การจัดลำดับจีโนมทั้งหมดสำหรับการวินิจฉัยความผิดปกติของการขยายซ้ำทางระบบประสาทในสหราชอาณาจักร: ความแม่นยำในการวินิจฉัยย้อนหลังและการศึกษาการตรวจสอบทางคลินิกในอนาคต

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:ali.ma@wecistanche.com

สรุป

พื้นหลัง

ความผิดปกติของการขยายตัวซ้ำส่งผลกระทบต่อประมาณ 1 ใน 3000 คนและเป็นโรคที่แตกต่างกันทางคลินิกที่เกิดจากการขยายตัวของการเกิดซ้ำของ DNA ตีคู่สั้น การทดสอบทางพันธุกรรมมักเป็นแบบเฉพาะเจาะจง ส่งผลให้เกิดการวินิจฉัยของผู้ที่มีการนำเสนอทางคลินิกที่ผิดปกติ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในผู้ป่วยเด็กที่ไม่มีประวัติครอบครัวในเชิงบวกมาก่อน การจัดลำดับทั้งจีโนมถูกใช้มากขึ้นในการทดสอบบรรทัดแรกสำหรับความผิดปกติทางพันธุกรรมอื่นๆ ที่หายาก และเรามีเป้าหมายเพื่อประเมินประสิทธิภาพในการวินิจฉัยผู้ป่วยที่เป็นโรคเกี่ยวกับระบบประสาทความผิดปกติของการขยายตัวซ้ำ

วิธีการ

เราประเมินย้อนหลังความแม่นยำในการวินิจฉัยของการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดเพื่อตรวจหาตำแหน่งการขยายซ้ำที่พบบ่อยที่สุดซึ่งเกี่ยวข้องกับเกี่ยวกับระบบประสาทผลลัพธ์ (AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, C9orf72, CACNA1A, DMPK, FMR1, FXN, HTT และ TBP) โดยใช้ตัวอย่างที่ได้รับภายใน National Health Service ในอังกฤษจากผู้ป่วยที่สงสัยว่ามีเกี่ยวกับระบบประสาทความผิดปกติ; ใช้ผลการทดสอบ PCR ก่อนหน้านี้เป็นมาตรฐานอ้างอิง ความแม่นยำทางคลินิกของการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดเพื่อตรวจหาการขยายซ้ำได้รับการตรวจสอบในอนาคตในผู้ป่วยที่ผ่านการทดสอบทางพันธุกรรมและไม่ได้รับการวินิจฉัยซึ่งคัดเลือกในปี 2013–17 ให้กับ 100 000 โครงการจีโนมในสหราชอาณาจักร ซึ่งต้องสงสัยว่ามีพันธุกรรมเกี่ยวกับระบบประสาทความผิดปกติ (รูปแบบเริ่มต้นของ ataxia, neuropathy, spastic paraplegia, dementia, motor neuron disease,พาร์กินโซเนียนความเคลื่อนไหวความผิดปกติ ความพิการทางสติปัญญา หรือความผิดปกติของกล้ามเนื้อ) หากมีการเรียกการขยายซ้ำโดยใช้การจัดลำดับจีโนมทั้งหมด จะใช้ PCR เพื่อยืนยันผลลัพธ์

ผลการวิจัย

ความแม่นยำในการวินิจฉัยของการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดเพื่อตรวจหาการขยายซ้ำได้รับการประเมินเทียบกับการทดสอบ PCR 793 ครั้งที่ทำก่อนหน้านี้ภายใน NHS จากผู้ป่วย 404 ราย การจัดลำดับจีโนมทั้งหมดจำแนกอย่างถูกต้อง 215 จาก 221 อัลลีลที่ขยาย และ 1316 จาก 1321 อัลลีลที่ไม่ขยาย แสดงความไว 97·3 เปอร์เซ็นต์ (CI 94·2–99·0) ร้อยละ 95 และความจำเพาะ 99·6 เปอร์เซ็นต์ (99·1–99 ·9) จากตำแหน่งที่เกี่ยวข้องกับโรค 13 ตำแหน่งเมื่อเปรียบเทียบกับผลการทดสอบ PCR ในตัวอย่างจากผู้ป่วย 11 631 รายในโครงการจีโนม 100 000 การหาลำดับจีโนมทั้งหมดระบุการขยายซ้ำ 81 ครั้ง ซึ่งได้รับการทดสอบโดย PCR ด้วย: 68 ได้รับการยืนยันว่าเป็นการขยายซ้ำในช่วงการก่อโรคทั้งหมด โดย 11 รายไม่ใช่ - การขยายตัวหรือการเปลี่ยนแปลงขั้นกลางที่ทำให้เกิดโรค และอีก 2 รายการเป็นแบบที่ไม่ขยายซ้ำ (อัตราการค้นพบที่ผิดพลาด 16 เปอร์เซ็นต์)

การตีความ

ในการศึกษาของเรา การจัดลำดับจีโนมทั้งหมดสำหรับการตรวจจับการขยายซ้ำมีความไวและความจำเพาะสูง และนำไปสู่การระบุเกี่ยวกับระบบประสาทความผิดปกติของการขยายตัวซ้ำในผู้ป่วยที่ไม่ได้รับการวินิจฉัยก่อนหน้านี้ การค้นพบนี้สนับสนุนการใช้การจัดลำดับจีโนมทั้งหมดในห้องปฏิบัติการทางคลินิกเพื่อการวินิจฉัยผู้ป่วยที่มีเกี่ยวกับระบบประสาทการนำเสนอที่สอดคล้องกับความผิดปกติของการขยายตัวซ้ำ

เงินทุน

สภาวิจัยทางการแพทย์ กรมอนามัยและสังคม บริการสุขภาพแห่งชาติอังกฤษ สถาบันวิจัยสุขภาพแห่งชาติ และอิลลูมินา

บทนำ

แม้จะมีความก้าวหน้าล่าสุดในความเข้าใจของเราเกี่ยวกับพื้นฐานทางพันธุกรรมของหายากเกี่ยวกับระบบประสาทความผิดปกติถึง 70 เปอร์เซ็นต์ของผู้ป่วยที่มีความผิดปกติดังกล่าวยังคงไม่ได้รับการวินิจฉัยทางพันธุกรรม1–3 ส่วนหนึ่งเป็นเพราะความท้าทายทางเทคนิคของการทดสอบตัวแปรทางพันธุกรรมที่ซับซ้อนและซ้ำซาก การขยายตัวดังกล่าวคาดว่าจะส่งผลกระทบประมาณ 1 ใน 3000 คน (ภาคผนวก p 1) และเป็นสาเหตุสำคัญของความผิดปกติของระบบประสาทมากกว่า 40 ชนิด4 รวมทั้งโรคฮันติงตันและกลุ่มอาการเอ็กซ์เปราะบาง ความผิดปกติของการขยายตัวซ้ำนั้นแตกต่างกันทางคลินิกและทางพันธุกรรม และการขยายตัวซ้ำสามารถเชื่อมโยงกับโรคต่างๆ ตัวอย่างเช่น การขยายตัวใน C9orf72 อาจปรากฏเป็นเส้นโลหิตตีบด้านข้าง amyotrophic หรือภาวะสมองเสื่อมส่วนหน้า 5 การขยายซ้ำใน loci ที่ต่างกันยังทำให้เกิดลักษณะฟีโนไทป์ที่คล้ายคลึงกัน ทำให้ยากต่อการแยกความแตกต่างทางคลินิก: การขยายตัวซ้ำในยีน ataxia ของ spinocerebellar อย่างน้อย 10 ยีนมักปรากฏเมื่อโตเต็มวัย -เริ่มมีอาการผิดปกติ 6 และใน C9orf72 และ AR สามารถทำให้เกิดโรคเซลล์ประสาทสั่งการได้7,8

