อนุภาคนาโนซิงค์ออกไซด์ส่งเสริมกระบวนการชราภาพในลักษณะที่ขึ้นกับขนาด

โปรดติดต่อoscar.xiao@wecistanche.comสำหรับข้อมูลเพิ่มเติม

เชิงนามธรรม

สังกะสีออกไซด์ (ZnO) อนุภาคนาโน (NPs) มักใช้ในสินค้าเครื่องสำอาง โรงเรือน ไบโอเซนเซอร์ และการนำส่งยา เช่นเดียวกับระบบในอุดมคติในหลอดทดลอง เซลล์ต้นกำเนิดจากเยื่อหุ้มเซลล์ (MSC) ถูกใช้เพื่อทดสอบความเป็นพิษเฉียบพลัน ในการศึกษานี้ ผลของความเป็นพิษต่อเซลล์ที่ขึ้นกับขนาดของ ZnO NPs บน MSCs ได้รับการประเมิน MSC ของไขกระดูกและไขมันถูกบำบัดด้วย ZnO NPs ด้วยขนาดเฉลี่ย 10-30 และ 35-45 นาโนเมตร ความเข้มข้น 5 และ 10ug/มล. ของ ZnO NP พบว่าเป็นความเข้มข้นที่ปลอดภัยสำหรับขนาด NP ที่ 10-30 และ 35-45 นาโนเมตร ตามลำดับประโยชน์ของซิสแทนเช่การวิเคราะห์วัฏจักรเซลล์ระบุว่า ZnO NPs ขนาดเล็กมีผลเสียต่อกระบวนการเข้าสู่เซลล์ในการสังเคราะห์ DNA มากกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับขนาดที่ใหญ่กว่า ผลการทดสอบ -galactosidase แสดงให้เห็นการส่งเสริม Forocess แก่ในเซลล์ที่รับการรักษาด้วย ZnO NPs ที่มีขนาดเล็กกว่า พบว่า NP ทั้งสองขนาดเพิ่มการควบคุมยีนที่เกี่ยวข้องกับการแก่ก่อนวัย NF-kB และ p53 และปรับลดยีน Nanog ต่อต้านวัย โดยสรุปแล้ว ZnO NPs ขนาดที่เล็กกว่าสามารถปรับปรุงกระบวนการชราภาพในเซลล์ได้

กรุณาคลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

1. บทนำ

ในทศวรรษที่ผ่านมา อุตสาหกรรมนาโนเทคโนโลยีจำเป็นต้องได้รับการพัฒนาอย่างรวดเร็วทั่วโลก สังกะสีออกไซด์ (ZnO) อนุภาคนาโน (NPs) โดยทั่วไปมักใช้ในผลิตภัณฑ์ดูแลความงาม โรงเรือน ไบโอเซนเซอร์ การนำส่งยา การสร้างภาพชีวภาพ และเป็นสารต้านเชื้อราและแบคทีเรีย [1-5] โครงสร้างนาโนของ ZnO มีคุณสมบัติที่ยอดเยี่ยมสองสามอย่าง เช่นเดียวกับความเสถียรของสารประกอบ ช่วงพื้นผิวจำเพาะที่ดี ไฮไลท์การโต้ตอบของอิเล็กตรอนสูง และกิจกรรมของสารประกอบไฟฟ้า [6] ZnO NPs ส่วนใหญ่ใช้เป็นสารเติมแต่งแสงยูวีที่กระจายตัวในผลิตภัณฑ์เครื่องสำอาง เช่น ครีมกันแดด ยาสีฟัน และผลิตภัณฑ์ที่สวยงาม [7, 8] ด้วยการใช้สารโครงสร้างระดับนาโนอย่างแพร่หลายสำหรับสินค้าเชิงพาณิชย์ ความปลอดภัยทางชีวภาพของวัสดุเหล่านี้ได้รับการพิจารณาเพื่อสำรวจผลกระทบทางธรรมชาติและทางพิษวิทยาของการแสดงอย่างผิดปกติและทันทีของสารเหล่านี้ [9] เนื่องจากชนิดของออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา (ROS) และไอออนของโลหะที่ไม่ละลายน้ำ วัสดุนาโนเช่น ZnO มีผลกระทบที่เป็นพิษต่อเซลล์ [10,11]ซิสแทนเช่ โคเลสเตอรอลเนื่องจากความเป็นพิษของ ZnO NPs ในน้ำบริสุทธิ์พิเศษนั้นสูงกว่าในน้ำเกลือที่มีบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) ในตัวกลางที่เป็นน้ำต่างๆ ความเป็นพิษของ ZnO NPs ส่วนใหญ่สอดคล้องกับไอออนของสังกะสีอิสระ [12] แม้ว่า Zinc NP complex กับตัวกลางจะทำให้เกิดความเป็นพิษต่ำกว่า ความเข้มข้นของ Zn2 plus ion จะลดลงอย่างมาก Zn2 ที่สร้างขึ้นบวกกับ ZnO NPs ที่ไม่ละลายน้ำทำให้เกิดเนื้อร้ายและการอักเสบ [13] ROS ระหว่างเซลล์ซึ่งเกิดจาก ZnO NPs ทำให้เกิดการตายของเซลล์และความผิดปกติของ mitochondrial oxidative phosphorylation [10]

