตัวอย่างไฮโดรซอล B หมายถึงการดูดกลืนโดยไม่มีเอนไซม์หรือตัวอย่างไฮโดรซอล C หมายถึงการดูดกลืนด้วยเอนไซม์ และไฮโดรโซลและไดดิเคตการดูดกลืนแสงโดยไม่มีเอนไซม์แต่มีไฮโดรซอล นอกจากนี้เรายังคำนวณ 50 เปอร์เซ็นต์ไทโรซิเนสความเข้มข้นในการยับยั้ง (IC50) ของตัวอย่างที่ยับยั้งการทำงานของไทโรซิเนส 50 เปอร์เซ็นต์

2.10. การวิเคราะห์จลนศาสตร์ของการยับยั้งไทโรซิเนสของเห็ด

ของผสมปฏิกิริยาประกอบด้วย 20 ไมโครลิตรของ L-ไทโรซีนหรือ L-DOPA (0.25 มก./มล.) เป็นสารตั้งต้น, 100 ไมโครลิตรของเห็ดไทโรซิเนส (20 หน่วย/มล.) ใน 0.2 โมลาร์ของโซเดียม ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ( pH 6.8) และ 80 µL ของตัวอย่างไฮโดรโซลแต่ละตัวในปริมาตรรวม 200 µL การสอบวิเคราะห์ถูกดำเนินการที่ 25 ◦C และจลนพลศาสตร์การยับยั้งของตัวอย่างไฮโดรซอลแต่ละตัวด้วยไทโรซิเนสวิเคราะห์โดยใช้พล็อต Lineweaver–Burk การแลกเปลี่ยนซึ่งกันและกันถูกใช้เพื่อความสมดุลอย่างรวดเร็วจากการยับยั้งแบบไม่มีการแข่งขันแบบผสม ตามที่แสดงออกในสมการ (1) [20] ค่า Ki สำหรับตัวอย่างไฮโดรซอลถูกประมาณจากการจำลองความชัน (สมการ (2)) ค่า Ki สำหรับไฮโดรซอลถูกคำนวณจากการจำลองจุดตัดแกน 1/v (สมการ (3))

โดยที่ Vmax คือความเร็วสูงสุดของไทโรซิเนสกิจกรรม Ksis ค่าคงที่การแยกตัวของสารตั้งต้น (S) จากสารตั้งต้นของเอนไซม์-สารตั้งต้น (ES), Ki คือค่าคงที่การแตกตัวของตัวยับยั้ง[I] จากสารเชิงซ้อนของเอนไซม์-ตัวยับยั้ง และ Ki คือค่าคงที่การแตกตัวของตัวยับยั้งจากเอนไซม์-สารตั้งต้น คอมเพล็กซ์สารยับยั้ง (ESI)

2.11. การทดสอบการเพาะเลี้ยงเซลล์และความมีชีวิตของเซลล์

B16-F10 เซลล์เมลาโนมา (BCRC60031) ได้รับมาจาก Bioresource Collection and ResearchCenter (BCRC), ไต้หวัน เซลล์ B16-F10 ถูกเพาะเลี้ยงในตัวกลางของ Eagle ที่ได้รับการดัดแปลงของ Dulbecco (Gibco, California, USA) ที่มี FBS 10 เปอร์เซ็นต์ที่ 37 ◦C ใน CO2 5 เปอร์เซ็นต์ โดยทริปซิไนเซชัน เซลล์จะถูกเก็บเกี่ยว ความอยู่รอดของเซลล์ถูกวัดโดยใช้การสอบวิเคราะห์ 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-อิล)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) ตามที่บรรยายโดย Lee [15 ].

2.12. สารบัญเซลลูล่าร์เมลานิน

ปริมาณเมลานินถูกวัดโดยใช้วิธีการที่ลีอธิบาย [15]. โดยสังเขป เซลล์ B16-F10 ถูกเพาะเลี้ยงในเพลต 6-หลุมที่ความหนาแน่น 0.8 × 105 เซลล์ต่อหลุมและถูกบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นเซลล์จะถูก รักษาด้วย 100-นาโนโมลาร์ -ฮอร์โมนกระตุ้นเมลาโนไซต์ ( -MSH), กรดโคจิก (กลุ่มควบคุมเชิงบวก) และไฮโดรซอลที่ความเข้มข้นต่างๆ เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากการล้างสองครั้งด้วย PBS เซลล์ถูกไลซิดินบัฟเฟอร์ที่มีโซเดียม ฟอสเฟต 100 มิลลิโมลาร์ (pH 6.8) ไทรทัน X-100 เปอร์เซ็นต์ 1 เปอร์เซ็นต์ และฟีนิลมีเทนซัลโฟนิลฟลูออไรด์ 0.1 มิลลิโมลาร์ และเก็บไว้ที่ −80 ◦C เป็นเวลา 30 นาที หลังจากรวบรวมเซลล์ เม็ดเซลล์ถูกละลายใน 1N ​​NaOH ที่มี DMSO 10 เปอร์เซ็นต์ที่ 65 ◦C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจากนั้น วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 405 นาโนเมตร