ความผิดปกติของการขยายตัวซ้ำๆ เกิดขึ้นจากการเพิ่มจำนวนของลำดับ DNA ที่ซ้ำกันแบบสั้นที่ซ้ำกัน และเกณฑ์การทำให้เกิดโรคสำหรับความผิดปกติแต่ละอย่างนั้นจำเพาะต่อสถานที่ ขนาดของการขยายจะแตกต่างกันไปตั้งแต่น้อยกว่า 30 ครั้ง (เช่น ใน CACNA1A) ไปจนถึงหน่วยการทำซ้ำหลายพันหน่วย (เช่น ใน FMR1, DMPK, C9orf72 และ FXN ซึ่งสามารถขยายได้ถึงขนาด 5 kb) การขยายตัวซ้ำจะแสดงให้เห็นถึงความไม่เสถียรของโมเลกุล ซึ่งสามารถนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงในขนาดซ้ำ (โดยทั่วไปจะเพิ่มความยาว) ข้ามรุ่นและเนื้อเยื่อ4 ในสภาวะเหล่านี้ การเพิ่มจำนวนการทำซ้ำมักจะนำไปสู่การโจมตีก่อนหน้านี้และโรคที่รุนแรงมากขึ้นในลำดับ รุ่น 4 เด็กที่มีอาการผิดปกติของการขยายตัวซ้ำอาจปรากฏเป็นอาการหลายระบบโดยไม่มีลายเซ็นฟีโนไทป์เฉพาะ 9 และเด็กที่มีความผิดปกติเหล่านี้มักจะไม่ได้รับการวินิจฉัยเมื่อไม่มีประวัติครอบครัวเกี่ยวกับความผิดปกติของการขยายตัวซ้ำมากกว่าเมื่อเป็นอยู่10– 12

การประเมินในห้องปฏิบัติการของการขยายซ้ำมักจะจำกัดเฉพาะการประเมินระดับโมเลกุลเป้าหมายของโลคัสแต่ละรายที่ชี้นำโดยการวินิจฉัยทางคลินิกที่น่าสงสัยโดยใช้วิธี PCR-based หรือ Southern blot13 ซึ่งอาจมีค่าใช้จ่ายสูงและใช้เวลานาน นอกจากนี้ เนื่องจากลักษณะทางฟีโนไทป์ที่หลากหลายและทับซ้อนกันของความผิดปกติเหล่านี้ ตำแหน่งการขยายตัวซ้ำที่เกี่ยวข้องกับโรคจึงยังไม่ได้รับการทดสอบ14

การจัดลำดับจีโนมทั้งหมดกำลังเกิดขึ้นในฐานะเครื่องมือวินิจฉัยขั้นแรกในผู้ป่วยที่มีโรคหายาก15 แต่จนกระทั่งเมื่อเร็วๆ นี้ คิดว่ามีความสามารถจำกัดในการประเมินตำแหน่งที่มีการขยายซ้ำ 16 อย่างไรก็ตาม ความก้าวหน้าทางชีวสารสนเทศทำให้การตรวจหาโรคเป็นไปได้ -ทำให้เกิดการขยายซ้ำจากข้อมูลการจัดลำดับยุคหน้า17–22 ในที่นี้ เรารายงานเกี่ยวกับการประเมินการวินิจฉัยของวิธีการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดเพื่อตรวจหาการขยายซ้ำโดยใช้ข้อมูล PCR ย้อนหลัง และการตรวจสอบทางคลินิกในผู้ป่วยในโครงการ 100000 Genomes ที่ สงสัยว่ามีความผิดปกติทางระบบประสาท ไม่ได้รับการวินิจฉัยจากการทดสอบทางพันธุกรรมครั้งก่อน

วิธีการ

การออกแบบการศึกษาและผู้เข้าร่วม

การประเมินการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดสำหรับการตรวจหาการขยายซ้ำนี้รวมถึงการประเมินความแม่นยำในการวินิจฉัยและความแม่นยำทางคลินิก ความแม่นยำในการวินิจฉัยได้รับการประเมินโดยใช้ข้อมูลจากผู้ป่วยที่เคยได้รับการทดสอบโดย PCR สำหรับการขยายตัวซ้ำที่ทราบว่าทำให้เกิดโรคทางระบบประสาท4 ระบุผู้ป่วยจากสองแหล่ง: 100 000 โครงการจีโนมและห้องปฏิบัติการจีโนมที่โรงพยาบาลมหาวิทยาลัยเคมบริดจ์ ( เคมบริดจ์ สหราชอาณาจักร) สำหรับผู้ป่วยทั้งสองกลุ่ม การทดสอบ PCR ได้ดำเนินการกับตัวอย่างผู้ป่วยโดยห้องปฏิบัติการใน National Health Service (NHS) ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของการประเมินทางคลินิกตามปกติ: สำหรับตัวอย่างในโครงการ 1000000 Genomes การทดสอบ PCR ได้กระทำก่อนการจัดหาเข้าร่วมโครงการโดย ห้องปฏิบัติการประสาทพันธุศาสตร์โรงพยาบาลมหาวิทยาลัยคอลเลจลอนดอน (ลอนดอน สหราชอาณาจักร); ตัวอย่างที่มีการขยายซ้ำที่ยืนยันด้วย PCR ได้มาจากผู้ป่วยที่ทดสอบโดยห้องปฏิบัติการจีโนมที่เคมบริดจ์ ผู้ป่วยที่มีผลการทดสอบ PCR-positive และ PCR-negative สำหรับความผิดปกติของการขยายตัวซ้ำได้รับการระบุเพื่อรวมในการศึกษาของเราผ่านระบบบันทึกในห้องปฏิบัติการ ผู้ป่วยทุกรายได้รับความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรสำหรับการใช้ตัวอย่างเพื่อประกันคุณภาพและวัตถุประสงค์ในการวิจัยและการฝึกอบรม ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของการเพิ่มประสิทธิภาพและการตรวจสอบบริการทางคลินิก

การจัดลำดับจีโนมทั้งหมดของแต่ละตัวอย่างดำเนินการในห้องปฏิบัติการหนึ่งในสองห้องปฏิบัติการ: Genomics England (Hinxton, UK) สำหรับตัวอย่างโครงการ 100000 Genomes (n=254) และ Illumina Clinical Services Laboratory (ICSL; San Diego, CA, สหรัฐอเมริกา) สำหรับตัวอย่างที่ได้รับจากห้องปฏิบัติการจีโนมที่เคมบริดจ์ (n=150) โดยรวม ชุดข้อมูลนี้ใช้สำหรับส่วนความแม่นยำในการวินิจฉัยของการศึกษา และประกอบด้วยข้อมูล PCR และข้อมูลการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดจากผู้ป่วย 404 ราย ครอบคลุม 13 loci ที่แสดงถึงความผิดปกติของการขยายตัวซ้ำของระบบประสาทที่พบบ่อยที่สุด: 11 loci ที่เกี่ยวข้องกับ ataxia และ late- ความผิดปกติของระบบประสาทที่เริ่มมีอาการ (HTT, AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, TBP, C9orf72 และ FXN) หนึ่งตำแหน่งที่เกี่ยวข้องกับความบกพร่องทางสติปัญญา (FMR1) และหนึ่งตำแหน่งที่เกี่ยวข้องกับโรคกล้ามเนื้อเสื่อม (DMPK) สำหรับแต่ละสถานที่ มีข้อมูลการทดสอบ PCR สำหรับอัลลีลที่ขยายอย่างน้อยหนึ่งอัลลีล (ภาคผนวก p 24)

ความแม่นยำทางคลินิกได้รับการประเมินโดยการตรวจสอบความสอดคล้องของการขยายซ้ำตามที่ตรวจพบด้วยการจัดลำดับจีโนมทั้งหมด โดยสงสัยว่ามีการวินิจฉัยทางคลินิกหลังจากการยืนยัน PCR ในผู้ป่วยที่สงสัยว่ามีความผิดปกติทางระบบประสาททางพันธุกรรม (รูปแบบครอบครัวหรือเริ่มมีอาการของ ataxia, neuropathy, spastic paraplegia, dementia , โรคเซลล์ประสาทสั่งการ,พาร์กินโซเนียนความผิดปกติของการเคลื่อนไหว ความพิการทางสติปัญญา หรือความผิดปกติของกล้ามเนื้อ) ที่ได้รับคัดเลือกให้เข้าร่วมโครงการ 100,000 Genomes ในปี 2013–17 โครงการ 100000 Genomes เป็นโครงการในสหราชอาณาจักรเพื่อประเมินคุณค่าของการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดในผู้ป่วยที่มีความต้องการการวินิจฉัยที่ไม่ได้รับการตอบสนองในโรคหายากและมะเร็ง หลังจากได้รับการอนุมัติทางจริยธรรมสำหรับโครงการ 10,000 Genomes โดยคณะกรรมการจริยธรรมการวิจัย Cambridge South ทางตะวันออกของอังกฤษ (ข้อมูลอ้างอิง 14/EE/1112) รวมถึงการวิเคราะห์ข้อมูลและการส่งคืนผลการวินิจฉัยแก่ผู้ป่วย ผู้ป่วยเหล่านี้ได้รับคัดเลือกโดยผู้เชี่ยวชาญด้านสุขภาพและนักวิจัยจาก ศูนย์การแพทย์จีโนม 13 แห่งในอังกฤษและลงทะเบียนในโครงการหากพวกเขาหรือผู้ปกครองให้ความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรสำหรับตัวอย่างและข้อมูลเพื่อใช้ในการวิจัย รวมถึงการศึกษานี้ Probands และสมาชิกในครอบครัวอื่น ๆ หากเป็นไปได้ได้รับการลงทะเบียนตามเกณฑ์คุณสมบัติที่กำหนดไว้สำหรับโรคที่หายากโดยเฉพาะ (ภาคผนวก หน้า 5–11) ผู้ป่วยได้รับคัดเลือกให้เข้าร่วมโครงการ 100,000 Genomes หลังจากการทดสอบทางพันธุกรรมตามมาตรฐานการดูแลใน NHS ตามที่ระบุไว้ในเกณฑ์คุณสมบัติ ข้อมูลพื้นฐานทางคลินิกที่ได้มาตรฐานถูกบันทึกโดยใช้ Human Phenotyping Ontology (HPO)23 เทียบกับแบบจำลองข้อมูลเฉพาะโรค24 รวบรวมสถานะโรคของสมาชิกในครอบครัวเทียบกับการบ่งชี้ทางคลินิกของโพรแบนด์สำหรับการทดสอบ