Cistanche สามารถต่อต้านริ้วรอย

การทดลองในร่างกายหลายครั้งได้ชี้ให้เห็นถึงผลกระทบที่เป็นอันตรายของ Zn NPs ต่อรูปแบบชีวิตต่างๆ เช่น แมลงหวี่ [14] ปลา [15] สัตว์ครึ่งบกครึ่งน้ำ [16] หนู [17] หนู [18] และแบคทีเรีย [19] Zn NP ยังได้รับรายงานว่าแสดงความเป็นพิษ ในหลอดทดลอง [20-22] แม้จะมีความเป็นพิษที่ซ่อนอยู่หลายอย่างที่เกี่ยวข้องกับ ZnO NPs แต่ก็มีการใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับการใช้งานด้านชีวการแพทย์และวัตถุประสงค์ทางเภสัชกรรมต่างๆ [23] ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีการวิจัยเพิ่มเติมเพื่อประเมินผลกระทบที่เป็นพิษของสารนี้ต่อเซลล์ ในการวิจัยด้านพิษวิทยา MSC ถูกใช้เป็นแบบจำลองในอุดมคติในร่างกาย [24] การแยกและการขยาย MSCs ในวัฒนธรรมเป็นเรื่องง่าย และการสร้างความแตกต่างทำได้โดยการกระตุ้นที่เหมาะสม เซลล์ต้นกำเนิดจากเซลล์ต้นกำเนิดจากไขกระดูก (BMSCs) แสดงความไวต่อการทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ของยารักษาโรคมะเร็งและยาอื่นๆ ที่เป็นพิษต่อเซลล์ [25] นอกจากนี้ เซลล์ต้นกำเนิดจากเยื่อหุ้มเซลล์จากไขมัน (AMSCs) ยังได้ถูกนำมาใช้เพื่อประเมินความปลอดภัยของยาและเพื่อค้นหายา [26] ดังนั้น ในการศึกษานี้ เราคิดว่า AMSCs และ BMSCs ที่กำหนดเป้าหมายโดย ZnO NP อาจเหมาะสมสำหรับการพิจารณาความเสี่ยงที่อาจเกิดขึ้นในการพัฒนาสูงวัย ในการประเมินความเป็นพิษของเซลล์ การทดสอบการแสดงออกของยีน ซึ่งเป็นปัจจัยที่มีบทบาทในกระบวนการที่เป็นพิษในระยะเริ่มต้นนั้นมีความสำคัญอย่างมาก [26] ดังนั้น ยีน Nanog จึงเป็นตัวบ่งชี้ของเซลล์ต้นกำเนิดเฉพาะในการวิจัยปัจจุบันเพื่อคาดการณ์ความเป็นพิษ นาโนกมีหน้าที่สองอย่างในการสร้างความแตกต่างของเซลล์ต้นกำเนิดและการต่ออายุตัวเอง [27] นอกจากนี้ ยีน Nanog ยังกระตุ้นการปราบปรามการชราภาพโดยปรับลดการแสดงออกของยีน p27KIPI [28]ผลข้างเคียงของ cistanche deserticolaในการตอบสนองแบบคลาสสิกต่อความเป็นพิษต่อยีน เพื่อจำกัดการเพิ่มจำนวนเซลล์ p53 ในจีโนมที่เสียหายทำให้เกิดการหยุดวงจรของเซลล์และการตายของเซลล์ การตรวจสอบจำนวนมากได้เน้นย้ำถึงบทบาทของเฟรมเวิร์ก NF-kB ในการกระตุ้นการเปลี่ยนแปลงที่กระตุ้นในเนื้อเยื่อในช่วงอายุมากขึ้น [29] ดังนั้นในการศึกษานี้ การทดสอบวัฏจักรเซลล์ การทดสอบกาแลคโตซิเดสในแหล่งกำเนิด และระดับ mRNA ของยีน NF-kB, p53 และนาโนก