2.13. Western Blot

เซลล์ถูกสลายตามที่บรรยายไว้ในส่วนที่ 2.11 และอยู่ภายใต้ Western blotting สำหรับโปรตีน MITF โดยใช้แอนติบอดีต้าน MITF

2.14. การทดสอบการปกป้องดีเอ็นเอ

ความเสียหายของ DNA ออกซิเดชันถูกกำหนดโดยการแปลง DNA นีโอพลาสมิด supercoiledpCI แบบวงกลมให้อยู่ในรูปแบบที่มีลักษณะเป็นวงกลมหรือที่เสื่อมสภาพเพิ่มเติมโดยใช้วิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [21,22] โดยมีการดัดแปลงเล็กน้อย ของผสมปฏิกิริยาของ 20 µL มี 2.5 µL ของ supercoiledpCI neo (150 ng/µL), 10 µL ของสารละลายปฏิกิริยาเฟนตันที่มีไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 30 mM, 100-µMferric chloride และ 100 กรดแอสคอร์บิก µM ในบัฟเฟอร์ Tris-HCl 20 มิลลิโมลาร์ (pH 7.6) และไฮโดรซอล 5µL(0.3325–5.32 มก./มล.) หรือเควอซิทิน (กลุ่มควบคุมเชิงบวก 250 ไมโครกรัม/มล.) ของผสมของปฏิกิริยาถูกบ่มที่37 ◦C เป็นเวลา 30 นาที และรูปแบบพลาสมิด DNA ถูกแยกบนเจลอะกาโรส 0.7 เปอร์เซ็นต์และถูกย้อมโดยใช้SafeView™ (Applied Biological Materials (ABM) Inc., ริชมอนด์, แคนาดา)

เพื่อกึ่งปริมาณสารต้านอนุมูลอิสระกิจกรรมของสารสกัด ปริมาณของรูปแบบ supercoiled และ nicked ของ pCI neo ถูกหาปริมาณโดยใช้เครื่องมือ AlphaImager Mini (proteinsimple) และวัดความเข้มของแถบบน agarose gels โดยใช้ซอฟต์แวร์ Gelpro ในกลุ่มควบคุมเชิงลบและเชิงบวก pCI neoplasmid ถูกบ่มเพียงอย่างเดียวและด้วยส่วนผสมของสารทำปฏิกิริยาเฟนตัน ตามลำดับ ข้อมูลแสดงเป็นปริมาณของ DNA ซุปเปอร์คอยล์ที่สัมพันธ์กับปริมาณนั้น (100 เปอร์เซ็นต์ ) ในกลุ่มควบคุมเชิงลบ ฤทธิ์ป้องกันของสารสกัดคำนวณจากปริมาณของพลาสมิด DNA แบบ supercoiled และ nicked โดยใช้สมการต่อไปนี้ [23]:

การป้องกันพลาสมิดซุปเปอร์คอยล์ ( เปอร์เซ็นต์ ) =ความเข้มของรูปแบบซุปเปอร์คอยล์pCI neo DNA แถบความเข้ม × 100

การป้องกันพลาสมิดที่มีจุดซ่อนเร้น ( เปอร์เซ็นต์ ) =ความเข้มของรูปแบบจุดแข็ง pCI neo DNA band ความเข้ม × 100

2.15. การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) ความแตกต่างระหว่างการรักษาถูกระบุโดยใช้การทดสอบ t ของนักเรียนหรือ ANOVA ตามด้วยการทดสอบของ Scheffe ความแตกต่างถือว่ามีนัยสำคัญเมื่อ p <>

3. ผลลัพธ์และการอภิปราย

3.1. การระบุสารประกอบระเหยใน Hydrosol

วิเคราะห์เนื้อหาของไฮโดรโซลโดยใช้ GC/MS ส่วนประกอบถูกระบุตามเวลาการกักเก็บของมาตรฐานและปริมาณถูกกำหนดหาจากพื้นที่พีคของตัวชะ (รูปที่ 2) ตามที่สรุปไว้ในรูปที่ 2A–D, ทรานส์-ซินนามัลดีไฮด์, เบนซาลดีไฮด์และซินนามิล อะซิเตตเป็นสารประกอบหลักใน COK hydrosol และมีอยู่ที่ 87.7 เปอร์เซ็นต์ , 7.0 เปอร์เซ็นต์ และ 5.3 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ ก่อนหน้านี้พบ Eugenol ในน้ำมันหอมระเหยจาก C. verum ที่ 7.29 เปอร์เซ็นต์ [24] แต่ไม่พบใน COK hydrosol ปัจจุบัน (รูปที่ 2) ความแตกต่างในกระบวนการสกัดและวิธีการทดสอบอาจส่งผลต่อความแตกต่างในเนื้อหาซินนามัลดีไฮด์ของน้ำมันหอมระเหย C. cassia [25]