เพื่อระบุสาเหตุการเกิดซ้ำขยายในผู้ป่วยโรคที่ไม่ได้รับการวินิจฉัยทางพันธุกรรม เราได้ทดสอบผู้ป่วยที่มีความผิดปกติทางพันธุกรรมที่น่าสงสัยซึ่งสอดคล้องกับโรคที่มีการขยายตัวซ้ำ ผู้ป่วยได้รับการคัดเลือกตามความสอดคล้องของโรคและข้อกำหนด HPO ที่มีความผิดปกติที่เกี่ยวข้องกับการขยายตัวซ้ำ ข้อมูลการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดของผู้ป่วยถูกสอบปากคำเพื่อค้นหาการขยายตัวในชุดการทำซ้ำเฉพาะโดยใช้แผงการขยายซ้ำสี่แบบที่แตกต่างกันตามลักษณะทางคลินิกของพวกเขา (ภาคผนวก p 5) การขยายซ้ำที่เลือกเพื่อรวมไว้ในแผงเหล่านี้เป็นตำแหน่งการขยายตัวซ้ำที่ก่อให้เกิดโรคทางระบบประสาทที่พบบ่อยที่สุด ผู้ป่วยที่มีอาการทางคลินิกที่อาจเข้ากันได้กับความผิดปกติของการขยายตัวซ้ำหลายครั้งได้รับการทดสอบในหลายแผง หากมีการเรียกการขยายซ้ำโดยใช้การจัดลำดับจีโนมทั้งหมด จะมีการทดสอบเพื่อยืนยันโดย PCR

สำหรับผู้ป่วยแต่ละรายที่ได้รับการยืนยันการขยายตัวซ้ำแล้วซ้ำเล่า แพทย์ในพื้นที่จะได้รับแจ้งถึงผลการวินิจฉัยที่เป็นไปได้ และการประเมินการมีส่วนร่วมของการขยายตัวซ้ำในลักษณะทางคลินิกของผู้ป่วย สำหรับการขยายซ้ำที่อธิบายลักษณะทางคลินิกของผู้ป่วยทั้งหมดหรือบางส่วน จะมีการออกรายงานการวินิจฉัยตามขั้นตอนมาตรฐานในท้องถิ่น

ขั้นตอน

สำหรับตัวอย่างในอดีตของ NHS ที่ใช้ในส่วนความแม่นยำในการวินิจฉัยของการศึกษาของเรา ก่อนหน้านี้มีการทดสอบการขยายซ้ำโดยใช้การขยาย PCR และการวิเคราะห์ชิ้นส่วน ซับใต้ดำเนินการสำหรับการขยาย C9orf72 ขนาดใหญ่ ในส่วนความแม่นยำทางคลินิกของการศึกษาของเรา การขยายซ้ำที่ตรวจพบโดยการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดในผู้ป่วยจาก 100 000 โครงการจีโนมได้รับการทดสอบโดย PCR ในตัวอย่างที่เก็บไว้ในห้องปฏิบัติการทางพันธุกรรมของ NHS รายละเอียดเพิ่มเติม รวมทั้งลำดับไพรเมอร์ มีอยู่ในภาคผนวก (หน้า 2–3, 25–26)

DNA ถูกเตรียมสำหรับการหาลำดับจีโนมทั้งหมดโดยใช้การเตรียมห้องสมุด TruSeq DNA PCR-Free และทำการจัดลำดับคู่แบบปลายคู่ 150 bp หรือ 125 bp บนแพลตฟอร์ม HiSeq 2000 หรือ HiSeq X ที่สถานที่ผลิตจีโนมปริมาณงานสูงสำหรับ Genomics England และที่ ICSL . จีโนมถูกจัดลำดับที่ความลึกเฉลี่ย 35× (31× ถึง 37×; ภาคผนวก p 27) การทำจีโนไทป์แบบ short-tandem-repeat ดำเนินการโดยใช้แพ็คเกจซอฟต์แวร์ ExpansionHunter เวอร์ชัน 3.1.2.25,26 กล่าวโดยย่อ ExpansionHunter ปรับการจัดลำดับใหม่ให้อ่านผ่านชุดการทำซ้ำแบบสั้นควบคู่ที่กำหนดไว้ล่วงหน้าเพื่อประเมินขนาดของอัลลีลทั้งสองจากแต่ละอัลลีล (ภาคผนวก p 3)

ผลลัพธ์ของ ExpansionHunter ประกอบด้วยการประมาณจำนวนองค์ประกอบที่เกิดซ้ำ ขนาดโดยรวม และขีดจำกัดความเชื่อมั่นสำหรับสถานที่แต่ละแห่งที่ประเมิน แนวทางจาก Association for Medical Pathology และ College of American Pathologists แนะนำให้ตรวจสอบด้วยสายตาของการเรียกตัวแปรในระหว่างการประเมินตามปกติของตัวแปรลำดับที่มีปริมาณงานสูง27

อย่างไรก็ตาม ตัวแปรการทำซ้ำแบบสั้นควบคู่แบบสั้นไม่สามารถแสดงภาพได้อย่างเพียงพอโดยเครื่องมือสร้างภาพทั่วไป เช่น Integrative Genomics Viewer ในการตรวจสอบข้อมูลการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดที่อยู่ภายใต้การเรียกจีโนไทป์แต่ละครั้ง เครื่องมือการสร้างภาพกราฟถูกนำมาใช้ ซึ่งช่วยให้สามารถแสดงภาพฮาโพลไทป์ได้โดยตรงและการอ่านข้อมูลซ้อน ของจีโนไทป์ของ ExpansionHunter (ภาคผนวก หน้า 3, 15) การตรวจสอบด้วยสายตาของกราฟไพล์อัพได้ดำเนินการในการหาลำดับจีโนมทั้งหมดในการเรียกซ้ำแบบสั้นควบคู่แบบสั้นเพื่อยืนยันว่าการทำนายของ ExpansionHunter สำหรับอัลลีลนั้นมีอยู่ในการอ่านแต่ละครั้งทั้งหมด (กล่าวคือ ลำดับการทำซ้ำมีขนาดเล็กกว่าความยาวของการอ่านลำดับ) เพื่อยืนยันการมีอยู่ของการขยายตัวของ monoallelic หรือ biallelic; เพื่อตรวจจับการเรียกสมมุติฐานบวกเท็จ และเพื่อตรวจหาอัลลีลลบเท็จในการขยายการทำซ้ำแบบไบอัลลีลิก เช่น FXN (ภาคผนวก หน้า 4, 16)

ExpansionHunter ประมาณการขนาดการทำซ้ำจากข้อมูลการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดโดยการวิเคราะห์การอ่านการจัดลำดับที่ทั้งหมดหรือบางส่วนมีการทำซ้ำแบบสั้นควบคู่ หากอัลลีลการทำซ้ำแบบตีคู่สั้นสั้นกว่าความยาวที่อ่านได้ ExpansionHunter จะคาดการณ์ขนาดที่แน่นอน หากอัลลีลการทำซ้ำแบบเรียงซ้อนสั้นๆ ยาวกว่าความยาวการอ่าน ExpansionHunter จะประมาณขนาดการทำซ้ำภายใน CI ขึ้นอยู่กับองค์ประกอบของลำดับโลคัส ความลึกของการจัดลำดับ และคุณภาพของการจัดลำดับ

