การศึกษาเปรียบเทียบคุณสมบัติและกลไกการต่อต้านริ้วรอย: เรสเวอราทรอลและการจำกัดแคลอรี่ Ⅱ

ผลของ resveratrol และ CR ต่อการแสดงออกของ mRNA ของ SIRT1, p53 และ Foxo3a ในเนื้อเยื่อของหนูอายุมาก

สภาวะความเครียดออกซิเดชันมักกระตุ้นให้เกิดการแสดงออกและกิจกรรมของ SIRT1 SIRT1 ปรับการทำงานของปัจจัยการอยู่รอดที่สำคัญ ได้แก่ p53 และ Foxo3a [9] ในการตรวจสอบผลกระทบของ resveratrol และ CR ต่อระดับ mRNA ของ SIRT1, p53 และ Foxo3a ในหนูสูงวัยที่ถูกกระตุ้นด้วย D-Gal ได้ทำการตรวจวิเคราะห์ RT-PCR เชิงปริมาณ เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมเชิงลบที่เกี่ยวข้อง ระดับการแสดงออกของ mRNA ของ SIRT1 และ Foxo3a ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ แต่ระดับ p53 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม D-Gal (P < 0.01; รูปที่ 9A และ 9B). นอกจากนี้ การรักษาพร้อมกันของ resveratrol หรือ CR กับ D-gal ในหนูทำให้ระดับการแสดงออกของ SIRT1 และ Foxo3a mRNA เพิ่มขึ้น แต่ระดับ p53 ลดลงเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมแบบจำลอง (P < {0.05) อย่างไรก็ตาม เมื่อเทียบกับการรักษาด้วยวิธี CR ระดับการแสดงออกของ SIRT1 mRNA เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในตับที่ได้รับ resveratrol ขนาดสูงร่วมกับกลุ่ม D-gal ระดับการแสดงออกของ p53 mRNA ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในตับและสมองที่ได้รับ resveratrol ขนาดสูงร่วมกับ D- กลุ่มสาว (P <0.05)

คลิกที่นี่เพื่อรับผลิตภัณฑ์เสริมอาหารต่อต้านวัย Cistanche

ผลของเรสเวอราทรอลและ CR ต่อการแสดงออกของโปรตีนหลักที่เกี่ยวข้องกับ SIRT1-ในเนื้อเยื่อสมองของหนูอายุมาก

FOXO3a และ p53 ซึ่งควบคุมโดย SIRT1 เป็นโมเลกุลปลายน้ำของ SIRT1 ในขณะเดียวกัน กิจกรรมของ SIRT1 จะถูกควบคุมโดยโมเลกุลต้นน้ำ ตัวอย่างเช่น DBC1 (หรือที่เรียกว่า KIAA1967), AROS (หรือที่เรียกว่า RPS19BP1) และตัวยับยั้งเนื้องอก HuR (หรือที่เรียกว่า ELAVL1) [9, 10] . ในการตรวจสอบผลกระทบของ resveratrol และ CR ต่อระดับโปรตีนของ p53, FOXO3a, HuR, AROS และ DBC1 ในหนูสูงวัยที่เกิดจาก D-Gal ได้ทำการทดสอบแบบ Western blot เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมเชิงลบที่เกี่ยวข้อง ระดับการแสดงออกของโปรตีน FOXO3a, AROS และ HuR ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ แต่ระดับ p53 และ DBC1 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม D-gal (P < 0.01 ; รูปที่ 10) นอกจากนี้ การรักษาพร้อมกันของ resveratrol หรือ CR กับ D-gal ในหนูทำให้การแสดงออกของโปรตีนของ FOXO3a, AROS และ HuR เพิ่มขึ้น แต่ระดับ p53 และ DBC1 ลดลงเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมแบบจำลอง (P < 0.05) อย่างไรก็ตาม เมื่อเทียบกับการรักษาด้วย CR ระดับการแสดงออกของโปรตีน HuR เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ แต่ระดับ DBC1 ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในสมองของ resveratrol ขนาดสูงร่วมกับกลุ่ม D-gal (P < 0.05) ไม่มีความแตกต่างระหว่างกลุ่ม resveratrol บวก D-gal และกลุ่ม CR บวก D-gal ในระดับการแสดงออกของโปรตีน p53, FOXO3a และ AROS (P > 0.05)

การแสดงออกของ FOXO3a และ p53 ในเนื้อเยื่อสมองและตับ

สถานะการแสดงออกของ FOXO3a และ p53 ถูกกำหนดในเนื้อเยื่อสมองและตับโดยอิมมูโนฮิสโตเคมี การวิเคราะห์อิมมูโนฮิสโตเคมีของ FOXO3a และ p53 พบว่าการแสดงออกของ FOXO3a ในเนื้อเยื่อสมองและตับลดลงอย่างมีนัยสำคัญ และการแสดงออกของ p53 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม D-Gal เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมเชิงลบ (P < 0{{13} }5 รูปที่ 11) ยิ่งไปกว่านั้น การให้สาร resveratrol หรือ CR ร่วมกับ D-gal พร้อมกันในหนูแรททำให้การแสดงออกของ FOXO3a เพิ่มขึ้น แต่การแสดงออกของ p53 ลดลงเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมแบบจำลอง (P < 0.05) อย่างไรก็ตาม ไม่มีความแตกต่างระหว่างกลุ่ม resveratrol บวก D-gal และกลุ่ม CR บวก D-gal ในนิพจน์ p53 และ FOXO3a (P > 0.05)