3.2. คุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระของไฮโดรโซลจากใบ COK

3.2.1. กิจกรรมกวาดล้าง DPPH Radical

ในรูปที่ 3A ฤทธิ์กำจัดอนุมูลอิสระของ DPPH ของไฮโดรโซลตั้งแต่ 1.06×10−2 ถึง 5.32×10−1 มก./มล. อยู่ระหว่าง 5.04 เปอร์เซ็นต์ ± 0.96 เปอร์เซ็นต์ และ 41.76 เปอร์เซ็นต์ ± 2.50 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ถึงปริมาณรังสีที่ขึ้นอยู่กับปริมาณรังสีโดย COK hydrosol ในการเปรียบเทียบ กลุ่มควบคุมที่เป็นบวก BHT และ -tocopherolscavenged 94.32 เปอร์เซ็นต์ ± 0.08 เปอร์เซ็นต์ และ 93.82 เปอร์เซ็นต์ ± 0.13 เปอร์เซ็นต์ ของ DPPH reactive radicals ตามลำดับ ที่ 0.5 มก./มล. กิจกรรมการขจัดอนุมูลอิสระของ COK hydrosol เป็นไปได้มากที่สุดเนื่องจาก cinnamaldehyde (รูปที่ 2 ) การศึกษาจำนวนมากแสดงให้เห็นว่าฟีนอลและฟลาโวนอยด์ป้องกันการก่อตัวของอนุมูล DPPH โดยการบริจาคอะตอมไฮโดรเจน ดังนั้น กิจกรรมการกำจัดอนุมูล DPPH ของสายพันธุ์ Cinnamomum อาจสะท้อนการกระทำในฐานะผู้ให้ไฮโดรเจน [26,27]

3.2.2. คีเลชั่นโลหะไอออน

เราประเมิน Fe2 บวกความสามารถในการจับของไฮโดรโซลที่ 1.06 × 10-3 และ 5.32 × 10-1 มก./มล. ดังแสดงในรูปที่ 3A คีเลชั่นโลหะโดยส่วนประกอบไฮโดรซอลเพิ่มขึ้นเล็กน้อยตามความเข้มข้น แต่ที่6 มก./มล. มีกิจกรรมคีเลตของ EDTA เพียง 37.3 เปอร์เซ็นต์ (รูปที่ 3A)

3.2.3. ลดแรง

ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 3A กำลังรีดิวซ์ของส่วนประกอบไฮโดรซอลขึ้นอยู่กับความเข้มข้นและสูงกว่าของ BHT และ -โทโคฟีรอล (0.22 ± 0.01 และ {{9 }}.33 ± 0.15 ตามลำดับ) ที่0.5 มก./มล. ในการศึกษาก่อนหน้านี้ กำลังรีดิวซ์ของสารสกัดหยาบจากกิ่ง C. osmophloeum ในเศษส่วน BuOH มีค่าสูงสุดในบรรดาเศษส่วนทั้งหมดและเพิ่มขึ้นเป็นเส้นตรงด้วยความเข้มข้น [28] เนื่องจากสารต้านอนุมูลอิสระศักยภาพที่แตกต่างกันระหว่างสารประกอบในสารสกัด ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระโดยรวมของสารสกัดขึ้นอยู่กับตัวทำละลายในการสกัด อย่างไรก็ตาม กำลังรีดิวซ์ (ค่า OD {{0}}.7) ของน้ำที่สกัดจากกิ่ง C. osmophloeum มีความใกล้เคียงกัน (ค่า OD=0.66 ± 0.01) กับค่าปัจจุบันC osmophloeum hydrosols (รูปที่ 3A) ซึ่งผลิตขึ้นโดยใช้การกลั่นด้วยไอน้ำ การลดกำลังโดยทั่วไปเกี่ยวข้องกับการมีตัวรีดิวซ์และกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระ ซึ่งสะท้อนถึงการหยุดปฏิกิริยาลูกโซ่ของอนุมูลอิสระโดยการจัดหาอะตอมไฮโดรเจนที่ลดลง กำลังรีดิวซ์ของ C. osmophloeum อาจเกิดจากการมีอยู่ของกลุ่มไฮดรอกซิลในสารประกอบฟีนอลิก (รูปที่ 2) ซึ่งอาจทำหน้าที่เป็นผู้ให้อิเล็กตรอน