การวิเคราะห์ทางสถิติ

เราจัดประเภทการทำซ้ำเป็นการขยายโดยการจัดลำดับจีโนมทั้งหมด หากขนาดที่ ExpansionHunter ทำนายไว้สูงกว่าค่าตัดการเรียงก่อนการกลายพันธุ์ หรือไม่ขยายหากขนาดที่คาดการณ์ไว้ต่ำกว่าจุดตัด (ภาคผนวก p 28)

ความไวและ CIs สำหรับการตรวจจับการขยายตัวซ้ำของการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดถูกคำนวณเป็นสัดส่วนของอัลลีลที่มีการทำซ้ำแบบขยายระหว่างอัลลีลที่ยืนยันด้วย PCR ก่อนหน้านี้ที่มีการทำซ้ำแบบขยาย ความจำเพาะถูกประเมินเป็นสัดส่วนของอัลลีลที่ไม่ขยายระหว่างการเกิดซ้ำที่ไม่ขยายซ้ำที่ทดสอบก่อนหน้านี้โดย PCR คำอธิบายแบบเต็มของสูตรทางสถิติมีอยู่ในภาคผนวก (p 1)

เพื่อเปรียบเทียบขนาดการทำซ้ำโดย PCR กับการประมาณขนาดซ้ำโดยการจัดลำดับจีโนมทั้งหมด อัลลีลที่หาปริมาณโดย PCR ถูกนำมาเปรียบเทียบกับขนาดซ้ำที่ ExpansionHunter คาดการณ์ไว้สำหรับอัลลีลที่สั้นกว่าความยาวที่อ่านจากตำแหน่งการทำซ้ำแบบสั้นทั้ง 13 ตำแหน่ง ความสอดคล้องคำนวณโดยเปอร์เซ็นต์ของขนาดการทำซ้ำที่คาดการณ์โดย ExpansionHunter ซึ่งสอดคล้องกับขนาดที่วัดด้วย PCR โดยคำนึงถึงข้อผิดพลาด PCR ที่บวกหรือลบหนึ่งซ้ำ การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ทางสถิติ R เวอร์ชัน 3.6.3

บทบาทของแหล่งเงินทุน

การออกแบบการศึกษา การลงทะเบียนผู้ป่วย การเก็บข้อมูล และการจัดลำดับนำโดยพนักงานของ Genomics England และนักวิจัยเชิงวิชาการ พนักงานของ Illumina ดำเนินการจัดลำดับตัวอย่างผู้ป่วย 150 รายเป็นองค์ประกอบที่วางแผนไว้ของการศึกษาความแม่นยำในการวินิจฉัยลำดับจีโนมทั้งหมด และพัฒนา ExpansionHunter พนักงานของ Genomics England นักวิจัยเชิงวิชาการ และผู้เขียนร่วม RTH, ED และ MAE ได้ทำการวิเคราะห์และตีความการขยายซ้ำในผู้ป่วยที่ได้รับคัดเลือกให้เข้าร่วมโครงการ 100 000 Genomes แหล่งเงินทุนไม่มีบทบาทในการตีความข้อมูลหรือการเขียนรายงาน

ผลลัพธ์

ความแม่นยำในการวินิจฉัยของการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดเพื่อตรวจหาการขยายตัวซ้ำได้รับการประเมินเทียบกับการทดสอบ PCR 793 ครั้งที่ทำก่อนหน้านี้ภายใน NHS จากผู้ป่วย 404 ราย (ผู้ป่วย 64 รายได้รับการทดสอบซ้ำมากกว่าหนึ่งครั้ง รูปที่ 1) จากการทดสอบเหล่านี้ 183 รายถูกจัดประเภทว่ามีการขยายซ้ำและ 610 ไม่มีการขยายซ้ำโดย PCR โดยให้ผลทั้งหมด 221 แบบขยายตัวและ 1321 อัลลีลที่ไม่ขยายตัวใน 13 โรค (ภาคผนวกหน้า 24, 28) การจัดลำดับจีโนมทั้งหมดจำแนกอย่างถูกต้อง 215 จาก 221 อัลลีลที่ขยาย และ 1316 จาก 1321 อัลลีลที่ไม่ขยาย เมื่อเปรียบเทียบกับผลการทดสอบ PCR (ภาคผนวก pp 27, 29) แสดงความไวเริ่มต้น 97·3 เปอร์เซ็นต์ (95 เปอร์เซ็นต์ CI 94·2–99 ·0) และความจำเพาะ 99·6 เปอร์เซ็นต์ (99·1–99·9; ตารางที่ 1) หลังจากการแก้ไขสายตาของการโทรทั้งหมดตามคุณภาพของการอ่าน ความไวเพิ่มขึ้นเป็น 99·1 เปอร์เซ็นต์ (96·8–99·9) และความจำเพาะเป็น 100 เปอร์เซ็นต์ (99·7–100; รูปที่ 2A ตารางที่ 1) การแสดงภาพอัลลีลแบบขยายทำให้สามารถตรวจจับผลลัพธ์ที่เป็นเท็จ-บวกและการจัดประเภทใหม่ของอัลลีลที่เป็นเท็จ-ลบทั้งหมดใน FXN ซึ่งมีเพียงหนึ่งอัลลีลเท่านั้นที่ถูกจัดประเภทอย่างถูกต้องว่าขยายในตัวอย่างที่มีการขยายสองอัลลีล (ภาคผนวก หน้า 17, 18)

ความยาวซ้ำถูกหาปริมาณโดย PCR ในการทดสอบ 509 PCR สอบปากคำ 945 อัลลีลใน 13 ตำแหน่งการขยายซ้ำ ความสัมพันธ์ระหว่าง ExpansionHunter และ PCR สำหรับขนาดการทำซ้ำที่สั้นกว่าและใหญ่กว่าความยาวในการอ่านลำดับ (เช่น 150 bp) จะแสดงอยู่ในภาคผนวก (ภาคผนวก p 19) มีการสังเกตความสอดคล้องสูงสำหรับการทำซ้ำที่สั้นกว่าความยาวในการอ่าน โดยมีข้อตกลง 92·7 เปอร์เซ็นต์ (836 จาก 902) ระหว่าง PCR และ ExpansionHunter มีการสังเกตความแปรปรวนของโลคัส โดยมีความสอดคล้องกันสูงระหว่าง ExpansionHunter และ PCR สำหรับ ATXN2, ATXN7, CACNA1A และ HTT และความสอดคล้องต่ำสำหรับ DMPK หรือ TBP (ภาคผนวก p 30) ความยาวของอัลลีลที่มากกว่าความยาวในการอ่านถูกประเมินต่ำเกินไปโดย ExpansionHunter ซึ่งส่งผลต่อความแม่นยำของการโทรใน DMPK, FMR1 และ FXN (รูปที่ 2B ภาคผนวก หน้า 19, 31)

แม้ว่า ExpansionHunter สามารถระบุอัลลีลขนาดใหญ่ได้อย่างถูกต้องใน FMR1, DMPK, C9orf72 และ FXN (ภาคผนวก p 29) การประมาณการขนาดที่คาดการณ์ไว้มักจะต่ำกว่าที่ได้รับจาก PCR เนื่องจากขนาดซ้ำเพิ่มขึ้นภายในช่วงการก่อโรค ซึ่งส่งผลต่อ ความสามารถในการแยกความแตกต่างระหว่างการขยายขนาดใหญ่และขนาดเล็กใน DMPK, C9orf72 และ FXN หรือระหว่างการขยายแบบเต็มและการเรียงสับเปลี่ยนใน FMR1 (ภาคผนวก p 31) ตัวอย่างเช่น ตำแหน่งที่มีความยาวการทำซ้ำที่ประเมินโดย PCR มากกว่า 200 การทำซ้ำใน FMR1 และจัดประเภทเป็นการกลายพันธุ์แบบเต็มจะมีขนาดการทำซ้ำเฉลี่ยโดยประมาณโดย ExpansionHunter ที่ 92·6 (SD 17·8; ภาคผนวก p 31)

เพื่อทดสอบความสามารถในการตรวจหาการขยายตัวซ้ำโดยการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดเพื่อแก้ไขการวินิจฉัยของผู้ป่วยที่ทดสอบก่อนหน้านี้และไม่ได้รับการวินิจฉัยทางพันธุกรรม เราได้ทดสอบผู้ป่วย 11 631 รายที่สงสัยว่ามีความผิดปกติทางระบบประสาททางพันธุกรรมซึ่งคัดเลือกเข้าร่วมโครงการ 100000 Genomes (รูปที่ 1) ข้อมูลการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดได้รับการประเมินโดยใช้แผงขยายซ้ำสี่แบบที่แตกต่างกันตามลักษณะทางคลินิกของผู้ป่วย จำนวนผู้ป่วยที่ทดสอบกับแต่ละแผงสี่แผงแสดงไว้ในตารางที่ 2