2 วัสดุและวิธีการ

2.1 คุณสมบัติและลักษณะของอนุภาคนาโน

ZnO NPs ขนาดต่างๆ กันสองขนาด (Sigma Aldrich, USA) โดยมีข้อมูลต่อไปนี้ถูกซื้อ: ขนาดหนึ่งที่มีขนาดเฉลี่ย 10-30nm บวกความบริสุทธิ์ 99 เปอร์เซ็นต์ ความหนาแน่น 5.606g/cm³ และประมาณ 20-60m2/ g พื้นที่ผิวและอื่น ๆ ที่มีขนาดเฉลี่ย 35-45 นาโนเมตร, ＋ความบริสุทธิ์ร้อยละ 99, ความหนาแน่น 5.606g/cm³ และพื้นที่ผิวประมาณ 65m-/g (รูปที่ 1) จากนั้น สต็อค ZnO NPs 100ug/มล. ใน 1 มล. ของ PBS ถูกเตรียมโดย sonication เป็นเวลา 3 นาที

2.2 การแยกตัวของสเต็มเซลล์มีเซนไคมอล

BMSC ถูกเลือกจากหนูแรทเพศผู้ {{0}}สัปดาห์ (200-250 ก.) นำ epiphyses ออก ไขกระดูกเข้าถึงได้ และไขกระดูกทั้งหมด (BM) ปลั๊กถูกทำให้หน้าแดงจากกระดูกหน้าแข้งและกระดูกต้นขาด้วยเข็มฉีดยาขนาด 10 มล. ที่มีสื่อกลางอินทรีดัดแปลงของ Dulbecco (DMEM) (Laboratories Inc., MA, USA) บวก 10 เปอร์เซ็นต์ของซีรั่มโคนมของทารกในครรภ์ (FBS) ตัวอย่าง BM ถูกรวบรวมและทำให้อารมณ์เสียอย่างแม่นยำโดยเข็มความปรารถนาที่ต่อเนื่องกันของเกจ 18 และ 20 เกจต่อท้ายเข็มฉีดยาขนาด 10 มล. ที่คล้ายกัน จากนั้น ระงับเซลล์ถูกหมุนเหวี่ยงเป็นเวลา 5 นาทีที่ 1,000 รอบต่อนาที หลังจากการอัดเม็ดเซลล์ พวกมันถูกแขวนลอยใหม่ในตัวกลางที่มี FBS 10 เปอร์เซ็นต์ ในการเล่นตัวนับจำนวนเซลล์ กรดอะซิติก 4 เปอร์เซ็นต์ถูกผสมกับสารแขวนลอยในปริมาณต่ำเพื่อสลายเซลล์เม็ดเลือดแดง การนับเซลล์ทำได้โดยฮีโมไซโตมิเตอร์ ต่อจากนั้น เซลล์ขนาด 5×10' ถูกชุบในจานเพาะเลี้ยงขนาด 100 มม. เก็บไว้ในคาร์บอนไดออกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์ ที่ 37 องศา และเปลี่ยนด้วยอาหารสดทุกๆ 3-4 วัน [30] การใช้ collagenase type I (น้ำหนัก 0.15 เปอร์เซ็นต์ต่อปริมาตร) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37 องศา เนื้อเยื่อไขมันจะถูกแยกด้วยเอนไซม์ ในการกำจัดอนุภาคที่ไม่แยกตัวออกจากกัน สารแขวนลอยถูกกรองด้วยตัวกรอง 70-um จากนั้น DMEM ที่มี FBS 10 เปอร์เซ็นต์ (v/v) ถูกเติมและหมุนเหวี่ยงที่ 700×g เป็นเวลา 5 นาที ในที่สุด เม็ดของเซลล์ถูกแขวนลอยใหม่ใน DMEM ด้วยเพนิซิลลิน/สเตรปโตมัยซิน 1 เปอร์เซ็นต์ (v/v) และ 10 เปอร์เซ็นต์ (v/v)FBS [31]

2.3 การเพาะเลี้ยงเซลล์

AMSC และ BMSC เพาะเลี้ยงใน DMEM (Laboratories Inc., MA, USA) โดยใช้ยาปฏิชีวนะ 1 เปอร์เซ็นต์และ FBS 10 เปอร์เซ็นต์ในสภาวะการเพาะมาตรฐาน (ที่ 37 องศา ใน CO2 5 เปอร์เซ็นต์ และความชื้น 95 เปอร์เซ็นต์) [32]