3.2.4. การทดสอบ TEAC

ค่า TEAC ของไฮโดรซอลปัจจุบันเพิ่มขึ้นที่ความเข้มข้นที่สูงกว่า 5.32 × 10−3 มก./มล. และมากกว่าสารประกอบอ้างอิง - โทโคฟีรอลและ BHT ดังแสดงในรูปที่ 3A ความสามารถในการเข้าถึงตำแหน่งรากของ ABTS บวกคือ เกณฑ์หลักสำหรับกิจกรรมในการทดสอบ TEAC ดังนั้น กลุ่มฟีนิลขององค์ประกอบไฮโดรซอลในปัจจุบันจึงมีอุปสรรคน้อยกว่ากลุ่มโทรลอกซ์เล็กน้อย

3.2.5. ความสัมพันธ์ระหว่าง TPC กับกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระ

ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 3B มีความสัมพันธ์ที่มีนัยสำคัญอย่างมากระหว่าง TPC กับ DPPH freeradical scavenging activity ที่ GAE จาก 1.75 ± 0.438 ถึง 100.41 ± 1.581 mg/g . สัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ของ TPC ที่มีกิจกรรมการขับอนุมูลอิสระ DPPH, กิจกรรม FIC, กำลังรีดิวซ์และ TEAC คือ0.980, 0.925, 0.967 และ 0.902 ตามลำดับ (รูปที่ 3B) โดยรวมแล้ว ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าสารต้านอนุมูลอิสระกิจกรรมของ COK hydrosols มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับเนื้อหาฟีนอล

3.3. ผลของความเข้มข้นของ COK Hydrosol ต่อกิจกรรมของ Tyrosinase

เรากำหนดผลของความเข้มข้นของ COK hydrosol ต่อการเกิดออกซิเดชันของ L-tyrosine และ L-DOPA โดยเห็ดไทโรซิเนสและทำการเปรียบเทียบกับฤทธิ์ของกรดโคจิกซึ่งเป็นตัวยับยั้งไทโรซิเนสที่รู้จักกันดี (รูปที่ 3C,D) ไฮโดรโซลในปัจจุบันมีฤทธิ์ยับยั้ง L-tyrosine และ L-DOPA oxidase ที่มีศักยภาพและขึ้นอยู่กับขนาดยาของเอนไซม์ tyrosinase เห็ด (รูปที่ 3C) แต่มีฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนสสูงกว่าเมื่อมี L-tyrosine ซับสเตรต (กิจกรรมโมโนฟีโนเลส) มากกว่า L-DOPA (กิจกรรมไดฟีโนเลส) ค่า IC5{{10}} ของกรดโคจิกเทียบกับโมโนฟีโนเลสและไดฟีโนเลสแอคติวิตีเท่ากับ 4.0 × 10−5 และ 7.8 × 10−3 มก./มล. (รูปที่ 3C) ตามลำดับ มากกว่าไฮโดรซอลปัจจุบันอย่างมีนัยสำคัญ (7.96 × 10−4 มก./มล. และ 0.35 มก./มล. ตามลำดับ; รูปที่ 3D) ดังนั้น เพื่อให้บรรลุกิจกรรมการยับยั้งไทโรซิเนส 90 เปอร์เซ็นต์ (กิจกรรมโมโนฟีโนเลส) ไฮโดรโซลและกรดโคจิกจึงจำเป็นที่ 0.52 มก./มล. และ 4.0 × 10−3 มก./มล. ตามลำดับ เมื่อใช้แอล-ไทโรซีนเป็นสารตั้งต้น (รูปที่ 3C, D ). แม้ว่าผลการยับยั้งไทโรซิเนสต้องการความเข้มข้นของกรด COK hydrosolthan kojic ที่สูงขึ้น แต่กิจกรรมการยับยั้งไทโรซิเนสที่มีศักยภาพก็เห็นได้ชัดในการทดลองเหล่านี้