การอภิปราย

กระบวนการทางเคมีขั้นพื้นฐานที่เกี่ยวข้องกับความชรานั้นได้รับการปรับปรุงขั้นแรกโดยทฤษฎีอนุมูลอิสระแห่งวัย[11],และความเครียดออกซิเดชันเชื่อว่าเป็นปัจจัยหลักในกระบวนการชราตามปกติตัวริเริ่มอนุมูลอิสระ AAPHเคยชินทำให้เกิดความเครียดออกซิเดชันและสร้างแบบจำลองของออกซิเดชันความชราภาพของเซลล์ที่เกิดจากความเครียดใน IMR ของมนุษย์-90 เซลล์ [12, 13] ข้อดีของวิธีนี้คือ AAPH สลายตัวด้วยความร้อนสร้างอนุมูลปราศจากการเปลี่ยนแปลงทางชีวภาพหรือเอนไซม์ และอัตราการรุ่นที่รุนแรงสามารถควบคุมได้ง่ายโดยการปรับความเข้มข้นของตัวเริ่มต้น [12] AAPH พบว่ายับยั้งการขยายพันธุ์ของมนุษย์IMR- 90 เซลล์ในลักษณะที่มีความเข้มข้นและขึ้นกับเวลา ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าการบ่ม 2 วันด้วย AAPH (1 มิลลิโมลาร์) เพิ่มเปอร์เซ็นต์ของอัตราส่วนบวกของ SA -Gal อย่างมีนัยสำคัญ, จำนวนประชากรของเซลล์อะพอพโทซิส, ลดการแสดงออกของ mRNA ของ SIRT1 และเหนี่ยวนำให้สัณฐานวิทยาขยายและแบนราบ สิ่งเหล่านี้บ่งชี้ว่าความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันซึ่งเป็นผลมาจาก AAPH ทำให้เซลล์ IMR-90 เข้าสู่วัยชรา ตามแบบจำลองการชราภาพระดับเซลล์นี้ การรักษาด้วย resveratrol 10 ไมโครโมลาร์สามารถยับยั้งการชราภาพและการตายของเซลล์ที่เกิดจาก AAPH ได้อย่างมีประสิทธิภาพมากกว่าการรักษาด้วย CR

โมเดลสัตว์ D-gal เป็นโมเดลสัตว์สูงวัยที่ได้รับการยอมรับในระดับสากล และมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในด้านยาต่อต้านริ้วรอย. D-gal เป็นสารอาหารทางสรีรวิทยาที่ปกติจะถูกเผาผลาญโดย D-galactokinase และ galactose-1-ฟอสเฟตในสัตว์ อย่างไรก็ตาม การมี D-gal ที่มากเกินไปซึ่งไม่ได้ถูกเผาผลาญโดยเอนไซม์ข้างต้น แต่สะสมอยู่ในเซลล์ นำไปสู่ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชั่นและการทำลายเซลล์ [14] ดังนั้น การให้ D-gal ในระยะยาวทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงที่คล้ายกับการแก่ตามธรรมชาติในสัตว์ เช่น อายุขัยสั้นลง ความผิดปกติทางความคิด การเสื่อมสภาพของระบบประสาท ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน การตอบสนองของภูมิคุ้มกันลดลง และการสร้างผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้ายไกลเคชั่นขั้นสูง (AGE) [15] การศึกษาครั้งนี้ชี้ให้เห็นถึงความสำเร็จในการจัดตั้งแบบจำลองอายุเลียนแบบ ซึ่งเห็นได้จากการเรียนรู้ที่โดดเด่นและความจำเสื่อม การผลิต MDA การสะสมของ lipofuscin การลดลงของ T-AOC และ SOD และการลดลงของกิจกรรม telomerase ในสมอง ในขณะเดียวกัน การรักษา resveratrol หรือ CR ปกป้องหนูที่ถูกเหนี่ยวนำด้วย D-gal จากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชั่นโดยยกระดับการทำงานของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ ลดระดับของผลิตภัณฑ์ lipid peroxidation และรักษาสมดุลของระบบออกซิเดชั่นและแอนติออกซิเดชั่น ในการทดสอบพฤติกรรมและการทำงานของเทโลเมอเรส การรักษา resveratrol หรือ CR สามารถย้อนความบกพร่องทางสติปัญญาที่เกิดจาก D-gal และกิจกรรมของเทโลเมอเรสได้ นอกจากนี้ หนูทดลองที่มีอายุมากขึ้นที่ได้รับ resveratrol ในปริมาณสูง แสดงผลค่อนข้างมีนัยสำคัญต่อพฤติกรรมมากกว่าหนูที่ได้รับ CR

รูปที่ 11: การวิเคราะห์อิมมูโนฮิสโตเคมีของการแสดงออกของ p53 (A, B) และ FOXO3a (C, D) ในตับ (A, C) และเนื้อเยื่อสมอง (B, D) ของหนูอายุมาก กำลังขยาย 20 เท่า NG, กลุ่มควบคุมเชิงลบ; MG, กลุ่มควบคุมแบบจำลอง; RESL กลุ่ม resveratrol ขนาดต่ำ; RESH, กลุ่ม resveratrol ขนาดสูง; CR กลุ่มควบคุมแคลอรี่