2.4 การกำหนดลักษณะของเครื่องหมายพื้นผิวของ BMSC และ AMSCS

BMSC และ AMSC ถูกเก็บเกี่ยวเป็นเวลา 5 นาทีที่ 37 องศา เคลือบโดยการปั่นแยก 200×g เป็นเวลา 5 นาที และล้างด้วย PBS ที่แช่เย็น ถัดไป 5 ul ของแอนติบอดีคอนจูเกต fluorescein (FITC) ซึ่งรวมถึง CD34-PE, CD90-FITC, CD45-FITC และ CD73-FITC (Thermo Fisher Scientific, Germany) ถูกเพิ่มเข้าไปใน BMSCs และ AMSCs แล้วเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้อง (RT) และในที่มืดเป็นเวลา 20 นาที ตัวอย่างถูกประเมินด้วยโฟลว์ไซโตมิเตอร์ (BD FACS Calibre; San Jose, CA, USA)[33, 34]

2.5 ความเป็นพิษต่อเซลล์ในหลอดทดลอง

สำหรับการทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ของ NPS BMSC และ AMSC ถูกเพาะเลี้ยงในเพลต {0}}หลุมที่จุดบรรจบกันที่ 70-80 เปอร์เซ็นต์ อนุภาคทั้งหมดถูกแขวนลอยใน DMEM ที่สมบูรณ์ (NPs ที่เจือจาง 10 เปอร์เซ็นต์กับ 90 เปอร์เซ็นต์) DMEM ที่มี PBS) [35] บาธ sonication ทำสองครั้ง แต่ละครั้งเป็นเวลา 5 นาที เพื่อผสมความเข้มข้นของ ZnO NPs สุดท้ายอย่างละเอียด ดังนั้น BMSC และ AMSC จึงถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกัน (0,3,5,10,25 และ 50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ของ ZnO NPs เป็นเวลา 24, 48 และ 72 ชั่วโมง จากนั้น การทดสอบ MTT ถูกใช้เพื่อทดสอบความมีชีวิตของเซลล์ที่บำบัดปริมาณ cistanche redditการเตรียมสารละลาย MTT stock ((3-(4,5-diminish ethyl thiazole-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide) ถูกทำให้เสร็จโดยการเติม 1 มิลลิลิตรของ PBS ถึง 5 มก. MTT (ซิกมา สหรัฐอเมริกา) ในที่มืด จากนั้น 20ul ของสารละลายสต็อกถูกผสมกับหลุมทดลองทั้งหมด สุดท้าย ตัวอย่างถูกขับออกจากตู้ฟักและผสมกับ DMSO โดยมีสีม่วงที่เห็นได้ชัดเจนในขั้นตอนนี้ ซึ่งได้รับการพัฒนาผ่านการปิเปตและอ่านค่าทันทีต่อหน้า UV ที่ 570 นาโนเมตร

2.6 การทดสอบวัฏจักรเซลล์

BMSC และ AMSC ถูกเพาะในเพลต 6-หลุมที่ต่างกัน ในขณะที่พบการบรรจบกันของเซลล์ 70 เปอร์เซ็นต์ ความเข้มข้นของ ZnO NP ที่ปลอดภัย (5 และ 10ug/มล. ในขนาดที่เล็กกว่าและใหญ่กว่าของ ZnO NPs ตามลำดับ) ได้รับการรักษาในเซลล์สำหรับการทดสอบ MTT และฟักเป็นเวลา 72 ชั่วโมงที่ 37 องศา (5 เปอร์เซ็นต์) CO2). สื่อถูกดึงออกจากดิสก์คอนโฟคอลหลังจาก 72 ชั่วโมงและถูกล้างด้วย PBS สองครั้งและหมุนเหวี่ยง เซลล์ถูกตรึงโดยใช้เอทานอล (70 เปอร์เซ็นต์) ที่ 4 องศาเป็นเวลา 2 วัน จากนั้น เซลล์ที่ฟักแล้วถูกล้างอีกครั้งด้วย PBS และเขย่าเล็กน้อย ตามนั้นสื่อจะถูกลบออกจากดิสก์คอนโฟคอลอย่างสมบูรณ์ ถัดไป 10ul RNase ถูกเติมและบ่มเป็นเวลา 45 นาที สำหรับการย้อมสี เซลล์ถูกแขวนไว้ด้วยสารละลายโพรพิเดียมไอโอไดด์ 10ul (ซิกมา สหรัฐอเมริกา) โฟลว์ไซโตมิเตอร์ถูกฟ้องเพื่อประเมิน DNA ของเซลล์ [36]