โดยรวมแล้ว เราตรวจพบและยืนยันการขยายตัวซ้ำด้วยสายตาในตัวอย่างจากผู้ป่วย 105 ราย (ตารางที่ 2 ภาคผนวก pp 20, 33) ในจำนวนนี้ มีตัวอย่าง 81 ตัวอย่างสำหรับการทดสอบยืนยันโดย PCR และ 68 ตัวอย่างได้รับการยืนยันว่ามีการขยายตัวซ้ำ (0·6 เปอร์เซ็นต์ผลผลิต): 45 (1·2 เปอร์เซ็นต์) ที่ 3692 ในแผง A, แปด ({ {18}}·3 เปอร์เซ็นต์ ) จาก 2743 ในแผง B ห้า (0·6 เปอร์เซ็นต์ ) ของ 860 ในแผง C และสิบ (0·1 เปอร์เซ็นต์ ) ของ 6731 ในแผง D การเรียกส่วนขยายสิบสามจาก 81 รายการ ไม่ได้รับการยืนยันว่าเป็นการขยายซ้ำที่ทำให้เกิดโรค (อัตราการค้นพบที่ผิดพลาด 16 เปอร์เซ็นต์) ในจำนวนนี้ สองอัลลีลที่ไม่ขยายใน ATXN1 และ ATXN2 สี่อัลลีลเป็นการโทรขนาดกลางของ FMR1 (ภาคผนวก p 21) และเจ็ดรายการเป็นการเรียงสับเปลี่ยน FMR1

รายละเอียดทางคลินิกของผู้ป่วย 68 รายที่มีการขยายซ้ำที่ได้รับการยืนยันโดย PCR รวมถึงการนำเสนอทางคลินิก การระบุการขยายตัวซ้ำ และการมีส่วนร่วมของการขยายซ้ำไปยังลักษณะทางคลินิกของผู้ป่วยแสดงไว้ในตารางที่ 3 เงื่อนไข HPO ขนาดซ้ำโดยประมาณโดย ExpansionHunter และการออกรายงานการวินิจฉัยนั้นแสดงอยู่ในภาคผนวก (หน้า 33) หรือไม่

พบการขยายตัวในผู้ป่วยที่แสดงการนำเสนอทางคลินิกที่ทับซ้อนกันหลากหลายซึ่งทดสอบด้วยแผง A (ตารางที่ 3 ภาคผนวก p 22) รวมถึงการขยายตัวซ้ำ ATXN2 ในผู้ป่วยโรคพาร์กินสันที่เริ่มมีอาการ levodopa ที่ตอบสนองต่อโรคและประวัติของความผิดปกติของสมองน้อยก้าวหน้า และการขยายตัวของ AR ในผู้ป่วยสี่รายที่ได้รับการวินิจฉัยทางคลินิกว่าเป็นโรค Charcot-Marie-Tooth รวมถึงผู้ป่วยรายหนึ่งที่มีโรคระบบประสาททำลายล้างที่ได้รับการยืนยันทางพันธุกรรม (เช่นโรค Charcot-Marie-Tooth ประเภทที่ 1 ผู้ป่วย 42; ภาคผนวก p 33) พบการวินิจฉัยทางคลินิกก่อนหน้านี้ที่หลากหลายในผู้ป่วยที่มีการขยายตัวซ้ำที่ทำให้เกิดโรค

ตัวอย่างเช่น ในผู้ป่วยเจ็ดรายที่มีเส้นโลหิตตีบด้านข้าง amyotrophic หรือโรคเซลล์ประสาทสั่งการอื่น ๆ การขยายตัวถูกระบุใน AR (n=4) และ C9orf72 (n=3) ในผู้ป่วยที่มีอาการผิดปกติทางพันธุกรรม เราได้ระบุการขยายตัวใน loci ที่ไม่ได้รับการประเมินว่าเป็นส่วนหนึ่งของการตรวจวินิจฉัยตามปกติภายใน NHS ณ เวลาที่รับสมัคร ซึ่งรวมถึง ATN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, FXN, TBP และ HTT ( ตารางที่ 3). นอกจากนี้เรายังตรวจพบการขยายตัวซ้ำในผู้ป่วยที่มีอาการทางคลินิกที่สอดคล้องกับความผิดปกติของการขยายตัวซ้ำแบบอื่น ซึ่งรวมถึงการขยายตัวของ C9orf72 ในโรคพาร์กินสันที่เริ่มมีอาการในระยะเริ่มต้นและในครอบครัว (ผู้ป่วย 24 ตารางที่ 3) และการขยายซ้ำในช่วงการแทรกซึมที่ลดลงใน HTT (38 ครั้ง) ในพี่สาวสองคนที่มีความผิดปกติในการเคลื่อนไหว สมองเสื่อม ซึมเศร้า และมีปัญหาในการพูด (ผู้ป่วย 44 และ 45) เน้นย้ำความท้าทายในการวินิจฉัยที่นำเสนอโดยความผิดปกติของการขยายตัวซ้ำเหล่านี้

เด็กแปดคนที่ได้รับการทดสอบด้วยแผง B พบว่ามีการขยายตัวซ้ำของ CAG ขนาดใหญ่ (รูปที่ 3) โดยเจ็ดคนได้อธิบายลักษณะทางคลินิกของผู้ป่วยอย่างเต็มที่ ผู้ป่วยหกรายไม่มีประวัติครอบครัวที่ให้ข้อมูลและไม่ได้รับการเสนอให้มีการทดสอบการขยายตัวซ้ำซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของการประเมินทางคลินิกของพวกเขาในเวลาที่รับสมัคร (ผู้ป่วย 48–53; ตารางที่ 3 ภาคผนวก p 33) เด็กสองคนนี้มีส่วนขยาย HTT ขนาดใหญ่ (90-100 CAG ซ้ำ) น่าสังเกตว่า เด็กคนหนึ่งได้รับมรดกซ้ำจากพ่อแม่ที่ไม่ได้รับผลกระทบโดยไม่มีประวัติครอบครัวเป็นโรคฮันติงตัน การทดสอบครอบครัวยังดำเนินอยู่ แต่มีการระบุอัลลีลการแทรกซึมที่ลดลงในตระกูลขยาย ซึ่งบ่งชี้ว่าการทำซ้ำได้ขยายตัวมากกว่า 60 หน่วยซ้ำในรุ่นเดียว (ผู้ป่วย 52) ในขณะที่เขียนไม่มีใครในครอบครัวแสดงสัญญาณของโรคฮันติงตันและการให้คำปรึกษาและการทดสอบทางพันธุกรรมสำหรับผู้ปกครองอย่างต่อเนื่อง เด็กสองคนที่อายุน้อยกว่า 5 ปีมีการขยายตัวซ้ำหลายครั้งใน ATXN7 และนำเสนอด้วยโรคหลายระบบที่ซับซ้อน สำหรับเด็กคนหนึ่ง (ผู้ป่วย 50 คน) ผู้ปกครองแสดงปัญหาการเดิน 2 ปีหลังจากลงทะเบียนในโครงการ 100000 Genomes ในทำนองเดียวกัน เด็กหญิงอายุ 10 ปีที่มีความบกพร่องทางสติปัญญาพบว่ามี99-การขยายตัวซ้ำใน ATXN2 แม้ว่าข้อเท็จจริงที่ว่าพ่อแม่ทั้งสองถูกกำหนดว่าไม่ได้รับผลกระทบ และพบว่าเด็กหญิงอายุ 18 ปีที่มีภาวะสมองเสื่อมมีอาการ { {19}}ขยายซ้ำใน ATN1 (ภาคผนวก p 33)

ตรวจพบการขยายตัวห้าครั้งใน DMPK (แผง C) รวมถึงในเด็กและมารดาที่มีการวินิจฉัยทางคลินิกของกล้ามเนื้อเสื่อม ในพี่น้องสองคนที่สงสัยว่าเป็นโรคกล้ามเนื้อส่วนปลาย และในวัยรุ่นที่เป็นโรคกล้ามเนื้อผิดปกติแต่กำเนิด (ผู้ป่วย 54–58) ตรวจพบการขยายตัวของ FMR1 (แผง D) ในเด็กชายเก้าคนและเด็กหญิงหนึ่งคน และการวินิจฉัยโรค Fragile X อธิบายลักษณะทางคลินิกที่นำเสนอทั้งหมดหรือบางส่วน (ผู้ป่วย 59–68)