การศึกษาแสดงให้เห็นว่า CR ซึ่งช่วยลดการบริโภคอาหารที่มีคุณค่าทางโภชนาการลง 10-40 เปอร์เซ็นต์สามารถชะลอความชราและเพิ่มอายุขัยดังนั้น ระดับ CR หนึ่งระดับที่ใช้กันทั่วไป (การลดปริมาณอาหารลดลง 40 เปอร์เซ็นต์) จึงถูกนำมาใช้ในหนูกลุ่ม CR ในการศึกษาครั้งนี้ อย่างไรก็ตาม งานวิจัยบางชิ้นพบว่าไม่มีผลประโยชน์ของ CR ต่อการมีอายุยืนยาวของไพรเมตที่มีอายุตามธรรมชาติ [16] ในทำนองเดียวกัน แม้ว่าการรักษาด้วย resveratrol จะกระตุ้นให้เกิดผลคล้าย CRการเผาผลาญพลังงานและเมตาบอลิซึมในคนอ้วน [17] ไม่ได้ปรับปรุงการทำงานของเมตาบอลิซึมในผู้หญิงที่ไม่อ้วนที่มีความทนทานต่อกลูโคสปกติ [18] สาเหตุของความแตกต่างระหว่างการศึกษาเหล่านี้ยังไม่ชัดเจน แต่อาจเป็นเพราะ CR และ resveratrol ทำงานเพื่อฟื้นฟูสภาวะสมดุลในสภาวะสมดุลในบุคคลที่ถูกบุกรุกทางเมแทบอลิซึม และน้อยกว่าในบุคคลที่มีสุขภาพแข็งแรง ซึ่งมีความเป็นไปได้ที่สอดคล้องกับหน้าที่ที่ทราบของ SIRT1 ในการศึกษาในสัตว์ทดลอง [19] ดังนั้น แบบจำลองหนูสูงวัยที่เหนี่ยวนำด้วย D-gal จึงถูกนำมาใช้เพื่อเปรียบเทียบกิจกรรมต่อต้านความชราของ resveratrol หรือ CR แทนที่จะเป็นแบบจำลองหนูที่มีอายุตามธรรมชาติ

SIRT1 ซึ่งเป็น deacetylase ที่ขึ้นกับ (NAD plus ) ได้รับความสนใจอย่างมากเนื่องจากมีบทบาทหลายอย่างในการยืดอายุขัย การต้านทานความเครียด และลดการตายของเซลล์ [20, 21] การศึกษาที่สะสมได้บอกเป็นนัยอย่างชัดเจนว่า SIRT1 เป็นเป้าหมายสำคัญของ resveratrol และ CR [22] มีโมเลกุลปลายน้ำของ SIRT1 จำนวนมาก รวมถึง p53, Foxo1, Foxo3, Foxo4 และ E2F1 ซึ่งควบคุมโดย SIRT1 ในขณะเดียวกัน กิจกรรมของ SIRT1 ถูกควบคุมโดยโมเลกุลต้นน้ำ ตัวอย่างเช่น p53, HIC1, E2F1, DBC1, HuR และ AROS การถอนสารอาหารแบบเฉียบพลันเปิดใช้งานโปรแกรมการถอดรหัสที่โปรโมเตอร์ SIRT1 ซึ่งควบคุมโดยปัจจัยการถอดรหัส Foxo3a และ p53 เนื่องจาก p53 กดการแสดงออกของยีน SIRT1 การกำจัดโดย Foxo3a จึงเปิดใช้งานการถอดรหัส SIRT1 [23] เมื่อเร็วๆ นี้ DBC1 และ AROS ถูกอธิบายในฐานะตัวควบคุมเชิงลบและบวกโดยตรงของกิจกรรม SIRT1 ตามลำดับ HuR แสดงผลของการลดระดับการแสดงออกของ SIRT1 ในเซลล์ชราภาพ [9, 10]

Crชะลอความชราและยืดอายุขัยเฉลี่ยและสูงสุดในหลากหลายสายพันธุ์ ได้แก่ หนู หนู ปลา แมลงวัน หนอน และยีสต์ อย่างไรก็ตาม โครงการอาหารที่เคร่งครัดดังกล่าวในบุคคลที่ใช้ชีวิตอิสระได้ก่อให้เกิดปัญหาด้านจริยธรรมและระเบียบวิธี [24] ในปัจจุบัน การเพิ่มอายุขัยอาจมีความสำคัญมากกว่าการยืดอายุขัยเพียงอย่างเดียว การตรวจสอบเมื่อเร็วๆ นี้ชี้ให้เห็นว่า เรสเวอราทรอลเป็นหนึ่งในตัวกระตุ้นกิจกรรม SIR2 ที่มีศักยภาพมากที่สุดในบรรดาโพลีฟีนอลจากพืชทั้งหมด [25] และมันมีอิทธิพลต่ออายุยืนผ่านกลไกที่คล้ายคลึงกันดังที่เห็นในการจำกัดแคลอรี่ ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า CR และ resveratrol มีกิจกรรมที่คล้ายคลึงกันในการกู้คืนระดับการแสดงออกของ SIRT1 mRNA เพิ่มการแสดงออกของโปรตีนของ FOXO3a, AROS และ HuR และลดระดับ p53 และ DBC1 ในขณะเดียวกัน หลักฐานที่น่าสนใจหลายบรรทัดบ่งชี้ถึงผลประโยชน์ของเรสเวอราทรอลต่อระบบประสาท ตับ และระบบหัวใจและหลอดเลือด