2.7 Galactosidase in situ assay สำหรับความชราของเซลล์

กิจกรรมของ senescence-associated-galactosidase (SA-gal) ซึ่งเป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพทั่วไปสำหรับการทดสอบอายุในเซลล์ ได้รับการประเมินโดย SA- -gal staining kit (Thermo Fisher Scientific, Germany) เช่นเดียวกับในการศึกษาก่อนหน้านี้ [37]. เซลล์ถูกเพาะในเพลต 24-หลุม และบำบัดด้วย ZnO NP สองขนาดที่ต่างกันด้วยความเข้มข้นที่ปลอดภัย ต่อไป พวกมันถูกล้างใน PBS ตรึงในส่วนผสมตรึง G/F (20 เปอร์เซ็นต์ของกลูตาราลดีไฮด์ ＋ 37 เปอร์เซ็นต์ ฟอร์มาลไดด์) และบ่มที่ RT เป็นเวลา 3-5 นาที จากนั้นเซลล์ถูกย้อมในสารละลายย้อมสีสด (10 มล. ซิเตรต Na บวก 250ul โพแทสเซียมเฟอริไซยาไนด์ ＋250ul โพแทสเซียมเฟอร์โรไซยาไนด์＋100ul MgCl＋250ul NaCl＋200ul X-gal) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงในที่มืดที่ 37 องศา SA- -เซลล์กัล-บวกแสดง สีเขียวถูกมองเห็นโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แสงกลับหัว

2.8 PCR แบบเรียลไทม์

BMSCs และ AMSCs ที่มี ZnO NPs ต่างกันสองขนาดได้รับการบำบัดในความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุด 5 และ 10 ug/ml ตามลำดับ พวกมันถูกเก็บเกี่ยวหลังจาก 48 ชั่วโมง และใช้ชุดสกัด RNA (Bio Basic INC) เพื่อแยก RNA ทั้งหมด cDNA เส้นแรกของ cDNA ถูกสังเคราะห์โดยการถอดรหัสแบบย้อนกลับโดยใช้ชุด SYBR Green qPCR MasterMix 2X, SYBR degree Premix Ex TaqIM (TaKaRa, Japan) จากนั้นจึงประเมินคุณภาพและปริมาณของ cDNA ที่สังเคราะห์โดยเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific ประเทศเยอรมนี)ประโยชน์ของสารสกัดจาก cistancheจากนั้น 2ul ของ cDNA ถูกใช้สำหรับการขยายยีนเป้าหมาย ไพรเมอร์เฉพาะได้รับการออกแบบโดยซอฟต์แวร์ Primer 3 และใช้เพื่อขยายการแสดงออกของยีน p53, NF-kB และนาโนก (General Biotech, Korea) ลำดับของไพรเมอร์แสดงไว้ในตารางที่ 1

ระดับการแสดงออกถูกทำให้เป็นมาตรฐานจนถึงระดับการแสดงออกของยีน GAPDH เป็นยีนการดูแลทำความสะอาด ในการทำ PCR แบบเรียลไทม์ จะใช้รอบแรกที่ 95 องศาเป็นเวลา 3 นาที และ 40 รอบที่ 95 องศาสำหรับช่วง 20 วินาทีที่ 60 องศาเป็นเวลา 20 วินาที และที่ 72 องศาเป็นเวลา 30 วินาที

2.9 การวิเคราะห์ทางสถิติ

การทดสอบทั้งหมดดำเนินการเป็นสามเท่า และผลลัพธ์แสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) ข้อมูลถูกป้อนลงในซอฟต์แวร์ SPSS (IBM Corp. NY, USA) และวิเคราะห์โดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองทาง (ANOVA)

3 ผลลัพธ์

3.1 การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทรีของสเต็มเซลล์มีเซนไคม์

เซลล์ต้นกำเนิดมีเซนไคมอลของหนูแรทถูกแยกออกจากแหล่งกำเนิดสองแหล่ง ซึ่งรวมถึงเนื้อเยื่อไขมันและ BM มาร์คเกอร์ CD พื้นผิวของ MSC ได้รับการตรวจสอบ และพบ AMSC หรือ BMSC ส่วนใหญ่ (98.18 และ 99.62 เปอร์เซ็นต์ ) สำหรับ CD90 เป็นมาร์กเกอร์พื้นผิวเชิงบวกใน MSC (รูปที่ 2A, B) นอกจากนี้ 94.80 และ 99.76 เปอร์เซ็นต์ของ CD73 ใน AMSC หรือ BMSC ถูกย้อมอย่างแน่นอน ตามลำดับ (รูปที่ 2A, B) นอกจากนี้ เปอร์เซ็นต์ที่อ่านไม่ได้ของ BMSC หรือ AMSC แสดงการแสดงออกของ CD45 (0.18 หรือ 0.56 เปอร์เซ็นต์ ) และ CD34 (0.71 หรือ 12.65 เปอร์เซ็นต์ ) ใน AMSC หรือ BMSC ตามลำดับ ซึ่งเป็นเครื่องหมายของเชื้อสายที่สร้างเม็ดเลือด (รูปที่ .2A, B). โปรไฟล์ระดับโมเลกุลเหล่านี้แสดงให้เห็นถึงคุณสมบัติพิเศษของ BMSC และ AMSC นอกจากนี้ยังอนุมัติการกำจัดเซลล์เม็ดเลือดที่มีคุณภาพและการแยกเซลล์ต้นกำเนิดจากเยื่อหุ้มเซลล์ออกจากเนื้อเยื่อไขมันและ BM ในระหว่างการแยกเซลล์สโตรมอล