การอภิปราย

การวินิจฉัยความผิดปกติของการขยายตัวซ้ำเป็นเรื่องที่ท้าทายในการดูแลสุขภาพเนื่องจากลักษณะทางคลินิกที่แตกต่างกันและทับซ้อนกันและการค้นพบทางคลินิกที่ไม่เฉพาะเจาะจง ซึ่งสามารถเพิ่มขึ้นในความรุนแรงตามอายุและในแต่ละรุ่นต่อ ๆ ไป ความผิดปกติของการขยายตัวซ้ำเป็นสาเหตุที่พบบ่อยที่สุดของโรคทางระบบประสาทที่สืบทอดมา4 อย่างไรก็ตาม ผู้ป่วยอาจไม่ได้รับการวินิจฉัย เนื่องจากการทดสอบทางพันธุกรรมไม่เพียงพอหรือเนื่องจากยังไม่มีการค้นพบตัวแปรทางพันธุกรรมเชิงสาเหตุ ปัจจุบันวิธีการทดสอบมีการแยกส่วน และผู้ป่วยอาจได้รับการทดสอบตำแหน่งการขยายซ้ำที่ไม่ถูกต้อง หรือได้รับการทดสอบระดับโมเลกุลสำหรับตัวแปรระดับต่างๆ เนื่องจากลักษณะทางคลินิกที่ทับซ้อนกันกับความผิดปกติทางพันธุกรรมทางระบบประสาทอื่นๆ

การจัดลำดับจีโนมทั้งหมดถูกนำมาใช้ในการตั้งค่าต่างๆ ในการทดสอบการวินิจฉัยบรรทัดแรกสำหรับความผิดปกติทางระบบประสาทที่พบได้ยาก แต่ก่อนหน้านี้คิดว่ามีความสามารถต่ำในการตรวจหาการขยายซ้ำ 16 เครื่องมือหลายอย่างได้รับการพัฒนาเพื่อระบุการขยายตัวซ้ำจากทั้งจีโนม การจัดลำดับในการตั้งค่าการวิจัย31 แต่วิธีการเหล่านี้ไม่ได้ถูกนำมาใช้กับข้อมูลการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดที่รวบรวมจากผู้ป่วยจำนวนมากในบริการดูแลสุขภาพเดียว เรานำเสนอหลักฐานว่าอัลกอริธึมที่ออกแบบมาเพื่อตรวจจับการขยายซ้ำจากการจัดลำดับทั้งจีโนมสามารถประเมินการขยายตัวซ้ำที่ก่อให้เกิดโรคที่พบบ่อยที่สุดได้อย่างน่าเชื่อถือ และแก้ไขกรณีที่ไม่ได้รับการวินิจฉัยทางพันธุกรรมในกลุ่มผู้ป่วยที่มีความผิดปกติทางระบบประสาทกลุ่มใหญ่ ผลลัพธ์ของเราบ่งชี้ว่าการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดสามารถแยกแยะระหว่างอัลลีลที่ไม่ขยายและอัลลีลที่ขยายออกที่มีความไวและความจำเพาะสูงผ่านตำแหน่งการขยายซ้ำ 13 ตำแหน่ง (ซึ่งสามารถปรับปรุงเพิ่มเติมได้ด้วยการตรวจสอบด้วยภาพ) สามารถคำนวณขนาดของอัลลีลที่เล็กกว่าความยาวที่อ่านได้อย่างแม่นยำ และอาจประเมินขนาดของส่วนขยายขนาดใหญ่ใน FMR1, DMPK, FXN และ C9orf72 ต่ำเกินไป

เมื่อการตรวจหาการขยายซ้ำโดยการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดได้รับการประเมินโดยเทียบกับผลลัพธ์เชิงบวกและเชิงลบที่ได้รับก่อนหน้านี้ที่ห้องปฏิบัติการจีโนมเพื่อการวินิจฉัยทางคลินิกโดยใช้วิธีการมาตรฐานทองคำ เราพบความไวขั้นต่ำ 97·3 เปอร์เซ็นต์และความจำเพาะ 99·6 เปอร์เซ็นต์ นอกจากนี้ เราแสดงให้เห็นว่าทั้งความจำเพาะและความไวสามารถปรับปรุงได้ด้วยการจัดการการอ่านไพลอัพแบบแมนนวล ทำให้สามารถตรวจจับผลลัพธ์ที่เป็นเท็จ-บวก และจัดประเภทใหม่ของอัลลีลลบเท็จในตัวอย่างที่มีการขยายแบบไบอัลเลลิก จากผู้ป่วย 6731 รายที่ได้รับการทดสอบสำหรับ FMR1 (แผง D) คาดว่าจะมีการขยายการโทร 124 ครั้ง เราสามารถแยก 97 ออกได้ผ่านการตรวจสอบด้วยสายตาว่ามีผลบวกที่ผิดพลาด สิ่งนี้บ่งชี้ว่า 1 ใน 54 การทดสอบการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดจะมีการเรียก FMR1 ซึ่งจะต้องได้รับการตรวจสอบด้วยสายตาเพื่อละทิ้งการเรียกที่เป็นเท็จที่อาจเกิดขึ้นได้ งานกำลังดำเนินการปรับปรุงวิธีการสร้างยีนของ ExpansionHunter เพื่อลดจำนวนการเรียกที่ผิดพลาดสำหรับ FMR1

We show that repeat sizing is accurate for repeats smaller than the sequencing read lengths, and therefore that most non-expanded and premutation CAG repeat expansion disorder alleles can be sized accurately. These results are consistent with other studies showing a strong correlation between whole genome sequencing and PCR quantification of repeat lengths smaller than the sequencing read length.19,25,26 Whole genome sequencing expansion detection is limited in its sizing of alleles considerably larger than the read length, such as in Fragile X syndrome. We note that all FMR1 repeats previously classified by PCR as fully expanded (ie, >200 repeats) were classified by whole genome sequencing as permutation (50–200 repeats) in this study. Repeat size estimation for repeats larger than the read length is particularly important for loci in which the length of the repeat correlates with the disease clinical features. This includes DMPK, for which small expansions (50–150 repeats) cause mild myotonic dystrophy type 1 and large expansions (>การทำซ้ำ 1,000 ครั้ง) ทำให้เกิดโรคที่รุนแรงมากขึ้น และความผิดปกติของ spinocerebellar ataxia type 36 (NOP56) ซึ่งการขยายตัวที่มากกว่า 650 ครั้งถือเป็นการก่อโรค และขนาดการทำซ้ำ 15–650 ถือเป็นระดับกลาง และรูปแบบต่างๆ ที่มีนัยสำคัญที่ไม่แน่นอน

มีการระบุตำแหน่งการขยายซ้ำมากกว่า 40 รายการ; ตำแหน่งเหล่านี้จำนวนมากเพิ่งถูกระบุและขณะนี้เกี่ยวข้องกับสภาวะที่ไม่สามารถอธิบายได้ก่อนหน้านี้ ซึ่งรวมถึงภาวะสมองน้อยผิดปกติที่มีอาการทางระบบประสาทและกลุ่มอาการ vestibular areflexia (RFC1) 32 และโรคลมบ้าหมู myoclonic (SAMD12) 33 ตำแหน่งที่มีการขยายตัวซ้ำที่ก่อให้เกิดโรคทางระบบประสาทที่พบบ่อยที่สุดคือ เลือกสำหรับการศึกษาของเราโดยพิจารณาจากความพร้อมของตัวอย่างกลุ่มควบคุมเชิงบวกและเชิงลบ

ผลการวิจัยที่นำเสนอในที่นี้แนะนำว่า ExpansionHunter ควรจะสามารถจำแนกอัลลีลที่ไม่ขยายและขยายได้อย่างแม่นยำที่ตำแหน่งการขยายซ้ำใดๆ หากอัลลีลที่ไม่ขยายมีขนาดเล็กกว่าความยาวที่อ่านได้ (เช่น 150 bp) แม้ว่า Loci ที่ขยายซ้ำส่วนใหญ่มีอัลลีลที่เล็กกว่า 150 bp เมื่อไม่ขยาย loci บางตำแหน่งซึ่งขนาดของอัลลีลที่ยังไม่ขยายนั้นใกล้เคียงกับ 150 bp (เช่น NOTCH2NLC)34 อาจยากกว่าที่จะสร้างจีโนไทป์โดยใช้วิธีนี้ สำหรับตำแหน่งที่การทำซ้ำแบบขยายมีขนาดใหญ่กว่าความยาวที่อ่านได้อย่างมีนัยสำคัญ การจัดลำดับทั้งจีโนมสามารถตรวจจับการขยายตัวที่ทำให้เกิดโรคได้ (เช่น NOP56,35 RFC120,32) เทคโนโลยีการหาลำดับที่อ่านมานานที่เกิดขึ้นใหม่อาจเสนอแนวทางเสริมเมื่อทำการขยายพันธุ์จีโนไทป์ขนาดใหญ่36