วัสดุและวิธีการ

การเพาะเลี้ยงเซลล์ ความเครียด และการรักษา

IMR สายพันธุ์ไฟโบรบลาสต์แบบไดพลอยด์ของมนุษย์-90 ได้มาจาก ATCC เซลล์เติบโตในอาหารเลี้ยงเชื้อขั้นต่ำที่จำเป็น (MEM) (Gibco, UK) เสริมด้วย 10 เปอร์เซ็นต์ของ Fetal bovine serum (FBS) (Gibco) ที่ 37 องศาใน 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 หลังจากถึงจุดบรรจบกัน เซลล์จะถูกเพาะลงใน 6-จานเพาะเชื้อ หนึ่งวันต่อมา เซลล์ได้รับการรักษาเป็นเวลา 48 ชั่วโมงด้วย 1 mM 2,2′-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) (Sigma, USA) ที่เจือจางใน MEM บวก 10 เปอร์เซ็นต์ FBS การฟักตัว 48 ชั่วโมงด้วยตัวริเริ่มอนุมูลอิสระ AAPH สร้างแบบจำลองของการชราภาพของเซลล์ที่เกิดจากความเครียดออกซิเดชัน [12, 13] เซลล์ควบคุมถูกบ่มในอาหารเลี้ยงเชื้อเพียงอย่างเดียว หลังการบำบัด AAPH IMR-90 ถูกล้างด้วยน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์เย็น (PBS) pH 7.4 และบ่มด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อสดหรืออาหารเลี้ยงเชื้อที่มีเรสเวอราทรอล (กลุ่มเรสเวอราทรอล) หรือ MEM เสริมด้วย FBS 3 เปอร์เซ็นต์ (กลุ่ม CR) สำหรับ ก่อนเก็บเกี่ยวอีก 48 ชม.

กิจกรรมการย้อมสี SA -gal

ตรวจสอบลักษณะที่ปรากฏของ biomarkers ของการชราภาพ (การลดลงของศักยภาพในการเพิ่มจำนวนและการเพิ่มขึ้นของ SA -gal-staining) [26] จากวันหลังการรักษา จากนั้นเซลล์จะถูกย้อมสีตามคำแนะนำของผู้ผลิต SA -gal Staining Kit (CST, USA) หลังจากการย้อมสี มีการตรวจสอบเซลล์อย่างน้อย 300 เซลล์ในหลายฟิลด์และนับเซลล์บวก SA -gal การทดลองเหล่านี้ทำซ้ำสามครั้ง และแสดงผลลัพธ์เป็นค่าเฉลี่ยพร้อมส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) เพื่อหลีกเลี่ยงการย้อมสีที่ไม่เฉพาะเจาะจงซึ่งอาจเกิดจากการรวมตัวกันของเซลล์ การย้อมสี SA -gal histochemical ได้ดำเนินการกับเซลล์ย่อยที่ไหลมารวมกัน

การวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด

เซลล์เติบโตบนใบปิดใน 6-จานเพาะเลี้ยงตามที่อธิบายไว้ข้างต้น หลังจากรักษาด้วยเรสเวอราทรอลและ CR แล้ว แผ่นปิดถูกนำออกจากเพลต จากนั้นเซลล์จะถูกตรึงด้วยกลูตาราลดีไฮด์ที่เติมด้วยฟอสเฟต 2.5 เปอร์เซ็นต์ และถูกตรึงภายหลังด้วยออสเมียมเททรอกไซด์ที่บัฟเฟอร์ด้วยบัฟเฟอร์ 1 เปอร์เซ็นต์ ชิ้นงานคงที่ถูกแช่ในแอลกอฮอล์ t-butyl หลังจากการคายน้ำผ่านชุดเอทานอลที่ให้คะแนน ชิ้นงานถูกทำให้แห้งเยือกแข็งจากที-บิวทิลแอลกอฮอล์ จากนั้นเคลือบด้วยทองระเหยโดยใช้เครื่องเคลือบแบบละเอียดอัตโนมัติ (JFC-1600, JEOC, ญี่ปุ่น) และตรวจสอบโดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด (JEOL, JSM{{11} }LV, ญี่ปุ่น).

การวิเคราะห์อะพอพโทซิส

หลังจากการบ่ม resveratrol หรือ CR เซลล์ทั้งหมดถูกเก็บเกี่ยวด้วยทริปซินและล้างสองครั้งด้วย PBS ตามด้วยแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์การจับ Annexin V 400 ไมโครลิตร จากนั้นเซลล์จะถูกย้อมสีตามคำแนะนำของผู้ผลิตชุดตรวจหาการตายของเซลล์ Annexin V-FITC (BestBio, China) FACSCalibur flow cytometer (Becton-Dickinson, San Jose, CA) ถูกนำมาใช้เพื่อตรวจจับการเรืองแสง และเปอร์เซ็นต์ของเซลล์ apoptotic ถูกคำนวณโดยระบบซอฟต์แวร์ภายในของ FACSCalibur วิเคราะห์เซลล์ประมาณ 104 เซลล์สำหรับแต่ละเส้นทาง

ขั้นตอนสัตว์

หนูเผือกวิสตาร์ตัวผู้ที่มีน้ำหนักประมาณ 200 ± 10 กรัม ได้มาจากศูนย์สัตว์ทดลองของวิทยาลัยการแพทย์ถงจี้ มหาวิทยาลัยวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีหัวจง (SCXK 2010-0009) สัตว์เหล่านี้ได้รับการปรับสภาพเป็นเวลา 2 สัปดาห์ก่อนที่จะให้ยาในศูนย์สัตว์ทดลองของมหาวิทยาลัยแพทย์แผนจีนหูเป่ย ในช่วงเวลานั้นพวกมันสามารถเข้าถึงอาหารและน้ำได้ฟรี หลังจากปรับตัวให้ชินกับสภาพแวดล้อมแล้ว ได้ทำการคัดเลือกหนู 50 ตัวและแบ่งออกเป็น 5 กลุ่มๆ ละ 10 ตัว สัตว์ได้รับการดูแลตามแนวทางและโปรโตคอลระดับชาติที่ได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมสัตว์ประจำสถาบัน (IAEC)