3.2 ความเป็นพิษต่อเซลล์ในหลอดทดลอง

การทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ตามสีแบบ MTT ถูกนำมาใช้เพื่อตรวจสอบความอยู่รอดของ BMSC หรือ AMSC หลังการบำบัดด้วย ZnO NPs 10-30 และ 35-45 นาโนเมตร เป็นเวลา 1,2 และ 3 วัน (รูปที่ 3) ตามข้อมูลที่แสดงในรูปที่ 2 ผลกระทบของขนาด ZnO NP ที่แตกต่างกันสองขนาดบน BMSC หรือ AMSC นั้นขึ้นอยู่กับขนาดยาและเวลา ที่ขนาดยา 5 และ 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร, 10-30 และ 35-45 นาโนเมตร ZnO NPs บ่งชี้การมีชีวิตที่ดีสำหรับ AMSC และ BMSC ตามลำดับ (รูปที่ 3) นอกจากนี้ ความมีชีวิตของ AMSC และ BMSC ที่มี 35-45 นาโนเมตร ZnO NPs ลดลงในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยาและเวลาที่ความเข้มข้นเท่ากัน (รูปที่ 3)

3.3 การทดสอบวัฏจักรเซลล์

ผลของ ZnO NPs ต่อการกระจายรอบเซลล์ของ BMSC และ AMSCs ได้รับการศึกษาโดยใช้การย้อมด้วยโพรพิเดียม ไอโอไดด์ และวัดโดยโฟลว์ไซโตเมทรี ดังแสดงในรูปที่ 4 AMSC และ BMSC ที่บำบัดด้วย 10-30nm ZnO NPs

ระบุว่าอัตราส่วนของเซลล์เข้าสู่ระยะ GO/Gl เพิ่มขึ้น (82.2 และ 82.01 เปอร์เซ็นต์ ) เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (81.92 และ 78.76 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ) เมื่อสัญญาณที่ขับเคลื่อนการเพิ่มจำนวนพบการตายของเซลล์หรือขาดหายไป เซลล์มีแนวโน้มที่จะเพิ่มขึ้นใน G0/G1 [38]

นอกจากนี้ ใน AMSC และ BMSC ที่บำบัดด้วย 10-30nm ZnO NPs ระยะ G2/M ลดลง (7.38 และ 9.98 เปอร์เซ็นต์ที่เปิดกว้าง) เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (10.04 และ 13.47 เปอร์เซ็นต์ ) ซึ่งบ่งชี้ว่าเซลล์ถูกจับกุมที่ วัฏจักรเซลล์ S และ G2/M และไม่เพิ่มจำนวนอย่างแข็งขัน (รูปที่ 4) อย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์วัฏจักรเซลล์ของ 35-45 nm ZnO NPs บ่งชี้ถึงการสะสมที่เพิ่มขึ้นของเซลล์เฟส G2/M ใน AMSCs และ BMSCs (14.19 และ 16.18 เปอร์เซ็นต์ อย่างเปิดกว้าง) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม G2/M (10.04 และ 13.47 เปอร์เซ็นต์ ) แสดงถึงการชะลอตัวของกระบวนการวัฏจักรเซลล์ (รูปที่ 4) เมื่อ DNA เสียหาย จุดตรวจ G2 จะยับยั้งการแบ่งเซลล์แบบไมโทซิส และทำให้แน่ใจได้ว่าจีโนมที่ปราศจากข้อผิดพลาดจะขยายจำนวนขึ้นซ้ำไปยังเซลล์ลูกสาวแต่ละเซลล์

3.4 กาแลคโตซิเดสในแหล่งกำเนิด assay

การทำงานของเอนไซม์เบตา-กาแลคโตซิเดสถูกใช้ในงานนี้เพื่อตรวจสอบผลของ 10-30 และ 35-45 นาโนเมตร ZnO NPs ต่อการชราภาพของ BMSC และ AMSC ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่าบริเวณเซลล์ที่มีการย้อมสีเขียวเป็นบวกพบบ่อยขึ้นในกลุ่มที่ได้รับ ZnO NP ในเซลล์ต้นกำเนิดจากหนูทั้งสองประเภทเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 5A, B)