หลากหลายไทโรซิเนสการเตรียมการ วิธีทดสอบกิจกรรม และความบริสุทธิ์ของสารยับยั้งและส่วนประกอบอาจมีส่วนทำให้เกิดความแตกต่างในจลนพลศาสตร์การยับยั้งเอนไซม์ [29] อย่างไรก็ตาม ฤทธิ์ทางชีวภาพของสารสกัดจากพืชนั้นมาจากส่วนประกอบที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพ ซึ่งอาจได้รับผลกระทบจากสายพันธุ์พืช เวลาเก็บเกี่ยว ฤดู แหล่งกำเนิดทางภูมิศาสตร์ แนวทางปฏิบัติทางพืชไร่ และวิธีการสกัด สารยับยั้งได้รับการระบุและจำแนกลักษณะเฉพาะจากแหล่งธรรมชาติในการศึกษาเมื่อเร็วๆ นี้ และความสัมพันธ์ระหว่างกิจกรรมการยับยั้งและส่วนผสมจากธรรมชาติก็เป็นที่ยอมรับเป็นอย่างดี (ตารางที่ 1) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง แอลดีไฮด์และสารประกอบอื่นๆ เหล่านี้รวมถึงซินนามัลดีไฮด์, 2-ไฮดรอกซี-4-เมทอกซี เบนซาลดีไฮด์, แอนซัลดีไฮด์, คัมมินัลดีไฮด์, กรดคิวมิก, ฟลาโวนอล, ฟลาโวน และไอโซฟลาแวน [4,19,30–37] ไฮโดรซอลในปัจจุบันประกอบด้วยซินนามาลดีไฮด์ 87.7% และเบนซาลดีไฮด์ 7.0 เปอร์เซ็นต์ ซึ่งบ่งชี้ว่าซินนามัลดีไฮด์ ตามด้วยเบนซาลดีไฮด์ เป็นสารหลักที่มีหน้าที่ในการยับยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนสของไฮโดรโซล ตามตารางที่ 1 เราพบว่าไฮโดรโซลที่มีเบนซาลดีไฮด์มีศักยภาพมากกว่า แทนเพียวซินนามัลดีไฮด์และช่วยเพิ่มไทโรซิเนสฤทธิ์ยับยั้งไฮโดรโซล นอกจากนี้ Benzaldehydeswere ยังยืนยันว่าสามารถยับยั้งทั้งกิจกรรมไดฟีโนเลสและโมโนฟีโนเลสของเห็ดไทโรซิเนส [38] กลไกการยับยั้งไทโรซิเนสของสารยับยั้งประเภทเบนซาลดีไฮด์น่าจะมาจากความสามารถในการสร้างฐานชิฟฟ์ที่มีกลุ่มอะมิโนหลักในเอนไซม์ [33,39] การเพิ่มกลุ่มบริจาคอิเล็กตรอนที่ตำแหน่งพาราของเบนซาลดีไฮด์จะเพิ่มกิจกรรมการยับยั้งไทโรซิเนส อาจจะทำให้ฐานชิฟฟ์มีเสถียรภาพ

3.4. โหมดจลนศาสตร์ของการยับยั้งไทโรซิเนสของเห็ดโดย COK Hydrosol

ศึกษาพฤติกรรมจลนพลศาสตร์ของไฮโดรโซลต่อโมโนฟีโนเลสและกิจกรรมไดฟีโนเลสของไทโรซิเนสโดยใช้แอล-ไทโรซีนและ L-DOPA เป็นสารตั้งต้นตามลำดับ ดิไทโรซิเนสวิเคราะห์การยับยั้งจลนศาสตร์ของไฮโดรซอลโดยใช้แผนภาพคู่กลับของ Lineweaver–Burk ดังแสดงในรูปที่ 4 ในรูปที่ 4A, B, เส้นทั้งสี่แสดงถึงเอนไซม์ที่ไม่ถูกยับยั้ง (บรรทัดที่ 1) และการยับยั้งโดยความเข้มข้นสาม (บรรทัดที่ 2 – บรรทัดที่ 4) ของไฮโดรซอล และ เส้นเหล่านี้ตัดกันทางด้านซ้ายของแกน 1/v เหนือแกน 1/S ภายใต้สภาวะการทดลองที่ไม่ถูกยับยั้ง ความเร็วสูงสุด (Vmax) ของปฏิกิริยาออกซิเดชันของ L-tyrosine และ L-DOPA ที่เร่งปฏิกิริยาโดยไทโรซิเนสคือ {{10}}}.055 ∆OD475/minand 0.096 ∆OD475/min โดยไม่มี ไฮโดรซอล (บรรทัดที่ 1 ในรูปที่ 4A, B) ตามลำดับ พารามิเตอร์จลนศาสตร์ Km (ค่าคงที่ไมเคิลลิส) สำหรับเห็ดไทโรซิเนสที่ได้จากการพล็อต Lineweaver–Burk โดยใช้ L-tyrosine และ L-DOPA เป็นสารตั้งต้น ตามลำดับ แสดงว่า Km คือ 0.534 มก./มล. และ0.511 มก./มล. โดยไม่มีไฮโดรซอล (สาย 1 ในรูปที่ 4A, B)