หนูกลุ่ม I (กลุ่มควบคุมเชิงลบ) ได้รับกระสายยาเพียงอย่างเดียว (1 มล./กก. ของน้ำหนักตัว 0.9 เปอร์เซ็นต์ของน้ำเกลือ) เป็นเวลา 6 สัปดาห์ หนูกลุ่ม II (กลุ่มควบคุมแบบจำลอง) ได้รับ D-gal (200 มก./กก. น้ำหนักตัว, Sigma Chemical, St. Louis, MO) เป็นเวลา 6 สัปดาห์ หนูกลุ่มที่ III (กลุ่มที่ได้รับ resveratrol ปริมาณต่ำ) ได้รับ D-gal และ resveratrol (50 มก./กก. ของน้ำหนักตัว) ที่ละลายในไดเมทิลซัลฟอกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์ (DMSO) เป็นเวลา 6 สัปดาห์ หนูกลุ่ม IV (กลุ่ม resveratrol ปริมาณสูง) ได้รับ D-gal และ resveratrol (100 มก./กก. น้ำหนักตัว) หนูกลุ่ม V (กลุ่ม CR) ได้รับ D-gal และ CR (ได้รับอาหารที่มีแคลอรีต่ำกว่าหนูที่กินในปริมาณจำกัด 40 เปอร์เซ็นต์ [27]) เป็นเวลา 6 สัปดาห์ D-gal ได้รับทางช่องท้องในขณะที่ให้ resveratrol ทางปากตลอดระยะเวลาของการทดลอง หนูถูกสังเวยในวันสุดท้ายของการรักษา จากนั้นเลือด ซีรั่ม และอวัยวะจะถูกเก็บทันทีสำหรับการวิเคราะห์ทางชีวภาพหรือเก็บไว้ที่ −80 องศาเพื่อใช้ในภายหลัง

การทดสอบพฤติกรรม

การทดสอบเขาวงกตน้ำ Morris ได้รับการออกแบบมาเพื่อประเมินความสามารถในการเรียนรู้เชิงพื้นที่และความจำของหนูหลังจาก 6 สัปดาห์หลังการบาดเจ็บ [28] การทดสอบเขาวงกตในน้ำของ Morris ประกอบด้วย4-การเรียนรู้และการฝึกความจำระหว่างวัน และการทดลองด้วยโพรบในวันที่ 5 สัตว์ต่างๆ ได้รับการฝึกในสระน้ำทรงกลม (เส้นผ่านศูนย์กลาง 155 ซม.) พร้อมสัญญาณภาพ แท่นสำหรับหนีภัย (เส้นผ่านศูนย์กลาง 9.0 ซม.) จมอยู่ใต้น้ำ 1.0 ซม. ใต้ผิวน้ำในสระ ซึ่งคงไว้ที่ 25 ± 2 องศา ตำแหน่งของแท่นยังคงอยู่ตรงกลางของทิศตะวันตกเฉียงเหนือตลอด 4-ช่วงการฝึกอบรมหนึ่งวัน ในแต่ละวัน หนูได้รับการฝึกสำหรับหนึ่งช่วงตอนเช้าและหนึ่งช่วงในตอนบ่าย หนูว่ายน้ำอย่างอิสระจนกระทั่งพบแท่นภายใน 120 วินาที หากล้มเหลว จะถูกวางไว้บนแท่นเป็นเวลา 10 วินาที เวลาแฝงในการหลบหนี (การค้นหาแพลตฟอร์มการหลบหนีที่จมอยู่ใต้น้ำ) และความเร็วในการว่ายน้ำถูกบันทึกไว้ การทดลองของโพรบทำโดยถอดแท่นออกและปล่อยให้หนูแต่ละตัวว่ายน้ำอย่างอิสระเป็นเวลา 120 วินาทีภายในสระ จำนวนการข้ามชานชาลาในลานฝึก (ที่ยกชานชาลาออก) ถูกบันทึกด้วยระบบวิดีโอคอมพิวเตอร์ แบบจำลองเขาวงกตน้ำที่มองเห็นได้นั้นไม่ได้ดำเนินการหลังจากสังเกตเห็นความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในความเร็วในการว่ายน้ำระหว่างหนูที่รักษาด้วย D-gal และยานพาหนะ

การตรวจจับตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่เกี่ยวข้องกับความเครียดออกซิเดชัน

ระดับของ MDA, SOD และ T-AOC ในเลือดและเนื้อเยื่อถูกกำหนดด้วยโฟโตเมตริกตามโปรโตคอลของผู้ผลิตโดยใช้ชุดทดสอบเอนไซม์ที่มีจำหน่ายทั่วไป (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing City, PR China) การทดลองทั้งหมดที่อธิบายไว้ในส่วนนี้ดำเนินการเพิ่มขึ้นสามเท่าเพื่อให้ได้ค่าเฉลี่ยและ SD