ในเซลล์ปกติ กรดไลโซโซม -กาแลคโตซิเดสถูกผลิตและรวบรวมในไลโซโซม ตามที่สังเกตพบในกลุ่มควบคุม แต่ในเซลล์ชราภาพ ไลโซโซมเพิ่มขึ้นและสร้างระดับบนของ -galactosidase ที่ชื่อว่า senescence-associated -galactosidase (SA- -gal) ตามที่ตรวจพบในเซลล์ที่บำบัดด้วย ZnO NPs (รูปที่ 5) เซลล์บวกของ SAgal ถูกย้อมเป็นสีน้ำเงินแกมเขียวภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบลานสว่าง เซลล์ที่บำบัดทั้งสองเซลล์มีค่าเป็นบวกเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม สีเขียวอมฟ้าสูงสุดได้มาใน AMSC ด้วย 10-30nm ZnO NPs (รูปที่ 5A)

3.5 PCR แบบเรียลไทม์

การแสดงออกสัมพัทธ์ของยีน NF-kB, P53 และ Nanog ถูกประเมินเทียบกับ GAPDH เป็นยีนการดูแลทำความสะอาดบนทั้ง BMSC และ AMSC ซึ่งสัมผัสกับ ZnO NP 5 และ 10ug/ml ใน 10-30 และ 35-45 ขนาดนาโนเมตร ตามลำดับ หลังจาก 48 ชม. ผลลัพธ์ของการแสดงออกของยีน Nanog ในเซลล์ที่บำบัดด้วย 10-30 และ 35-45 nm ZnO NPs แสดงให้เห็นอย่างมีนัยสำคัญ (P<0.01)lower regulation="" in="" the="" amscs="" (fig.6a)="" and="" bmscs="" in="" comparison="" with="" the="" control="" group="" (fig.="">

เซลล์ที่บำบัดด้วย 10-30nm ZnO NPs แสดงการแสดงออกที่ต่ำกว่าของยีน Nanog เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ที่รับการรักษาด้วย

4. การอภิปราย

การศึกษานี้ประเมินผลกระทบที่เป็นพิษของ ZnO NP สองขนาดต่อ BMSC และ AMSC;10-30nm เมื่อมีขนาดเล็กกว่าและ 35-45nm เมื่อมีขนาดใหญ่ขึ้น ผลการวิจัยพบว่า ZnO NPs ที่มีขนาดเล็กกว่ามีผลเป็นพิษมากกว่าขนาดที่ใหญ่กว่า พื้นที่ผิวและขนาดอนุภาคของ NPs เป็นคุณสมบัติของวัสดุที่สำคัญจากมุมมองทางพิษวิทยา เมื่อขนาดอนุภาคลดลง พื้นที่ผิวของมันจะสูงขึ้นและอนุญาตให้แสดงอนุภาคหรืออะตอมในระดับที่สูงขึ้นอย่างผิวเผินเมื่อเทียบกับด้านในของวัสดุ [39]

วัสดุนาโนที่มีขนาดเล็กกว่า 50 นาโนเมตรแสดงคุณสมบัติทางเคมีกายภาพที่ไม่ซ้ำกัน เนื่องจากมีขนาดเล็ก พื้นที่ผิวสูง ต้นทุนต่ำ มีปฏิกิริยาดีขึ้น และเข้าสู่ตัวแบ่งเซลล์ได้ง่าย [40-42] จากผลการทดสอบ MTT ความเข้มข้นที่เหมาะสมและปลอดภัยของ ZnO NPs ที่มีขนาดเล็กและใหญ่ขึ้นที่ศึกษาคือ 5 และ 10 ug/ml ตามลำดับ เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม การวิเคราะห์วัฏจักรเซลล์ของเราแสดงให้เห็นว่าความเข้มข้นที่ปลอดภัยของ ZnO NP ขนาด 10-30 นาโนเมตรมีผลเป็นพิษต่อ AMSC โดยการลดจำนวนเซลล์ในเฟส S และ GO/G1 ซึ่งบ่งชี้ถึงการจับกุมกระบวนการและการสูญเสียเซลล์ ของสัญญาณการขยายตัวของไดรฟ์ ZnO NPs ในขนาด 35-45 นาโนเมตร ทำให้เซลล์ในเฟส G2/M และ S ลดลง ส่งผลให้กระบวนการรอบเซลล์ช้าลง