เส้นสี่เส้น ที่ได้จากเอนไซม์ที่ไม่ถูกยับยั้งและจากไฮโดรซอลที่มีความเข้มข้นต่างๆ กันสามระดับ ตัดกันทางด้านซ้ายของแกน 1/v เหนือแกน 1/S ความเข้มข้นของไฮโดรโซลที่เพิ่มขึ้นส่งผลให้ Vmax ลดลงและ Km เพิ่มขึ้น โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เมื่อใช้ L-ไทโรซีนเป็นซับสเตรต การเพิ่มความเข้มข้นของไฮโดรซอลส่งผลให้เกิดเส้นหลายเส้นที่มีความลาดเอียงและการสกัดกั้นที่หลากหลาย แต่สิ่งเหล่านี้ตัดกันในจตุภาคที่สอง (บรรทัดที่ 1-4 ในรูปที่ 4A) ผลลัพธ์ที่คล้ายกันเกิดขึ้นเมื่อ L-DOPA ถูกใช้เป็นสารตั้งต้น (บรรทัดที่ 1-4 ในรูปที่ 4B) ซึ่งสนับสนุนการยืนยันว่าไฮโดรซอลมีสารยับยั้งไทโรซิเนสชนิดผสม ตามการยับยั้งแบบผสม ส่วนประกอบของไฮโดรโซลน่าจะจับเอ็นไซม์อิสระและสารตั้งต้นของเอนไซม์-สารตั้งต้น การยับยั้งแบบผสมสามารถเกิดขึ้นได้หลายวิธี: การยับยั้งของไฮโดรซอลอาจเกิดขึ้นได้เนื่องจากพวกมันมีปฏิสัมพันธ์กับตัวกลางภายหลังในรูปแบบปฏิกิริยาแต่ไม่ได้เกิดขึ้นกับสารเชิงซ้อนของเอนไซม์-สารตั้งต้นเริ่มแรก [40] ดังนั้นเราจึงกำหนดค่าคงที่การแยกตัว (Ki และ Ki ตามลำดับ) สำหรับตัวยับยั้งการจับกับเอ็นไซม์ฟรี (E) และสารเชิงซ้อนของเอนไซม์-สารตั้งต้นโดยใช้แผนภาพสองส่วนกลับและแปลงของความชันและการสกัดกั้นแนวตั้ง เทียบกับความเข้มข้นของไฮโดรซอลต่อหน้า L-ไทโรซีน (รูปที่ 4C, D) หรือ L- DOPA เป็นสารตั้งต้น (รูปที่ 4E, F) ดังแสดงในรูปที่ 4A, B ค่า Ki เมื่อใช้ L-tyrosine เนื่องจากสารตั้งต้นต่ำกว่าเมื่อมี L-DOPA ประมาณ 1.28 เท่า ซึ่งบ่งชี้ว่าเอนไซม์ยับยั้งมีผลจับกับ L-tyrosine ได้ดีกว่า L-DOPA นอกจากนี้ ค่า Ki มากกว่าค่า Ki สำหรับการออกซิเดชันของ L-DOPA 1.71 เท่า ซึ่งบ่งชี้ว่าความสัมพันธ์ของส่วนประกอบไฮโดรซอลสำหรับเอนไซม์อิสระนั้นแข็งแกร่งกว่าค่าสำหรับคอมเพล็กซ์ของสารตั้งต้นของเอนไซม์ ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าไฮโดรซอลส่งผลต่อความสัมพันธ์ของ เอ็นไซม์สำหรับ L-DOPA แต่ไม่ไปจับกับแอกทีฟไซต์ นอกจากนี้ ค่าของ Ki เกือบจะเท่ากับ Kifor ที่เกิดปฏิกิริยาออกซิเดชันของ L-tyrosine ซึ่งบ่งชี้ว่าสารยับยั้งแบบผสมคือตัวยับยั้งที่ไม่สามารถแข่งขันได้ ซึ่งจับกับเอ็นไซม์อิสระและสารตั้งต้นของเอนไซม์-สารตั้งต้นที่มีค่าคงที่สมดุลเดียวกันโดยใช้ L- ไทโรซีนเป็นสารตั้งต้น (รูปที่ 4A) อย่างไรก็ตาม ค่าคงที่การจับสมดุลของเอ็นไซม์อิสระและเอ็นไซม์-สารตั้งต้นเชิงซ้อน ตามลำดับ แตกต่างกันโดยใช้ L-DOPA เป็นสารตั้งต้น (รูปที่ 4B) ซึ่งบ่งชี้ว่าตัวยับยั้งแบบผสม (แบบแข่งขันและแบบไม่มีการแข่งขัน) สามารถจับไม่เพียงกับ เอ็นไซม์อิสระแต่ยังมีเอ็นไซม์-สารตั้งต้นที่ซับซ้อนโดยใช้ L-DOPA เป็นสารตั้งต้น การศึกษาก่อนหน้านี้ยังเปิดเผยว่าน้ำมันหอมระเหย C. cassia และซินนามัลดีไฮด์เป็นสารยับยั้งชนิดผสม [19] ในทางตรงกันข้าม ทรานส์-ซินนามัลดีไฮด์ที่แยกได้จากเปลือกของ C. cassia บ่งชี้ถึงการยับยั้งการแข่งขันสำหรับการเกิดออกซิเดชันของ L-DOPA โดยเห็ดไทโรซิเนส[32] ในขณะที่ซินนามัลดีไฮด์แยกได้จากรากของพี cernua เป็นการยับยั้งแบบไม่มีการแข่งขัน [35]