ระดับของไลโปฟัสซินถูกกำหนดโดยวิธีโซฮาล [29] โดยสังเขป เราชั่งน้ำหนักเปลือกสมอง 0 มก. 200 มก. เติมสารสกัดคลอโรฟอร์ม-เมทานอล (2:1) 2 มล. ทำให้เป็นเนื้อเดียวกันและกรอง จากนั้นล้างสิ่งตกค้างด้วยสารสกัด รวมตัวกรอง เพิ่มสารสกัดเป็น 5 มล. และวัดความเข้มของการเรืองแสงบนเครื่องสเปกโตรมิเตอร์เรืองแสง ความยาวคลื่นที่ปล่อยออกมาคือ 435 นาโนเมตร และความยาวคลื่นที่กระตุ้นคือ 365 นาโนเมตร สเปกโตรฟลูออโรมิเตอร์ได้รับการกำหนดมาตรฐานโดยให้การเบี่ยงเบน 50 ที่ความยาวคลื่นด้านบนด้วยสารละลายควินินไบซัลเฟต 1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ใน 0.1 M H2 SO4 ผลลัพธ์แสดงเป็นหน่วยเรืองแสงสัมพัทธ์/มล.คลอโรฟอร์ม/กรัมน้ำหนักเนื้อเยื่อเปียก

การตรวจจับกิจกรรม TE

สำหรับการสกัดเทโลเมอเรส เนื้อเยื่อประมาณ 30 มก. ถูกล้างสองครั้งใน PBS เย็นจัด และสุดท้ายทำให้เป็นเนื้อเดียวกันใน PBS ประมาณ 150 มล. วัดกิจกรรม TE โดยใช้ชุด TE ELISA ตามคำแนะนำของผู้ผลิต (Nanjing Sen Beijia Biological Technology Co., Ltd., Nanjing, China) ขีดจำกัดความไวของการทดสอบคือ 0.8 IU/L สำหรับ TE

การวิเคราะห์ RT-PCR

ระดับการแสดงออกของ mRNA ของ SIRT1, Foxo3 และ p53 ในตับและเนื้อเยื่อสมองได้รับการวิเคราะห์โดยใช้การวิเคราะห์ RT PCR RNA ทั้งหมดถูกสกัดโดยใช้ Trizol และประเมินปริมาณและความบริสุทธิ์ของพวกมันโดยเครื่องอัลตราไมโครสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ (Thermo Fisher Scientific, USA) ตามการวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 260 และ 280 นาโนเมตร หลังจากการหาปริมาณ cDNA ถูกสังเคราะห์โดยใช้ชุด FastQuant RT (Tiangen Biotech, Beijing, China) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ระดับของการแสดงออกของ SIRT1, Foxo3, p53 mRNA ถูกวัดโดย RT-PCR โดยใช้ TANGEN SuperReal PreMix Plus (Tiangen Biotech, Beijing, China) พร้อมไพรเมอร์เฉพาะ (ตารางที่ 2) PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณดำเนินการด้วยระบบ LightCycler 480 องศา PCR (โรช บาเซิล สวิตเซอร์แลนด์) โดยใช้ 20 μL เป็นปริมาตรรวมของแต่ละปฏิกิริยา การขยาย PCR เริ่มต้นโดย 15 นาทีของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 95 องศา จากนั้นตามด้วย 40 รอบที่ 95 องศาเป็นเวลา 10 วินาที, 59–63 องศา (อุณหภูมิการหลอม) เป็นเวลา 20 วินาทีและ 72 องศาเป็นเวลา 30 วินาที และการบ่มครั้งสุดท้ายที่ 72 องศาเป็นเวลา 5 นาที จำนวนเกณฑ์รอบที่ได้รับของแต่ละยีน (ค่า Ct) ถูกทำให้เป็นมาตรฐานเป็นเท่าของการเปลี่ยนแปลงสัมพัทธ์ตามสมการของ 2-∆∆CT method [30]

ตารางที่ 2: รายการไพรเมอร์

การวิเคราะห์แบบตะวันตก

วิเคราะห์ระดับการแสดงออกของโปรตีนของ p53, FOXO3a, HuR, RPS19BP1 และ DBC1 ในเนื้อเยื่อสมองโดยใช้การวิเคราะห์การซับแบบตะวันตก โปรตีนทั้งหมดของเนื้อเยื่อสมองสกัดโดยใช้ RIPA Lysis Buffer (Beyotime, China) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดโดยใช้ BCA Protein Assay Kit (Beyotime, China) โปรตีน 5 มก. ถูกแยกออกโดยใช้เจล SDS-โพลีอะคริลาไมด์ 12 เปอร์เซ็นต์ และถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF (0.45 μm, มิลลิพอร์, สหรัฐอเมริกา) บล็อกรอยเปื้อนด้วยนมไร้ไขมัน 5 เปอร์เซ็นต์ใน TBS จากนั้นบ่มข้ามคืนที่อุณหภูมิ 4 องศาด้วยการเจือจางแอนติบอดีหลักที่เหมาะสม: anti-p53 (SC- 6243, เทคโนโลยีชีวภาพซานตาครูซ), anti-FOXO3a (#12829, Cell เทคโนโลยีการส่งสัญญาณ), การต่อต้าน HuR (#12582, เทคโนโลยีการส่งสัญญาณด้วยเซลล์), การต่อต้าน AROS (Ab201091, abcam), การต่อต้าน DBC1 (#5857, เทคโนโลยีการส่งสัญญาณด้วยเซลล์), การต่อต้าน- - (AC004, เทคโนโลยี ABclonal) . หลังจากล้างเมมเบรนเพื่อกำจัดแอนติบอดีปฐมภูมิส่วนเกิน เมมเบรนจะถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่เหมาะสมที่เจือจาง 1:2000-1:5000 (AC004 หรือ AS003, เทคโนโลยี ABclonal) เมมเบรนถูกล้าง 3 ครั้งแล้วสร้างภาพโดยใช้ Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo Scientific) - การดำเนินการถูกใช้เป็นการควบคุมภายใน