การประเมินการขยายซ้ำโดยใช้การจัดลำดับจีโนมทั้งหมดในผู้ป่วยที่ไม่ได้รับการวินิจฉัย 11 631 รายที่คัดเลือกเข้าร่วมโครงการจีโนม 100 000 ให้ผู้ป่วย 68 รายที่มีการค้นพบที่อธิบายได้ชัดเจน ผู้ป่วยได้รับคัดเลือกเข้าสู่ 100 000 โครงการจีโนมหลังการทดสอบทางพันธุกรรมตามมาตรฐานของการดูแล ดังนั้น สัดส่วนของการขยายซ้ำที่ระบุในกลุ่มนี้แสดงถึงการเพิ่มขึ้นของผลการวินิจฉัยจากการทดสอบ NHS มาตรฐาน ซึ่งรวมถึงการทดสอบเฉพาะที่สำหรับความผิดปกติของการขยายตัวซ้ำ เช่น FXN หรือ DMPK ข้อสังเกต การวินิจฉัยบางอย่างไม่สงสัยตามลักษณะทางคลินิกของผู้ป่วย ซึ่งรวมถึงผู้ป่วยเด็ก 6 คนที่ไม่มีประวัติครอบครัวที่ทราบเกี่ยวกับความผิดปกติของการขยายตัวซ้ำ ขนาดการขยายตัวซ้ำเฉลี่ยที่คาดการณ์โดยการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดในผู้ป่วยเด็กที่อธิบายไว้ในการศึกษานี้มีขนาดใหญ่กว่าค่าเฉลี่ยในผู้ใหญ่อย่างมาก สอดคล้องกับความคาดหวังว่าการขยายตัวที่มากขึ้นเกี่ยวข้องกับการเริ่มมีอาการเร็วขึ้นและรุนแรงขึ้น แม้กระทั่งในเด็ก จำเป็นต้องมีการทำงานเพิ่มเติม แต่การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าการประเมินการก่อโรคขึ้นอยู่กับอายุและตามขนาดซ้ำอาจสนับสนุนการวินิจฉัยโรคในเด็กโดยการลดอันตรายที่อาจเกิดขึ้นจากการระบุอัลลีลที่มีความเสี่ยงในผู้ใหญ่ซึ่งนำไปสู่การทดสอบคาดการณ์ที่ไม่พึงประสงค์ในเด็ก

การค้นพบของเราช่วยให้สามารถกำหนดขั้นตอนการวินิจฉัยทางคลินิกสำหรับการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดได้ (ภาคผนวก p 23) เราเสนอให้มีการตรวจสอบด้วยสายตาสำหรับการเรียกทั้งหมดที่ถูกจัดประเภทเป็น Extended เพื่อตรวจหาผลบวกที่ผิดพลาด และสำหรับการขยายแบบสองอัลลีลที่ตรวจพบอัลลีลที่ขยายเพียงอันเดียว (เช่น FXN) เราขอแนะนำให้ห้องปฏิบัติการใช้ ExpansionHunter เพื่อประเมินการมีอยู่ของส่วนขยายโดยไม่ต้องปฏิบัติตามการประมาณขนาดและดำเนินการทดสอบ PCR เพื่อยืนยันเป็นส่วนประกอบมาตรฐานของเวิร์กโฟลว์การทดสอบ

โรคที่ถ่ายทอดทางพันธุกรรมที่หายากนั้นรวมถึงลักษณะทางคลินิกที่หลากหลาย ทำให้การทดสอบจีโนมจำเพาะเฉพาะสถานที่ไม่มีประสิทธิภาพ ลำบาก และมีราคาแพง เรานำเสนอหลักฐานว่าการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดในระดับคลินิกซึ่งมีศักยภาพในการวินิจฉัยโรคทางระบบประสาทที่พบได้ยากซึ่งโดยทั่วไปแล้วจะนำเสนอด้วยตัวแปรเบสเดียว อินเดล หรือหมายเลขสำเนาสามารถขยายเพื่อขยายซ้ำได้ เนื่องจากการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดให้การทดสอบเพียงครั้งเดียวที่สามารถระบุการขยายซ้ำที่พบบ่อยที่สุด ตลอดจนทำให้สามารถทดสอบการกลายพันธุ์ของจุดและการคัดลอกตัวแปรจำนวนในยีนที่เกี่ยวข้องกับสภาวะเหล่านี้ได้พร้อมๆ กัน จึงมีโอกาสที่จะระบุผู้ป่วยส่วนใหญ่ที่มีความผิดปกติต่างกันเหล่านี้ ที่ไม่ได้รับการวินิจฉัยโดยใช้การทดสอบเฉพาะสถานที่ ในยุคของการรักษาใหม่ๆ สำหรับความผิดปกติเหล่านี้ การตรวจหาตั้งแต่เนิ่นๆ อาจกลายเป็นสิ่งสำคัญ37 ผลลัพธ์เหล่านี้สนับสนุนการใช้การจัดลำดับจีโนมทั้งหมดเพื่อตรวจหาการขยายตัวซ้ำในห้องปฏิบัติการวินิจฉัยทางคลินิก ซึ่งเป็นวิธีการที่รวมอยู่ใน NHS England National Genomic แล้ว Test Directory,38 สำหรับการตรวจสอบโรคทางระบบประสาทที่หาได้ยากซึ่งไม่ได้รับการวินิจฉัย

อ้างอิง

1 Ngo KJ, Rexach JE, Lee H และอื่น ๆ เพดานการวินิจฉัยสำหรับการจัดลำดับภายนอกในภาวะสมองเสื่อมและความผิดปกติทางระบบประสาทที่เกี่ยวข้อง ฮัมมูตัต 2020; 41: 487–501.

2 Lynch DS, Koutsis G, Tucci A และอื่น ๆ โรคอัมพาตขาหดเกร็งทางพันธุกรรมในกรีซ: การกำหนดลักษณะของประชากรที่ยังไม่ได้สำรวจก่อนหน้านี้โดยใช้การจัดลำดับรุ่นต่อไป Eur J Hum Genet 2016; 24: 857–63.

3 Graziola F, Garone G, Stregapede F และอื่น ๆ ผลลัพธ์ในการวินิจฉัยของแผงยีนการจัดลำดับรุ่นต่อไปที่กำหนดเป้าหมายสำหรับความผิดปกติของการเคลื่อนไหวที่เริ่มในเด็ก: การศึกษาตามรุ่น 3- ปี Front Genet 2019; 10: 1026.

4 Paulson H. ทำซ้ำโรคการขยายตัว Handb Clin Neurol 2018; 147: 105–23.

5 Gossye H, Engelborghs S, Van Broeckhoven C, van der Zee J. C9orf72 ภาวะสมองเสื่อมส่วนหน้าและ/หรือเส้นโลหิตตีบด้านข้าง amyotrophic ซีแอตเทิล รัฐวอชิงตัน: ​​มหาวิทยาลัยวอชิงตัน ปี 2015

6 Klockgether T, Mariotti C, Paulson HL. ความผิดปกติของ Spinocerebellar Nat Rev Dis ไพรเมอร์ 2019; 5: 24.

7 Shakkottai VG, Fogel BL. neurogenetics ทางคลินิก: ataxia spinocerebellar ที่โดดเด่น autosomal คลินิกประสาท 2013; 31: 987–1007.

8 La Spada A. กล้ามเนื้อลีบกระดูกสันหลังและ bulbar. ใน: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, eds. บทวิจารณ์ยีน ซีแอตเทิล รัฐวอชิงตัน: ​​มหาวิทยาลัยวอชิงตัน พ.ศ. 2542

9 Gousse G, Natural H, Touraine R และอื่น ๆ รูปแบบที่ร้ายแรงของ spinocerebellar ataxia type 7 ที่เริ่มมีอาการในวัยเด็ก ซุ้มกุมาร 2018; 25: 42–44.