3.5. ผลกระทบที่ขึ้นกับความเข้มข้นของความเข้มข้นของไฮโดรโซลต่อการสร้างเม็ดสี

เพื่อทดสอบผลของไฮโดรโซลต่อความมีชีวิตของเซลล์และการสร้างเมลาโนมาที่ความเข้มข้นที่แตกต่างกัน ({{0}}.0035–10.64 มก./มล.) เราเหนี่ยวนำให้เกิดการสร้างเมลาโนมาในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16-F10 โดยใช้ -MSH และเปรียบเทียบ ผลกระทบจากการใช้กรดโคจิกเป็นตัวควบคุมเชิงบวก (รูปที่ 5) ผลลัพธ์ของการทดสอบความมีชีวิตของเซลล์นี้บ่งชี้ว่าไฮโดรซอลไม่มีความเป็นพิษต่อเซลล์ที่ความเข้มข้น 0.0035–1.064 มก./มล. ในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16F10 (รูปที่ 5a) ในขณะที่มีการพัฒนาสารยับยั้งการสร้างเม็ดสี ความปลอดภัยและประสิทธิผลควรเป็นข้อพิจารณาที่สำคัญที่สุดสำหรับการใช้งานหลายอย่าง อย่างไรก็ตาม การบำบัดเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16F10 ด้วยไฮโดรโซลทำให้ความสามารถในการอยู่รอดของเซลล์ลดลงอย่างเห็นได้ชัดที่ความเข้มข้น 5.32–10.64 มก./มล. จากผลการศึกษาคัดกรองความปลอดภัยและประสิทธิภาพของผิว-ไวท์เทนนิ่งผลิตภัณฑ์ใน B16F10 การเพาะเลี้ยงเซลล์ 1.064 มก./มล. คือความเข้มข้นตามเกณฑ์สำหรับการคัดกรองปฐมภูมิที่มีเซลล์เป็นพื้นฐาน ดังนั้นจึงใช้ความเข้มข้น 0.1064–1.064 มก./มล. เพื่อตรวจสอบกลไกการต่อต้านไทโรซิเนสในเซลล์มะเร็งผิวหนัง B16F10 ด้วยไฮโดรโซล

การกดขี่ของการสร้างเมลาโนเจเนซิสโดยการบำบัดด้วยไฮโดรโซลที่ความเข้มข้นต่างๆ ถูกกำหนดหาเปอร์เซ็นต์ของปริมาณเมลานินในเซลล์ (รูปที่ 5b) นอกจากนี้เรายังวิเคราะห์ระดับการแสดงออกของ MITF โดยใช้ Western blotting (รูปที่ 5c) ในการทดลองเหล่านี้ ปริมาณเมลานินและระดับการแสดงออกของ MITF ถูกระงับโดยขึ้นอยู่กับขนาดยาโดย COK hydrosol ซึ่งบ่งชี้ว่า COK hydrosol ลดปริมาณเมลานินในเซลล์โดยการยับยั้งการสังเคราะห์ MITF