ผลการศึกษาของเราสอดคล้องกับการศึกษาอื่นๆ ที่แสดงให้เห็นว่า NPs อาจนำไปสู่การตายของเซลล์โดยการทำอันตรายต่อ DNA หรือออร์แกเนลล์ [43, 44] แม้ว่าจะมีรายงานทางพิษวิทยาที่จำกัดเกี่ยวกับผลกระทบของ ZnO NPs แต่ก็มีรายงานบางฉบับเกี่ยวกับผลกระทบที่เป็นพิษต่อเซลล์ของ ZnO NP ในหลอดทดลอง [45-47] การศึกษาพบว่าความเครียดออกซิเดชันถูกกระตุ้นในเซลล์ TR146 ที่มีความเข้มข้น 10ug/มล. ของ ZnO NPs [48] และในเซลล์ SH-SY5Y ที่มีความเข้มข้น 15 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร [49] ไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบที่ปล่อยออกมาในเซลล์ THP-1 ที่มี 17.69 ug/ml ของ ZnO NPs 【20】 ความเสียหายของดีเอ็นเอยังเกิดขึ้นที่ความเข้มข้น 6.4 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรของ ZnO NPs ในเซลล์มะเร็งลำไส้ของมนุษย์ [50] และที่ความเข้มข้น 12.5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรในเซลล์เยื่อบุผิวของไตของหนูแรท [51] การสัมผัสกับวัสดุนาโนเป็นสิ่งที่หลีกเลี่ยงไม่ได้เพราะสิ่งเหล่านี้กลายเป็นส่วนหนึ่งในชีวิตประจำวันของเรา ดังนั้น ความเป็นพิษของการวิจัยวัสดุนาโนจึงถูกนำมาพิจารณา [52] รูปที่ 9 แสดงปฏิสัมพันธ์ของ ZnO NPs ในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม การกำหนดเซลล์ในวัยชราแสดงให้เห็นระดับกิจกรรม lysosomal -galactosidase ที่เพิ่มขึ้น [53] ผลการทดสอบ SA- -gal ของเราพบว่า ZnO NPs ทั้งในขนาดที่เล็กกว่าและใหญ่กว่า (10-30 และ 35-45 นาโนเมตร) กระตุ้นเซลล์ให้ผลิตไลโซโซม อย่างไรก็ตาม สีเขียวอมฟ้าสูงเกิดจากระดับไลโซโซมสูงในเซลล์ที่สัมผัสกับ ZnO NPs 10-30 นาโนเมตร เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม

P53 ทำงานเป็นคุณภาพชีวิตที่เป็นเลิศของการทำงานของตัวเก็บเสียงเนื้องอกที่แข็งแกร่งและตัวควบคุมอายุ [54] p53 สามารถลดและเพิ่มความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันได้ อาจเป็นเพราะผลกระทบสองเท่าต่อการชราภาพ ผลลัพธ์ PCR แบบเรียลไทม์ของเราบ่งชี้ว่ามีการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของยีน p53 และ NF-kB ในเซลล์ที่สัมผัสกับ ZnO NP ทั้งสองขนาด อย่างไรก็ตาม ยีนเหล่านี้แสดงออกมากเกินไปในเซลล์ที่บำบัดด้วย NPs ที่มีขนาดเล็กกว่า (10-30nm) นอกจากนี้ ระดับ mRNA ของยีน Nanog ยังถือเป็นยีนต่อต้านวัยอีกด้วย สำหรับยีน Nanog ผลการศึกษาของเราแสดงให้เห็นการปรับลดขนาดของ ZnO NPs ที่ศึกษาในเซลล์ที่ได้รับการรักษาทั้งสองอย่างมีนัยสำคัญ อย่างไรก็ตาม การปรับลดต่ำที่สุดในขนาด 10-30nm บ่งชี้ว่า ZnO NP สามารถเป็นพิษได้มากกว่าในขนาดที่เล็กกว่าในขนาดที่ใหญ่กว่า (35-45 นาโนเมตร)

5. สรุป

ZnO NPs (10-30 และ 35-45 nm) แจ้งให้เซลล์เข้าสู่กระบวนการชรา ขนาดที่เล็กกว่าของ ZnO NPs มีผลเป็นพิษต่อการสังเคราะห์ DNA มากกว่าขนาดที่ใหญ่กว่า พบการย้อมสีกาแลคโตซิเดสสูงสุดในขนาดที่เล็กกว่าขนาดที่ใหญ่กว่าของ ZnO NPs นอกจากนี้ ยีนที่เกี่ยวข้องกับการเสื่อมสภาพ (NF-kB และ p53) ได้แสดงออกมากเกินไปอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ ZnO NPs ที่รับการรักษาด้วยทั้งสองขนาด นอกจากนี้ ยังได้รับการควบคุมยีนที่เกี่ยวข้องกับการต่อต้านริ้วรอย (Nanog) อย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ที่บำบัดด้วย ZnO NPs

บทความนี้คัดลอกมาจาก Journal of Materials Science: Materials in Medicine (2021) 32:128https://doi.org/10.1007/s10856-021-06602-x