10 Ansorge O, Giunti P, Michalik A และอื่น ๆ Ataxin-7 การรวมและการแพร่หลายในทารก SCA7 ที่มีการทำซ้ำ 180 CAG แอนนิวโรล 2004; 56: 448-52.

11 Ramocki MB, Chapieski L, McDonald RO, Fernandez F, Malphrus AD. Spinocerebellar ataxia type 2 ที่มีการถดถอยทางปัญญาในวัยเด็ก เจ เด็ก Neurol 2008; 23: 999–1001

12 Mitchell N, LaTouche GA, Nelson B, Figueroa KP, Walker RH, Sobering AK Spinocerebellar ataxia ในวัยเด็กที่เริ่มมีอาการ 3: ดีสโทเนียลิ้นเป็นอาการเริ่มต้น อาการสั่น การเคลื่อนไหว Hyperkinetic อื่น ๆ 2019; เผยแพร่ออนไลน์ 13 กันยายน

13 เบิร์ด ทีดี. Myotonic dystrophy type 1 ใน: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, eds บทวิจารณ์ยีน ซีแอตเทิล รัฐวอชิงตัน: ​​มหาวิทยาลัยวอชิงตัน ปี 2019

14 Aydin G, Dekomien G, Hoffman S, Gerding WM, Epplen JT, Arning L. ความถี่ของ SCA8, SCA10, SCA12, SCA36, FXTAS และ C9orf72 ในผู้ป่วย SCA ที่เป็นลบสำหรับประเภทย่อย SCA ที่พบบ่อยที่สุด BMC เซลล์ประสาท 2018; 18: 3

15 Turro E, Astle WJ, Megy K และอื่น ๆ การจัดลำดับจีโนมทั้งหมดของผู้ป่วยโรคหายากในระบบสุขภาพแห่งชาติ ธรรมชาติ 2020; 583: 96–102.

16 แอชลีย์ อีเอ. สู่การแพทย์แม่นยำ Nat Rev Genet 2016; 17: 507–22.

17 Liu HY, Zhou L, Zheng MY, และคณะ การวินิจฉัยและอรรถประโยชน์ทางคลินิกของการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดในกลุ่มครอบครัวชาวจีนที่ไม่ได้รับการวินิจฉัยซึ่งมีโรคหายาก ตัวแทนวิทย์ 2019; 9: 19365.

18 Mousavi N, Shleizer-Burko S, Yanicky R, Gymrek M. การทำโปรไฟล์ภูมิทัศน์ทั่วทั้งจีโนมของการขยายซ้ำแบบตีคู่ กรดนิวคลีอิก Res 2019; 47: e90.

19 Tankard RM, Bennett MF, Degorski P, Delatycki MB, Lockhart PJ, Bahlo M. การตรวจจับการขยายของการทำซ้ำแบบควบคู่ในกลุ่มที่เรียงลำดับด้วยข้อมูลการจัดลำดับแบบอ่านสั้น Am J Hum Genet 2018; 103: 858–73.

20 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Bennett MF และอื่น ๆ การระบุตามชีวสารสนเทศของการทำซ้ำแบบขยาย: การขยายเพนทาเมอร์แบบอินโทรนิกที่ไม่อ้างอิงใน RFC1 ทำให้เกิด CANVAS Am J Hum Genet 2019; 105: 151–65.

21 กรอส AM, Ajay SS, Rajan V, et al. ตัวแปรจำนวนสำเนาในการจัดลำดับจีโนมทางคลินิก: การใช้งานและการตีความสำหรับโรคที่หายากและไม่ได้รับการวินิจฉัย Genet Med 2019; 21: 1121–30.

22 Trost B, Engchuan W, Nguyen CM, และคณะ การตรวจจับซ้ำของ DNA ควบคู่ทั่วทั้งจีโนมที่ขยายตัวในออทิสติก ธรรมชาติ 2020; 586: 80–86.

23 Robinson PN, Kohler S, Bauer S, Seelow D, Horn D, Mundlos S. The Human Phenotype Ontology: เครื่องมือสำหรับคำอธิบายประกอบและวิเคราะห์โรคทางพันธุกรรมของมนุษย์ Am J Hum Genet 2008; 83: 610–15.

24 จีโนมิกส์อังกฤษ แบบจำลองข้อมูลทางคลินิกของสภาวะโรคที่หายาก 2018 https://www.genomicsengland.co.uk/?wpdmdl=5500 (เข้าถึง 4 ส.ค. 2021)

25 Dolzhenko E, van Vugt JJFA, Shaw RJ และอื่น ๆ การตรวจจับการขยายซ้ำแบบยาวจากข้อมูลลำดับจีโนมทั้งหมดที่ไม่มี PCR ความละเอียดของจีโนม 2017; 27: 1895-903.

26 Dolzhenko E, Deshpande V, Schlesinger F และอื่น ๆ ExpansionHunter: เครื่องมือตามกราฟลำดับเพื่อวิเคราะห์ความผันแปรในพื้นที่ทำซ้ำแบบสั้นควบคู่ ชีวสารสนเทศ 2019; 35: 4754–56.

27 Roy S, Coldren C, Karunamurthy A และอื่น ๆ มาตรฐานและแนวทางในการตรวจสอบท่อส่งชีวสารสนเทศเพื่อการจัดลำดับยุคหน้า: คำแนะนำร่วมกันของ Association for Molecular Pathology และ College of American Pathologists J โมลวินิจฉัย 2018; 20: 4–27.

28 Robinson JT, Thorvaldsdottir H, Winckler W, และคณะ โปรแกรมดูจีโนมเชิงบูรณาการ แนท ไบโอเทคโนโลยี 2011; 29: 24–26.

29 Schneider SA, van de Warrenburg BPC, Hughes TD, และคณะ ฟีโนไทป์ที่เป็นเนื้อเดียวกันของการนำเสนอที่คล้ายกับโรคฮันติงตันในตระกูล SCA17 ประสาทวิทยา 2549; 67: 1701–03.

30 Schneider SA, โรคเบิร์ดที. ฮันติงตัน, โรคฮันติงตันที่มีลักษณะคล้ายกัน และโรคหลอดเลือดหัวใจตีบที่ไม่เป็นพิษเป็นภัย: มีอะไรใหม่ Mov Disord Clin Pract 2016; 3: 342–54.

31 Bahlo M, Bennett MF, Degorski P, Tankard RM, Delatycki MB, ล็อกฮาร์ต PJ ความก้าวหน้าล่าสุดในการตรวจจับการขยายซ้ำด้วยการจัดลำดับยุคถัดไปแบบอ่านสั้น F1000Res 2018; 7: 736.

32 Cortese A, Simone R, Sullivan R และอื่น ๆ การขยายตัวแบบไบอัลเลลิกของการทำซ้ำแบบอินโทรนิกใน RFC1 เป็นสาเหตุทั่วไปของอาการผิดปกติที่เริ่มมีอาการ แนท เจเน็ต 2019; 51: 649–58.

33 Ishiura H, Doi K, Mitsui J และอื่น ๆ การขยายตัวของ TTTCA และ TTTTA ที่เกิดขึ้นภายในจะเกิดซ้ำในโรคลมชัก myoclonic ในวัยผู้ใหญ่ที่ไม่เป็นพิษเป็นภัย แนท เจเน็ต 2018; 50: 581–90.

34 Ishiura H, Shibata S, Yoshimura J และอื่น ๆ การขยายตัวซ้ำของ CGG แบบไม่เข้ารหัสในโรคการรวมตัวในเซลล์ประสาท, โรคกล้ามเนื้อหัวใจขาดเลือด และโรคที่ทับซ้อนกัน แนท เจเน็ต 2019; 51: 1222–32.

35 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Pope K, และคณะ การวินิจฉัยอย่างรวดเร็วของ spinocerebellar ataxia 36 ในตระกูลสามชั่วอายุคนโดยใช้ข้อมูลการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดแบบอ่านสั้น ย้าย Disord 2020; 35: 1675–79.

36 Mantere T, Kersten S, Hoischen A. การจัดลำดับการอ่านที่ยาวนานซึ่งเกิดขึ้นในพันธุศาสตร์ทางการแพทย์ Front Genet 2019; 10: 426.

37 เอลเลอร์บี้ LM. ความผิดปกติของการขยายตัวซ้ำ: กลไกและการรักษา ประสาทบำบัด 2019; 16: 924–27.

38 ระบบสุขภาพแห่งชาติ. National Genomic Test Directory: เกณฑ์การทดสอบสำหรับโรคที่หายากและเป็นโรคที่สืบทอดมา ตุลาคม 2564