3.6. การทดสอบการปกป้องดีเอ็นเอ

ออกซิเจนชนิดปฏิกิริยาเป็นที่ทราบกันดีว่าสามารถทำลาย DNA และทำให้เซลล์เสื่อมสภาพและเกิดมะเร็งได้ การทดสอบ DNAnicking นำเสนอระบบแบบจำลองที่ปราศจากเซลล์ที่สะดวกในการตรวจสอบการผลิตของอนุมูลอิสระที่สร้างความเสียหายของ DNA อย่างละเอียดอ่อน [41] ในการทดลองเหล่านี้ ปฏิกิริยาของเฟนตันได้ผลิตไฮดรอกซิลเรดิคัลซึ่งจับพลาสมิด DNA ที่มีซุปเปอร์คอยล์และแปลงเป็น DNA ในรูปแบบที่มีรูพรุน ซึ่งทำให้การเคลื่อนตัวของอิเล็กโตรโฟรีติกลดลง [42,43]. ดังนั้น เพื่อประเมินกิจกรรมการป้องกัน DNA ของไฮโดรโซล เราจึงบ่มpCI neo DNA ด้วยสารตั้งต้นของเฟนตัน [44] ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 6 รูปแบบพลาสมิดซุปเปอร์คอยล์และแบบนิกเคดมีความโดดเด่นอย่างชัดเจนด้วยอัตราการเคลื่อนที่แบบอิเล็กโตรโฟเรติกสัมพัทธ์บนเจลอะกาโรส supercoiledDNA เคลื่อนที่เร็วที่สุด และ DNA ที่เจาะจงเคลื่อนที่ช้าที่สุดตามลำดับ หลังการรักษาด้วยไฮโดรซอล ความเสียหายของดีเอ็นเอลดลงเล็กน้อยที่ความเข้มข้นของไฮโดรซอลที่ 1.33–5.32 มก./มล. โดยมีการป้องกัน 28–58 เปอร์เซ็นต์ของรูปแบบซุปเปอร์คอยล์ ตามลำดับ (ช่อง 6–8) ที่ความเข้มข้นของไฮโดรซอลที่ 0.3325–0.665 มก./มล. ไม่พบการป้องกันที่สัมพันธ์กับกลุ่มควบคุมเชิงลบ (เลน 4 และ 5) ในทางตรงกันข้าม เควอซิทินปกป้องพลาสมิด DNA จากไฮดรอกซิลเรดิคัลอย่างมีประสิทธิภาพ- การกระจายตัวที่เป็นสื่อกลางดังที่แสดงไว้ก่อนหน้านี้ [45] นี่เป็นข้อมูลแรกที่แสดงผลการป้องกันของสารสกัดจากไฮโดรซอลจากซี osmophloeum Kanehira ทำลาย DNA จากปฏิกิริยาของเฟนตัน ผลกระทบเหล่านี้น่าจะเกิดจากการมีสารประกอบโพลีฟีนอล

4. บทสรุป

COK ถูกใช้เป็นพืชสมุนไพรมานานแล้วในไต้หวัน อย่างไรก็ตาม ตามความรู้ของเรา นี่เป็นรายงานฉบับแรกที่แสดงให้เห็นว่าไฮโดรโซลที่เตรียมโดยการกลั่นด้วยไอน้ำจากใบ COK มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระตามที่สังเกตได้จากการทดสอบสารต้านอนุมูลอิสระกิจกรรมและความเสียหายของ DNA นอกจากนี้เรายังแสดงให้เห็นว่าไฮโดรซอลนี้ยับยั้งการสร้างเม็ดสี ในการวิเคราะห์ GC/MS พบว่าสารประกอบหลักใน COK hydrosol เป็นซินนามัลดีไฮด์และเบนซาลดีไฮด์ และสารเหล่านี้สามารถยับยั้งกิจกรรมโมโนฟีโนเลสและไดฟีโนเลสของไทโรซิเนสได้ ในการประเมินจลนพลศาสตร์การยับยั้งไทโรซิเนสของเรา COK hydrosol แสดงการยับยั้งทั้ง L-tyrosine และ L-DOPA oxidase แบบผสมขึ้นอยู่กับขนาดยาไทโรซิเนส. สารประกอบไฮโดรซอลในปัจจุบันยังยับยั้งการแสดงออกของโปรตีน MITF ซึ่งนำไปสู่การสังเคราะห์เมลานินที่เกิดจาก -MSH ที่ลดลง

สุดท้าย ความปลอดภัยเป็นข้อพิจารณาที่สำคัญสำหรับสารยับยั้งไทโรซิเนส โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับผลิตภัณฑ์เครื่องสำอางและอาหารที่ใช้แล้ว ซึ่งอาจใช้ในปริมาณที่กำหนด COK เป็นอาหารที่กินได้และสารเติมแต่งจากธรรมชาติที่ใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับอาหารและเครื่องสำอาง นอกจากนี้ ซินนามัลดีไฮด์ยังเป็นที่ยอมรับโดยทั่วไปว่าปลอดภัยสำหรับการบริโภคของมนุษย์ COK hydrosol เป็นวัสดุชีวภาพจากธรรมชาติที่ดีเยี่ยม มีประสิทธิภาพและปลอดภัยไทโรซิเนสและกิจกรรมยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินและศักยภาพในการป้องกันความเสียหายของ DNA ดังนั้นเราจึงเชื่อว่า COK hydrosol สามารถใช้เป็นสารขจัดเม็ดสีที่ปลอดภัยและมีประสิทธิภาพสำหรับการใช้งานหลายประเภท