อิมมูโนฮิสโตเคมี

ตัวอย่างเนื้อเยื่อได้รับการแก้ไขในฟอร์มาลินบัฟเฟอร์ที่เป็นกลาง 10 เปอร์เซ็นต์ภายใน 1 ชั่วโมงหลังจากการผ่าตัดออกและฝังพาราฟินโดยใช้วิธีการมาตรฐาน จากนั้นตัวอย่างที่ฝังพาราฟินแบบคงที่จะถูกตัดออกเป็นส่วนที่มีความหนา 5-μm ซึ่งถูกลดพาราฟินในไซลีน คืนความชุ่มชื้นในเอทานอล และไมโครเวฟบำบัดเพื่อดึงแอนติเจน แอนติบอดีปฐมภูมิที่เจือจางอย่างเหมาะสม anti-p53 (SC-6243, เทคโนโลยีชีวภาพซานตาครูซ) และ anti-FOXO3a (#12829, Cell Signaling Technology) ถูกบ่มเป็นเวลา 60 นาทีที่อุณหภูมิห้องในห้องที่มีความชื้น จากนั้นล้างสไลด์ใน PBS และต่อมาบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิเทียบกับแอนติบอดีต้านกระต่ายและการแสดงภาพของ HRP (ความเข้มข้น 1:300, #074-1506, KPL) จากนั้นล้างสไลด์และส่วนต่างๆ ได้รับการพัฒนาในสารละลายเอนไซม์-สารตั้งต้นไดอะมิโนเบนซิดีน (DAB, Sigma) ภาพของส่วนที่ย้อมด้วยอิมมูโนฮิสโตเคมีถูกจับโดยกล้องจุลทรรศน์ดิจิทัล Olympus (IX-73P1F, Olympus, ญี่ปุ่น)

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ผลลัพธ์แสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SD สำหรับการทดลองอิสระอย่างน้อยสามครั้ง และวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ SPSS 180 ความแตกต่างของกลุ่มในด้านเวลาแฝงในการหลบหนีและความเร็วในการว่ายน้ำในงานฝึกเขาวงกตแห่งน้ำ Morris ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองทาง (ANOVA) ด้วยการวัดซ้ำ ปัจจัยต่างๆ ได้แก่ การบำบัดและวันที่ฝึก ข้อมูลอื่นวิเคราะห์ด้วยการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวตามด้วยการทดสอบ Tukey ภายหลังการทดสอบ ค่าของ P น้อยกว่า 0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญ

บทสรุป

Resveratrol และ CR แสดงกิจกรรมต่อต้านความชราที่คล้ายคลึงกันทั้ง ในหลอดทดลอง และในร่างกาย ซึ่งพิสูจน์ได้จากความสามารถในการยับยั้งการชราภาพและการตายของเซลล์ที่เกิดจาก AAPH และฟื้นฟูความบกพร่องทางสติปัญญาที่เกี่ยวข้องกับอายุที่เกิดจากการให้ D-gal กลไกการต่อต้านความชราของพวกมันรวมถึงการควบคุมกิจกรรม TE ที่เพิ่มขึ้น การลดความเสียหายจากปฏิกิริยาออกซิเดชั่น และการควบคุมวิถี SIRT1 โดยรวมแล้ว 10 ไมโครโมลาร์ เรสเวอราทรอล ในหลอดทดลอง และปริมาณสูงของ เรสเวอราทรอล ในร่างกาย แสดงฤทธิ์ที่ค่อนข้างแรงในการต่อต้านความชราและกระตุ้นระดับ SIRT1 ผลลัพธ์เหล่านี้เกี่ยวข้องกับศักยภาพของ resveratrol ในการเลียนแบบ CR

ตัวย่อ

AAPH, 2,2′-อะโซบิส (2-อะมิดิโนโพรเพน) ไดไฮโดรคลอไรด์; AMPK, ไคเนสโปรตีนที่กระตุ้นอะดีโนซีนโมโนฟอสเฟต; ANOVA การวิเคราะห์ความแปรปรวน AROS แอคทีฟเรกูเลเตอร์ของ SIRT1; CR, การจำกัดแคลอรี่; DBC1 ลบในมะเร็งเต้านม 1; ดี-แกล, ดี-กาแลคโตส; FBS, ซีรั่มวัวของทารกในครรภ์; Foxo3a กล่องส้อม 3a; HuR, แอนติเจน Hu R; MEM สื่อที่จำเป็นขั้นต่ำ PBS, น้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต; PGC-1 , G coactivator รีเซพเตอร์ที่เปิดใช้งาน peroxisome proliferator-1 ; RES, เรสเวอราทรอล; SA -gal, ที่เกี่ยวข้องกับการชราภาพ -galactosidase; SD, ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน; SIRT1 ตัวควบคุมข้อมูลการปิดเสียง TE, เทโลเมอเรส.

ผลงานของผู้เขียน

แนวคิดและการออกแบบงานวิจัย: Gang Chen; การได้มา การวิเคราะห์ และการตีความข้อมูล: Juan Li, Xia Chun Zhang, Yi-Mei Liu; การได้รับเงินทุนและการแก้ไขต้นฉบับที่สำคัญสำหรับเนื้อหาทางปัญญา: Gang Chen, Ke-Li Chen; เขียนต้นฉบับ: Juan Li ผู้เขียนทุกคนได้อ่านและอนุมัติการจัดพิมพ์ต้นฉบับนี้แล้ว กิตติกรรมประกาศและเงินทุน

งานนี้ได้รับทุนสนับสนุนจาก China Postdoctoral Science Foundation (2016M601237) โครงการ Natural Science Foundation (81373704, 30873292)

ผลประโยชน์ทับซ้อน

ไม่มีความขัดแย้งทางผลประโยชน์จากผู้เขียนที่เข้าร่วมทั้งหมด

อ้างอิง

1. Ramis MR, Esteban S, Miralles A, Tan DX, Reiter RJ การจำกัดแคลโคริก เรสเวอราทรอล และเมลาโทนิน: บทบาทของ SIRT1 และผลกระทบต่อความชราและโรคที่เกี่ยวข้อง ผู้พัฒนา Mech Aging 2558; 146–148:28–41.

2. Colman RJ, Beasley TM, Kemnitz JW, Johnson SC, Weindruch R, Anderson RM การจำกัดแคลอรี่ช่วยลดอัตราการเสียชีวิตที่เกี่ยวข้องกับอายุและสาเหตุทั้งหมดในลิงจำพวกลิงชนิดหนึ่ง นัทคอมมูน. 2557; 5:3557.

3. Sohal RS, Weindruch R. ความเครียดจากการออกซิเดชัน การจำกัดแคลอรี่ และความชรา ศาสตร์. 2539; 273:59–63.

4. Testa G, Biasi F, Poli G, Chiarpotto E. การจำกัดแคลอรี่และการเลียนแบบการจำกัดอาหาร: กลยุทธ์ในการปรับปรุงสุขภาพผู้สูงอายุและอายุยืน Curr Pharm Des. 2557; 20:2950–77.

5. เลน MA, Roth GS, Ingram DK การเลียนแบบการจำกัดแคลอรี่: แนวทางใหม่สำหรับ biogerontology วิธี Mol Biol 2550; 371:143–9.

6. Baur JA, Pearson KJ, Price NL, Jamieson HA, Lerin C, Kalra A, Prabhu VV, Allard JS, Lopez-Lluch G, Lewis K, Pistell PJ, Poosala S, Becker KG และอื่นๆ เรสเวอราทรอลช่วยปรับปรุงสุขภาพและการอยู่รอดของหนูด้วยอาหารที่มีแคลอรีสูง ธรรมชาติ. 2549; 444:337–42.

7. Lagouge M, Argmann C, Gerhart-Hines Z, Meziane H, Lerin C, Daussin F, Messadeq N, Milne J, Lambert P, Elliott P, Geny B, Laakso M, Puigserver P และอื่นๆ เรสเวอราทรอลปรับปรุงการทำงานของไมโตคอนเดรียและป้องกันโรคเมตาบอลิซึมโดยกระตุ้น SIRT1 และ PGC-1อัลฟ่า เซลล์ 2549; 127:1109–22.

8. Howitz KT, Bitterman KJ, Cohen HY, Lamming DW, Lavu S, Wood JG, Zipkin RE, Chung P, Kisielewski A, Zhang LL, Scherer B, Sinclair DA ตัวกระตุ้นโมเลกุลขนาดเล็กของ Sirtuins ช่วยยืดอายุขัยของ Saccharomyces cerevisiae ธรรมชาติ. 2546; 425:191–6.

9. Kwon HS, Ott M. ข้อดีและข้อเสียของ SIRT1 แนวโน้ม Biochem Sci. 2551; 33:517–25.

10. Brooks CL, Gu W. SIRT1 ส่งผลต่อเมแทบอลิซึม การแก่ชรา และมะเร็งอย่างไร นัท เรฟ กรกฎ. 2552; 9:123–8.

11. Harman D. ทฤษฎีอนุมูลอิสระของความชรา. Mutat Re. 2535; 275:257–66.

12. Mayo JC, Tan DX, Sainz RM, Lopez-Burillo S, Reiter RJ ความเสียหายจากปฏิกิริยาออกซิเดชันต่อคาตาเลสที่เกิดจากอนุมูลเปอร์ออกซิล: การป้องกันการทำงานโดยเมลาโทนินและสารต้านอนุมูลอิสระอื่นๆ ฟรี Radic Res 2546; 37:543–53.

13. Hubackova S, Krejcikova K, Bartek J, Hodny Z. IL1- และ TGF -Nox4 การส่งสัญญาณ ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน และการตอบสนองต่อความเสียหายของ DNA เป็นคุณลักษณะร่วมกันของการจำลองแบบ พาราที่เหนี่ยวนำให้เกิดมะเร็ง และพาราซีนที่เหนี่ยวนำด้วยยา 'Bystander senescence '. เอจจิ้ง (ออลบานี นิวยอร์ก) 2555; 4:932–51. https:// doi.org/10.18632/aging.100520.

14. Cui X, Zuo P, Zhang Q, Li X, Hu Y, Long J, Packer L, Liu J. การได้รับ D-galactose อย่างเป็นระบบแบบเรื้อรังทำให้สูญเสียความทรงจำ การเสื่อมของระบบประสาท และความเสียหายจากอนุมูลอิสระในหนู: ผลการป้องกันของ R{{ 2}}กรดไลโปอิก J Neurosci ความละเอียด 2549; 84:647–54.

สอบถามเพิ่มเติม:

อีเมล:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: บวก 86 15292862950